CN113073109B - 基因在间甲酚合成中的应用、质粒及菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物合成领域，特别涉及基因在间甲酚合成中的应用、质粒及菌株。本发明以高产间甲酚的工业生产菌株为目标，将来源于棒曲霉的生物合成基因patK和patG，在构巢曲霉中进行共表达，得到菌株AnCR05，成功实现了间甲酚的异源表达，产量在摇瓶水平达到0.2g/L。通过构建不同排列组合的启动子的和基因，及增加基因拷贝数，构建了菌株AnCR16，使得间甲酚异源表达产量达到了2.0g/L。本发明构建的菌株为间甲酚的工业化生产提供了良好的表达体系。

Description

基因在间甲酚合成中的应用、质粒及菌株
技术领域
本发明涉及微生物合成领域，特别涉及基因在间甲酚合成中的应用、质粒及菌株。
背景技术
间甲酚适用于合成具有高市场价值的多种化学品，在工业上运用广泛。其主要用于农药中间体，生产杀虫剂，也运用于增塑剂和香料的中间体。因此高产量生产间甲酚对于工业生产具有很实用的应用价值。
由于间甲酚具有抗真菌和抗菌活性，它也被用作消毒剂和防腐剂(Puel等人，2010)。此外，作为精细化工行业中最重要的材料之一，它已被用于医药，农用化学品，香料和染料的生产。众所周知，间甲酚是维生素E，百里香酚，薄荷醇，巯基甲烷，倍硫磷，苄氯菊酯，抗氧化剂CA，二苯胺(DPA)，树脂增塑剂，压敏燃料和电子配子等的前体，因此可生产m-甲酚直接影响这些广泛使用的产品的供应和价格。对于间甲酚生产，主流技术包括从煤焦油中提取和化学方法，例如甲苯氯化水解法和异丙苯酸解法以获得甲酚。这些方法具有明显的缺陷，即，从邻，对和间甲酚的混合物中分离间甲酚的繁琐但必要的步骤，副产物，环境污染，低生产率和高成本。
间甲酚主要是通过化学方法从化石资源中生产的，必须采用额外的纯化步骤将其与邻、对甲酚混合物分离。由于化石资源储量的局限性和对绿色环境保护的关注，对甲酚的化学合成是不可持续的，因此需要由可再生资源进行生物技术生产。
许多青霉和曲霉菌可以天然合成间甲酚，由于其天然真菌宿主的产量低和遗传途径限制，产量较低。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了基因在间甲酚合成中的应用、质粒及菌株。将来源于棒曲霉的生物合成基因patk和patG，在构巢曲霉中进行共表达，得到菌株AnCR05，成功实现了间甲酚的异源表达，产量在摇瓶水平达到0.2g/L。通过构建不同排列组合的启动子的和基因，及增加基因拷贝数，构建了菌株AnCR16，使得间甲酚异源表达产量达到了2.0g/L。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了patk和patG的共表达在合成间甲酚中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，启动子选自amyB、gpdA或glaA。
本发明还提供了patk和patG的共表达、且patk和/或patG的过表达在合成间甲酚中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，启动子选自amyB、gpdA或glaA。
在本发明的一些具体实施方案中，patk与patG拷贝数的比例为(1～3)∶(1～3)。
在本发明的一些具体实施方案中，patK与patG拷贝数的比例为1∶1、2∶1、3∶1、3∶2或3∶3。
为了实现上述方案，本发明提供了包含patK和/或patG的质粒。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的所述质粒为pMC01质粒，包含patK。所述pMC01质粒的制备方法为：制作酵母菌种株BJ5464的感受态，向酵母感受态中转入pYTR载体和patK-up以及patK-dn质粒片段通过酵母组装得到pMC01质粒。所述patK-up质粒的制备方法为：以棒曲霉CGMCC No.3.6890的基因组DNA为模板，以01RK-F1(SEQ ID No.3)和01RK-R1(SEQ ID No.4)分别做为引物扩增得到patK-up质粒。所述patK-dn质粒的制备方法为：以棒曲霉CGMCC No.3.6890的基因组DNA为模板，01RK-F2(SEQ ID No.5)和01RK-R2(SEQ IDNo.6)分别做为引物扩增得到patK-dn质粒。pMC01质粒为pYTR的衍生物，在(BamHI/SwaI)位点插入基因patK。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的所述质粒为pMC05质粒，包含patG。所述pMC05质粒的制备方法为：制作酵母菌种株BJ5464的感受态，酶切后的pYTU载体和patG质粒通过酵母组装得到pMC05质粒。所述patG质粒的制备方法为：以棒曲霉CGMCC No.3.6890的基因组DNA为模板，05UG-F(SEQ ID No.11)和05UG-R(SEQ ID No.12)分别做为引物扩增得到patG质粒。pMC05质粒为pYTU的衍生物，在(PacI/SwaI)位点插入基因patG。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的所述质粒为pMC04质粒。由如SEQ IDNo.9～10所示的引物扩增patk片段，从而构建所述pMC04质粒。pMC04质粒为pYTP的衍生物，在(BamHI/SwaI)位点插入基因patk。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的所述质粒为pMC10质粒。由如SEQ IDNo.13～16所示的引物扩增patG，PgpdA和patk片段，从而构建所述pMC10质粒。pMC10质粒为pYTU的衍生物，在(PacI/SwaI)位点插入patG和PgpdA-patK。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的所述质粒为pMC11质粒。由如SEQ IDNo.17～18所示的引物扩增patk和PglaA片段，从而构建所述pMC11质粒。pMC11质粒为pYTP的衍生物，在(BamHI/SwaI)位点插入patk和PgpdA-patG。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的所述质粒为pMC12质粒。由如SEQ IDNo.19所示的引物扩增patG片段，从而构建所述pMC12质粒。pMC12质粒为pYTR的衍生物，在位点(BamHI/SwaI)插入patk和PglaA-patG。
此外，本发明还提供了转化有所述质粒的构巢曲霉工程菌株。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的菌株为AnCR05，转化有pMC01和pMC05，基因型分别为pYTR-patK和pYTU-patG。其中，菌株AnCR05中，patk与patG的拷贝数之比为1∶1。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的菌株为AnCR13，转化有pMC01和pMC10，基因型分别为pYTR-patK和pYTU-patG-PgpdA-patK。其中，菌株AnCR13中，patk与patG的拷贝数之比为2∶1。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的菌株为AnCR14，转化有pMC01，pMC10和pMC04，基因型分别为pYTR-patK，pYTU-patG-PgpdA-patK和pYTP-patK。其中，菌株AnCR14中，patk与patG的拷贝数之比为3∶1。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的菌株为AnCR15，转化有pMC01，pMC10和pMC11，基因型分别为pYTR-patK，pYTU-patG-PgpdA-patK和pYTP-patK-PgpdA-patG。其中，菌株AnCR15中，patk与patG的拷贝数之比为3∶2。
在本发明的一些具体实施方案中，提供的菌株为AnCR16，转化有pMC12，pMC10和pMC11，基因型分别为pYTR-patK-PglaA-patG，pYTU-patG-PgpdA-patk和pYTP-patK-PgpdA-patG。其中，菌株AnCR16中，patk与patG的拷贝数之比为3∶3。
基于上述，本发明所述质粒或所述构巢曲霉工程菌株在合成间甲酚中的应用。
本发明还提供了合成间甲酚的方法，经所述构巢曲霉工程菌株发酵，收集发酵液，纯化。
本发明以高产间甲酚的工业生产菌株为目标，将来源于棒曲霉的生物合成基因patK和patG，在构巢曲霉中进行共表达，得到菌株AnCR05，成功实现了间甲酚的异源表达，产量在摇瓶水平达到0.2g/L。
通过构建不同排列组合的启动子的和基因，及增加基因拷贝数，构建了菌株AnCR16，使得间甲酚异源表达产量达到了2.0g/L。
本发明构建的菌株为间甲酚的工业化生产提供了良好的表达体系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示间甲酚的生物合成途径；
图2示菌株AnCR05中主峰的质谱图；
图3示HPLC检测AnCR05的发酵产物及间甲酚标准品图；
其中，a.AnCR05发酵萃取产物和间甲酚的HPLC对比；b.发酵产物主峰的紫外吸收谱图；
图4示AnCR05中分离到的产物进行核磁鉴定的1H谱图；
图5示AnCR05中分离到的产物进行核磁鉴定的13C谱图；
图6示构巢曲霉工程菌株AnCR05、AnCR13、AnCR14、AnCR15、AnCR16发酵萃取产物的HPLC分析图。
具体实施方式
本发明公开了基因在间甲酚合成中的应用、质粒及菌株，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明以高产间甲酚的工业生产菌株为目标，将来源于棒曲霉的生物合成基因patk和patG，在构巢曲霉中进行共表达，得到菌株AnCR05，成功实现了间甲酚的异源表达，产量在摇瓶水平达到0.2g/L。
通过构建不同排列组合的启动子的和基因，及增加基因拷贝数，构建了菌株AnCR16，使得间甲酚异源表达产量达到了2.0g/L。
本发明构建的菌株为间甲酚的工业化生产提供了良好的表达体系。
间甲酚的生物合成需要一个迭代的聚酮化合物合酶(PKS，6-甲基水杨酸合酶，patK)形成6-甲基水杨酸(6-MSA)和一个脱羧酶(6-甲基水杨酸脱羧酶，patG)以消除CO2形成间甲酚(如图1所示)。
表1本发明中所有用到的引物
Figure BDA0002967942980000041
Figure BDA0002967942980000051
注：下划线代表与片段上游或下游与载体的同源的序列。
05UG-F/10UG-R2，10PgpdA-F/R，10GK-F1/01RK-R1，01RK-F2/03UK-R2，04PK-F1/01RK-R1，01RK-F2/11PK-R2，11PgpdA-F/10PgpdA-R以及08RG-F/02PG-R作为引物组合。
表2本发明中用到的质粒
Figure BDA0002967942980000052
表3本发明中涉及的菌株
Figure BDA0002967942980000053
Figure BDA0002967942980000061
本发明提供的基因在间甲酚合成中的应用、质粒及菌株，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1构建产间甲酚工业菌株所需的质粒pMC01(即pYTU-patK)和pMC05(即pYTR-patG)
1.棒曲霉(Aspergillus clavatus)基因组DNA的提取
棒曲霉(A.clavatus)CGMCC No.3.6890购买自中国普通微生物菌种保藏中心，以下简称为菌株3.6890。
取菌株3.6890培养3天的PDA固体平板(马铃薯粉20g，葡萄糖10g，琼脂粉20g，水1000mL.)，放置于-80℃冻20min，取出后刮取表面菌丝，蒸馏水洗涤两次后冷冻干燥并保存于-20℃。使用液氮预冷的研钵将冻干的菌丝体研磨成细粉，重悬于500μL的裂解缓冲液(40μmol/L Tris-乙酸盐，20μmol/L乙酸钠，1μmol/L EDTA，1％w/v SDS，pH 7.8)中，移液枪吸打直至悬浮液的粘度显着降低且形成泡沫。加入RNA酶A并在37℃孵育5分钟，再加入165μL的5μmol/L NaCl溶液并混合。13000rpm离心20min，立即将上清液转移至新试管中，并加入400μL的氯仿和400μL的苯酚。轻轻颠倒试管直至溶液变成乳状。离心20分钟后以除去水相，并用等体积的氯仿萃取。用两个体积的95％乙醇沉淀上清液中的DNA。沉淀的DNA用70％冰冷的乙醇洗涤3次，干燥并溶解在50μLTE缓冲液(10μmmol/L Tris-HCl，0.1μmmol/L EDTApH7.8)中，并保存在-20℃。
2.目的片段的扩增
根据菌株3.6890中间甲酚生物合成基因序列设计扩增patk和patG序列的引物，用于后续pYTR-patK、pYTU-patG质粒的构建。这两个基因序列可在National Center forBiotechnology Information(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索到：
patk(ACCESSION XM_001273092，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/XM_001273092.1？report＝genbank&log$＝nucltop&blast_rank＝1&RID＝1W2170WP013)；
patG(ACCESSION JN698985，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/JN698985.1？report＝genbank&log$＝nucltop&blast_rank＝1&RID＝1W2B7JGR01R)。
设计相应的引物扩增片段并用于构建pYTR-patK、pYTU-patG质粒。引物序列如下(下划线表示基因与载体连接处，位于载体的部分序列)：
表4
Figure BDA0002967942980000071
以菌株3.6890的基因组DNA为模板，01RK-F1/R1和01RK-F2/R2分别做为引物扩增得到patk基因上的上半部分和下半部分片段。所述上半部分和下半部分的分界点是01RK-F2的序列，即此序列上游均为patK上半部分(patK-up)，此序列下游均为patK下半部分(patK-dn)。
以菌株3.6890的基因组DNA为模板，05UG-F/R分别做为引物扩增得到PYTU-patG质粒。
PCR扩增体系如下：
表5
无菌水 33.5μL
5×buffer 10μL
dNTP(10mM) 1uL
Q5enzyme 1uL
引物F 1.5μL
引物R 1.5μL
模板 1.5μL
总体积 50μL
PCR扩增条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，33个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
3.pYTR和pYTU载体的提取
使用全式金质粒小提试剂盒(Trans EasyPure Plasmid MiniPrep Kit)提取pYTR和pYTU载体，具体步骤如下：
a.合有pYTR和pYTU载体大肠杆菌分别过夜培养，取2-4mL菌液，10000rpm离心1min，尽可能倒干净上清液。
b.向收集的菌体中加入250μL的RB溶液(含RNase A)，漩涡震荡直至菌体完全重悬。
c.向离心管中再加入250μL的LB溶液，离心管上下颠倒5-6次，室温静置3-5min。
d.向离心管中加入350μL的NB溶液，离心管上下颠倒4-6次，室温静置2min。
e.最大转速离心10min，小心吸取上清加入到离心柱中，10000×g离心1min，倒掉收集管废液。
f.向离心柱中加入650μL的WB溶液(使用前需先加入80mL无水乙醇)，12000×g离心1min，倒掉收集管废液。重复一次。
g.将离心柱放入干净的1.5mL离心管中向离心柱中加入40μL的EB溶液或无菌水(60-70℃下预热)，室温静置2min。
h.12000×g离心1min，将离心管放于-20℃保存。
4.载体的酶切以及载体和目的片段的回收
pYTR载体使用SwaI和BamHI两种内切酶酶切，酶切缓冲液为NEBuffer 3.1。
pYTU载体使用SwaI和NotI双酶切，酶切缓冲液为NEBuffer 3.1。
其中SwaI酶切温度为25℃，BamHI和NotI酶切温度为37℃，酶切时间均为4h。酶切体系如下：
表6
pYTU/pYTR载体 5μg
10×buffer 2uL
内切酶 2uL
无菌水 补足至20μL
总体积 20uL
酶切后的载体和目的片段均使用OMEGA试剂盒(Gel Extraction Kit)回收。具体步骤如下：
a.将切下的凝胶块放入2mL离心管中，加入等体积的Binding buffer(XP2)，在60℃下加热直至凝胶完全溶解。
b.将溶液转移至DNA结合柱中，12000×g离心1min，倒掉收集管废液。
c.向DNA结合柱中加700μL SPW Wash Buffer(SPW Wash Buffer使用前需加100mL乙醇)，12000×g离心1min，倒掉收集管废液。重复一次。
d.空的DNA结合柱放入收集管，12000×g离心2min。
f.将DNA结合柱放入干净的1.5mL离心管中，加入15-30mL的EB缓冲液或蒸馏水(65℃预热)，室温静置2min。
g.12000×g离心1min，装有DNA的离心管放于-20℃保存。
5.酵母组装得到含有质粒pMC01和pMC05的酵母转化子
5.1.酵母感受态制备
制作酵母菌种株BJ5464-NpgA(MATα ura3-52 his3-Δ200 leu2-Δ1 trplpep4：：HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL)的感受态，感受态制备参照试剂盒：Zymo research-YeastTransformation II Kit Catalog No：T2001
详细步骤：
(1)30℃，220rpm，接15μL酵母菌体于10mL YPD培养酵母至对数期，培养18-22h，到OD600处于0.8-1.0；
(2)室温，500g离心4min收集酵母；
(3)室温，5mL EZ 1 solution清洗酵母沉淀，500g离心4min收集酵母；
(4)室温，5mL EZ 1 solution再次清洗酵母沉淀，500g离心4min收集酵母；
(5)室温，1mL EZ 2 solution重悬酵母沉淀，25μL每支分装，装入塑封袋，注明名称和时间，直接冻存于-70℃或者更低，得酵母感受态并储存备用。
5.2.酵母同源重组的转化子
(1)室温融化酵母感受态；
(2)向一份25μL酵母感受态中加入0.5μg的pYTR载体、patK-up、patK-down片段，向另一份25μL酵母感受态中加入0.5μg的酶切后的pYTU载体和patG片段。
(3)30℃，孵育1个小时，期间每15分钟votex振荡混匀一次；孵育时间可延长到2小时。
(4)将转化体系全部涂布到UDMS培养基上(0.5Bacto technical grade casaminoacids；2g dextrose；2g agar；add 10mL 10x nitrogen base stock.1mL Trp stock，1 mLAde stock 100mL DI water)，30℃，培养2-4天。
5.3.转化子鉴定
挑取4-5个转化子进行鉴定，鉴定采用菌落PCR的方式。每一个克隆转接1x1cm2转板，一天后，将扩大培养的酵母单克隆转化子进行PCR菌落验证。
酵母菌落PCR菌体预处理方法：
(i)配制试剂：0.2mM乙酸锂溶于1％SDS溶液、100％乙醇、70％乙醇
(ii)步骤：
从平板上刮取酵母单克隆于1.5mL EP管中，将细胞悬浮于100μL溶于含有1％SDS的0.2mM乙酸锂溶液中，70℃孵育5min；
再往1.5mL EP加入300μL96-100％乙醇，涡旋仪混匀；
1.5mL EP放入离心机中，转速15000g，离心3min；
将上清倒掉，往1.5mL EP的沉淀中加入200μL70％乙醇洗涤残余物，离心机使用15000g转速离心2-3min，弃上清，将沉淀物在65℃烘箱5min，使乙醇挥发；
最后，用15μLH2O重悬残余物，在涡旋仪上充分混匀，离心机使用15000g转速，离心15s。
取1μL上清做PCR模板进行质粒组装验证：
pMC01质粒使用pYTR-SF/SR引物测序；pMC05质粒使用pYTU-SF/SR引物测序，引物序列如下：
表7
Figure BDA0002967942980000091
Figure BDA0002967942980000101
测序得到的序列与目标序列比对，序列一致则表示构建的质粒正确。
5.4.酵母质粒抽提
将鉴定正确的质粒pMC01和pMC05，从1x1cm2平板上刮取酵母，提取过程参照试剂盒：Zymo research Zymoprep II Yeast Plasmid Miniprep II Kit Catalog No：D2004
5.5.将酵母质粒导入到大肠杆菌Top10中进行质粒扩增
质粒扩增使用商业化大肠杆菌Top10，转化方法如下：
从-80℃冰箱中取出Top10的化学感受态，放到冰上解冻；
加入10μL组装液，轻轻晃动混匀，冰上放置30min；
放入42℃水浴中60-90s，取出后放到冰上2min；
加入200μL LB培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl)，放到37℃的摇床中孵育1h；
将培养基涂布到含100μg/mL氨苄抗性的LB固体平板上，过夜培养；
将长出来的克隆用含100μg/mL氨苄抗性的LB液体培养基培养12h，提质粒pMC01和pMC05质粒。
5.6.质粒pMC01和pMC05的验证
将提取的质粒寄到测序公司测序，pMC01质粒使用pYTR-SF/SR引物测序；pMC05质粒使用PYTU-SF/SR引物测序，引物序列同表7。
测序得到的序列与目标序列比对，序列一致则表示构建的质粒正确。
实施例2将pMC01和pMC05质粒转化进构巢曲霉
1.构巢曲霉原生质体的制作方法如下：
A.nidulans A1145(ΔSTΔEM)菌种涂布或者划线于合0.5μg/mL pyridoxineHCl，0.125μg/mL riboflavin，10mM urdine的固体CD培养基，37℃，4天左右，待长满平板后，用2mL 0.1％Tween-80；固体CD培养基配方为20g/L胰蛋白；50mL/L 20x硝酸盐；1mL/L微量元素；20g琼脂；溶解于1L水中。
棉签刮取半个平板左右的孢子，使用孢子过滤器过滤。将孢子接种到合0.5μg/mLpyridoxine HCl，0.125μg/mL riboflavin，10mM urdine的100mL液体CD培养基，镜检孢子浓度约为107个/mL。液体CD培养基配方为20g/L胰蛋白；50mL/L 20x硝酸盐(120gNaNO3；10.4g KCl；10.4g MgSO4·7H2O；30.4g KH2PO4溶解于1L水中)；1mL/L微量元素(2.20gZnSO4·7H2O；1.10g H3BO3；0.50g MnCl2·4H2O；0.16g FeSO4·7H2O；0.16g CoCl2·6H2O；0.16g CuSO4·5H2O；0.11g(NH4)6Mo7O24·4H2O；5.00g Na4EDTA。用1M KOH将pH值调节至6.5，摇床培养条件为37℃，250rpm。萌发孢子6.5h，孢子萌发的最好状态是菌丝体长到3倍于膨胀孢子大小，孢子先聚集后萌发。
使用离心机8000rpm转速离心培养基中的菌丝，加入15mL Osmotic Medium(1.2MMgSO4、10mM NaPO4，pH 5.8)，重复洗涤3次。
加入10mL的混合酶解液(30mg Lysing Enzyme，20mg Yatalase溶解在10mLOsmotic Medium buffer中)，30℃，80rpm摇床中培养，显微镜观察菌丝酶解情况，酶解好的原生质体约为孢子体积的两倍，形态均一，呈现薄壁状态。酶解时间一般在约2.5h。
加入3倍体积STC buffer(1.2M山梨糖醇；10mM CaCl2；10mM Tris-HCl，pH 7.5)，5000rpm离心10min，去除液体。
加入少量STC buffer重悬，使原生质体浓度约为108-109个/mL，分装到1.5mL离心管中，每管100μL。以上所有操作均在冰上或4℃。
2.将pMC01和pMC05质粒共同转化构巢曲霉原生质体
步骤如下：
取pMC01和pMC05质粒各5μg，一起加入到100μL原生质体中，轻轻混匀，于冰上放置60min。
加入1.25mL 60％PEG Solution(60％PEG 4000；50mM CaCl2；50mM Tris-HCl，pH7.5)，用移液枪轻轻混匀，室温放置20min。
轻柔涂布于含0.5μg/mL pyridoxine HCl的Solid CD-Sorbitol Medium(10g/L葡萄糖；50mL/L 20x硝酸盐；1mL/L微量元素；1.2M山梨糖醇；20g/L琼脂)平板，混匀涂布过程务必轻柔。37℃E置培养1天，再倒置培养1-2天，待克隆长出得构巢曲霉工程菌株AnCR05。
3.构巢曲霉产物鉴定
取单克隆转化子至含0.5μg/mL pyridoxine HCl的Solid CD Medium，37℃培养转化子菌株用于保种；
上述步骤取菌体接种到含0.5μg/mL pyridoxine HCl的Liquid CD-ST Medium的液体培养基中，37℃，250rpm，培养三天；萃取检测产物，能产间甲酚的菌株为构巢曲霉工程菌株AnCR05。
实施例3构巢曲霉工程菌株AnCR05检测间甲酚
工程菌株AnCR05间甲酚的检测
将验证正确的菌株AnCR05接种(108个/mL的孢子悬液，接种100μL)到50mL的液体CD-ST培养基(20g/L淀粉；20g/L胰蛋白；50mL/L 20x硝酸盐；1mL/L微量元素；将pH调节至6.5)培养基进行发酵，培养箱设置37℃、250rpm，在摇床培养3天后取样。
取50mL发酵液，菌丝和上清液分别用乙酸乙酯萃取检测3次，合并有机相。30℃旋转蒸发至完全干燥，加入300μL甲醇溶解。0.22μm滤膜过滤，使用高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)检测间甲酚。
间甲酚LC-MS检测条件：在Agilent-1200HPLC/6520QTOFMS(USA)系统上进行LC-MS分析，流动相为乙腈(v/v，0.1％甲酸)和水(v/v，0.1％甲酸)，流速0.8mL/min。0-15min，5％-95％乙腈；15-20min，95％乙，腈。进样量5μL。Q-TOF使用双重ESI作为离子源接口，并且ESI源以正电离模式运行。扫描范围是m/z 100-1000。得到的样品质谱图(图2)，与间甲酚标准品一致。
HPLC分析条件为：0-25min，5-95min乙腈(含0.1％甲酸)，流速1.0mL/min，进样量5μL。保留时间为13.67min的峰，与间甲酚标准品保留时间一致(图3a)，紫外吸收特征峰为199nm，211nm，227nm，271nm(图3b)。
为进一步鉴定AnCR05产生了间甲酚，我们将发酵萃取产物中的主峰分离出来，做了核磁鉴定(图4、图5)，经鉴定后，确定分离出的产物是间甲酚。
通过HPLC分析测量的标准曲线计算间甲酚的定量：
用半-半稀释法分别稀释200.0mg/mL的间甲酚标准品，并用0.22μm膜过滤。对每个样品进样5μL进行HPLC分析，并在265nm处检测。每次分析后，用MeOH清洗进样针。样品浓度设置为x(＝0，20，40，80，100，150，200mg/mL)，HPLC显示265nm下间甲酚的峰面积设置为y，得到间甲酚的回归方程，y＝1×106x-519009(R2＝0.9924)，线性范围为0-50.0mg/mL。
样品浓度如果超出线性范围，稀释样品。
通过HPLC分析发酵提取物，然后计算间甲酚产量。每个样品设置三个平行，误差线代表计算的标准偏差。
发酵的LC-MS检测结果显示，构巢曲霉菌株AnCR05产生了间甲酚，产量达到736.2mg/L。
本发明还针提高间甲酚的产量进行了启动子的优化和基因拷贝数的优化。使用了amyB、gpdA和glaA三个启动子，重复组合的分配给patK/G两个基因；以及patK∶patG＝1∶1，2∶1，3∶1，3∶2，3∶3的基因拷贝数优化，分别得到736.26，854.59，1102.91，1110.12，1290.43mg/L的间甲酚。对应的HPLC谱图如图6所示，计算所用原始数据表8所示。
表8构巢曲霉工程菌株AnCR05，13-16发酵萃取产物中间甲酚峰产量数据(每个实验组做三个重复)
Figure BDA0002967942980000121
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 基因在间甲酚合成中的应用、质粒及菌株
<130> IM2021013I
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5521
<212> DNA
<213> patK
<400> 1
atggaatctt cagctacatc ttcacgtcct tcacggggaa cttctcctcc ttctctagac 60
actccaggaa ccgagcacag tgaattcgtg agagacactg ggactacaca ccaagaacgc 120
ggaatgctaa ctgacgggct aggaattctc caacgatgtc gccgtggtag ggattggctg 180
ccgagtggct gggggcaacc acagccccga acaactatgg caatccctca tggacaagca 240
gagcgcctcg ggcgagatac ccgccatgcg ctgggagcca taccatcgac gggatcccag 300
aaacgccaag gagctcagca agacgacctc gcgtggttac ttcctggacc atctcgagga 360
ctttgacagt cagttcttcg gtatctcgcc caaggaggcg gagcagatgg atccccaaca 420
gagaatctcc cttgaggtgg cctgggaggc acttgaggat gctggcattc ccgcgaaagg 480
cctgtcgggg agcgacactg ctgtcttctg gggcgtcaac tcagatgact actccaagct 540
ggtcttggag gatctgccta acatcgaagc gtggatgggc attgggaccg cgtactgcgg 600
tatacccaac cgaatctcct atcacttgaa cctcatgggt cctagtacgg cggtcgacgc 660
tgcctgtgct tcgtccctcg tcgccatcca tcacggtgtc caggccatcc agctcggcga 720
gtccaagatt gccattgttg gcggagtcaa cgctctctgc ggtccgggtc tgaccagagt 780
gttggacaag gccggcgcaa tctcctccga aggcttctgc cggtcctttg acgacgaggc 840
aaaggggtat ggccggggtg agggcgccgc cgccatcatc ctgaagaacc tctcccgcgc 900
cattaacgac aaagatcgca tcctcgctgt catcaagggc agtgccgtcg cgcaagacgg 960
caagacgaat ggcatcatgg ccccgaacgc gaaagctcag cagctggtgg cccagaatgc 1020
tctagcagtc ggcaacatcg atcctctcac cgtccgatac gtagaggctc acgccacctc 1080
aactccgctg ggcgacccaa cggagatctc tgctattgcc gcagtatatg gcgttggacg 1140
ggattctcaa gacccttgct tcatcgggtc catcaagccc aacatcggcc acctggaagc 1200
cggcgcagga gccatgggtt ttatcaaggc gaccctggct atccgcaagg gtatcttgcc 1260
tccccaggcg aatctgaaca agcttaacag ccgcatcgac tgggataagg caggagtcaa 1320
ggttgttcag gaggcgacca agtggcccga gacggacacc attcgtcgcg cgagtatctg 1380
ttcgtacgga tacggtggca ccgtctccca cgcggtcatt gagcaattcc tccccctgtc 1440
cggactagag tctttgcaaa cacagtcccc agatggcccg ggtgtcctac ttctgtctgg 1500
cccccagcag aagcgcctgt ctgttcaagc agagacccta cggaaatgga ttgcccagga 1560
cggacgcaac cacgacttgt ccagcgtcct gaccacgtta gccacccgaa gagaccatca 1620
cgactatcgc gccgctatgg tggtagagag ccacgacgac gcagaaacag ccctggaggc 1680
cctggccaag ggagccgatc atcctcttgt cgcacagggt cgtgtgctcg gcactgacat 1740
ccggaaggac gtggtttggg tgttctccgg ccacggcgcg cagtggactg atatgggcaa 1800
ggagctactc aacaaccccg tcttctaccg cgccatccag ccactcgacg agctggtcca 1860
agccgaaatt ggcctgtcgc ccatagagat gctcctgacg ggcgatttcg attcctcgga 1920
tcgcgtccag atcctcacgt acatcatgca gattggtatc agcgctgtcc tgaagagcaa 1980
cggggtcttc ccccaggcta tcattggaca ctctgtcgga gagatcgctg ccagtgtcgt 2040
ggcaggagct ctgacgccgg cggagggtgc gctgattgta acccgccgag cggcgctgta 2100
tcgtcgcgtc atgggccagg gcggcatgat cctcgtcaac ctccctgcta gtcaggtcga 2160
gcaggaattg ggccagcggg aggacctggt cgtggctatt gagtcgtccc cgtcttcctg 2220
tgtggtcgct ggagatagag atgtcgtggc ccaggccgca gaaagcttca aagagcgcgg 2280
cgtcaagact ttcaccgtca aaaccgacat tgcgttccac agtcccacat taaatggatt 2340
gatcgatccg atgctcgaag cgctcgcgga ggatctggcg cccagcacac ccactgtccg 2400
tctgttctct acctcacttg tcgatccccg cggccaagac ctgcgcgata ttcactactg 2460
gaccaacaac atggtgaacc gcgtccgtct tacttctgct gtcaacgccg cggtcgaaga 2520
gggataccgt atcttcctgg aagtttccag ccacccggtg gtcactcact cgatcaatga 2580
gacgctgatg gatggtgggt tggaagactt cgctgtcatc cctactttac tacgccagaa 2640
gccgacggag aagcacatcc tctacagcat tgcacagctg cactgtcgag gcgccgaggt 2700
cgactggaag gctcaactgc cggggccctg ggcggacgga ctgcccacga ccacctggat 2760
gcacaagccc atctggcgga agatcgaaag cgctccgcta catacgggcc tcacccacga 2820
cgtcgagaag cataccctgc taggccagcg cattggcatt gcgggcacca atacaaccgt 2880
ctacacgacc cgattggaca acgacacgaa gccgttcccc ggtagccatc ccttgcacgg 2940
aacggagatt gtgcccgctg ctggcctgat taataccttc atgaagggta ctggcggacg 3000
caggctgcag aatgtcgtgc tgcgagtccc cgtggccatt aacgcgcctc gttctgtcca 3060
ggttgtggtg caagaggacc aagttaagat catgtcccgt ctgctttcag acacgccaca 3120
ggccacggag gatgactcgt cgtgggctac ccataccacc gcgtactggg cgcgggatat 3180
ccaagaggct gtggacccaa tcgacatcgc tgctgtgaaa aagcgcctgg gaacccgaat 3240
ccgggacgac ttctccatca actacctcga ccaggtcggt gtctcggcca tggggttccc 3300
atgggccatc acggagcact accacaagga caaggagatg atcgcccgtg tggacgtcaa 3360
cccggccgtg accggggacg cgcctctccc ctgggactcg tcctcgtggg caccaattct 3420
cgacgctgct acctccgttg gctcgaccgt gtttggcacg ccggcccttc gcatgcctgc 3480
tcagatcgac cgcgtggaca ttttcacctc gcaagatcca cccaagatcg gctggctgta 3540
tgttgaggat gcctcggacg cggctcctac ctcccatgtt agtgtcctga acgaggctgg 3600
cgaggtcgtt gcgaagttca ccgcgatgcg gttttccgag attgaaggca ccccgggtgt 3660
cagcggtagc atggagagtc tggtgcacca gctggcctgg cccccggcta ctcctgcgga 3720
agagcccctg tccatcgaca cagtccttct ggtttcgtcg gatgccgcaa cgatgcgcca 3780
gtacgccaac accattccca ggggcgtcag atcgttcgaa ttctcgagcg tccaggacct 3840
tatcagccag gacaagtcag gtctgcgact cgacaagggc actgcggttg cttacatccc 3900
cggcgaagtt cagtctctgg aggagatccc cgctgcatcc gaatctttca cctgggaggt 3960
gctggagctg gtcaaataca tcgtcaaggg cggtctccct ctgaaggcgt tcatcctgac 4020
atccaatgtg ggcagtggtg agaccccaac tgcactagct caggcccctc ttttcgggct 4080
ggcgcggatc atcgccagcg agcatcctga cctcggatgc ctgatcgata gcgagaatcc 4140
cgtgtttccc ttgacggcca tgcgatacat ccagggcgcg gacgtcatcc ggatcaacga 4200
cgacgtcgct cgcacagcac gtcttcgcag cctaccacgc aacaagctcc atcccgccag 4260
ccagccgcca cgcctcctgc cccggtccga gggcacatac ctcatcacgg gcggactcgg 4320
cgtcctcggt cttgaaacag cagacttcct cgtcgaaaat ggcgcacgcc ggctcatcct 4380
gatctcccgc cgcgccctcc cgccgcgccg cacctgggac gcagccccaa gcgacctcca 4440
acccactctc gccaagatcc gcaacctcga gtcccgcggc gcgacagtcc acatcctgcc 4500
cctcgacatc agccaccctg ccgcagcaac ccagctctcc actgccctcg acaccctgtc 4560
tctgcccccc gtcctcggcg tcgtccacgc cgccggcgtc ctcgacaacc aactgatcct 4620
cgaaacgacc cgcgacgcct tcacacgcgt cctcgcgccc aagatcgccg gcgcgctcgc 4680
cctccacgcc gtcttccccc cgaacaccct cgacttcttc ctcctcttct cctcctgcgg 4740
caacctcttc ggcttcccgg gccaggcgtc gtacggcgcc ggcaacgcct tcctggatac 4800
cctggccacg caccgcgcgc ggctcggcga cgccgccgtc gcggtgcagt ggacctcgtg 4860
gcgcgggatg ggcatgggcg cgagcaccga gttcatcaac gccgagctcg agtccaaggg 4920
catcacggac gtcacccgcg acgaggcctt cggcgcctgg ctgcatctcg cgcggtatga 4980
catcgaccac ggcgtggtgc tgcgcagtct cgccttcgac gagggcgagc ctctccccgt 5040
ctccatcctg accgatatcg ccgtgcgccg ggtgggtgtc gccgctgcgg gtgacgtgcc 5100
tggcaccgct gctgctggcg gcgcggacgc gatcccctcc tccggtccgg agctgaaggt 5160
ctaccttgat gagaagatcc ggggctgtgt ggcgaaggtc ctccagatgg gagcggagga 5220
tgtcgactcc aaggcggcgc tggcggattt gggggttgac tcggtcatga cggttagttt 5280
gcggcggcag ctgcagcaga cgctcaaggt gaaggtgccg tcgacgttga cctggagtca 5340
tcccacggtc agccatttgg tgggctggtt tgctgagaag gttgggaagt gaagggacgg 5400
actggtcttg atgtgatcat gaacttgttt ccctcaaatt ttgttgatgt tttttttttg 5460
gctttgtttt ttgccttttg tcttcgttgt ttagatatct atactgcagc acgtagaatg 5520
a 5521
<210> 2
<211> 1061
<212> DNA
<213> patG
<400> 2
atggcaaaga ttgacgtgca ccatcatttc tatcctcagg ccatgcgcga aggtgagaac 60
aatcttggat tccatacata catacataca tagatatata tatatatatg ctgacctcgt 120
ttcctgcgtt tccagctctt gagcgcgcgg gaggagatcc ttctgggtgg tatattccac 180
cctggacctt ggatctggac aaggagattt ctcgcgtgct gaaagtgcaa accaccatcc 240
tctccgtaac cgccccaggt cccggcatcg aaacagatcc aggcaaagca gcggcgctag 300
ctcgtctctg caacgaagag gcggcggcaa ttagagacgc tcaccccctc cagtacggct 360
tcttcgcctc cgtgccatct ctcttcgaca ccgccgccgt gctggcggaa atcgagcacg 420
cattcaccaa tctccacgca gacggagtca ctctctacac ccgctacgga gcaggacaca 480
gctatctcgg cgatgaacgc ttccggccca tttgggcgga gctgagcaag cgccgcgccg 540
tggtcttcat ccaccccacc cacgccgtcg acacgcagtt gatcaactcc tggatgccgc 600
agcccatgtt cgactaccca cacgagaccg gccgcaccgc catggatctg ctcacccgcg 660
gtgtcatccg ggactatccc ggctgcaaga tcatcctgtc gcatgcgggc gggacgctgc 720
cgtatttgat ccatcgcgcg gcgacaatgc tgcccttcat gcctcggaat ctggggatgt 780
cgagggaaga gatcgtggag gcggcgcgta cgttttactt cgataccgcg atttcggcga 840
atccggtgac gttgaaggcg ctgcttgagt ttgcgaagcc tgggcacgtg ttgtttggga 900
gtgacttccc caatgcgcca cggggtgcga tcacgcattt cacgagcttt ctcgagggat 960
atgataacat gtccgaggag acgcggaggc tggtggaaag ggaggcggcg ctggagctgt 1020
ttcctcgact tcggggccag tcgactcggg cttgtctctg a 1061
<210> 3
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acatagacac atctaaacat taattaagga tccatggaat cttcagctac atcttcacgt 60
c 61
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcacgaca ttctgcagcc tgcgtccgcc agtacccttc atgaag 46
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttcatgaag ggtactggcg gacgcaggct gcagaatgtc gtgctg 46
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tatcatcgaa agggagtcat ccaatttaaa tcgataaacg acaaaagtga tatattgcaa 60
gag 63
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taaaccccac agaaggcatt tttaattaag gatccatggc aaagattgac gtgcaccat 59
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagacccaac aaccatgata ccaggggatt taaattaacg atagaactgc gggatagta 59
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccccacagaa ggcattttta attaaggatc catggaatct tcagctacat cttcacgt 58
<210> 10
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccaacaacc atgataccag gggatttaaa tcgataaacg acaaaagtga tatattgcaa 60
ga 62
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agcatcatta cacctcagca ttaattaaat ggcaaagatt gacgtgcacc 50
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacatacccg taattttctg ggcatttaaa ttaacgatag aactgcggga tagtagtcga 60
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
taacgataga actgcgggat agtagt 26
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acacctgatc gactactatc ccgcagttct atcgttaact ccggtgaatt gatttgggtg 60
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggatccttaa ttaatgttta gatgtgtcta tgt 33
<210> 16
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acatagacac atctaaacat taattaagga tccatggaat cttcagctac atcttcacgt 60
c 61
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgataaacga caaaagtgat atattgcaag aga 33
<210> 18
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tctcttgcaa tatatcactt ttgtcgttta tcgactccgg tgaattgatt tgggt 55
<210> 19
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cttgcaatat atcacttttg tcgtttatcg cctgatcttc cgaactggtc gt 52
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctcctctcgt ctcctcacga ag 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgatcaaacg agccagactc ct 22
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggctgaagtg cttcctccct ttta 24
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ttaatgagct tcaaattatc gattgt 26

Claims (4)

1.一种包含patK和patG的质粒组合物，其特征在于，所述质粒组合物由3个质粒组成，所述质粒均包括AMA1自主复制子以及patK和patG基因，所述质粒组合物中patK与patG拷贝数的比例为3:3，启动子选自amyB、gpdA或glaA；所述patK基因如序列1所示和所述patG基因如序列2所示。
2.包含如权利要求1所述质粒组合物的构巢曲霉工程菌株，其特征在于，所述菌株不能合成sterigmatocystin和emericellamide。
3.如权利要求2所述构巢曲霉工程菌株在合成间甲酚中的应用。
4.合成间甲酚的方法，其特征在于，经如权利要求2所述构巢曲霉工程菌株发酵，收集发酵液，纯化。
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