KR100945483B1

KR100945483B1 - ｐｉｋＤ 조절유전자의 발현벡터를 이용한 스트렙토미세스베네주엘라에（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）에서폴리케타이드（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）의 생산성 증가방법

Info

Publication number: KR100945483B1
Application number: KR1020070107787A
Authority: KR
Inventors: 윤여준; 정원석; 정순정; 박성렬; 박제원
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2007-10-25
Filing date: 2007-10-25
Publication date: 2010-03-05
Also published as: KR20090041971A

Abstract

본 발명은 스트렙토미세스 베네주엘라에(Streptomyces venezuelae)에서 유용한 생리활성물질인 폴리케타이드의 생성 증가방법에 관한 것으로, pikD 조절유전자 발현벡터를 제조하고 이를 부가적으로 주입함으로써, 스트렙토미세스 베네주엘라에에서 이종 틸락톤(tylactone; TL)과 데소사미닐 틸락톤(desosaminyl tylactone; DesTL)의 생성을 증가시켜 pikD 조절유전자의 이종 폴리케타이드의 생성을 위한 적용가능성에 관한 것이다. 본 발명은 생육속도는 높으나 이종 매크로리드의 생산성이 낮은 스트렙토미세스의 생산성을 높이는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, pikD 유전자를 이용한 발현벡터를 제공함으로써, 향후 데소사미닐 매크로리드와 하이드록실화된 신규한 화합물을 효율적인 방법으로 생산할 수 있게 하므로, 식품, 약리학적으로 매우 뛰어난 발명이라 할 것이다.

스트렙토미세스 베네주엘라에, pikD, 폴리케타이드, 매크로리드, pYJ276

Description

ｐｉｋＤ 조절유전자의 발현벡터를 이용한 스트렙토미세스 베네주엘라에（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）에서 폴리케타이드（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）의 생산성 증가방법{An enhancing method of the polyketide production in streptomyces venezuelae using the expression vector of pikD regulator}

본 발명은 스트렙토미세스 베네주엘라에(Streptomyces venezuelae)에서 유용한 생리활성물질인 폴리케타이드의 생성 증가방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 발육성장속도는 빠르나 이종물질의 생산성이 낮은 스트렙토미세스 베네주엘라에의 개선을 위하여, 피크로마이신 등의 매크로리드(macrolide) 생합성에 필수적인 pikD 조절유전자 발현벡터를 제조하고 이를 부가적으로 주입함으로써, 스트렙토미세스 베네주엘라에에서 이종 틸락톤(tylactone; TL)과 데소사미닐 틸락톤(desosaminyl tylactone; DesTL)의 생성을 증가시켜 pikD 조절유전자의 이종 매크로리드의 생성을 위한 적용가능성에 관한 것이다.

폴리케타이드(Polyketide)는 카르복실산들이 연속적으로 축합되어 만들어져 매우 다양한 구조적 특성을 나타내는 2차 대사산물의 그룹으로, 항균, 항진균, 구충, 항암 및 농약 제재 등 약리학적으로 매우 중요한 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.

현재까지 발견된 폴리케타이드 중 가장 작은 구조를 갖는 것은 8개의 탄소로 이루어진 6-메틸살리실산(methylsalicylic acid, 6-MSA)으로 곰팡이에서 생산되며, 가장 커다란 구조를 갖는 것은 조류에서 생산되는 50개의 탄소로 구성된 브레베톡신(brevetoxin) 등이 있으며, 이 중 스트렙토미세스(Streptomyces)에서 가장 많은 종류의 폴리케타이드가 생산되고, 항암제와 항생제를 포함하는 생리 활성 물질로서 상품화 되어 있다.

폴리케타이드는 크게 3가지의 형태로 나눌 수 있으며, 이는 폴리케타이드 화합물의 생합성 과정에서 중요한 역할을 하는 효소인 폴리케타이드 생합성 효소(PKS)를 코딩하는 유전자의 구성 및 생합성 과정에 반응하는 효소의 특성에 따라 타입 I, II 및 III로 구분할 수 있다.

이러한 유용한 폴리케타이드 천연물질의 생합성에 관련된 클로닝되고 서열이 밝혀진 유전자의 수가 증가함에 따라, 원시 폴리케타이드 생산자의 유전적 조작의 어려움으로 인해, 유전적 및 생리학적으로 잘 규명된 숙주(host)에 의한 이종 폴리케타이드 생산에 많은 관심이 집중되고 있다.

미생물로부터 유용한 산물을 높은 수율로 생산하는 것은 산업적으로 매우 중요하며 특히 방선균에서 다른 균종에 비해 활발하게 응용되고 있다. 왜냐하면 미생물에서 발견된 12,000여종의 항생물질 중 약 60% 이상이 방선균으로부터 유래되었 으며, 각종 효소들의 생리활성물질의 보고라고 일컬어질 만큼 산업적으로 매우 중요한 미생물이기 때문이다.

따라서, 목적 화합물을 높은 수율로 생산하거나 후속 조합적 생합성 시도를 위한 기준을 제공하기 위하여 보다 다루기 쉽고 건강한 이종 숙주로 생합성 유전자를 전이시키는 방법이 실용적 대체수단으로 부각되고 있다.

최근 들어, 스트렙토미세스 세오리컬러(Streptomyces ceolicolor) 및 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans)를 포함한 몇몇 잘 알려진 방선균 이종 숙주 중에서도, 스트렙토미세스 베네주엘라에(Streptomyces venezuelae)가 유전조작이 쉽고, 다른 스트렙토미세스 종과 비교하여 볼 때 빠른 성장특성으로 인해 대사산물의 생산을 위한 배양기간이 3 내지 4일로 짧기 때문에 유망한 숙주로서 개발된 바 있다.

또한, 이들이 특이한 기질 유연성을 가지는 post-PKS tailoring (polyketide synthase tailoring; 폴리케타이드 합성효소 테일러링) 효소인 2개의 DesVII 글리코실트랜스퍼라제(DesVII glycosyltransferase) 및 PikC P450 모노옥시제나제(PikC P450 monooxygenase)를 가지고 있다는 점에서 신규한 화합물의 조합적 생합성을 위한 이종숙주로서의 또 다른 장점이다.

하지만, 스트렙토코커스 베네주엘라에(S. venezuelae)를 경쟁력있는 이종 숙주로 개발하는데 있어 중요한 걸림돌 중 하나는 이들이 상대적으로 이종 폴리케타이드의 생산성이 낮다는 점이다.

스트렙토미세스 종의 조절 부분은 생합성 유전자의 프로모터 부분과 결합하 여, 유전자 발현에 영향을 줌으로써 항생물질 생산에 직접적으로 영향을 주기 때문에 지대한 관심을 받고 있다.

스트렙토미세스 베네주엘라에(S. venezuelae)에서 유래한 조절인자인 pikD는 종래 피크로마이신(pikromycin) 생합성 클러스터의 유일한 조절부분으로 보고되었다(도 3A 참조).

상기 pikD은 뉴클레오티드 3인산염(NTP) 결합 모티프(motif) 및 C-말단에 위치한 헬릭스-턴-헬릭스(HTH) 모티프를 포함한 LuxR 계열(LAL)의 거대 ATP-결합 조절 유전자(regulator)로서, 새롭게 밝혀진 조절 그룹 중 하나이다.

또한 LAL 계열 조절 유전자인 pikD는 피크로마이신의 생합성 경로의 활성인자이고, 스트렙토미세스 베네주엘라에(S. venezuelae)에서 매크로리드(macrolide) 항생제 생합성을 위해 필수적인 것으로 알려져 있다.

다른 LAL 계열 조절 유전자로 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)의 라파마이신(rapamycin) 생합성 경로 유래 RapH 및 스트렙토미세스 노우르세이 (Streptomyces noursei) 유래 3가지 조절유전자 (NysRI, NysRII, 및 NysRIII)가 최근에 양성 조절인자인 것으로 보고된 바 있다.

스트렙토미세스 히그로스코피쿠스에서 rapH의 과다발현에 의하여 라파마이신 생산이 증진된 것과 같이, LAL 계열 조절유전자의 양성적 역할을 본래의 항생물질 생산을 증진시키는데 적용할 수 있다.

따라서, 같은 계열의 활성기인 pikD는, 프로모터에 의해 조절되는 대응 유전자를 활성화시켜, 효율적인 이종 숙주-벡터 시스템을 개발하는데 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

이에 본 발명에서는 티로신(tyrosin, tyl) 폴리케타이드 합성효소(PKS)를 발현하는 스트렙토미세스 베네주엘라에(S. venezuelae)의 돌연변이인 피크로마이신(Pik) 폴리케타이드 합성효소(PKS)가 결핍된 DHS201에 pikD 조절 유전자를 도입함으로써, 틸락톤(tylactone; TL)과 데소사미닐 틸락톤(desosaminyl tylactone; DesTL)의 생산을 증진시키는 방법에 대하여 조사하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 빠른 생육특성을 가지고 있으나, 이종 매크로리드의 생산성이 낮은 스트렙토미세스 베네주엘라에(Streptomyces venezuelae)로부터 폴리케타이드의 생산성을 증진시키는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 목적은 스트렙토미세스 베네주엘라에(S. venezuelae)에서 pikD 조절유전자를 발현시키기 위하여 새로운 벡터를 제조하고, 상기 벡터를 스트렙토미세스 베네주엘라에(S. venezuelae)에 주입하여, 그로부터 생성되는 틸락톤 및 데소사미닐 틸락톤의 증가를 조사하고 그에 따라 스트렙토미세스 베네주엘라에(S. venezuelae)에서 폴리케타이드 생산성이 증진되었음을 확인함으로써 달성하였다.

본 발명은 스트렙토미세스 베네주엘라에(streptomyces venezuelae) pikD 유전자를 함유한 하기의 구조를 갖는 발현벡터 pYJ276을 제공함을 특징으로 한다.

pSET152 벡터를 NheI 및 SacI 제한 효소로 처리하고, pACYC177 (New England BioLabs) 벡터에서 카나마이신 저항성 유전자를 PCR로 증폭하여 SacI 및 XbaI 제한 효소로 처리하며, 이를 pSET152 벡터에 결합시킨 후 스트렙토미세스 베네주엘라에로부터 유래한 pikD 유전자를 삽입하여 pYJ276을 제조할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 발현 벡터 pYJ276과 스트렙토미세스 베네주엘라에 유래 티로신(tyrosin) 폴리케타이드 합성효소(PKS) 유전자를 함유한 발현벡터 pBB155, pDHS3003 을 스트렙토미세스 베네주엘라에에 도입하여 형질전환시킴으로써, 이종 틸락톤과 데소사미닐 틸락톤이 형질전환되기 전의 균주에 비하여 상당량 증가하므로써 생산성이 낮은 문제점을 해결할 수 있다.

또한 본 발명은 pYJ276 발현벡터를 이용하여 폴리케타이드(polyketide) 생산성을 증진시키는 방법을 제공함을 특징으로 한다.

상기 폴리케타이드는 특히 바람직하게 데소사미닐 틸락톤임을 특징으로 할수 있으며, 또는 하이드록실화된 데소사미닐 틸락톤임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한 YJ113 균주에서 추출한 신규한 하이드록실화된 데소사미닐 틸락톤(hydroxylated desosaminyl tylactone)을 제공함을 특징으로 한다.

본 발명은, pikD 조절유전자 발현벡터를 이용한 스트렙토미세스 베네주엘라에에서의 이종 폴리케타이드의 생산성 증진 방법에 관한 것으로, 생육속도는 높으나 이종 매크로리드의 생산성이 낮은 스트렙토미세스의 생산성을 높이는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, pikD 유전자를 이용한 발현벡터를 제공함으로 써, 향후 데소사미닐 매크로리드와 하이드록실화된 신규한 화합물을 효율적인 방법으로 생산할 수 있게 하므로, 식품, 약리학적으로 매우 뛰어난 발명이라 할 것이다.

이하 본 발명이 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 스트렙토미세스 베네주엘라에 DHS2001 균주의 준비 및 배양

스트렙토미세스 베네주엘라에 균주는 ATCC(American Type culture collection)에서 구입하였으며 번호는 ATCC15439이다. 야생형 스트렙토미세스 베네주엘라에(S. venezuelae) 균주의 유전체상의 pikromycin PKS 유전자 집단 (pikA)을 제거하여 외래 유래의 유전자를 발현하는 이종 발현 숙주 DHS2001을 개발하였다. 하이그로마이신(hygromycin) 저항성 유전자와 동위 재조합 (homologous recombination)에 필요한 약 1kb 정도의 DNA 조작을 포함하는 벡터를 제작하여, pikromycin PKS와 치환(double crossover)하였다. 하이그로마이신 저항성 유전자가 pikromycin PKS에 치환되어 PKS가 제거된 균주는 하이그로마이신에는 내성을 보이며 아프라마이신에는 민감한 성질을 이용하여 선별하였다.

상기 피크로마이신 폴리케타이드 합성효소(Pik PKS) 유전자가 결실된 스트렙토미세스 베네주엘라에 DHS2001(S. venezuelae DHS2001)을 SPA 배지(리터당 1g 효 모익스트랙트, 1g 비프익스트랙트, 2g 트립토스, 10g 포도당, 적은양의 황산제1철, 15g 아가)에서 배양하였다.

실시예 2 : pikD 발현 벡터 pYJ276 의 제조

피크로마이신 폴로케타이드 합성효소 (Pik PKS) 유전자가 결실된 돌연변이 DHS2001에서 도 3C에 나타낸 바와 같이, pikAI 프로모터의 조절하에 두개의 SCP2*-타입의 복제 플라스미드인 pBB155 와 pDHS3003을 이용하여 Tyl PKS를 발현시킨 결과 이종 폴리케타이드인 틸락톤(틸락톤)과 데소사미닐 틸락톤(데소사미닐 틸락톤)이 성공적으로 생산되었다고 최근에 본 발명자들은 보고하였다.

상기 두개의 복제 벡터와 무관하게 pikD 조절유전자의 연속적인 과다발현을 위하여, 강한 ermE* 프로모터뿐만 아니라 대체가능한 항생제 마커를 함유하고 있는 3번째 발현벡터가 요구되었다.

그리하여 pikD 조절 유전자의 발현을 위해, 2개의 Tyl PKS 발현 벡터인 pBB155 및 pDHS3003 외에 새로운 벡터(pYJ276이라 명명함)를 도 1에 도식한 바와 같이 하기의 방법으로 제조하였다.

1) pSET152 벡터의 처리

박테리오파지 φC31에 기초한 pSET152 벡터는 아프라마이신 저항 유전자(aac(3)IV)를 가지고 있으며, 미생물 유전체에 직접 삽입되는 특성을 가지는 벡터이다. 상기 pSET152 벡터는 미국 미시간 대학교 미생물학과 데이비드 셔먼 교 수(David H. Sherman) 로부터 확보하였다. 이 벡터는 SacI 및 NheI 제한 효소로 처리하였다.

2) pACYC177 벡터 이용(카나마이신 저항 유전자의 분리)

상기 pSET152 벡터의 아프라마이신 저항 유전자(aac(3)IV)를 카나마이신 저항 유전자(aphII)로 대체하고자, pACYC177 (New England BioLabs) 카나마이신 저항 유전자를 PCR 방법을 통하여 획득하였다. 상기 pACYC177 벡터는 상업적으로 New England BioLabs에서 판매되는 벡터이다.

3) 카나마이신 저항 유전자의 증폭

pACYC177 플라스미드의 카나마이신 저항 유전자(aphII)를 다음과 같은 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.

5´- AAAGAGCTCCCCGAACCCCAGAGTCCC -3´및

5´- AAATCTAGACCTGATACCGCTCGCCGC -3´

(제한효소 자리는 밑줄로 표시하였다.)

4) pSET152와 카나마이신 저항 유전자의 결합 및 pYJ205 생성

PCR을 통하여 확보한 카나마이신 저항 유전자(aphII) 를 SacI/XbaI로 자른뒤, SacI/NheI으로 처리된 pSET152와 T4 DNA 리가아제를 통하여 결합시켜 pYJ205를 생성하였다.

5) pikD의 유전자의 분리 및 증폭

pikD 조절유전자 (Gene bank AF079139)는 다음의 방법으로 분리하였다. 스트렙토미세스 베네주엘라에 ATCC15439 균에서 전유전체를 분리하였고, 아래 제시된 정방향 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 방법을 통하여 pikD 조절 유전자를 수득하였다.

정방향 프라이머 5´- ACGACTGAATTCCACGGAAGCCCCGGATCG - 3´

역방향 프라이머 5´- CGGGGACACTCTAGATGGCTCAGGCCGTGA - 3´

(제한효소 자리는 밑줄로 표시하였다.)

PCR한 pikD 는 pGEM-T easy vector 로 주입하여 서열분석을 하고, NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스와 비교하여 정확한 서열이 얻어졌는지 여부를 확인하였다.

6) pYJ276 벡터의 제조: pikD 유전자와 pYJ205의 결합

5)에서 얻은 pikD 유전자를 BglII 및 XbaI 제한효소로 처리하여 분리하고, BamHI 및 XbaI 제한효소 처리된 pYJ205 벡터를 T4 DNA 리가아제(ligase) 효소 (New England BioLabs)를 사용하여 16℃에서 4시간 반응을 통하여 결합시켰다. 상기 결합으로 완성된 벡터는 EcoRI 및 XbaI 제한효소를 통하여 벡터를 절단하여 pikD 유전자가 pYJ205 벡터에 삽입되었음을 확인하였다.

상기 pikD 유전자를 pYJ205 벡터의 같은 자리에 끼워넣어 벡터를 완성하고 pYJ276으로 명명하였다. 상기 pYJ276 벡터는 카나마이신 저항 유전자가 포함되어 pBB155 (티오스트렙톤 저항성 유전자 포함) 및 pDHS3003 (아프라마이신 저항성 유전자)와 함께 발현하기에 적합하며, pikD 조절유전자를 클로닝하고 있어 pikD의 효용성을 검토하기에 적합하다.

실시예 3 : 스트렙토미세스 베네주엘라에 ( S. venezuelae ) 돌연변이 균주 YJ005 및 YJ113 의 제조

1) YJ005 돌연변이 균주의 제조

스트렙토미세스 DHS2001에 pBB155 및 pDHS3003 벡터를 도입하여 Tyl PKS를 발현하는 돌연변이 균주를 얻었다. Tyl PKS 발현 여부는 LC/MS 및 MS/MS 조각 분석 방법을 통하여 확인하였다. 상기 돌연변이 균주는 YJ005로 명명하였다. YJ005 균주는 pYJ113의 생산량을 비교하기 위한 대조군으로 사용되었다.

2) YJ113 균주의 제조

pikD 조절 유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pYJ276을 피크로마이신 폴리케타이드 합성효소(Pik PKS) 유전자가 결실된 스트렙토미세스 베네주엘라에의 염색체 DNA 내로 도입하여 돌연변이 균주를 제조하였으며, YJ112로 명명하였다.

pikD의 DHS2001의 염색체로의 도입여부는 서던 하이브리다이제이션에 의하여 확인하였다. YJ112로부터 분리된 염색체 DNA에 ermE* 프로모터 부위의 DIG가 라벨링된 280bp의 EcoRI-BamHI 조각으로 표시(probe)하였다.

EcoRI 과 XbaI으로 처리된 YJ112의 게놈DNA를 분석한 결과 3.1kb의 DNA 조각이 관찰되었고, DHS2001의 게놈 DNA에서는 DNA 밴드가 탐색되지 않은 것으로 보아 도입이 되었음을 확인할 수 있었다.

Tyl PKS 발현용 복제 플라스미드로서, tylGI-III 유전자를 함유하고 있는 pBB155 벡터와 tylGIV-V 유전자를 함유하고 있는 pDHS3003 벡터 2개를 하기의 방법으로 제조하였다. (도 2 참조)

티로신(Tyl) 생합성 유전자를 클로닝하기 위하여 스트렙토미세스 프라디아에(Streptomyces fradiae) 균주로부터 전유전체 (genomic DNA)를 추출하였고, 각각의 조작들을 PCR 방법을 통하여 증폭하였다. pBB155 벡터는 MfeI 및 EcoRI 제한효소를 이용하여 5'말단 부분의 유전자를 확보하였고 SphI 및 NsiI 제한효소를 이용하여 3'말단 부분의 유전자를 확보하였으며, 가운데 조각은 스트렙토미세스 프라디아에 전유전체를 EcoRI 및 sphI 제한효소를 처리하여 확보하였다. 이들 조각을 각각의 제한효소를 이용하여 연결하여 pBB155를 완성하였다. pDHS3003 벡터는 전 유전체로부터 bglII 및 AatII 제한효소를 이용하여 조각을 확보하여 완성하였다.

상기 pBB155 벡터와 pDHS3003 벡터를 pikD 유전자가 도입된 돌연변이 YJ112 균주로 주입시켜 형질전환시켰다. 상기 형질 전환체는 pBB155에 의하여 티오스트렙톤 저항성을 가지며, pDHS3003에 의하여 아프라마이신 저항성, pYJ276에 의하여 카나마이신 저항성을 가지게 되었다.

아프라마이신, 티오스트렙톤 및 카나마이신 조합 항생제에 대하여 저항성을 갖는 상기 형질전환체를 분리하여 YJ113 균주로 명명하였다.

실시예 4 : YJ005 및 YJ113 균주의 생산된 폴리케타이드의 추출

YJ005 및 YJ113 돌연변이 균주를 적당한 항생제를 섞은 R2YE 고체 배지에서 30℃에서 2-7일간 배양하였다. 배양한 배지를 작은 조각으로 자른 뒤 2부피의 메탄올로 미리 채워둔 250mL 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크로 옮겼다. 상기 플라스크를 30℃에서 2시간동안 회전교반시켜 추출물을 수득하였다. 상기 추출물은 깔대기와 여과종이(Whatman)를 이용하여 라운드 바텀 플라스크로 여과시키고, 상기 여과물을 30℃에서 증발시켰다. 상기 여과된 추출물을 1 부피의 증류수로 세척하고, 1 부피의 클로로포름으로 다시 추출한 후 1mL의 메탄올을 이용하여 농축시켰다. 그리고 나서 0.2μm의 나일론 시린지 필터(Whatman)로 여과시켰다.

실시예 5 : LC / ESI - MS 또는 ESI - MS / MS 를 이용한 이종 폴리케타이드의 분석

YJ005와 YJ113 균주에서의 이종 폴리케타이드 틸락톤(TL) 및 데소사미닐 틸락톤(DesTL)의 생산성을 비교하기 위하여 상기 추출물을 Waters/Micromass Quattro micro/MS를 이용하여 액체크로마토그래피/전자스프레이 이온화 질량 분석기(LC/ESI-MS) 및 전자스프레이 이온화 질량 분석기/질량분석기(ESI-MS/MS)를 조합하여 분석하였다.

150 × 3.9 mm Nova-Pak C₁₈ (4.0 μm, Waters) 역상(reversed-phase)칼럼을 이용하여 분리하였다. 역상 컬럼을 이용한 분리 시 분석 용매로 (A) 5mM(w/v)의 암 모늄 아세테이트가 가미된 0.05%의 아세트산 용액과, (B) 5mM(w/v)의 암모늄 아세테이트가 가미된 아세토니트릴 용액이 사용되었다. 분석 조건은 (B) 분석 용매를 20%에서 70%로 25분간, 20%에서 90%로 20분간, 90%에서 10분간 유지시키고, 20%로 10분간의 구배로 용출시켰다. 분석 시 유속은 분당 180 μL로 유지시켰다. 컬럼 용출물을 즉시 ESI-MS 또는 ESI-MS/MS에 주입하였고, 스플릿팅 없이 양이온 모드에서 작동시켰다. 틸락톤과 데소사미닐 틸락톤의 역가측정을 위한 교정 커브 작성을 위해 틸락톤 및 O-미카미노실 틸로놀리드(O-mycaminosyl tylonolide)를 표준물질로 사용하였다. 틸락톤(TL)과 데소사미닐 틸락톤(DesTL)의 생산수치는 3개의 각각의 배양액과 추출물로부터 틸락톤과 데소사미닐 틸락톤의 농도를 평균화하여 계산하였다.

실시 결과 YJ005 균주 추출물의 LC/MS 분석으로부터 각각 분자량 m/z=395 및 m/z=552를 가진 틸락톤(TL) 및 데소사미닐 틸락톤(DesTL) 피크가 각각 잔류시간 35.6분과 43.9분에 관찰되었다. 상기 화합물들의 ESI-MS/MS 분획화 결과 역시 틸락톤 및 데소사미닐 틸락톤의 LC/MS와 같은 패턴을 얻었다.

YJ005의 틸락톤 및 데소사미닐 틸락톤의 적정농도는 대략 0.5mg/mL 및 0.1mg/L 였다.

반면, 도 4B에서 보는 바와 같이 pikD 도입 돌연변이 YJ113에서는 약 1.4mg/L의 틸락톤과 1.8mg/L의 데소사미닐 틸락톤이 생산되었는데, 이는 YJ005에서 생산된 것과 비교하여 볼 때, 각각 틸락톤과 데소사미닐 틸락톤의 생산이 2.7배 및 17.1배 증가되었다는 것을 보여준다. 또한, YJ113의 추출물에서 m/z=568을 가진 두 개의 작은 피크가 잔류시간 27.4분과 28.8분에 또한 검출되었는데, 이는 데소사미닐 틸락톤의 하이드록실화된 형태에 의한 것으로 보인다.

상기 2개의 화합물의 구조를 ESI-MS/MS분석으로 예측하였다. 도 4C 및 4D에서 보는 바와 같이, m/z=568 를 가진 상기 화합물들은 m/z=158 과 568의 피크로 분획되고, 각각 데소사민의 옥소니움(oxonium) 이온 조각과 하이드록실화된 데소사미닐 틸락톤의 수소 부가생성물과 일치하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, YJ005 또는 YJ113 균주에서의 틸락톤과 데소사미닐 틸락톤의 생산을 7일간의 배양기간 동안 관찰하였다.

도 5A에서 YJ113 돌연변이 균주의 틸락톤 생산수치는 YJ005와 비교하여 볼 때 3일과 4일 사이에 뚜렷한 상승을 보였다.

도 5B에 나타낸 바와 같이, 데소사미닐 틸락톤의 경우에 YJ005 균주는 7일까지 단지 적은 양의 데소사미닐 틸락톤을 생산하였으나, YJ113 돌연변이에서는 2일과 3일 사이에 급격한 데소사미닐 틸락톤 생산의 상승이 있었고 7일째까지 유지되었다.

YJ113 균주에서 생산된 16-membered ring 이종 폴리케타이드(틸락톤과 데소사미닐 틸락톤)의 총합은 2일과 3일 사이에 급격히 증가하였고, YJ005와 YJ113은 3일후부터 상당한 차이를 나타내었다.

실시예 6 : RT - PCR 에 의한 반정량화 분석

xylE 리포터 시스템을 이용한 종래의 pikD의 유전자 분석에 의하면, pikD 조 절유전자는 야생형 스트렙토미세스 베네주엘라에 (S. venezuelae)에서의 직간접적으로 desI 프로모터를 억제하고 pikC 조절에 관여하지 않는 반면에, pikAI 프로모터를 활성화시킨다는 것을 보여주었다.

pikD 조절유전자의 과다발현이 신규한 하이드록실화된 데소사미닐 틸락톤 화합물의 생성뿐만 아니라 데소사미닐 틸락톤 생산의 급격한 증가(17.1배)를 일으킨다는 것은 종래의 보고와 일치하지 않았다.

pikAI 프로모터의 조절하에 있는 Tyl PKS의 발현과 특히 des 클러스터 및 pikC 의 발현에 대한 pikD의 영향을 확인하기 위하여, 반정량적 RT-PCR을 이용하여 전사 분석을 수행하였으며, 그 방법은 하기에 서술한 바와 같다.

1) 스트렙토미세스 베네주엘라에(S. venezuelae)로부터 전체 mRNA의 추출

R2YE 플레이트에서 자란 스트렙토미세스 베네주엘라에(S. venezuelae) YJ005 및 YJ113 돌연변이 균주로부터 2일 및 3일째에 전체 RNA를 분리하였다. mRNA의 분해를 방지하기 위하여 2부피의 RNA 보호시약(Qiagen) 과 1 부피의 PBS 버퍼를 혼합하였다. 상기 혼합용액을 R2YE 플레이트에 부은 후, 살균 스프레더를 이용하여 스프레딩하여 균집단을 얻었다. 배양한 균을 원심분리(5000 x g, 5분, 4℃) 하여 세포 펠렛을 회수한 후 1mL의 TRIzol 시약(Invitrogen)에 녹이고 나서, 5분간 실온에 방치하였다. 상기 혼합물에 200μL의 클로로포름을 첨가한 후 15초간 섞어준 뒤 4℃에서 15분동안 12000 x g 로 원심분리하였다. 상징액을 새로운 튜브에 옮기고 1 부피의 70% 에틸알콜과 혼합하였다. 상기 혼합물을 RNeasy Mini 스핀컬럼(Qiagen) 으로 옮겨 실온에서 15분동안 8000 x g로 원심분리하였다. 상기 스핀컬럼을 RPE 세척버퍼(Qiagen)로 2번 세척하여 전체 RNA를 얻었고, 얻어진 전체 RNA를 50μL의 RNase가 없는 증류수에 용해시켰다. DNase I(New England Biolabs)으로 처리하여 전체 mRNA를 수득하였다.

2) RT-PCR을 위한 프라이머(primer)의 설계

비슷한 Tm 수치 60℃를 가지며 약 500bp의 PCR 결과물을 생성하도록 프라이머(20-mers)를 설계하였다.

Tyl PKS 및 des 클러스터의 전사체를 탐색하기 위하여, Tyl PKS 유전자에 특이성이 있는 5개의 프라이머쌍(tylGI, tylGII, tylGIII, tylGIV, tylGV) 및 des 유전자에 특이성이 있는 4개의 프라이머쌍(desVII, desVI, desIV, desII)을 각각 설계하였다. 상기 프라이머 쌍 중에서 RT-PCR 밴드의 가시도에 근거하여 mRNA 형질전환체 1개당 1개의 프라이머쌍을 선택하였다.

결과적으로 Tyl PKS 유전자를 위한 2개의 프라이머쌍(tylGI, tylGIII)과 des cluster를 위한 2개의 프라이머쌍(desVI, desIV)이 선택되었다.

pikC 발현에 대한 부가적으로 도입된 pikD 조절유전자의 효과를 확인하기 위하여 그리고 pikD의 연속적인 과다발현을 확인하기 위하여 pikC 및 pikD 를 위한 특이 프라이머쌍을 설계하였다.

상기 올리고뉴클레오티드 프라이머들와 타겟 유전자는 표 1에 나타내었다.

프라이머	서열 (5´- 3´)	비고
TylGIF	TTCGTCCTCTTCTCCTCCGT	Forward primer for tylGI
TylGIR	TTCGGATGCCGCAGCACAAA	Reverse primer for tylGI
TylGVF	ATCTGCTCTTCGACCGGGAC	Forward primer for tylGV
TylGVR	ACTCGTTCTCCCGGCAGAAA	Reverse primer for tylGV
DesVIF	TTCACCAAGGAGTTCGGCGA	Forward primer for desVI
DesVIR	AGATGGACGTCGGAGAAGTG	Reverse primer for desVI
DesIVF	TTGTTGCAGCAGCGGGTGAT	Forward primer for desIV
DesIVR	TGAGGTGATCGTCCTGGACA	Reverse primer for desIV
PikCF	CGCTCAACCACAACATGCTG	Forward primer for pikC
PikCR	TGGCGATCAGATTGACCGTG	Reverse primer for pikC
PikDF	CGCGATGAATCTGGTGGAAC	Forward primer for pikD
PikDR	GCAGTACAGGAGGAACCTCA	Reverse primer for pikD

3) RT-PCR에 의한 mRNA 전사체의 탐색

원스텝 RT-PCR 키트(Qiagen)에 의하여 반정량적 역전사 PCR(RT-PCR) 분석을 수행하였다.

RNAguard RNase 저해제(Amersham Pharmacia)와 함께 모든 PCR 반응에 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, 5% v/v)를 첨가하였다. 5ng의 DNase I을 처리한 전체 RNA를 역전사 및 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였으며, 50℃에서 30분간 후 95℃에서 15분간, 94℃에서 1분간 32-35 사이클(tylGI, tylGV, pikC, pikD: 32 cycles; desVI, desIV: 35 cycles), 55℃에서 1분 및 72℃에서 45초간 수행하였다.

증폭된 결과물이 염색체 DNA에서 유래한 것이 아니라는 것을 확인하기 위하여, 각각의 실험 반응과 함께 Tag DNA 폴리머라제(New England Biolabs)를 사용한 음성 대조군 역시 실험을 수행하였다.

4) RT-PCR 결과물의 반정량화

Quantity One Software (version 4.1.1)에 의한 RT-PCR 결과물의 상대적 정량화 데이타를 얻기 위하여 아가로스 젤 전기영동에 의한 이미지 분석을 수행하였다.

RT-PCR 증폭이 끝난 후, 반응결과물(전체부피 50μL) 중 20μL를 0.5 μg의 에티디움 브로마이드를 함유한 1% 아가로스 젤에 전기영동시키고, Gel Doc 2000 (Bio-Rad)을 이용하여 자외선 하에서 관찰하였다. 증폭된 결과물의 상대적 양은 표준DNA의 알려진 양에 의한 강도와 비교하여 각 DNA 밴드의 평균적 강도를 계산하여 결정하였다. 모든 데이터는 적어도 3번 반복실험하여 계산하였다.

실험결과, 아가로스 젤 전기영동 후, YJ005 균주의 PCR 결과물의 밴드 강도를 YJ113 균주의 것과 비교하여 도 6에 나타내었다.

Tyl PKS 유전자 발현의 RT-PCR 분석에서 48시간과 비교하여 볼 때, 72시간에서 YJ005에서 Tyl PKS의 발현 수치가 감소한(tylGI 0.3배; tylGV 0.4배) 반면에 YJ113에서의 상기 유전자의 발현 수치는 같은 배양 기간 중 증가한 것을 확인할 수 있었다.

des 클러스터의 경우에는 YJ005 균주에서는 48시간에 비하여 72시간에서 약간 상승된 양의 desVI (1.4배) 및 desIV (1.3배)가 관찰되었고, 반면에 YJ113에서의 상기 유전자의 발현은 48시간과 72시간 사이에 두드러지게 증가하였다 (desVI 2.7배; desIV 3.6배).

한편, YJ113 균주에서 Tyl PKS 및 des 유전자의 전사수치는 YJ005의 것과 비교할 때 뚜렷하게 두드러지지는 않았지만 YJ113과 YJ005 균주에서의 Tyl PKS 및 des cluster의 발현은 72시간 후에 상당한 차이를 보였다(tylGI 4.6배; tylGV 3.8배; desVI 2.6배; desIV 3.3배). 반면에, YJ005 균주에서 pikC P450 하이드록실라제 유전자의 전사수치는 48시간과 비교하여 볼 때, 72시간에서 감소한(0.4배) 반면, YJ113에서의 pikC 전사 수치는 48시간에는 YJ005에서의 것과 비슷하였고, 그 양이 72시간까지 유지되었다. 따라서, 72시간 배양 후에는, YJ113 균주의 pikC 유전자는 YJ005 균주보다 2.7배 더 발현되었다.

pikD 조절유전자는 YJ005와 YJ113에서 48에서 72시간 배양동안 모두 꾸준히 발현이 되었지만, YJ113에서의 pikD 유전자의 전사량은 YJ005에서보다 2배정도 더 높았다.

실험결과 돌연변이 균주인 YJ113에 의한 신규한 하이드록실화된 데소사미닐 틸락톤 형태의 생성뿐 아니라 데소사미닐 틸락톤 생성의 증가는 pikD 유전자의 부가적 도입이 des 클러스터와 pikC의 발현증가를 유도했다는 것을 매우 강하게 보여준다.

RT-PCR을 이용한 des 유전자 클러스터와 pikC의 상대적 유전자 발현분석결과는 또한 des 유전자 클러스터와 pikC의 양성 조절 유전자로서의 pikD의 역할을 보여준다.

실시예 7: 스트렙토미세스 베네주엘라에 (S. venezuelae ) 돌연변이 균주 DHS2001 및 YJ112 를 사용한 폴리케타이드 아글리콘( aglycone )의 생전환( bioconversion ) 실험

스트렙토미세스 베네주엘라에(S. venezuelae)로부터 생산되는 아글리콘(aglycone)인 10-데옥시메티놀리드(10-deoxymethynolide; 10-DML) 및 나르본리드(narbonlide; NL)를 des가 결실된 돌연변이 균주인 YJ003으로부터 얻어냈다.

YJ003 균주로부터 10-데옥시메티놀리드(10-deoxymethynolide; 10-DML) 및 나르본리드(narbonlide; NL)를 수득하는 방법은 다음과 같다. YJ003 균주를 SCM 배지 (Soluble starch, 15 g; Soytone (Difco), 20 g; Calcium chloride, 0.1 g; Yeast extract, 1.5 g; Mops, 10.5 g; pH=7.2 with 6N KOH)에 3일간 배양하고 같은 부피의 에틸아세테이트로 추출하여 메탄올로 농축하였다. Prep LC를 이용하여 분리하였으며 분당 5mL의 유속으로 70분 동안 Watchers ODP-BP 5um (250 x 10 mm)의 컬럼을 사용하여 분리하였다. 분리 시 두 종류의 용액을 사용하였으며 (A) 0.1% 아세트산 용액 (B) 0.1% 아세트산을 섞은 아세토나이트릴 용액를 사용하였다. 10-데옥시메티놀리드(10-deoxymethynolide; 10-DML) 및 나르본리드(narbonlide; NL)이 용출되는 시간에 용출액을 받아 LC/MS를 통하여 물질의 순수도를 측정하였다. 정제된 틸락톤은 렉스터 대학의 에릭 쿤들리페 교수에게서 얻었다. 에탄올에 녹여져 있는 이러한 매크로락톤(10-DML, 0.9 mg; NL, 1.5 mg; TL, 0.06 mg) 에 1mL의 2차 증류수를 첨가하였다.

야생형 스트렙토미세스 베네주엘라에(S. venezuelae)의 생산률과 돌연변이 균주인 YJ005로부터의 틸락톤 생산률에 근거하여, 생전환 실험을 위한 상기 외생(外生)의 매크로락톤 10-데옥시메티놀리드, 나르본리드 및 틸락톤의 적당한 첨가 농도를 결정하였다.

돌연변이 균주인 DHS2001 및 YJ112를 RY2E 고체배지상에 30℃에서 2일간 배양한 후, 각 용액 1mL를 고체 배양배지에 도포하고 4일간 더 배양하였다. 상기 아가에서 성장한 배양물을 실시예 4에 기술한 방식으로 추출하였다. 각 아글리콘의 전환율의 결정을 위하여 정제된 10-데옥시메티놀리드, 나르본리드 및 틸락톤을 이용한 교정커브를 사용하였다.

DHS2001(pikA 결실 돌연변이) 및 YJ112(pikD가 과다발현된 DHS2001)를 이용한 아글리콘 바이오컨버젼실험을 수행한 결과는 아래와 같다.

정제된 틸락톤(0.06mg)을 DHS2001과 YJ112 균주의 고체배지에 첨가한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, DHS2001 및 YJ112 균주에서 각각 약 0.1mg/L과 1.7mg/L의 데소사미닐 틸락톤이 생합성되었고, 그들의 양은 YJ005(0.1 mg/L) 및 YJ113(1.8 mg/L)과 비슷하였다. 틸락톤을 첨가하여 배양한 YJ112 균주의 추출물에서도, YJ113 균주에서의 경우와 마찬가지로, 2개의 신규한 하이드록실화된 데소사미닐 틸락톤 형태가 또한 발견되었다. 더 많은 양의 틸락톤을 생전환 실험에 사용하였을 시, 틸락톤 초과량은 전환되지 않고 그대로 남아있었다.

정제된 10- 데옥시메티놀리드 (0.9 mg) 및 나르본리드 (1.5 mg)을 DHS2001 및 YJ112 균주의 배지에 첨가한 결과, 도 7A 및 7B에 나타낸 바와 같이, DHS2001과 YJ112 균주 모두 10- 데옥시메티놀리드을 메티마이신(methymycin), 네오메티마이신(neomethymycin) 및 노바메티신(novamethycin)을 포함한 12-membered ring으로 변환시켰다.

도 7C와 7D에 나타낸 바와 같이, YJ112 균주에서 10- 데옥시메티놀리드의 전체 12-membered ring 매크로리드로의 전환율은 약 91%을 나타냈으며, 이는 DHS2001 균주보다 5.1배 증가된 것이다

도 7E 및 도7F에 나타낸 바와 같이, 나르본리드 을 첨가한 배지에서 성장한 DHS2001 균주에서는 나르본리드 중 약 14%만이 피크로마이신(pikromycin)과 소량의 네오피크로마이신(neopikromycin) 및 나바피크로마이신(navapikromycin)으로 생전환된 반면, YJ112에서는 나르본리드 중 91%가 피크로마이신, 네오피크로마이신 및 노바피크로마이신을 포함한 14-membered ring 매크로리드로 전환되었다.

DHS2001에서 pikD의 과다발현은 6.3배 증가된 나르본리드의 14-membered ring 매크로리드로의 생전환을 일으켰다.

도 1은 pYJ276 벡터의 제조과정을 간략히 도식화한 것이다.

도 2는 pBB155 벡터 및 pDHS2001 벡터의 구조를 나타낸 것이다.

도 3 A는 스트렙토미세스 베네주엘라에 DHS2001의 유전자구조를 나타낸 것이다.

도 3 B는 틸락톤과 데소사미닐 틸락톤의 구조를 나타낸 것이다.

도 3 C는 pBB155, pDHS3003 및 pYJ276의 구조를 나타낸 것이다.

도 4 A는 YJ005 균주에서의 LC/MS를 이용한 폴리케타이드를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 4 B는 YJ113 균주에서의 LC/MS를 이용한 폴리케타이드를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 4 C는 YJ113 균주의 LC/MS 분석한 결과 중 잔류시간 27.4 분의 피크를 분획하여 MS/MS한 결과를 나타낸 것이다.

도 4 D는 YJ113 균주의 LC/MS 분석한 결과 중 잔류시간 28.83분의 피크를 분획하여 MS/MS한 결과를 나타낸 것이다.

도 5 A는 YJ005 및 YJ113 균주에서의 틸락톤의 배양시간에 따른 생산량을 나타낸 것이다.

도 5 B는 YJ005 및 YJ113 균주에서의 데소사미닐 틸락톤의 배양시간에 따른 생산량을 나타낸 것이다.

도 6는 YJ005 및 YJ113의 mRNA의 RT-PCR에 의한 전사체의 아가로스 상의 전 기영동에 의한 밴드강도 및 이를 정량화한 수치를 나타낸 것이다.

도 7 A는 10-데옥시메티놀리드(10-DML)를 생전환하였을 때 전환되는 화합물을 도식화한 것이다.

도 7 B는 나르본리드(NL)를 생전환하였을 때 전환되는 화합물을 도식화한 것이다.

도 7 C는 DHS2001 균주에서 10-데옥시메티놀리드의 생전환에 의한 화함물을 LC/MS로 분석한 것이다.

도 7 D는 YJ112 균주에서 10-데옥시메티놀리드의 생전환에 의한 화함물을 LC/MS로 분석한 것이다.

도 7 E는 DHS2001 균주에서 나르본리드의 생전환에 의한 화함물을 LC/MS로 분석한 것이다.

도 7 F는 YJ112 균주에서 나르본리드의 생전환에 의한 화함물을 LC/MS로 분석한 것이다.

Claims

스트렙토미세스 베네주엘라에(streptomyces venezuelae)에서 pikD 유전자를 함유한 하기 구조의 발현벡터 pYJ276.
박테리오파지 φC31에 기초로 하여 아프라마이신 저항 유전자(aac(3)IV)를 가지고 있으며, 미생물 유전체에 직접 삽입되는 특성을 가지는 pSET152 벡터(도 1의 A)와 pACYC177 벡터의 카나마이신 저항 유전자(도 1의 B)를 결합시켜 pYJ205 벡터(도 1의 C)를 제조하는 단계;

상기 pYJ205 벡터와 스트렙토미세스 베네주엘라에로부터 유래한 pikD 유전자(도 1의 D)를 결합시켜 pYJ276 벡터(도 1의 E)를 제조하는 단계; 및

상기 pYJ276 벡터를 티오스트렙톤 저항성 유전자를 포함하는 pBB155(도 2의 A), 아프라마이신 저항성 유전자를 포함하는 pDHS3003(도 2의 B)과 함께 스트렙토미세스 베네주엘라에 DHS2001 균주에 도입시켜 형질전환된 YJ113 균주를 제조하는 단계

로 구성된 pikD 발현벡터를 이용한 이종 폴리케타이드(polyketide) 생산성 증진 방법.
제 2항에 있어서, 상기 폴리케타이드가 데소사미닐 틸락톤(desosaminyl tylactone) 또는 하이드록실화된(hydroxylated) 데소사미닐 틸락톤임을 특징으로 하는 이종 폴리케타이드 생산성 증진 방법.
삭제