CN112852647B - 一种适用于拟茎点霉fs508的过表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种适用于拟茎点霉fs508的过表达载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于拟茎点霉FS508的过表达载体及其构建方法和应用。本发明在拟茎点霉FS508中过表达GPAT基因，所述的GPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次构建了适用于深海真菌拟茎点霉FS508的次级代谢产物生物合成基因的过表达载体，为促进lithocarpins在抗肿瘤先导化合物的应用及其他丝状真菌次级代谢生物合成基因的过表达及活性次级代谢产物生物合成效率的提升奠定了可靠的分子生物学基础。

Description

一种适用于拟茎点霉FS508的过表达载体及其构建方法和 应用
技术领域
本发明属于生物化学和分子生物学领域，具体涉及一种适用于拟茎点霉FS508的过表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
深海真菌由于其特殊生境及复杂的基因组能产生骨架新颖、生物活性独特的化合物，本发明前期从深海真菌拟茎点霉FS508(Phomopsis lithocarpus FS508)中分离获得了一系列tenellone杂合十元大环内酯的新骨架聚酮类化合物lithocarpins，且这类化合物具有显著的抗肿瘤活性。在此基础上，对P.lithocarpus FS508进行了基因组测序，预测了lithocarpins的生物合成基因簇，并从中发掘了新型的具有酰基转移和氨基转移活性的GPAT酶，预测GPAT基因是lithocarpins类化合物生物合成的关键基因。而P.lithocarpusFS508中lithocarpins生物合成效率较低。因此有必要对其采取基因工程改造以提升lithocarpins的产量，为抗肿瘤药物先导化合物的开发奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于深海真菌拟茎点霉FS508(P.lithocarpusFS508)的过表达lithocarpins生物合成基因GPAT基因的载体及其构建方法和应用。
本发明前期从深海真菌P.lithocarpus FS508中分离得到了新骨架聚酮类化合物lithocarpins，且其具有显著的抗肿瘤活性。本发明构建了适用于P.lithocarpus FS508的过表达载体，将GPAT基因插入至过表达载体，然后将重组载体通过PEG介导转化至P.lithocarpus FS508原生质体中，以提高GPAT基因的表达水平，从而提升lithocarpins类化合物的产量。为后期解析P.lithocarpus FS508中lithocarpins的生物合成途径及其开发作为抗肿瘤药物先导化合物奠定分子生物学基础。
本发明采取的技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种提高拟茎点霉FS508中抗肿瘤化合物lithocarpins产量的方法，是在拟茎点霉FS508中过表达GPAT基因，所述的GPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选，是将GPAT基因插入到表达载体中，然后转化至拟茎点霉FS508中进行过表达。
进一步优选，限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pBARGPE1-Hygro(该载体序列为公知，具体可查询网址www.miaolingbio.com)，根据酶切后的pBARGPE1的序列和GPA T序列，设计GPAT引物PBGPE1-GPAT-F：5’-gataagcttgatatcgatggcaaaaggggccg-3’，PBGE1-GPAT-R：5’-gactctagaggatcTCAGTGGTGGTGGTGGTG-3’，扩增GPAT基因片段，利用同源重组的方法将GPAT基因片段构建到已酶切的质粒pBARGPE1，构建pBARGPE1-GPAT载体，然后将pBARGPE1-GPAT载体通过原生质体转化法导入拟茎点霉FS508原生质体中。
本发明的第二个目的是提供产lithocarpins的工程菌株，其是在拟茎点霉FS508中过表达GPAT基因而获得的工程菌，所述的GPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第三个目的是提供一种适用于拟茎点霉FS508的pBARGPE1-GPAT载体的构建方法，其包括以下步骤：其是将GPAT基因插入到pBARGPE1载体中。
优选，具体方法为：
限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pBARGPE1-Hygro(该载体序列为公知，具体可查询网址www.miaolingbio.com)，根据酶切后PBGEⅠ的序列和GPAT序列，设计GPAT引物PBGE1-GPAT-F：5’-gataagcttgatatcgatggcaaaaggggccg-3’，PBGE1-GPAT-R：5’-gactctagaggatcTCAGTGGTGGTGGTGGTG-3’，扩增GPAT基因片段，利用同源重组的方法将GPAT基因片段构建到已酶切的质粒pBARGPE1，构建pBARGPE1-GPAT载体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次构建了适用于深海真菌拟茎点霉FS508的次级代谢产物生物合成基因的过表达载体，为后期其他深海真菌活性次级代谢生物合成基因的过表达提供借鉴，从而促进深海真菌的基因工程改造，同时为后期解析深海真菌拟茎点霉FS508中lithocarpins类化合物生物合成机制及发掘新型lithocarpins类化合物奠定分子生物学基础，促进lithocarpins及其类似物在抗肿瘤领域的开发利用。
本发明的深海真菌拟茎点霉FS508(Phomopsis lithocarpus FS508)公开于专利申请号CN201810974840.6，发明名称为：化合物lithocarpinol B及其制备方法和在制备抗真菌药物中的应用。
附图说明
图1为GPAT基因的PCR扩增图；
图2为潮霉素筛选GPAT基因过表达的重组P.lithocarpus FS508菌株平板图；
图3为以pBARGPE1-GPAT重组载体导入重组菌1-6#的重组菌总DNA为模板扩增原生质体的验证图；图中泳道1-8泳道分别是以水、野生菌和重组菌1-6#的总DNA为模板扩增载体中复制子ori的PCR产物；
图4为GPAT基因荧光定量PCR半定量验证图，泳道1-6为以重组菌1-6#的总DNA为模板扩增的产物；
图5为荧光定量分析重组P.lithocarpus FS508相对于野生P.lithocarpus FS508GPAT基因表达水平分析图，其中3#、5#表示重组P.lithocarpus FS508；
图6为野生和重组P.lithocarpus FS508(5#重组菌)中lithocarpins产量的HPLC分析图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：基因过表达PBGE1-GPAT载体的构建
限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pBARGPE1-Hygro，根据酶切后pBARGPE1-Hygro的序列和GPAT序列，设计GPAT引物pBARGPE1-GPAT-F：5’-gataagcttgatatcgatggcaaaaggggccg-3’，pBARGPE1-GPAT-R：5’-gactctagaggatcTCAGTGGTGGTGGTGGTG-3’，引物由广州擎科公司合成。以pET28a-GPAT质粒(是将GPAT基因转入到pET28a质粒中，所述的GPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)为模板，pBARGPE1-GPAT上下游引物(p BARGPE1-GPAT-F、pBARGPE1-GPAT-R)，PCR扩增978bp目的片段GPAT，反应体系为50μL：pBARGPE1-GPAT-F 0.5μL，pBARGPE1-GPAT-R 0.5μL，pET28a-GPAT 0.5μL，2×prime star 25μL，ddH2O23.5μL。PCR程序：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸10s，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增得到GPAT目的片段(图1)。
EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pBARGPE1-Hygro，37℃孵育3h，反应体系为30μL：E coRⅠ1μL，BamHⅠ1μL，pBARGPE1-Hygro 7μL(2μg)，FD buffer 3μL，ddH2O 18μL。同源重组将GPAT的PCR产物(GPAT目的片段)构建到双酶切的pBARGPE1载体，成功构建pBARGPE1-GPAT载体(即将如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的GPAT基因插入到p BARGPE1-Hygro的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点之间)，将构建成功的重组PBARGPE1-GPAT载体转至Trans5a感受态细胞，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴3min，加入无抗LB液体培养基500μL，37℃，180rpm 1h，4000rpm离心3min。弃上清400μL，剩余菌液轻轻混匀，取50μL均匀涂在含有氨苄的LB固体培养基。37℃过夜培养。挑取转化子扩大培养，菌液PCR扩增GPAT并测序筛选阳性克隆转化子，将验证正确的阳性克隆扩大培养，提取质粒送擎科测序。
实施例2
前期对深海真菌P.lithocarpus FS508用潮霉素抗性PDA平板筛选，在潮霉素浓度为100μg/mL，将P.lithocarpus FS508接种于PDA液体培养基培养48h，取生长较好的菌球湿重5g，PBS洗涤菌体3次。0.15g裂解酶溶解于20mL KC buffer，并用0.22μm滤膜过滤，28℃80rpm裂解3h。用6张擦镜纸和200目细胞筛再次过滤。滤液在4℃，5000rpm离心5min，弃上清，向沉淀中加入5mL KC buffer轻轻吹打混匀，4℃4000rpm离心5min。再向沉淀中加入1mLKC buffer，轻轻吹打混匀，即获得P.lithocarpus FS508原生质体。而后镜检，观察P.lithocarpus FS508原生质体的形态和数量。
按深海真菌P.lithocarpus FS508原生质体1×108CFU加5μg PBARGPE1-GPAT质粒，加400μL PEG4000；空白对照取原生质体1×107CFU加PEG 4000 400μL，冰置30min，再加入700μL PEG4000，冰置25min。最后加WI至10mL。28℃80rpm培养12h。取1mL空白对照原生质体至PDA固体培养基中，然后倒平板，再取1mL空白对照原生质体加入含100μg/mL PDA固体培养基中，倒平板，最后取1mL导入质粒的原生质体加入含100μg/mL潮霉素的PDA固体培养基倒平板，28℃培养7天。
实施例3：P.lithocarpus FS508中GPAT基因过表达分析
将实施例2筛选出的单菌落转接到PDA平板扩大培养(图2)，分别提取基因组和RNA，并将RNA逆转录为cDNA。以基因组为模板，PCR扩增PBARGPE1中的ColE1复制子，验证质粒是否导入P.lithocarpus FS508原生质体中，引物为ori-F:5’-ttgagatcctttttttctgcgc-3’和ori-R:5’-tttccataggctccgccccc-3’。野生菌中无法扩增得到589bp的片段，重组菌中1-6#中可扩增得到589bp的片段(图3)。证明PBARGPE1-GPAT质粒成功导入P.lithocarpus FS508。设计GPAT qPCR引物，先进行半定量PCR，初步分析GPAT的表达量(图4)。然后进行qP CR，根据Ct值采取2ΔΔCt的计算公式分析重组菌中GPAT相对于野生菌的表达量(图5)。GP ADH作为内参基因。3#和5#菌株中GPAT相对表达水平分别是野生菌株的7倍和25倍左右。荧光定量引物分别为qPCR-F:5’-ggcctgtggcagagcattgaaag-3’，qPCR-R:5’-gtatggggtaggagaggtg agcac-3’；内参基因引物GADPH-F:5’-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3’，GADPH-R:5’-CAG TGGGAACACGGAAAGC-3’。半定量PCR程序，半定量反应体系10μL：qPCR-F 0.5μL，q PCR-R 0.5μL，cDNA 1μL(100ng)，2×Taq master mix 5μL，ddH2O 3μL；GADPH-F 0.5μL，GADPH-R 0.5μL，cDNA 1μL(100ng)，2×Taq master mix 5μL，ddH2O3μL。PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min，然后进行琼脂糖凝胶电泳验证。荧光定量PCR反应体系20μL：qPCR-F 0.5μL，qPCR-R 0.5μL，cDNA 1μL(100ng)，2×Taq master mix 5μL，ddH2O 3μL；GADPH-F0.5μL，GADPH-R 0.5μL，cDNA 1μL(100ng)，2×Taq master mix 5μL，ddH2O 3μL。PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；最后72℃延伸10min。
实施例4：P.lithocarpus FS508中GPAT基因过表达产物分析
接种野生P.lithocarpus FS508菌株和GPAT基因过表达的P.lithocarpus FS508菌株(重组菌5#)至PDA培养基中，28℃，180rpm条件下培养7天。乙酸乙酯萃取发酵产物，旋转蒸发浓缩至干燥。用1.5mL色谱甲醇溶解粗提物。将溶解后的粗提物上样至HPLC(岛津LC-20A)，用C18柱(4.6×250mm)进行分析检测。检测条件为：40min内洗脱液从30％乙腈增加至100％乙腈，流速为1.0mL/min。以从P.lithocarpus FS508中分离得到tenellone B和lithocarpin A单体化合物为标准品，对比分析lithocarpins产量。图6结果表明，lithocarpin A单体峰保留时间为22.5min左右，野生P.lithocarpus FS508菌株中由于发酵量较小、发酵条件尚需优化及HPLC灵敏度相对低，几乎没有检测到tenellone B和lithocarpin A，而GPAT基因过表达P.lithocarpus FS508菌株中lithocarpin A和tenellone B对应峰峰高峰面积显著增加，说明lithocarpin A和其前体tenellone产量显著提升。
序列表
<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一种适用于拟茎点霉FS508的过表达载体及其构建方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 978
<212> DNA
<213> 拟茎点霉FS508(Phomopsis lithocarpus FS508)
<400> 1
atggcaaaag gggccgcccg atcgaatgga aaacgcgcca agcagtctcg acttcagcat 60
ctcgacccct taatcagcac acggagagag gacggcctgt ggcagagcat tgaaagggat 120
gaggcagaat tggcatcttc tgacaatgat tctactgtca gtcccgtcaa tgagccatct 180
ttggtagcaa aggagaaggg tgcttccggc caagatgtcg ttcactggcc tcaccaagac 240
ctctcgacgg ccagacaaac gtccaggacc tcagagacgc tgtctgctga tgacatcaag 300
cccataaagg aagagaacaa ttcagccagc caacgctcca taaccccaac caaggccgac 360
atcctagcca gcgtgctcac ctctcctacc ccatacccaa gtcttccaac gcccgctcgc 420
cctgttacaa acgcacctca agctgcacca ccgacaccag ctcagactcc gccagcacca 480
aagaggcgca ggggaagacc caggaagtcg agaaacgccc caaactggaa caggcgccgc 540
cgcgtccgct tctccgaccc cattccgtcc aacgatccag atccacggcc agaagaacct 600
cgagacaccc acgtcttcgt ccgtctgctc aagatagtcg tcaccgtcga cgatccccct 660
ccatcccaga gacaggaatt ggggtggaat aatcggtcca agggttggag actggccggg 720
gagaggagcg agcggaacat tggggatatt ggcgagctgt ttgacgatct gtcggtgcac 780
ggctcgcaat tgacggtcct tcttgcccct acggttggta gaggagcccg ggagccggtg 840
gagatgagct ggaacgcggt gagatggtgt ttccagggtg ccaatcagga ccttgggagt 900
ttgtcggtcg ctttgggcga gatgaaagac atggtgaagg atccgtgggc gaggcaattt 960
gttggacacg tgctgtgt 978

Claims (7)

1.一种提高拟茎点霉FS508中抗肿瘤化合物lithocarpins产量的方法，其特征在于，是在拟茎点霉FS508中过表达GPAT基因，所述的GPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，是将GPAT基因插入到表达载体中，然后转化至拟茎点霉FS508中进行过表达。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pBARGPE1-Hygro，根据酶切后的pBARGPE1的序列和GPAT序列，设计GPAT引物pBARGPE1-GPAT-F：5’-gataagcttgatatcgatggcaaaaggggccg-3’， pBARGPE1-GPAT-R：5’-gactctagaggatctcagtggtggtggtggtg-3’，扩增GPAT基因片段，利用同源重组的方法将GPAT基因片段构建到已酶切的质粒pBARGPE1，构建pBARGPE1-GPAT载体，然后将pBARGPE1-GPAT载体通过原生质体转化法导入拟茎点霉FS508原生质体中。
4. 一种产lithocarpins的工程菌株，其特征在于，是在拟茎点霉FS508中过表达GPAT基因而获得的工程菌，所述的GPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5. 一种适用于拟茎点霉FS508的pBARGPE1-GPAT载体的构建方法，其特征在于，是将GPAT基因插入到pBARGPE1载体中，所述的GPAT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pBARGPE1-Hygro，根据酶切后PBGEⅠ的序列和GPAT序列，设计GPAT引物PBGE1-GPAT-F：5’-gataagcttgatatcgatggcaaaaggggccg-3’， PBGE1-GPAT-R：5’-gactctagaggatctcagtggtggtggtggtg-3’，扩增GPAT基因片段，利用同源重组的方法将GPAT基因片段构建到已酶切的质粒pBARGPE1，构建pBARGPE1-GPAT载体。
7.一种根据权利要求5或6所述的构建方法构建得到的pBARGPE1-GPAT载体。
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