CN116286574B - 精准调控Bacillus subtilis内源多基因表达的CRISPRa方法及其应用 - Google Patents

精准调控Bacillus subtilis内源多基因表达的CRISPRa方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116286574B
CN116286574B CN202310086553.2A CN202310086553A CN116286574B CN 116286574 B CN116286574 B CN 116286574B CN 202310086553 A CN202310086553 A CN 202310086553A CN 116286574 B CN116286574 B CN 116286574B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus subtilis
sgrna
alpha
gene
dcas
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310086553.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116286574A (zh
Inventor
张炳坤
廖朝勇
崔健
呙于明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202310086553.2A priority Critical patent/CN116286574B/zh
Publication of CN116286574A publication Critical patent/CN116286574A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116286574B publication Critical patent/CN116286574B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/127—RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07048—RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/0101—(2E,6E)-Farnesyl diphosphate synthase (2.5.1.10), i.e. geranyltranstransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01148—4-(Cytidine 5'-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase (2.7.1.148)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了精准调控Bacillus subtilis内源多基因表达的CRISPRa方法及其应用。本发明属于基因工程领域，具体涉及精准调控Bacillus subtilis内源多基因表达的CRISPRa方法及其应用。本发明的重组枯草芽孢杆菌含有名称为dCas9‑α的蛋白质的编码基因，转录激活因子xylR的编码基因，其中dCas9‑α是由dCas9蛋白和RNA聚合酶II的α亚基连接而成的融合蛋白，RNA聚合酶II的α亚基连接在dCas9蛋白的C端。通过将A3E3表达盒导入上述重组枯草芽孢杆菌，得到的重组枯草芽孢杆菌的甲萘醌‑7产量显著提高，为研究枯草芽孢杆菌的特定生物功能提供了技术基础。

Description

精准调控Bacillus subtilis内源多基因表达的CRISPRa方法 及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及精准调控Bacillus subtilis内源多基因表达的CRISPRa方法及其应用。
背景技术
随着技术的快速发展和进步，微生物作为细胞工厂可以有效合成许多有价值的产物，例如化学品、生物燃料和保健品，合成生物学和代谢工程已广泛应用于设计和建造微生物细胞工厂。构建表达系统实现目的产物代谢途径的优化需要能够精准调节靶向基因表达变化。因此，精准调节基因表达量的技术手段是合成生物学领域亟待解决的问题。
Bacillus subtilis(B.subtilis)是一种广泛用于酶和化合物生产的微生物宿主。随着基因工程技术的发展，B.subtilis基因编辑策略得到了有效的改进。传统的分子生物学手段优化目的基因的表达，相关基因的表达量受表达载体的构成元件例如启动子，整合型或游离型等决定，基于传统过表达系统很难精确地微调目的基因的表达。CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9(CRISPR-associated protein 9)发展得到催化失活的Cas9(dCas9)，其仍然可以通过使用单向导RNA(sgRNA)与靶向DNA上的目标位点结合，而不是切割DNA。利用CRISPR/dCas9可以解决传统基因组编辑技术的局限。
甲萘醌-7(MENAQUINONE-7，MK-7)，是维生素K2的一个类型，即维生素K2侧链上含有7个异戊二烯单元，其是一种脂溶性维生素，是人体中不可缺少的重要维生素之一.
发明内容
本发明所要解决的问题为如何调控并提高微生物产甲萘醌-7能力。
为了解决以上问题，本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌。
本发明提供的重组枯草芽孢杆菌，含有名称为dCas9-α的蛋白质的编码基因，转录激活因子xylR的编码基因，所述dCas9-α是由dCas9蛋白和RNA聚合酶II的α亚基连接而成的融合蛋白，所述RNA聚合酶II的α亚基连接在所述dCas9蛋白的C端。
所述重组枯草芽孢杆菌还含有名称为A3E3表达盒的DNA分子，所述A3E3表达盒包括名称为sgA3box的sgRNA表达盒和名称为sgE3box的sgRNA表达盒，所述sgA3box表达名称为sgA3的靶向于枯草芽孢杆菌的ispA基因的sgRNA，所述sgE3box表达名称为sgE3的靶向于枯草芽孢杆菌的ispE基因的sgRNA。
上述重组枯草芽孢杆菌中，所述sgA3的靶点的核苷酸序列具体可为5’
-ATGGCTATCACTTCTAAAAA-3’，所述sgE3的靶点的核苷酸序列具体可为5’
-AGCTGTATCCTCTTTCCATC-3’。
上述重组枯草芽孢杆菌中，所述A3E3表达盒的核苷酸序列具体可为序列表中的序列4中第196至986位。
上述重组枯草芽孢杆菌不含有recA基因。
上述重组枯草芽孢杆菌是通过向枯草芽孢杆菌NB205导入dCas9-α的蛋白质的编码基因和转录激活因子xylR的编码基因并敲除recA基因得到的重组菌。
所述dCas9-α的蛋白质的编码基因和转录激活因子xylR的编码基因通过所述recA基因位点导入。
本发明还提供了用于构建重组枯草芽孢杆菌的组合物。
本发明提供的用于构建重组枯草芽孢杆菌的组合物，包括上述重组枯草芽孢杆菌和sgRNA相关材料，所述sgRNA相关材料可为下述任一种：
S1、上述DNA分子，所述DNA分子为表达盒，所述表达盒包括名称为sgA3box的sgRNA表达盒和名称为sgE3box的sgRNA表达盒，所述sgA3box表达名称为sgA3的靶向于枯草芽孢杆菌的ispA基因的sgRNA，sgA3的靶点为基因ispA起始密码子上游366bp的位点，所述sgE3box表达名称为sgE3的靶向于枯草芽孢杆菌的ispE基因的sgRNA，sgE3的靶点为基因ispE起始密码子上游345bp的位点。
S2、含有上述DNA分子的重组载体，
S3、含有S1)DNA分子的重组载体，
S4、含有S2)所述重组载体的重组微生物。
本发明还提供了一种DNA分子，所述DNA分子为上述A3E3表达盒，所述A3E3表达盒包括名称为sgA3box的sgRNA表达盒和名称为sgE3box的sgRNA表达盒，所述sgA3box表达名称为sgA3的靶向于枯草芽孢杆菌的ispA基因的sgRNA，所述sgE3box表达名称为sgE3的靶向于枯草芽孢杆菌的ispE基因的sgRNA。
上述DNA分子中，所述sgA3的靶点的核苷酸序列具体可为5’-ATGGCTATCACTTCTAAAAA-3’，所述sgE3的靶点的核苷酸序列具体可为5’-AGCTGTATCCTCTTTCCATC-3’。
上述DNA分子中，所述A3E3表达盒的核苷酸序列具体可为序列表中的序列4中第196至986位。
本发明的重组枯草芽孢杆菌含有名称为dCas9-α的蛋白质的编码基因，转录激活因子xylR的编码基因，其中dCas9-α是由dCas9蛋白和RNA聚合酶II的α亚基连接而成的融合蛋白，RNA聚合酶II的α亚基连接在dCas9蛋白的C端。序列1的第1471-3987位是dCas9基因的核苷酸序列，编码氨基酸序列是序列5的dCas9蛋白质，序列1的第5623-6567位是RNA聚合酶II的α亚基的核苷酸序列，编码氨基酸序列是序列6的RNA聚合酶II的α亚基蛋白质，；转录激活因子xylR的编码基因的核苷酸序列是序列1的第70-1194位，编码氨基酸序列是序列7的蛋白质。
上述重组枯草芽孢杆菌，上述用于构建重组枯草芽孢杆菌的组合物或上述DNA分子在制备甲萘醌-7中的应用也属于本发明保护的范围。
本发明还提供了制备甲萘醌-7的方法，所述方法包括培养上述重组枯草芽孢杆菌得到发酵产物，从所述发酵产物中得到甲萘醌-7。
本发明还提供了上述重组枯草芽孢杆菌或上述用于构建重组枯草芽孢杆菌的组合物在调控Bacillus subtilis内源多基因表达功能中的应用。
所述调控为增强。
首先设计基因ispA和基因ispE起始密码子上游不同位点的sgRNA，将dCas9-α引导到目的基因上游相应的位置，测定其激活下游基因转录水平，并将不同转录激活水平sgRNA分为两个水平。然后，将不同转录水平的sgRNA两两组合创建了一个具有双sgRNA的CRISPRa系统，以精确微调基因ispA和基因ispE的表达以达到最佳转录水平。
本发明利用dCas9的特性，通过调整sgRNA引导dCas9靶向不同位置来调节目的基因转录水平强度来精准调节内源基因的表达水平。进一步探究CRISPRa基因编辑工具在B.subtilis中的应用以及运用到B.subtilis提高甲萘醌-7合成的可能性。通过精准微调B.subtilis内源多基因转录水平并进行组合以实现甲萘醌-7更加高效合成。
保藏说明
菌种名称：枯草芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus subtilis
菌株编号：NB205
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年10月21日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25938
附图说明
图1为A)游离型sgRNA质粒的构建以及靶向基因ispA或基因ispE上游的位置。B)B.subtilis NB205敲除基因recA并插入dCas9-α。
图2为阳性克隆菌sgA1、sgA2、sgA3、sgA4、sgA5、sgE1、sgE2、sgE3、sgE4、sgE5菌液PCR琼脂糖电泳图。
图3为B.subtilis NB205通过不同的sgRNA引导dCas9-α所激活基因ispA不同转录水平。虚线表示两个基因激活水平。
图4为B.subtilis NB205通过不同的sgRNA引导dCas9-α所激活基因ispE不同转录水平。虚线表示两个基因激活水平。
图5为串联双sgRNA表达盒质粒构建。
图6为阳性克隆菌A3E2、A3E3、A4E2、A4E3菌液PCR琼脂糖电泳图。
图7为MK-7标品标准曲线。
图8为双sgRNA CRISPRa系统共激活对B.subtilis NB205基因ispA和基因ispE相对转录水平以及甲萘醌-7产量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的Bacillus subtilis(B.subtilis)NB205来源于CGMCC 25938。
下述实施例中的pAX01载体、pcDNA-dCas9-VP64载体、pSTOP1622载体购自湖南科爱医疗器械有限公司实验室保存。
下述实施例中细菌生长培养基和条件如下：
LB培养基：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％ NaCl，其余为水。
发酵培养基：6％葡萄糖、5％大豆蛋白胨、1.5％酵母提取物、0.3％ NaCl，其余为水。除非另有说明，否则所有培养物均在180rpm和37℃下在有氧条件下振荡生长。
对于阳性克隆菌筛选，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在添加了相应抗生素的LB培养基中生长，最终浓度为100μg/mL氨苄青霉素用于大肠杆菌，或15μg/mL四环素和10μg/mL红霉素用于枯草芽孢杆菌.将单克隆枯草芽孢杆菌在4mL LB并添加相应抗生素的试管中培养12h，然后将400μL细胞溶液接种到装有10mL发酵培养基的50mL烧瓶中，当发酵液OD600达到1时，加入0.5％木糖诱导发酵144小时。所有发酵均在无光下进行，以避免甲萘醌-7降解。
实施例1、精准调控B.subtilis内源多基因表达的CRISPRa系统的构建
基于dCas9-α的特性，构建微调B.subtilis基因表达的CRISPRa系统。在该系统中，将RNA聚合酶II的α亚基与dCas9的C末端融合的木糖诱导表达片段整合到B.subtilis基因组中，同时敲除基因recA，并避免后续游离型sgRNA质粒的同源重组错配。
本发明中所用的引物与寡核苷酸见表1。
表1.本专利中使用的引物和寡核苷酸
注：F：正向，R：反向。
一、CRISPRa系统的构建
将RNA聚合酶II的α亚基与dCas9的C末端融合的木糖诱导表达片段整合到B.subtilis基因组中。
1.pAX01载体插入多克隆位点区
利用常用的PCR设计软件Primer Premier 6，更改该软件的默认参数(对引物Tm值，长度和扩增片段长度等参数进行相应的更改)，利用该软件设计引物pAX01MCS oligo F和pAX01 MCS oligo R(具体见表1)，将质粒多克隆位点区基因序列构建至载体pAX01酶切位点SpeI和BamHI之间，退火，磷酸化得到重组质粒，命名为pAX01-linker new MCS。
2.pAX01-linker new MCS中插入dCas9编码序列
设计引物序列dCas9-pAX01 F和dCas9-pAX01 R(引物序列见表1)，具体步骤如下：
1)采用SpeI/SphI双酶切处理步骤1得到的重组质粒载体pAX01-linker new MCS；
2)以pcDNA-dCas9-VP64为模板，dCas9-pAX01 F和dCas9-pAX01 R为引物进行PCR，得到dCas9编码序列；
3)将步骤2)dCas9与步骤1)得到的pAX01-linker new MCS(SpeI/SphI)连接得到pAX01-dCas9 new MCS。
3.pAX01-dCas9 new MCS插入α
设计引物ApaI-α-pAX01 F和α-pAX01 R，(引物序列见表1)，具体构建步骤如下：
1)采用ApaI/NsiI双酶切处理步骤2得到的重组质粒载体pAX01-dCas9 new MCS；
2)以NB205基因组为模板，ApaI-α-pAX01 F和α-pAX01 R为引物PCR，得到ApaI-α-NsiI片段；
3)ApaI-α-NsiI(ApaI/NsiI酶切)与pAX01-dCas9 new MCS(ApaI/NsiI酶切)连接得到pAX01-dCas9-αnew MCS重组载体，pAX01-dCas9-αnew MCS的核苷酸序列为序列表中序列1。pAX01-dCas9-αnew MCS含有编码序列(CDS)是序列表中序列1的第1471-6567位dCas9-α的蛋白质的编码基因。
二、RecA敲除系统的构建
1.替换上游同源臂
引物remove LacA'up F和remove LacA'up R，RecA cinA-p'AX01 F和ecA cinA-p'AX01 R，(引物序列见表1)，具体构建步骤如下：
1)以步骤1获得的pAX01-linker new MCS为模板，remove LacA'up F和removeLacA'up R为引物反向PCR去除LacA'；
2)以枯草芽孢杆菌NB205基因组为模板，RecA cinA-p'AX01 F和RecA cinA-p'AX01 R为引物PCR得到cinA编码序列；
3)cinA与去除LacA'的p'AX01连接得到pC'AX-linker new MCS。
2.替换下游同源臂
引物remove'LacA dowm F和remove'LacA dowm R，RecA pbpX-pCX F和RecApbpX-pCX R(引物序列见表1)，具体构建步骤如下：
1)以上述pC'AX-linker new MCS为模板，remove'LacA dowm F和remove'LacAdowm R为引物，反向PCR去除'LacA；
2)以B.subtilis NB205基因组为模板，RecA pbpX-pCX F和RecA pbpX-pCX R为引物PCR，得到pbpX编码序列；
3)pbpX与去除'LacA的pCX-linker new MCS连接得到pCPX-linker new MCS。
3.删除木糖操纵子
引物pAX01 remove xyl-SpeI F和ApaI-pAX01 remove xyl R(引物序列见表1)，具体步骤如下：
1)将上述得到的pCPX-linker new MCS为模板，pAX01 remove xyl-SpeI F和ApaI-pAX01 remove xyl R为引物，反向PCR去除木糖操纵子；
2)自连接得到pCP。
4.插入dCas9-α表达框
引物dCas9-pAX01 F和α-pAX01 R，(引物序列见表1)，具体步骤如下：
1)采用SpeI/BamHI双酶切处理上述得到的重组质粒载体pCPX-linker new MCS；
2)以pAX01-dCas9-αnew MCS为模板，dCas9-pAX01 F和α-pAX01 R为引物，PCR得到dCas9-α表达框；
3)将上述得到的dCas9-α与pCPX-linker new MCS(SpeI/BamHI酶切)连接得到pCPX-dCas9-αnew MCS。
5.插入木糖诱导表达的dCas9-α同时敲除recA片段的获取
引物RecA cinA-p'AX01 F和RecA pbpX-pCX R(引物序列见表1)，具体步骤如下：以步骤4得到的pCPX-dCas9-αnew MCS为模板，RecA cinA-p'AX01 F和RecA pbpX-pCX R为引物，获得cinA-Em-α-dCas9-xylR-pbpX片段，核苷酸序列为序列表中序列2。
随后将相关DNA片段转化到菌株NB205，并将转化后菌液涂于LB固体培养基(含有10μg/mL红霉素Em)上。挑取阳性单克隆提取质粒，用引物recA-PCP-检F和recA-PCP-检R进行PCR电泳验证是否敲除基因recA成功并替换成Em-α-dCas9-xylR，将验证正确的含有p-dCas9-α△recA的阳性克隆命名为重组枯草芽孢杆菌NB205-dCas9-α△recA。
NB205-dCas9-α△recA含有名称为cinA-Em-α-dCas9-xylR-pbpX的DNA片段，cinA-Em-α-dCas9-xylR-pbpX的核苷酸序列是序列2，dCas9-α的蛋白质的编码基因和转录激活因子xylR的编码基因，所述dCas9-α是由dCas9蛋白和RNA聚合酶II的α亚基连接而成的融合蛋白，所述RNA聚合酶II的α亚基连接在所述dCas9蛋白的C端。dCas9-α的蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列2的第2787-7883位，序列2的第2787-6890位是dCas9基因的核苷酸序列，编码氨基酸序列是序列5的dCas9蛋白质，序列2的第6939-7883位是RNA聚合酶II的α亚基的核苷酸序列，编码氨基酸序列是序列6的RNA聚合酶II的α亚基蛋白质；转录激活因子xylR的编码基因的核苷酸序列是序列2的第1386-2510位，编码氨基酸序列是序列7的蛋白质。序列2的第19-1194位是pbpX的核苷酸序列，序列2的第8437-9174位是红霉素抗性基因Em的核苷酸序列，序列2的第9614-10864位是cinA的核苷酸序列，所述重组枯草芽孢杆菌NB205-dCas9-α△recA不含有recA基因。
实施例2、pPveg-sgRNA载体构建
1.pSTOP1622载体加入酶切位点
引物add NheI F和add NheI R；add ApaI F和add ApaI R，具体步骤如下：1)以pSTOP1622为模板，NheI F和add NheI R为引物反向PCR得到线性化的pSTOP1622-NheI；
2)pSTOP1622-NheI(NheI酶切)自连得到pSTOP1622-NheI；
3)以pSTOP1622-NheI为模板，ApaI F和add ApaI R为引物反向PCR得到线性化的pSTOP1622-NheI+ApaI；
4)pSTOP1622-NheI+ApaI(ApaI酶切)自连得到pSTOP1622-NheI+ApaI。
2.pPveg载体构建引物XbaI+SpeI-Pveg F和Pveg-BglII R
1)以B.subtilis NB205基因组为模板，XbaI+SpeI-Pveg F和Pveg-BglII R为引物进行PCR，得到XbaI+SpeI-Pveg-BglII启动子序列；
2)XbaI+SpeI-Pveg-BglII(XbaI/BglII酶切)与pSTOP1622-NheI+ApaI(XbaI/BglII酶切)连接得到pPveg。
2.游离型sgRNA质粒构建
构建游离型sgRNA质粒空载体。它可以插入多个sgRNA靶向不同目的基因上游DNA序列位置(图1中A)，具体步骤如下：
引物sgRNA unit F和sgRNA unit R(引物序列见表1)，具体构建步骤：
1)采用BsrGI/BglII双酶切处理步骤1中得到的重组载体pPveg；
2)引物为sgRNA unit F和sgRNA unit R，退火，磷酸化；
3)连接得到pPveg-sgRNA，核苷酸序列为序列表中序列3。
3.pPveg-sgRNA空载体插入靶向sgRNA验证
设计10个sgRNAs，分别将dCas9-α引导至基因ispA起始密码子上游第112-132位(简称112)、第276-296位(简称276)、第366-386位(简称366)、第437-457位(简称437)和第543-563位(简称543)的位点，并标记为sgA1、sgA2、sgA3、sgA4和sgA5，以及基因ispE起始密码子上游第132-152位(简称132)、第275-295位(简称275)、第345-365位(简称345)、第364-384位(简称364)和第511-531位(简称511)的位点并标记为sgE1、sgE2、sgE3、sgE4和sgE5(图1中B)。
A.sgA1、sgA2、sgA3、sgA4和sgA5阳性克隆构建过程
1)载体pPveg-sgRNA经过SapI酶切；
2)在25μL体系中各加入sgRNA ispA XXX-(XXX表示为如下122、276、366、437或543)oligo F和sgRNA ispA XXX-(122、276、366、437、543)oligo R引物5μL，水15μL，95℃3min，0.1℃/s退火至16℃，16℃保持10min，完成退火，磷酸化得到带有粘性末端的sgRNA退火产物；
3)将上述1)、2)得到的载体与片段连接得到pPveg-sgRNA-ispAXXX-(XXX表示为如下122、276、366、437、543)。
将上述制备的重组载体pPveg-sgRNA-ispA XXX-(122、276、366、437、543)转入大肠杆菌DH5α，涂于LB的固体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)上。挑取阳性单克隆提取质粒，分别电转化至枯草芽孢杆菌NB205，将枯草芽孢杆菌阳性克隆菌标记为sgA1、sgA2、sgA3、sgA4和sgA5。
将枯草芽孢杆菌阳性克隆菌在4mL LB液体培养基(含有15μg/mL四环素)培养12h，然后将400μL细胞溶液接种到装有10mL发酵培养基的50mL烧瓶中，当发酵液OD600达到1时，加入0.5％木糖诱导发酵144小时。所有发酵均在无光下进行，以避免甲萘醌-7降解。
B.sgE1、sgE2、sgE3、sgE4和sgE5阳性克隆构建过程
1)载体pPveg-sgRNA经过SapI酶切；
2)在25μL体系中各加入sgRNA ispE XXX-(XXX表示为如下132、275、345、364和511)oligo F和sgRNA ispE XXX-(XXX表示为如下132、275、345、364和511)oligo R引物5μL，水15μL，95℃3min，0.1℃/s退火至16℃，16℃保持10min，完成退火，磷酸化得到带有粘性末端的gRNA退火产物；
3)将上述1)、2)得到的载体与片段连接得到重组载体pPveg-sgRNA-ispEXXX-(XXX表示为如下132、275、345、364和511)。
将上述制备的重组载体pPveg-sgRNA-ispEXXX-(XXX表示为如下132、275、345、364和511)转入大肠杆菌DH5α，涂于LB固体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)上。挑取阳性单克隆提取质粒，分别电转化至枯草芽孢杆菌NB205-dCas9-α△recA，将枯草芽孢杆菌阳性克隆菌标记为sgE1、sgE2、sgE3、sgE4和sgE5。
将阳性克隆枯草芽孢杆菌在4mL LB液体培养基(含有15μg/mL四环素)培养12h，然后将400μL细胞溶液接种到装有10mL发酵培养基的50mL烧瓶中，当发酵液OD600达到1时，加入0.5％木糖诱导发酵144小时。所有发酵均在无光下进行，以避免甲萘醌-7降解。
将上述质粒转化并将阳性克隆菌菌液PCR鉴定(用引物XbaI+SpeI-Pveg F和Pveg-BglII R PCR鉴定)，若整合成功，菌液PCR将会有约500bp条带，结果如图2所示，阳性克隆菌菌液PCR在500bp附近有目标条带。
通过qRT-PCR检测相对转录水平发现，各阳性克隆菌中，基因ispA分别增加了1.11-2.79倍(图3)，基因ispE分别增加了1.67-2.05倍(图4)。
实施例3、构建串联双sgRNA表达质粒
1.构建串联双sgRNA表达质粒
将激活基因ispA或基因ispE的相对转录水平分为两类：基因激活水平1(Geneactivation level 1，激活倍数约2倍)，选取代表性sgRNA:sgA3和sgE3，基因激活水平2(Gene activation level2，激活倍数约1.5倍)，选取代表性sgRNA:sgA4和sgE2(图3和图4)。将sgA3、sgA4、sgE2和sgE3两两组合构建4个串联双sgRNA表达质粒A(图5)。
A.sgRNA转录单元串联过程如下：
1)按照上述实施例2中步骤3方法获得pPveg-sgRNA ispA XXX-(366、437)；
2)按照上述实施例2中步骤3方法获得pPveg-sgRNA ispE XXX-(275、345)；
3)用SpeI/ApaI酶切pPveg-sgRNA ispE XXX-(275、345)，得到片段Pveg-sgE2,Pveg-sgE3；
4)用NheI/ApaI酶切pPveg-sgRNA ispA XXX-(366、437)得到质粒骨架；
5)将上述片段与质粒骨架连接得到pPveg-sgRNA ispA XXX-(366或437)-sgRNAispE-(275或345)XXX。
pPveg-sgRNA-ispA3–sgRNA-ispE3的核苷酸序列是序列表中的序列4。
pPveg-sgRNA-ispA3–sgRNA-ispE3含有名称为A3E3表达盒的DNA分子，所述A3E3表达盒包括名称为sgA3box的sgRNA表达盒和名称为sgE3box的sgRNA表达盒，所述sgA3box表达名称为sgA3的靶向于枯草芽孢杆菌的ispA基因的sgRNA，所述sgE3box表达名称为sgE3的靶向于枯草芽孢杆菌的ispE基因的sgRNA。
A3E3表达盒的核苷酸序列是序列4的第196-986位。其中，第196-523位是sgA3box的核苷酸序列，第196-424位是启动子的核苷酸序列，第428-447位是sgA3基因的核苷酸序列，第524-529位是终止子的核苷酸序列。第659-986位是sgE3box的核苷酸序列，第659-887位是启动子的核苷酸序列，第891-910位是sgE3基因的核苷酸序列，第987-992位是终止子的核苷酸序列。
sgA3的靶点的核苷酸序列为5’-ATGGCTATCACTTCTAAAAA-3’，sgE3的靶点的核苷酸序列为5’-AGCTGTATCCTCTTTCCATC-3’。
pPveg-sgRNA-ispA3–sgRNA-ispE2与pPveg-sgRNA-ispA3–sgRNA-ispE3的区别仅在于将序列4的第891-910位替换为5’-TGGTTTTTATGACACAGTAA-3’其它核苷酸序列与序列4相同。
pPveg-sgRNA-ispA4–sgRNA-ispE2与pPveg-sgRNA-ispA3–sgRNA-ispE3的区别仅在于将序列4的第428-447位替换为5’-ATTTCAAACCGTTCTTGGCA-3’，并将序列4的第891-910位替换为5’-TGGTTTTTATGACACAGTAA-3’，其它核苷酸序列与序列4相同。
pPveg-sgRNA-ispA4–sgRNA-ispE3与pPveg-sgRNA-ispA3–sgRNA-ispE3的区别仅在于将序列4的第891-910位替换为5’-ATTTCAAACCGTTCTTGGCA-3’，其它核苷酸序列与序列4相同。
质粒转化:电转化生长培养基(EG)：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、9％山梨糖醇，其余为水。电转化洗涤介质(EW)：9％山梨糖醇、7％甘露糖醇、18％海藻糖、10％甘油，其余为水。电转化回收培养基(ER)：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、9％山梨糖醇、7％甘露糖醇、18％海藻糖，其余为水。
B.subtilis NB205的优化电转化：
感受态菌株的制备：1)将新鲜菌落接种在装有4mL LB的10mL试管中，并在37℃下以180rpm培养12h；2)将1mL细胞溶液接种在40mL EG中，并在37℃以180rpm培养至0.85<OD600<0.95；3)40mL细胞溶液在4℃下以5,000rpm离心10分钟，弃去上清液；4)将细胞沉淀轻轻重悬于30mL预冷的EW(4℃)中，然后在4℃下以5,000rpm离心10分钟，弃去上清液。此步骤重复3至4次；5)将最终的细胞沉淀轻轻重悬于1mL预冷的EW中，将60μL细胞溶液分配到每个2mL无菌管中，并立即在-80℃下储存。
电转化条件：1)DNA(300ng)与NB205-dCas9-α△recA感受态细胞混合并加入电转化杯中；2)电击参数为2000V，4ms；3)将1mL ER加入电转化杯中重悬细胞，取出至2mL无菌管中，37℃培养3h。将溶液以3,000rpm离心2分钟。将菌体涂布在相应的抗生素LB板上。其中，DNA(300ng)为pPveg-sgRNA-ispA3–sgRNA-ispE3、pPveg-sgRNA-ispA3–sgRNA-ispE2、pPveg-sgRNA-ispA4–sgRNA-ispE2或pPveg-sgRNA-ispA4–sgRNA-ispE2。
将阳性克隆菌液进行PCR鉴定(分别用引物IspA-366Oligo F，IspE-275Oligo R鉴定A3E2；用引物IspA-366Oligo F，IspE-345Oligo R鉴定A3E3；用引物IspA-437Oligo F，IspE-275Oligo R PCR鉴定A4E2；用引物IspA-437Oligo F，IspE-345Oligo R PCR鉴定A4E3；若整合成功，菌液PCR将会有约500bp条带，如图6)。将鉴定正确的阳性克隆菌标记为A3E2、A3E3、A4E2、A4E3。
NB205-dCas9-α△recA-A3E3(图8中表示为A3E3)是用引物IspA-366Oligo F，IspE-345Oligo R进行PCR得到500bp条带的阳性克隆菌。
NB205-dCas9-α△recA-A3E2(图8中表示为A3E2)是用引物IspA-366Oligo F，IspE-275Oligo R进行PCR得到500bp条带的阳性克隆菌。
NB205-dCas9-α△recA-A4E2(图8中表示为A4E2)是用引物IspA-437Oligo F，IspE-275Oligo R进行PCR得到500bp条带的阳性克隆菌。
NB205-dCas9-α△recA-A4E3(图8中表示为A4E3)是用引物IspA-437Oligo F，IspE-345Oligo R进行PCR得到500bp条带的阳性克隆菌。
2.qRT-PCR检测双sgRNA表达质粒激活靶基因的转录水平
定量实时PCR(qRT-PCR)：在指数生长期，收集上述获得的阳性克隆菌A3E2、A3E3、A4E2、A4E3和B.subtilis NB205(Conrtrol)菌体，使用TRIzol溶液提取总RNA。通过NanoDrop仪器(Thermo Fisher Scientific，USA)在260nm处测量RNA浓度。接下来，通过StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix with guide DNA(gDNA)Remover(GenStar,Shanghai,China)将总RNA逆转录为互补DNA(cDNA)。通过2X RealStar GreenFast Mixture(GenStar，中国上海)进行qRT-PCR以测定靶基因与内参基因rpsJ(核糖体蛋白S10编码基因)的相对mRNA表达。量化循环(Cq)的值定义为在PCR反应的延伸阶段报告荧光可与背景区分开来的循环，一式三份平均。
由图7可知，在枯草芽孢杆菌NB205(Conrtrol)中，基因ispA或基因ispE的转录水平由双sgRNA共同激活与单sgRNA激活对于目的基因转录水平增长的趋势是一致的。
3.阳性菌株A3E2、A3E3、A4E2、A4E3的MK-7提取和HPLC分析。
从上述阳性克隆菌A3E2、A3E3、A4E2、A4E3培养物(10mL)(阳性克隆菌的培养基成分为：6％葡萄糖、5％大豆蛋白胨、1.5％酵母提取物、0.3％ NaCl，其余为水)中取发酵液900μL，将其与异丙醇和正己烷以3/4/8的比例混合(发酵液/异丙醇/正己烷，V/V/V)。将混合物振荡2min得到均匀的悬浮液，然后以3000rpm离心10min，收集有机层真空蒸发，然后将干燥的沉淀物重新溶解在100μL异丙醇中，HPLC测定溶液MK-7含量。准确称取10.00mg MK-7标准品，用20mL异丙醇在50℃水浴中溶解10分钟，制成标准溶液。Agilent Infinity IIPrime LC系统与DAD检测器(波长254nm)结合用于分析MK-7滴度。使用C18色谱柱(EclipsePlusC18 RRHD 1.8μm，2.1×50mm)分离代谢物。流动相含有乙腈：乙醇(50:50，v/v)。柱温箱恒温40℃，流速0.2mL/min。制定MK-7标品标准曲线(图7)：y＝49.863x+23.813，R2＝0.9999，其中x:MK-7标品浓度，y表示峰面积。
统计分析:实验为3个重复(n＝3)，数据以平均值±标准差表示。数据统计采用t-test检验，显著性水平分别用ns(p>0.05)、***(p<0.001)表示。
结果显示：HPLC测定B.subtilis NB205中MK-7的产量发现，sgA3和sgE3的组合(均为基因激活水平1)增加最显著，比原菌株提高了93.47％(图8)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (5)

1.重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌含有名称为dCas9-α的蛋白质的编码基因和转录激活因子xylR的编码基因，所述dCas9-α是由dCas9蛋白和RNA聚合酶II的α亚基连接而成的融合蛋白，所述RNA聚合酶II的α亚基连接在所述dCas9蛋白的C端；所述重组枯草芽孢杆菌还含有名称为A3E3表达盒的DNA分子，所述A3E3表达盒包括名称为sgA3box的sgRNA表达盒和名称为sgE3box的sgRNA表达盒，所述sgA3box表达名称为sgA3的靶向于枯草芽孢杆菌的ispA基因的sgRNA，所述sgE3box表达名称为sgE3的靶向于枯草芽孢杆菌的ispE基因的sgRNA，所述A3E3表达盒的核苷酸序列为序列表中序列4第196-986位。
2.根据权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌不含有recA基因。
3.根据权利要求1或2所述重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌是通过向枯草芽孢杆菌NB205导入dCas9-α的蛋白质的编码基因、转录激活因子xylR的编码基因和所述A3E3表达盒并敲除recA基因得到的重组菌。
4.权利要求1-3中任一所述的重组枯草芽孢杆菌在制备甲萘醌-7中的应用。
5.制备甲萘醌-7的方法，其特征在于：所述方法包括培养权利要求1-3中任一所述的重组枯草芽孢杆菌，得到发酵产物，从所述发酵产物中得到甲萘醌-7。
CN202310086553.2A 2023-02-09 2023-02-09 精准调控Bacillus subtilis内源多基因表达的CRISPRa方法及其应用 Active CN116286574B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310086553.2A CN116286574B (zh) 2023-02-09 2023-02-09 精准调控Bacillus subtilis内源多基因表达的CRISPRa方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310086553.2A CN116286574B (zh) 2023-02-09 2023-02-09 精准调控Bacillus subtilis内源多基因表达的CRISPRa方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116286574A CN116286574A (zh) 2023-06-23
CN116286574B true CN116286574B (zh) 2023-12-12

Family

ID=86795074

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310086553.2A Active CN116286574B (zh) 2023-02-09 2023-02-09 精准调控Bacillus subtilis内源多基因表达的CRISPRa方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116286574B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117016673B (zh) * 2023-10-09 2024-01-30 中国农业大学 一种枯草芽孢杆菌在改善蛋鸡的肠道菌群或肠道健康或营养吸收中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107602707A (zh) * 2017-10-17 2018-01-19 湖北大学 一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9‑ω融合蛋白及其应用
KR101884659B1 (ko) * 2017-08-30 2018-08-31 주식회사 에이스바이오텍 메나퀴논-７ 생성능이 향상된 신균주 바실러스 서브틸리스 ｂｓ４ 및 이를 이용한 메나퀴논-７의 대량 생산 방법
CN109055433A (zh) * 2018-08-20 2018-12-21 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种激活内源性Ngn3和MAFA基因表达的方法
CN110157749A (zh) * 2019-06-06 2019-08-23 江南大学 应用枯草芽孢杆菌群体响应调控系统合成mk-7的方法
CN110951741A (zh) * 2019-12-27 2020-04-03 江南大学 一种基于CRISPR Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统
CN111560383A (zh) * 2020-03-14 2020-08-21 天津大学青岛海洋技术研究院 促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的重组菌及其基因修饰方法
CN114480474A (zh) * 2020-11-11 2022-05-13 海南师范大学 一种海洋微拟球藻转录激活CRISPRa系统的构建及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101884659B1 (ko) * 2017-08-30 2018-08-31 주식회사 에이스바이오텍 메나퀴논-７ 생성능이 향상된 신균주 바실러스 서브틸리스 ｂｓ４ 및 이를 이용한 메나퀴논-７의 대량 생산 방법
CN107602707A (zh) * 2017-10-17 2018-01-19 湖北大学 一种特异性调节枯草芽孢杆菌外源基因表达的dcas9‑ω融合蛋白及其应用
CN109055433A (zh) * 2018-08-20 2018-12-21 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种激活内源性Ngn3和MAFA基因表达的方法
CN110157749A (zh) * 2019-06-06 2019-08-23 江南大学 应用枯草芽孢杆菌群体响应调控系统合成mk-7的方法
CN110951741A (zh) * 2019-12-27 2020-04-03 江南大学 一种基于CRISPR Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统
CN111560383A (zh) * 2020-03-14 2020-08-21 天津大学青岛海洋技术研究院 促进枯草芽孢杆菌合成甲萘醌-7的重组菌及其基因修饰方法
CN114480474A (zh) * 2020-11-11 2022-05-13 海南师范大学 一种海洋微拟球藻转录激活CRISPRa系统的构建及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CRISPR-assisted multi-dimensional regulation for fine-tuning gene expression in Bacillus subtilis;Lu Z等;Nucleic acids research;第47卷(第7期);第3页左栏第2、3段 *
The CRISPR toolbox for the gram-positive model bacterium Bacillus subtili;Zocca V F B等;Critical Reviews in Biotechnology;第42卷(第6期);813-826 *
枯草芽孢杆菌在系统与合成生物技术中研究进展及工业应用;康倩等;生物工程学报;第37卷(第3期);923-938 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116286574A (zh) 2023-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6696282B2 (en) Fusarium sporotrichioides strains for production of lycopene
WO2019090175A1 (en) Novel crispr-associated transposon systems and components
CN116286574B (zh) 精准调控Bacillus subtilis内源多基因表达的CRISPRa方法及其应用
CN113604472B (zh) 一种应用于里氏木霉的CRISPR/Cas基因编辑系统
Chang et al. Engineering the MEP pathway enhanced ajmalicine biosynthesis
KR100945483B1 (ko) ｐｉｋＤ 조절유전자의 발현벡터를 이용한 스트렙토미세스베네주엘라에（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）에서폴리케타이드（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）의 생산성 증가방법
CN105176899B (zh) 构建生产或高产目的基因产物重组菌的方法及构建的重组菌与应用
CN112029701B (zh) 一种基因工程菌及其在制备22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用
CN110563783B (zh) 一种高效低毒四霉素b衍生物及其定向高产代谢工程方法
Kakkar et al. Agrobacterium mediated biotransformation
WO2023130191A1 (en) Production of psychedelic compounds
CN113584034B (zh) 一种与青蒿素生物合成相关的miRNA、miRNA前体及其应用
CN115820702A (zh) 一种重组大肠杆菌静息细胞催化异戊烯醇高效制备冷杉醇的方法
CN111073821B (zh) 一种高产洛伐他汀不产桔霉素红色红曲霉菌株的构建方法
CN112553245B (zh) OsPIL16基因的新用途
CN110305881B (zh) 一种聚酮类化合物neoenterocins的生物合成基因簇及其应用
CN110129355B (zh) 基于线性片段同源重组进行须糖多孢菌基因簇阻断的方法
Lin Optimization of the transformation efficiency of Agrobacterium tumefaciens cells using electroporation
CN109182240B (zh) 地衣芽孢杆菌DW2ΔphoP在杆菌肽生产中的应用
CN110129244B (zh) 链霉菌底盘菌株及其构建方法、在异源表达研究中的应用
CN112501171B (zh) 两条特异性靶向猪Pax7基因的sgRNA导向序列及应用
CN107699581A (zh) 3，7‑二羟基卓酚酮生物合成基因簇及其应用
Karbalaei-Heidari et al. Genomically integrated orthogonal translation in Escherichia coli, a new synthetic auxotrophic chassis with altered genetic code, genetic firewall, and enhanced protein expression
CN116445515B (zh) 一种参与利普斯他汀及其结构类似物合成的基因簇及其应用
CN115786229B (zh) 一种用于红球菌基因敲除的重组系统及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant