CN112608853A

CN112608853A - 一株不产桔霉素的重组红曲菌及其构建方法

Info

Publication number: CN112608853A
Application number: CN202011553310.8A
Authority: CN
Inventors: 嘉晓勤; 赵天佑; 何猛; 陈小龙
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-04-06

Abstract

本发明提供了一株不产桔霉素的重组红曲菌——紫色红曲菌(Monascus purpureus)浙工红曲3号，由红曲霉A基因敲除桔霉素合成基因(pksCT)并去除外源基因后获得。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种不产桔霉素且不含外源基因的重组红曲菌，该重组紫色红曲菌在YES液体培养基中发酵15d后并未检测到桔霉素，为工业上红曲菌种改良提供了新的途径。

Description

一株不产桔霉素的重组红曲菌及其构建方法

(一)技术领域

本发明涉及一株不产桔霉素且不含外源筛选基因的重组红曲菌及其构建方法。

(二)背景技术

红曲菌是我国重要的食用和药用微生物，可以产生多种天然产物，包括红曲色素、Monacolin K和γ-氨基丁酸等，其代谢产物被广泛应用于医药、食品等行业。但是大部分具有工业价值的红曲菌的发酵产品都可能含有一种对人体具有肝、肾毒性的真菌毒素—桔霉素，从而影响红曲产品的销售。

为了消除红曲菌制品中潜在的桔霉素，通过理化诱变筛选得到性状优良的红曲菌是一种方法；但是筛选的工作量大且工业价值不确定。也有研究者利用基因工程手段对红曲菌菌种进行定向改造，将桔霉素合成基因(pksCT)替换成真菌筛选标记基因，例如潮霉素抗性基因(hph)；改造后的红曲菌发酵液中桔霉素的含量明显下降，但是外源导入的基因仍保留在改造后的红曲菌基因组上。外源基因片段大都来源于亲缘关系较远的原核生物，使得重组红曲菌的安全性受到质疑。

外源基因清除技术可以实现筛选基因的清除，目前主要用于解决转基因植物的环境安全性和食品安全性问题。而在丝状真菌中则较难实现外源基因的清除：由于丝状真菌存在同源重组和非同源末端连接两种DNA双链缺口修复机制，导致在丝状真菌中实现靶向基因片段的同源重组效率很低。

(三)发明内容

本发明的目的是克服现有红曲菌基因组改造技术和红曲菌产生桔霉素的不足，提供一株桔霉素合成基因(pksCT)敲除且外源筛选基因清除的重组紫色红曲菌(Monascuspurpureus)。

本发明采用的技术方案是：

一株不产桔霉素的重组红曲菌——紫色红曲菌浙工红曲3号(Monascuspurpureus浙工红曲3号)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，分类名称为：Monascus purpureus，保藏编号为CCTCC NO：M 2020728，保藏日期为2020年11月12日。

该紫色红曲菌浙工红曲3号由红曲霉A基因敲除桔霉素合成基因(pksCT)并去除外源基因后获得。红曲菌A是一株从土壤中筛选得到的具有工业价值的菌株，本发明利用Cre-LoxP系统对红曲菌A桔霉素合成基因(pksCT)进行敲除，使得红曲菌基因组上不保留外源基因片段。Cre-loxP是一种特定位点的重组酶技术，可在DNA的特定位点上执行删除、插入、易位及倒位，用该系统可以针对特定的细胞类型或采用特定的外部刺激，对细胞中DNA进行修改。

本发明还涉及一种构建所述重组红曲菌的方法，所述方法包括：

(1)以红曲菌A基因组为模板，分别设计引物进行PCR反应，扩增出pksCT基因的UTL核酸片段和UTR核酸片段：

(2)以根瘤农杆菌载体pPZP201为母核，与核酸替代片段WH连接得到pWH2双元载体，然后用XbaⅠ限制性内切酶酶切得到线性化pWH2载体；使用C112重组酶对线性化pWH2载体和UTL进行重组得到pWH2::UTL；SpeⅠ限制性内切酶酶切pWH2::UTL，使用C112重组酶对线性化载体和UTR进行重组得到pWH2::ΔpksCT；所述核酸替代片段WH依次包括以下序列：左LoxP序列、xyn1启动子、Cre酶序列、NOS终止子、hph序列和右LoxP序列；

(3)将重组载体pWH2::ΔpksCT转化到根瘤农杆菌AGL-1中，将含有重组载体pWH2::ΔpksCT的根瘤农杆菌AGL-1利用根瘤农杆菌介导的转化法转化红曲菌，潮霉素抗性平板上筛选转化子,在潮霉素抗性平板上不生长而在不含潮霉素抗性平板上生长的菌株进行PCR验证，验证成功的转化子即为所述重组紫色红曲菌。在含有木糖的平板上诱导培养转化子,潮霉素抗性平板上继续筛选诱导后的转化子,在不含潮霉素抗性的PDA培养基上生长而在含有潮霉素抗性的PDA培养基上不生长，则表示核酸替代片段WH缺失。

优选的，所述UTL核酸片段序列如SEQ ID NO.9所示，所述UTR核酸片段序列如SEQID NO.10所示。所述核酸替代片段WH序列如SEQ ID NO.11所示。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种不产桔霉素且不含外源基因的重组红曲菌，该重组紫色红曲菌在YES液体培养基中发酵15d后并未检测到桔霉素，为工业上红曲菌种改良提供了新的途径。

(四)附图说明

图1为基于同源重组的红曲菌桔霉素合成基因pksCT敲除原理图。

图2为UTL、UTR、pWH2和pWH2::ΔpksCT片段电泳图谱：其中：M，DL10000；1，UTL；2，UTR；3，pWH2；4，pWH2::ΔpksCT。

图3为重组红曲菌转化子PCR验证电泳图谱：其中：M，DL5000；1，P1和hygB-R PCR产物；2，hygB-F和P2 PCR产物；3，hygB-F和hygB-R PCR产物；4，P1和P2 PCR产物；5，红曲菌AP1和P2 PCR产物。

图4为浙工红曲3号PCR验证电泳图谱：其中：M，DL5000；1，浙工红曲3号P1和P2 PCR产物；2，红曲菌A P1和P2 PCR产物。

图5为红曲菌A和浙工红曲3号发酵液桔霉素含量图：其中黄色代表红曲菌A桔霉素含量；绿色代表浙工红曲3号桔霉素含量。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1pksCT基因敲除载体的构建：基于同源重组的pksCT基因敲除原理图如图1所示。

(1)pWH2载体的构建：利用融合PCR将左LoxP序列、xyn1启动子、Cre酶序列、NOS终止子、hph序列和右LoxP序列连接为序列表中SEQ ID No.11所示的WH核酸片段；使用BstXⅠ和MauBⅠ限制性内切酶对pPZP201载体(创新生物基因公司)进行双酶切，得到线性化pPZP201载体，使用C112重组酶(诺唯赞公司)对线性化pPZP201载体和WH核酸片段进行重组得到pWH2。

表1：BstXⅠ和MauBⅠ单酶切体系

表2：C112重组酶反应体系

(2)pksCT基因5’端侧翼序列(UTL)和3’端侧翼序列(UTR)的扩增：以红曲菌A的基因组为模板，用序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸序列为上、下游引物进行PCR反应，扩增出序列表中SEQ ID NO.9所示1005bp的UTL核酸片段；用序列表中SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列为上、下游引物进行PCR反应，扩增出序列表中SEQID NO.10所示的994bp的UTR核酸片段；UTL和UTR的PCR反应体系和PCR反应条件如下所示：

表3：UTL和UTR的PCR反应体系

PCR反应条件如下：95℃，3min；95℃，30sec；53℃，30sec；72℃，1min，循环数为35；72℃，5min；4℃，Forever。

(3)pksCT基因UTL和UTR和pWH2载体(含WH)进行重组连接：XbaⅠ限制性内切酶酶切pWH2载体，使用C112重组酶(诺唯赞公司)对线性化pWH2载体和UTL进行重组得到pWH2::UTL；SpeⅠ限制性内切酶酶切pWH2::UTL，使用C112重组酶(诺唯赞公司)对线性化载体和UTR进行重组得到pWH2::ΔpksCT。载体构建步骤中单酶切和重组反应体系如下：

表4：XbaⅠ和SpeⅠ单酶切体系

表5：C112重组酶反应体系

UTL核酸片段、UTR核酸片段、pWH2载体和pWH2::ΔpksCT载体电泳图见图2。泳道1为UTL核酸片段，泳道2为UTR核酸片段，泳道3为pWH2载体，泳道4为pWH2::ΔpksCT载体，M为DL10000。根据电泳结果显示UTL核酸片段、UTR核酸片段、pWH2载体和pWH2::ΔpksCT载体条带大小正确，桔霉素合成基因(pksCT)敲除载体构建成功。

实施例2：根瘤农杆菌介导的基因转化及敲除子的筛选

1、培养基

PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0，若配制固体培养基则需要在液体培养基中加入20g/L的琼脂。

IM液体培养基：NaCl 0.3g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.136g/L，MgSO₄·7H2O0.6g/L,CaCl₂·2H₂O 0.01g/L,Na₂-EDTA·2H₂O 1.3mg/L，Na₂-MoO₄·2H₂O 0.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.5mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 1mg/L，H₃BO₄ 0.5mg/L，10mL/L50％甘油，2mL/L 0.1mol/LAS，10mL/L 20％葡萄糖，10mL/L 1mol/L MES。

Co-IM培养基：配方同IM培养基，加入琼脂粉10g/L。

(2)实验方法

1、使用热击转化法将重组载体pWH2::ΔpksCT转化到大肠杆菌中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-16h；挑取克隆子进行PCR验证。然后将重组载体pWH2::ΔpksCT转化到根瘤农杆菌AGL-1中，涂布于含有卡那霉素和利福平双抗的LB平板上，28℃培养48h可长出菌落。挑取克隆子进行PCR验证。

2、红曲菌孢子的收集

将红曲菌接种到PDA斜面，28℃培养20d,无菌水洗下孢子，配成浓度为10⁶cfu/mL的孢子悬浮液。

3、根瘤农杆菌诱导培养

将含有pWH2::ΔpksCT的根瘤农杆菌AGL-1接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，28℃培养12-16h，离心收集菌体。用IM培养基将农杆菌菌体重悬并将菌体浓度稀释到OD_600nm＝0.4-0.5，同样条件下继续诱导培养6h。

4、红曲菌孢子和根瘤农杆菌的共培养

用步骤3制备的根瘤农杆菌菌液将红曲菌孢子液稀释至10⁵cfu/mL，取200μL稀释液涂布在铺有玻璃纸的Co-IM培养基上，28℃正置培养2d-3d。

5、潮霉素抗性平板筛选转化子

转移Co-IM培养基上的玻璃纸至灭菌的空平皿中，倒入约40℃含有50μg/mL潮霉素和0.5mg/mL头孢霉素的PDA培养基，于28℃培养箱培养。将长出的菌落挑出，接种到含有50μg/mL潮霉素的PDA培养基上继续培养；如果能生长，可断定为转化子。

6、PCR验证pksCT敲除盒基因重组突变株

提取转化子基因组DNA，用序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的寡核苷酸序列为上游引物和下游引物进行PCR反应，用序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.6所示的寡核苷酸序列为上游引物和下游引物进行PCR反应，用序列表中SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.8所示的寡核苷酸序列为上游引物和下游引物进行PCR反应，用序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的寡核苷酸序列为上游引物和下游引物进行PCR反应，PCR反应体系和反应条件如下：

表6：pksCT敲除盒PCR反应体系

PCR反应条件如下：98℃，5min；98℃，15sec；53℃，15sec；72℃，3min，循环数为30；72℃，5min；4℃，Forever。

PCR验证pksCT敲除盒基因重组突变株，实验结果如图3所示；其中：M，DL5000；1，P1和hygB-R PCR产物；2，hygB-F和P2 PCR产物；3，hygB-F和hygB-R PCR产物；4，P1和P2 PCR产物；5，红曲菌A P1和P2 PCR产物。以红曲菌A基因组为模板使用P1和hygB-R、hygB-F和P2、hygB-F和hygB-R进行PCR得不到PCR产物，而以重组菌基因组为模板则能够得到大小正确的PCR产物。以红曲菌A基因组和组菌基因组为模板使用P1和P2进行PCR,到条带相差4500bp，因此证明重组菌构建成功。

实施例3：重组红曲菌浙工红曲3号中pksCT基因敲除盒的诱导缺失

(1)培养基

MA培养基：蛋白胨1.0g/L，酵母粉0.5g/L，木糖20g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.4g/L，KH₂PO₄2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L,CaCl₂·2H₂O 0.3g/L,尿素0.3g/L，Tween80 0.5g/L，微量元素母液1mL(MnSO₄·H₂O 1.6g/L，CoCl·6H₂O 2.0g/L，ZnSO₄·7H₂O 1.4/L，FeSO₄·7H₂O5.0g/L)。

(2)实验方法

1、将经过验证的转化子孢子，转接到含有1％(wt/vol)的D-木糖的MA培养基中，摇瓶在28℃200r/min培养2d。

2、将菌丝挑至含1％D-木糖的MA固体培养基上，28℃培养5-7d。

3、将孢子用无菌水洗下，离心浓缩后稀释到不同浓度涂布到含有1％(wt/vol)D-木糖和0.1％(wt/vol)Triton X-100(Sigma Aldrich)的MA固体平板，28℃培养2-3d。

4、用接种针从每块平板上挑出含有单菌落的小琼脂块一半放入含有50μg/mL潮霉素抗性PDA培养基,另一半放入不含潮霉素抗性的PDA培养基上。根据在抗性平板上是否生长判断敲除盒WH有没有缺失；在潮霉素抗性平板上不生长而在普通平板上生长的红曲菌即为敲除盒消除成功的转化子。

5、将转化子继续转接至不含潮霉素抗性PDA培养基上培养，提取转化子基因组DNA，用序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的寡核苷酸序列为上游引物和下游引物进行PCR反应。PCR反应体系和反应条件如下：

表7：WH核酸片段消除重组突变株PCR反应体系

PCR反应条件如下：98℃，5min；98℃，15sec；53℃，15sec；72℃，1min，循环数为30；72℃，5min；4℃，Forever。

PCR验证核酸替代片段WH消除重组突变株，实验结果如图4所示，其中：M，DL5000；1，浙工红曲3号P1和P2 PCR产物；2，红曲菌A P1和P2 PCR产物，浙工红曲3号和红曲菌A的P1和P2 PCR产物，大小差距为500bp，所以浙工红曲3号确定桔霉素合成基因(pksCT)被敲除，并且外源筛选标记也被缺失。

实施例4：出发菌株红曲菌A和浙工红曲3号桔霉素含量的检测

(1)培养基

PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。

YES液体培养基：酵母浸膏40g/L，蔗糖160g/L。

(2)实验方法

1、原始红曲菌和pksCT敲除红曲菌的液态发酵

将400μL红曲菌孢子悬浮液(10⁵cfu/mL)接种至盛有50mL YES液体培养基的250mL三角烧瓶中，28℃静置培养15d。第7d，9d，11d，13d和15d取样，滤纸过滤后收集发酵液用于桔霉素产量测定。

2、红曲菌发酵液桔霉素含量的检测

取不同培养时间的发酵液1mL于5mL离心管中，加入等量的甲苯/乙酸乙酯/甲酸(7:3:1，v/v/v)混合液，剧烈震荡混匀，12000r/min离心10min，取上清液用色谱级甲醇稀释后过0.22μm有机滤膜，之后采用高效液相色谱法(HPLC)测定桔霉素浓度。

桔霉素HPLC检测的色谱条件：色谱柱：Agilent Zobra SB-C18柱(5μm，250×4.6mm)；流动相为乙腈：水＝50：50，水用磷酸调节pH至2.5；检测器：荧光检测器，λex＝331nm，λem＝500nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。进样体积：20μL。

3、实验结果

红曲菌A发酵液随着培养时间的增加，桔霉素在第15d时含量最高，达到23.8μg/mL；而浙工红曲3号发酵液随着时间的增加，桔霉素并未检测到。红曲菌A和浙工红曲3号发酵液桔霉素含量示意图如图5所示。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一株不产桔霉素的重组红曲菌及其构建方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

agctatgacc atgattacga attcaggctt tatcccaccc ca 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

ataatgtatg ctatacgaat aattggccca gccaatgtga ag 42

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atagcataca ttatagcaat ttatatactc cagtcctatt acccc 45

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

cagtgccaag cttatttaaa tgagcgagca tcaaaagcaa aaaca 45

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

atgcctgaac tcaccgcgac g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

ctattccttt gccctcggac g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

atgtgtctcc aatgctgtat c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

attgctgtct gatctgccac c 21

<210> 9

<211> 1005

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

aggctttatc ccaccccagg ccagcttttc aagcatcaac ccttcactca atgcaaaggc 60

tgaggaaaaa atagagatct cgacccgttt aaagccttgg gatgcacctt tcagagctgc 120

actcatcaac aactacggtg cttccgggtc caatgcctcc atggttgtta cgcaaccacc 180

aaatctgacg gagaccccct cgacaccgtt gccagggaaa agctatccat tctggatcag 240

tgcatttgac caacagagcc ttcaaagtta cgttcggagg ttgcgccaat ttctcgaaaa 300

acatgcggca gacaaaaacc taagcgtcgc aaacttgtct ttccaagttg cttgtcaatc 360

aaactggtct cttccccaag ccctggtatt cagtgccagc acaaaggagg agctgaatag 420

ggcccttgca tcttttgaga aaggcagcac ggatttccca tctgtccagc ttccggatcc 480

gaagcccgtc atcctatgct ttggagggca agtttccacc tatgttggtt tggatcaaga 540

ggtctataac agcactgcga ttttgagaca ttacttagat cagtgcgatg ccatgtgcct 600

ttcgctaggc ctgcaaagta tctacccggc tattttccaa cggtccccaa tcgaggatat 660

tgttcagctt caaacagcgc tgtttgcgat gcagtattcc tgcgccaagg catggataga 720

tagcggactg aaggttgcct cggtcgtcgg gcacagcttt ggtgagttga tagctctatg 780

tgtctccaat gctgtatcgt tgaaggatgc tgtcaagatg atttccggtc gagcccgcct 840

tattaaggag cgctggggcg ctgacaaggg gtccatgatc gctgtcgagg cggacctttc 900

cgatgtggaa gctttgttgg ccaaggtgaa atcacagatg ggatctgaaa cgggacttgc 960

aatcgcctgc tataatgcat caaaaagctt cacattggct gggcc 1005

<210> 10

<211> 994

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

atactccagt cctattaccc ccgtatcaat tcgagaagtc gaggcactgg atggatctga 60

aggtaccccc gaagcccgaa gcttctgtgc aggtggcaga gcagacagca attatcgagg 120

caccgaaggg cctgacgact ttcgttggtt atcaagacgc atcccagcgc tctgtgaggt 180

tcagagtaaa tgtcacgaca gaaaagttta accgtctcct gtccggccat atcatggcaa 240

atgccgctgc tgtctgtccc ggtatgttcc aggttgagat agcccttgat gctttgacga 300

gtcttcgacc agagttccag gcccgtagct ttatcccaga gctacatgac ctaaggcatt 360

atcaaccgct tgtcagagac gaatcccggg cagtctggat cgaagctcac tgtcccaacg 420

cggaaggcct cgtctggaat tggaagttga ctgcaagtga cgataaggga agtggttctg 480

taacccatac ttcgggaaca atcacattcc aagcggcgga cagtgtgcaa gtcaagtccg 540

agttcgagaa acttagacgt ctgatcggcc gaaagcgctg tttgcaactc cttgacagca 600

acgtggcaga cgatatcctg cagggtcgca acatctaccg tgcctttacg gaagtgattg 660

attacaaaga aatttatcgc catgtcacca agatcgctgg cagggataac gagtctgcag 720

gaagggtcat aaaaacatac gacggagaga cctggctcga cacagtcttg accgactgct 780

tctgccaagt ggcgggtatc ttcgtgaatc tcatgaccac taagattgat ttgtctgaga 840

gaggaatttt catctgcgac ggaattgatc ggtggttgcg agcacctaat gcaggttcaa 900

acaacactcc ttcgcaggtt tatgaggtct ttgctctaca ccattgcgaa tcggattcaa 960

agtatctcag cgatgttttt gcttttgatg ctcg 994

<210> 11

<211> 5125

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

aattattcgt atagcataca ttatacgaag ttatactaga gaagttccta tactttttag 60

agaataggaa cttcggaata ggaacttcac tagagatatc aagcaactac gtaaaactcc 120

atgagattgc agatgcggcc cactggaata caacatcctc cgcaagtccg acatgaagcc 180

ccttgacttg attggcaggc taaatgcgac atcttagccg gatgcacccc agatctgggg 240

aacgcgccgc ttgaggcccg aagcgccggg ttcgatgcat tactgccata tttcagcagt 300

taactaggac cggcttgtgt cgatattgcg ggtggcgttc aatctattcc ggcactccta 360

tgccgtttga tccgatacct ggagggcgtg ctttaggcaa aatgccaagc ttcgaggata 420

ctgtacgagc cgctttcaac ctcacttgat gatgtctgag tttcatcaag agaattgaag 480

tcaaagctca aatcatgatg tgaagaggtt ttgaatgtgg aagaattctg catatataaa 540

gccatggaag aagacgtaaa actgagacag caagctcaac tgcatagtat cgacttcaag 600

gaaaacacgc acaaataatc atcatggccc acgtgatgac ccgacgtcga tgcaactcat 660

tgagagtcct tatgtatgct tacatccaga atggtcgtca atccagccga gcgattcacg 720

gaacttgtac gccggatgag gctggtcccg tctgccactt tcacctgagc gtcttcaact 780

cggcgaccta cagctcggca gtcaagagta ggtaaggacg gcatagtacc actactaggt 840

actagcattc tcttcgggca atatttactt actacctacc tagactaggg taccctatcg 900

agctcgcccc cgtcaagcag accctgaact tcgacctgct gaagctggcc ggcgacgtcg 960

agagcaaccc cggccccgat aacgacaaga agcgcaagag ctggggccag gtcctgcccg 1020

agcccaagac caacctgccc ccccgcaagc gcgccaagac ctccaattta ctgaccgtac 1080

accaaaattt gcctgcatta ccggtcgatg caacgagtga tgaggttcgc aagaacctga 1140

tggacatgtt cagggatcgc caggcgtttt ctgagcatac ctggaaaatg cttctgtccg 1200

tttgccggtc gtgggcggca tggtgcaagt tgaataaccg gaaatggttt cccgcagaac 1260

ctgaagatgt tcgcgattat cttctatatc ttcaggcgcg cggtctggca gtaaaaacta 1320

tccagcaaca tttgggccag ctaaacatgc ttcatcgtcg gtccgggctg ccacgaccaa 1380

gtgacagcaa tgctgtttca ctggttatgc ggcggatccg aaaagaaaac gttgatgccg 1440

gtgaacgtgc aaaacaggct ctagcgttcg aacgcactga tttcgaccag gttcgttcac 1500

tcatggaaaa tagcgatcgc tgccaggata tacgtaatct ggcatttctg gggattgctt 1560

ataacaccct gttacgtata gccgaaattg ccaggatcag ggttaaagat atctcacgta 1620

ctgacggtgg gagaatgtta atccatattg gcagaacgaa aacgctggtt agcaccgcag 1680

gtgtagagaa ggcacttagc ctgggggtaa ctaaactggt cgagcgatgg atttccgtct 1740

ctggtgtagc tgatgatccg aataactacc tgttttgccg ggtcagaaaa aatggtgttg 1800

ccgcgccatc tgccaccagc cagctatcaa ctcgcgccct ggaagggatt tttgaagcaa 1860

ctcatcgatt gatttacggc gctaaggatg actctggtca gagatacctg gcctggtctg 1920

gacacagtgc ccgtgtcgga gccgcgcgag atatggcccg cgctggagtt tcaataccgg 1980

agatcatgca agctggtggc tggaccaatg taaatattgt catgaactat atccgtaacc 2040

tggatagtga aacaggggca atggtgcgcc tgctggaaga tggcgattag cgcgcgcgcc 2100

accaccacca ccaccactaa taggatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat 2160

tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc 2220

atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag 2280

tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata 2340

aattatcgcg cgccgtgtca tctatgttac tagatcacta gagagctctg tacagtgacc 2400

ggtgactctt tctggcatgc ggagagacgg acggacgcag agagaagggc tgagtaataa 2460

gcgccactgc gccagacagc tctggcggct ctgaggtgca gtggatgatt attaatccgg 2520

gaccggccgc ccctccgccc cgaagtggaa aggctggtgt gcccctcgtt gaccaagaat 2580

ctattgcatc atcggagaat atggagcttc atcgaatcac cggcagtaag cgaaggagaa 2640

tgtgaagcca ggggtgtata gccgtcggcg aaatagcatg ccattaacct aggtacagaa 2700

gtccaattgc ttccgatctg gtaaaagatt cacgagatag taccttctcc gaagtaggta 2760

gagcgagtac ccggcgcgta agctccctaa ttggcccatc cggcatctgt agggcgtcca 2820

aatatcgtgc ctctcctgct ttgcccggtg tatgaaaccg gaaaggccgc tcaggagctg 2880

gccagcggcg cagaccggga acacaagctg gcagtcgacc catccggtgc tctgcactcg 2940

acctgctgag gtccctcagt ccctggtagg cagctttgcc ccgtctgtcc gcccggtgtg 3000

tcggcggggt tgacaaggtc gttgcgtcag tccaacattt gttgccatat tttcctgctc 3060

tccccaccag ctgctctttt cttttctctt tcttttccca tcttcagtat attcatcttc 3120

ccatccaaga acctttattt cccctaagta agtactttgc tacatccata ctccatcctt 3180

cccatccctt attcctttga acctttcagt tcgagctttc ccacttcatc gcagcttgac 3240

taacagctac cccgcttgag cagacatcac catgcctgaa ctcaccgcga cgtctgtcga 3300

gaagtttctg atcgaaaagt tcgacagcgt ctccgacctg atgcagctct cggagggcga 3360

agaatctcgt gctttcagct tcgatgtagg agggcgtgga tatgtcctgc gggtaaatag 3420

ctgcgccgat ggtttctaca aagatcgtta tgtttatcgg cactttgcat cggccgcgct 3480

cccgattccg gaagtgcttg acattgggga attcagcgag agcctgacct attgcatctc 3540

ccgccgtgca cagggtgtca cgttgcaaga cctgcctgaa accgaactgc ccgctgttct 3600

gcagccggtc gcggaggcca tggatgcgat cgctgcggcc gatcttagcc agacgagcgg 3660

gttcggccca ttcggaccgc aaggaatcgg tcaatacact acatggcgtg atttcatatg 3720

cgcgattgct gatccccatg tgtatcactg gcaaactgtg atggacgaca ccgtcagtgc 3780

gtccgtcgcg caggctctcg atgagctgat gctttgggcc gaggactgcc ccgaagtccg 3840

gcacctcgtg cacgcggatt tcggctccaa caatgtcctg acggacaatg gccgcataac 3900

agcggtcatt gactggagcg aggcgatgtt cggggattcc caatacgagg tcgccaacat 3960

cttcttctgg aggccgtggt tggcttgtat ggagcagcag acgcgctact tcgagcggag 4020

gcatccggag cttgcaggat cgccgcggct ccgggcgtat atgctccgca ttggtcttga 4080

ccaactctat cagagcttgg ttgacggcaa tttcgatgat gcagcttggg cgcagggtcg 4140

atgcgacgca atcgtccgat ccggagccgg gactttcggg cgtacacaaa tcgcccgcag 4200

aagcgcggcc gtctggaccg atggctgtgt agaagtactc gccgatagtg gaaaccgacg 4260

ccccagcact cgtccgaggg caaaggaata gagtagatgc cgaccgggat ccacttaacg 4320

ttactgaaat catcaaacag cttgacgaat ctggatataa gatcgttggt gtcgatgtca 4380

gctccggagt tgagacaaat ggtgttcagg atctcgataa gatacgttca tttgtccaag 4440

cagcaaagag tgccttctag tgatttaata gctccatgtc aacaagaata aaacgcgttt 4500

cgggtttacc tcttccagat acagctcatc tgcaatgcat taatgcattg gacctcgcaa 4560

ccctagtacg cccttcaggc tccggcgaag cagaagaata gcttagcaga gtctattttc 4620

attttcggga gacgagatca agcagatcaa cggtcgtcaa gagacctacg agactgagga 4680

atccgctctt ggctccacgc gactatatat ttgtctctaa ttgtactttg acatgctcct 4740

cttctttact ctgatagctt gactatgaaa attccgtcac cagcccctgg gttcgcaaag 4800

ataattgcac tgtttcttcc ttgaactctc aagcctacag gacacacatt catcgtaggt 4860

ataaacctcg aaaatcattc ctactaagat gggtatacaa tagtaaccat gcatggttgc 4920

ctagtgaatg ctccgtaaca cccaatacgc cggccgaaac ttttttacaa ctctcctatg 4980

agtcgtttac ccagaatgca caggtacact tgtttagagg taatccttct tactagagaa 5040

gttcctatac tttttagaga ataggaactt cggaatagga acttcactag aataacttcg 5100

tatagcatac attatagcaa tttat 5125

Claims

1.一株不产桔霉素的重组红曲菌——紫色红曲菌浙工红曲3号(Monascus purpureus浙工红曲3号)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，分类名称为：Monascus purpureus，保藏编号为CCTCC NO：M 2020728，保藏日期为2020年11月12日。

2.一种构建权利要求1所述不产桔霉素的重组红曲菌的方法，所述方法包括：

(2)以根瘤农杆菌载体pPZP201为母核，与核酸替代片段WH连接得到pWH2双元载体，然后用XbaⅠ限制性内切酶酶切得到线性化pWH2载体；使用C112重组酶对线性化pWH2载体和UTL进行重组得到pWH2::UTL；SpeⅠ限制性内切酶酶切pWH2::UTL，使用C112重组酶对线性化载体和UTR进行重组得到pWH2::ΔpksCT；所述核酸替代片段WH顺次包括以下序列：左LoxP序列、xyn1启动子、Cre酶序列、NOS终止子、hph序列和右LoxP；

(3)将重组载体pWH2::ΔpksCT转化到根瘤农杆菌AGL-1中，将含有重组载体pWH2::ΔpksCT的根瘤农杆菌AGL-1利用根瘤农杆菌介导的转化法转化红曲菌，潮霉素抗性平板上筛选转化子,在潮霉素抗性平板上不生长而在不含潮霉素抗性平板上生长的菌株进行PCR验证，验证成功的转化子即为所述重组紫色红曲菌。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述UTL核酸片段序列如SEQ ID NO.9所示，所述UTR核酸片段序列如SEQ ID NO.10所示。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述核酸替代片段WH序列如SEQ ID NO.11所示。