CN107746849B - 一种甾体羟化酶基因的高效筛选方法 - Google Patents

一种甾体羟化酶基因的高效筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种甾体羟化酶的高效筛选方法。本发明针对雷斯青霉的生长特性和产酶特性，获得了雷斯青霉专用的高效产孢培养基，然后通过筛选合适的助溶剂和建立最佳诱导条件进一步强化了诱导过程对目标基因转录表达的良性驱动，同时引入转录组测序和qRT‑PCR组合的方法借助计算机分析生物信息学信息形成了高效筛选具备C15α位羟化酶功能编码基因的识别方法，获得来源于雷斯青霉的C15α位羟化酶编码基因，在原始基因序列的基础上通过进一步筛选获得编码高活性C15α位羟化酶的新基因。

Description

一种甾体羟化酶基因的高效筛选方法
技术领域：
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种甾体羟化酶基因的高效筛选方法。
背景技术：
孕二烯酮(化学名：18,19-二去甲基孕甾-4,15-二烯-13-乙基-17β-羟基-3-羰基-20-炔)是迄今为止活性最强、有效剂量最低的口服避孕药，几乎无雄激素与雌激素活性，具有良好的避孕效果和极少的副作用，因而被广泛使用。C15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是孕二烯酮合成过程最重要的中间体，因此，高效获得高纯度的C15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是制造孕二烯酮最关键的环节。
目前C15α-羟基左旋乙基甾烯双酮仅能通过化学合成获得。合成过程需要昂贵的Pb(OAc)2和Bu3SnOMe作为催化剂，该反应过程副产物较多严重影响了C15α-羟基左旋乙基甾烯双酮产物的纯度。
与化学合成方法相比，生物催化反应具有很高的立体选择性、区域选择性和化学选择性，技术核心即是获得可专一性羟化C15α位的生物催化剂。雷斯青霉作为全细胞已被成功用于C15α位羟化左旋乙基甾烯双酮生产C15α-羟基左旋乙基甾烯双酮。然而由于雷斯青霉全细胞中除了具有C15α位羟化的酶之外还具有其他位置催化酶，导致C15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的转化率仅为60～70％。筛选鉴定获得单一催化活性的C15α位的羟化酶则可以从根本上解决C15α-羟基左旋乙基甾烯双酮生物法转化的技术难题，并形成高效的C15α-羟基左旋乙基甾烯双酮生物法制造新方法。
本发明首先针对雷斯青霉的生长特性和产酶特性，获得了雷斯青霉专用的高效产孢培养基，为建立后续高灵敏度的诱导表达筛选系统奠定了基础，然后通过筛选合适的助溶剂和建立最佳诱导条件进一步强化了诱导过程对目标基因转录表达的良性驱动，同时引入转录组测序和qRT-PCR组合的方法借助计算机分析生物信息学信息形成了高效筛选具备15α位羟化酶功能编码基因的识别方法，获得来源于雷斯青霉的15α位羟化酶编码基因。在原始基因序列的基础上通过进一步筛选获得编码高活性15α位羟化酶的新基因。
发明内容：
本发明以具备C15α位羟化左旋乙基甾烯双酮生成15α-羟基左旋乙基甾烯双酮能力的雷斯青霉为出发菌株，通过引入不同的原料组合筛选获得了高效产孢培养基，以获得足量的雷斯青霉孢子并简化菌体培养环节，通过筛选最佳的助溶剂和优化诱导剂的添加剂量及时机建立了雷斯青霉C15α位羟化相关基因的高效诱导方法，并通过建立高效的cDNA内标标定方法和RT-PCR荧光定量分析方法鉴别诱导前后目标功能基因的表达剂量差异性成功获得了C15α位羟化酶的编码基因。相关基因经密码子优化后全合成对应序列，并作为模板在通用长引物的介导下采用低温易错PCR，进一步筛选获得编码高活性C15α位羟化酶的新基因。
所述C15α-羟化酶基因筛选方法具体如下：
(1)采用高效产孢培养基培养雷斯青霉
所述高效产孢培养基是在雷斯青霉常用培养基的基础上添加以下固型粉料中的至少一种形成：玉米秸秆粉碎物，小麦秸秆粉碎物，高粱秸秆粉碎物，水稻秸秆粉碎物，玉米芯粉碎物，豆粕粉碎物，木屑粉碎物，麸皮粉碎物，鱼粉粉碎物，贝壳粉碎物；
所述常用培养基为PDA培养基、麦芽汁培养基，牛肉浸膏培养基，马丁氏培养基，察氏培养基，沙氏培养基等；
优选地，固型粉料的添加量为1-10g/L；
优选地，固型粉料由玉米芯粉碎物和木屑粉碎物组成；
更优选地，玉米芯粉碎物和木屑粉碎物的比例为：0.3～6；
优选地，固型粉料由豆粕粉碎物和小麦秸秆粉碎物组成；
更优选地，豆粕粉碎物和小麦秸秆粉碎物的比例为：0.8～4；
优选地，产孢条件为：25～28℃，湿度60～65％，培养72h；
(2)雷斯青霉菌丝体培养
用无菌水将雷斯青霉孢子洗下，制备孢子悬液并接种到培养基中，进行菌丝体培养；
(3)诱导转化
诱导组菌丝体培养24h后添加0.01-0.02％的底物进行诱导3.5～7.0h，之后再投加0.1％的底物进行甾体转化，并以不进行诱导的转化过程做对照组；
投加底物进行甾体转化的同时，每50mL培养基加入10μL蛋白质合成抑制剂；
所述底物由助溶剂溶解，所述的助溶剂为甲醇、乙醇、乙二醇、乙酸乙酯、己酸己酯、二甲亚砜、N,N-二甲基酰胺(DMF)、乙腈或丙酮中的至少一种；
所述助溶剂的添加量为底物的1％(V：m)；
优选地，助溶剂为甲醇、二甲亚砜或DMF；
优选地，诱导时间为6～7h；
(4)雷斯青霉总RNA的提取、纯化和cDNA的合成
转化完成后，分别提取诱导组和对照组雷斯青霉的总RNA；去除基因组DNA后进行转录组测序和cDNA的合成；
(5)qRT-PCR分析筛选目的基因
①转录组测序后挑选开放阅读框(ORF)完整的基因作为候选基因，将候选基因与已报到的P450酶家族基因进行比对，获得目标基因；
②根据筛选出的目标基因设计qRT-PCR引物，选择内参基因做对照，计算目标基因诱导组与对照组的表达差异倍数，确定最终的目的基因；
进一步地，内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)；
进一步地，表达差异倍数通过2—△△Ct法算出；
进一步地，以诱导组与对照组的总RNA为模板，反转录合成第一链cDNA，分别以两种cDNA为模板，PCR扩增内标基因，确定反转录合成cDNA的质量；
进一步地，所述内标基因包括雷斯青霉已报到的所有相关基因，如beta-tubulin，alkaline serine protease，calmodulin等；
进一步地，所述内标基因为beta-tubulin基因；
③以质量稳定的第一链cDNA为模板，扩增获得目的基因的完整核苷酸序列，并通过筛选获得高活性C15α位羟化酶基因；
所述筛选的方法包括但不限于易错PCR、定点突变、紫外诱变、亚硝基胍诱变、钴60诱变或等离子束诱变等；
进一步地，本发明筛选获得的新基因可以通过建立的大肠杆菌验证平台进行高效表达，并鉴定其催化功能。该鉴定筛选方法同样适用其他常见的微生物宿主表达平台菌株，如酿酒酵母，毕赤酵母，乳酸克鲁维酵母，谷氨酸棒杆菌，枯草芽胞杆菌，地衣芽孢杆菌杆菌，黑曲霉，米曲霉等等。
有益效果：
1、本发明提供的高效产孢培养基提高产孢效率，以一步产孢培养取代菌体多次传代放大过程，从而获得诱导过程所需的高密度孢子，菌体经过12h培养，孢子数可达1012/100g级别；
2、本发明优化形成的最佳诱导剂量和诱导时间可使在最佳诱导条件下RNA转录水平的差异被显著检测到；同时使用上述RNA逆转录获得的cDNA形成量的差异性也可以被显著检测到；
3、本发明可以筛选获得未知功能的新基因，特别是对于已获得相应序列并已知可能的几种催化属性的新基因可以快速获得；另外，本发明还可以高效的进行多个基因的同步筛选，具备筛选通量大筛选周期短和筛选效果显著的综合特征。
附图说明：
图1重组大肠杆菌239，613和1280表达C15α位羟化酶转化产物的TLC结果
其中，1：左旋乙基甾烯双酮底物标品；2：15α-羟基左旋乙基甾烯双酮标品；3:C15α位羟化酶重组大肠杆菌239转化60h样本；4:C15α位羟化酶重组大肠杆菌613转化60h样本；5:C15α位羟化酶重组大肠杆菌1280转化60h样本；
图2重组大肠杆菌15134表达C15α位羟化酶转化产物的TLC结果
其中，1：左旋乙基甾烯双酮底物标品；2：15α-羟基左旋乙基甾烯双酮标品；3:C15α位羟化酶重组大肠杆菌15134转化30h样本；4:C15α位羟化酶重组大肠杆菌15134转化40h样本；5:C15α位羟化酶重组大肠杆菌15134转化48h样本。
具体实施方式：
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法，其中所用的试剂，如无特别说明，均为常规市售试剂。
本发明按照以下实施方案进行实施：
1.目的基因来源菌株为雷斯青霉(Penicillium Raistrickii)ATCC10490(ATCC10490菌株已公开在非专利文献《15a-Hydroxylation of a steroid(13-ethyl-gon-4-en-3,17-dione)by Penicillium raistrickii in an ionic liquid/aqueousbiphasic system》Biotechnol Lett(2012)34:2113-2117中)；目的基因获得后的表达菌株为大肠杆菌E.coli BL21。
2.雷斯青霉培养使用培养基为PDA培养基：称取土豆200g，加水煮沸30min，六层纱布过滤，加入20g葡萄糖，补水至1L，115℃灭菌20min；固体或斜面培养基添加15g琼脂粉。
大肠杆菌培养使用LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，去离子水溶解后，终体积定容至1L，调节pH至7.0，加入15g琼脂粉，121℃灭菌20min。
3.雷斯青霉的培养及孢子悬液的制备
将雷斯青霉孢子接种于PDA斜面培养基，28℃培养箱恒温培养3～5d。待孢子成熟后，无菌水洗下分生孢子，取出一部分用血球计数板计数，再用无菌水调节孢子悬液至一定浓度备用。本发明专用的产孢培养基即为PDA培养基基础上添加不同来源的秸秆等粉碎物筛选获得。具体包括玉米秸秆粉碎物(A)，小麦秸秆粉碎物(B)，高粱秸秆粉碎物(C)，水稻秸秆粉碎物(D)，玉米芯粉碎物(E)，豆粕粉碎物(F)，木屑粉碎物(G)，麸皮粉碎物(H)，鱼粉粉碎物(I)，贝壳粉碎物(J)等。
4.雷斯青霉菌丝体的培养
用无菌水将斜面上的雷斯青霉孢子洗下，调节孢子悬液至1×107个/mL。将上述孢子悬液接种到2个装有50mL PDA培养基的三角瓶中，每个三角瓶中加入1mL孢子悬液，并分别标记1号和2号，28℃，180r/min摇床培养。
5.诱导实验及甾体底物投料
本实验采用的助溶剂为甲醇，乙醇，乙二醇，乙酸乙酯，己酸己酯，二甲亚砜，N,N-二甲基酰胺(DMF)，乙腈和丙酮等，将甾体底物(本发明中采用的甾体底物为左旋乙基甾烯双酮)与助溶剂以适当比例充分混合，至底物完全溶解备用。
菌丝体培养约24h后，在2号三角瓶(诱导组)中加入0.005-0.02％的底物进行诱导，1号瓶(对照组)不添加，3.5～7.0h后，收集并洗涤菌体，然后在1、2号瓶各加入0.1％的底物和10μL蛋白质合成抑制剂进行甾体转化实验。培养条件为：摇床转速180r/min，转化温度28℃，相同条件下转化48h后，取样处理分析。
6.转化产物的硅胶薄层层析(TLC)分析
样品处理：取500μL 48h的菌体发酵液，加入200μL的乙酸乙酯混匀，12000r/min离心10min，取上层乙酸乙酯层20μL，用直径为0.5mm的毛细管在硅胶层析板上进行TLC实验。点样位于在距层析板下底边约1cm处，样点间距0.5cm。
层析：将点样好的硅胶板放入层析缸中展开，加盖，密封，待展开剂前沿距顶端1-2cm时，取出点样板，烘干，在紫外检测仪下观察层析结果。
7.转化产物的高效液相色谱(HPLC)分析
样品制备：取50mL培养48h的发酵液，加入20mL的乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层，通过旋转蒸发仪将乙酸乙酯除去，用10mL的乙腈将残余物重新溶解，离心除去沉淀，过0.45μm微孔滤膜后，以备HPLC分析。
色谱条件：检测器：Shimadau SPD型UV-VIS检测器；色谱柱Kromasil C18(250mm×4.6mm i.d,Du pon)；流动相：乙腈：水(80：20)；流速1mL/min；检测波长241nm；进样量10μL。
转化率的计算：以转化产物的峰面积与所有物质(包括底物和产物)峰面积总和之比来表示。
8.雷斯青霉总RNA的提取、纯化和cDNA的合成
分别从1号和2号三角瓶中取菌体以Trizol法提取总RNA，即具体方法详见市售真菌总RNA快速提取试剂盒。
用DNAaseI处理RNA样品，适量的DEPC H2O溶解后，琼脂糖凝胶电泳，确认是否去除基因组DNA。将纯化后的经过诱导6h的雷斯青霉ATCC10490RNA 300μL送至深圳华大基因科技有限公司进行转录组测序。
采用Invitrogen公司提供的反转录试剂盒，对得到的RNA进行反转录合成cDNA的第一链，在70℃水浴中保温15min后立即放在冰上冷却并放于-70℃保存备用。
根据转录组测序结果，设计一对特异性引物tublin-F和tublin-R，以该基因为内参基因，以上述获得cDNA作为模板，进行PCR验证。
tublin-F：AACCATCTCCGGTGAGCACG
tublin-R：GCATGCAGATATCGTACAGAGC
按照以下程序进行PCR：94℃预变性5min，后94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环，之后72℃终延伸10min，4℃保存。
9.雷斯青霉转录组测序信息分析
根据雷斯青霉转录组测序所得预测的P450基因序列结果，筛选出目标基因。将筛选出来的片段设计qRT-PCR引物，选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因作为内参对照基因(以下简称GAPDH)进行qRT-PCR；
采用北京康为世纪生物科技有限公司的定量PCR试剂盒，qRT-PCR反应体系(20μL)：
Master mix 10μL
上游引物(10μmol/L) 0.2μL
下游引物(10μmol/L) 0.2μL
模板cDNA 1μL
ddH<sub>2</sub>O 8.6μL
反应条件：
95℃预变性10min，后95℃变性15s，58℃退火1min，95℃变性15s，共40个循环，之后60℃退火1min，95℃变性15s，4℃保存。
qRT-PCR过程中的Ct值表明扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数，我们利用每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在的线性关系来查看目标基因在雷斯青霉经过诱导和不经过诱导两种情况下的表达差异。
表达差异倍数通过2—△△Ct法算出：
具体步骤为：
(1)目标基因的Ct值-内参基因的Ct值＝ΔCt；
(2)实验样本的ΔCt值-对照样本的ΔCt值＝ΔΔCt；
(3)计算表达水平比率：2—△△Ct＝表达量的比值。
采用北京康为世纪生物科技有限公司的定量PCR试剂盒实施定量PCR过程。
10.目的基因片段的克隆和在大肠杆菌中的表达
根据qRT-PCR筛选方法确定的目的基因核酸序列，设计基因的上下游引物，以上述合成cDNA作为模板，进行PCR获得目的基因的全片段。
将纯化回收得到的目的基因与pET-22b载体(购自上海生工生物有限公司)进行连接(克隆位点根据基因序列合理选择)转化E.coli BL21感受态。根据质粒抗性筛选阳性克隆，并碱法快速小量提取重组质粒酶切验证。
11.目的基因核酸序列的优化
在筛选获得的目的基因核酸序列基础上，根据大肠杆菌密码子偏好性优化目的基因的核酸序列并进行全基因合成(密码子优化的同时消除新合成基因中的HindIII和EcoRI位点)。合成获得的目的基因片段作为模板，采用长引物低退火温度(40～50℃)易错PCR筛选获得高活性目的酶的编码基因。目的片段克隆入pET-22b载体的HindIII和EcoRI位点。筛选阳性重组菌用于后续发酵和催化功能验证。
12.重组大肠杆菌的发酵培养及其甾体转化
将经验证正确的含表达载体的重组大肠杆菌接种于装有30mL LB诱导培养基的250mL发酵瓶中，以携带pET-22b载体空质粒的大肠杆菌BL21作为对照，置回转式摇床于200r/min，30℃培养约18h后，投入0.1％底物进行转化。转化条件为：摇床转速200r/min，转化温度为37℃，转化时间为24h-48h。转化结束后，取样处理分析。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1:产孢培养基的筛选及最优产孢培养基制备孢子
按照实施方案步骤1～3中描述的菌种培养方法和产孢方法，在PDA培养基的基础上每升添加3g固型粉料即为产孢培养基。固型粉料包括：玉米秸秆粉碎物(A)、小麦秸秆粉碎物(B)、高粱秸秆粉碎物(C)、水稻秸秆粉碎物(D)、玉米芯粉碎物(E)、豆粕粉碎物(F)、木屑粉碎物(G)、麸皮粉碎物(H)、鱼粉粉碎物(I)或贝壳粉碎物(J)中的至少一种。使用上述产孢培养基25～28℃，湿度60～65％，培养72h，可收集孢子量如表1所列。E、G组合和F、B组合用于后续大量孢子的制备，孢子制备量为2.9×1012～9.8×1012个/100g产孢培养基。相同条件培养条件下PDA相同条件下获得孢子量为3.0×107个/100g产孢培养基。
表1：不同固型粉料组份1:1组成的产孢培养基获得孢子总量(个/100g)
B C E G I
A 1.6×10<sup>10</sup> 2.2×10<sup>11</sup> 3.8×10<sup>10</sup> 6.2×10<sup>11</sup> 1.2×10<sup>10</sup>
B 2.0×10<sup>9</sup> 4.0×10<sup>10</sup> 2.1×10<sup>10</sup> 4.5×10<sup>12</sup> 5.5×10<sup>11</sup>
C 2.0×10<sup>10</sup> 7.2×10<sup>11</sup> 1.7×10<sup>11</sup> 2.0×10<sup>10</sup> 6.7×10<sup>10</sup>
D 5.8×10<sup>11</sup> 5.2×10<sup>12</sup> 4.7×10<sup>11</sup> 3.5×10<sup>11</sup> 9.0×10<sup>10</sup>
E 3.7×10<sup>10</sup> 1.3×10<sup>11</sup> 4.4×10<sup>10</sup> 8.9×10<sup>12</sup> 2.0×10<sup>11</sup>
F 6.9×10<sup>12</sup> 8.5×10<sup>10</sup> 6.1×10<sup>11</sup> 2.7×10<sup>10</sup> 7.5×10<sup>11</sup>
G 2.5×10<sup>10</sup> 3.2×10<sup>11</sup> 1.9×10<sup>12</sup> 6.8×10<sup>11</sup> 8.3×10<sup>10</sup>
H 1.0×10<sup>9</sup> 4.9×10<sup>11</sup> 6.6×10<sup>10</sup> 2.3×10<sup>12</sup> 5.4×10<sup>11</sup>
I 1.3×10<sup>11</sup> 2.2×10<sup>10</sup> 4.1×10<sup>11</sup> 5.3×10<sup>11</sup> 2.0×10<sup>11</sup>
J 3.0×10<sup>10</sup> 2.9×10<sup>11</sup> 7.6×10<sup>10</sup> 9.2×10<sup>10</sup> 1.5×10<sup>12</sup>
表2不同比例及添加量的E、G和F、B组合的产孢培养基获得孢子总量(个/100g)
1g/L 5g/L 8g/L 10g/L
E：G＝0.3 5.4×10<sup>11</sup> 7.1×10<sup>12</sup> 7.9×10<sup>12</sup> 8.2×10<sup>12</sup>
E：G＝6 9.1×10<sup>12</sup> 10.3×10<sup>12</sup> 10.8×10<sup>12</sup> 11.2×10<sup>12</sup>
E：G＝3 9.0×10<sup>12</sup> 10.0×10<sup>12</sup> 10.5×10<sup>12</sup> 11.0×10<sup>12</sup>
F：B＝0.8 9.5×10<sup>11</sup> 1.2×10<sup>12</sup> 2.0×10<sup>12</sup> 2.5×10<sup>12</sup>
F：B＝4 8.0×10<sup>12</sup> 9.2×10<sup>12</sup> 9.8×10<sup>12</sup> 10.5×10<sup>12</sup>
F：B＝2 9.0×10<sup>12</sup> 9.1×10<sup>12</sup> 9.7×10<sup>12</sup> 10.4×10<sup>12</sup>
实施例2：最佳诱导条件下C15α位羟化效果
按照实施方案步骤4～7描述的方法，不同诱导条件下羟化功能对比方法为，将底物和助溶剂充分混匀后加入雷斯青霉培养液中，诱导后收集菌体并使用生理盐水重悬洗涤菌丝体，然后添加0.1％的底物左旋乙基甾烯双酮进行羟化过程，羟化过程实施48h后HPLC方法测定产物15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的生成量和底物左旋乙基甾烯双酮的残留量(色谱条件：检测器：Shimadau SPD型UV-VIS检测器；色谱柱Kromasil C18(250mm×4.6mm i.d,Du pon)；流动相：乙腈：水(80：20)；流速1mL/min；检测波长241nm；进样量10μL。)。产物与底物的比值即为相对羟化比例。
助溶剂分别使用甲醇，乙醇，乙二醇，乙酸乙酯，己酸己酯，二甲亚砜，N,N-二甲基酰胺(DMF)，乙腈和丙酮，添加量均为底物的1％；诱导时底物的添加剂量分别为0.005％，0.01％，0.015％和0.02％；诱导时间分别为3.5h，5h，6h，7h。相对羟化比例为：羟化获得的产物总量除以添加的底物总量(批次实验中底物的添加总量一致)，如表3所示。可见最佳助溶剂为甲醇或二甲亚砜或DMF，诱导时底物最佳添加剂量为0.01～0.02％，最佳诱导时间为6～7h。
表3助溶剂的筛选及底物使用条件的优化
Figure BDA0001424772400000101
实施例3：qRT-PCR分析筛选目标基因
按照实施方案步骤8～9中的方法，过滤收集经诱导组和对照组的菌丝体，采用TRIZOL试剂法提取总RNA。将上述所提总RNA送去测序公司进行转录组测序，整理出测序获得的较完整的开放阅读框(ORF)作为候选基因用于后续比对分析。C15α位羟化酶属于典型P450相关酶家族，将挑选出开放阅读框ORF相对比较完整的候选基因序列与NCBI生物信息库平台已报到并注解为P450酶家族的基因序列进行分析，有15个基因注解是编码细胞色素P450氧化还原酶(Cytochrome P450 Reductase，简称CPR)的，CPR是细胞色素P450氧化酶中的电子唯一供体，参与甾体药物合成和人体内一系列外源化合物代谢的过程，是细胞色素P450系统中的重要组成部分，也是与C15α位羟化酶功能最类似的一类酶。因此优先上述15个基因的碱基序列作为目标序列，设计相应的上下游引物并用于后续qRT-PCR筛选鉴定过程。
根据筛选出来的目标序列片段设计qRT-PCR引物，同时选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因作为内参对照基因(以下简称GAPDH)进行qRT-PCR。
表4 15个目标基因的引物及其退火温度
Figure BDA0001424772400000111
Figure BDA0001424772400000121
qRT-PCR过程中的Ct值表明扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数，我们利用每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在的线性关系(即起始拷贝数越多其Ct值越小)，来查看目标基因在雷斯青霉经过诱导和不经过诱导两种情况下的表达差异。
表达差异倍数通过2—△△Ct法算出：
具体步骤为：
(1)目标基因的Ct值-内参基因的Ct值＝ΔCt；
(2)诱导组样本的ΔCt值-对照组样本的ΔCt值＝ΔΔCt；
(3)计算表达水平比率：2—△△Ct＝表达量的比值。
表5目标基因在qRT-PCR过程中的Ct值
Figure BDA0001424772400000122
Figure BDA0001424772400000131
抽提雷斯青霉总RNA后，根据Invitrogen公司提供的逆转录试剂盒以oligo-dT为引物反转录合成第一链cDNA，得到诱导组和对照组的cDNA。分别以两种cDNA为模板进行PCR，扩增所用的引物是根据在雷斯青霉整个生长过程中表达稳定的内参基因tublin的cDNA基因序列设计一对特异性引物：
tublin-F：AACCATCTCCGGTGAGCACG；
tublin-R：GCATGCAGATATCGTACAGAGC。
经0.8％的琼脂糖电泳检测PCR产物，得到产物大小约为600bp(该基因cDNA长度约为600bp)，与预测目的片段的大小一致，说明合成的cDNA质量较好。以此cDNA为模板，使用上述转录组测序筛选获得的优秀目的基因239，613和1280的上下游引物扩增获得目的基因的完整核酸序列用于后续研究。
实施例4：目的基因在大肠杆菌中克隆表达及功能验证
按照实施方案步骤10描述的方法，在目的基因239，613和1280上游引物中引入EcoRI位点，在其下游引物中引入XhoI位点，重新合成引物，并以实施例3中制备的cDNA为模板扩增获得目的基因239，613和1280全序列，并克隆入表达载体pET-22b的EcoRI和XhoI位点，转化E.coli BL21感受态。获得的重组菌按照实施方案步骤12描述的方案进行甾体转化。结果如图1所示，成功实现了目的基因239，613和1280在大肠杆菌中的表达。
实施例5：目标基因经密码子优化和易错PCR进化后大肠杆菌中表达及功能验证
按照实施方案步骤11描述的方法，根据239，613和1280的核酸序列，参照大肠杆菌K12的密码子偏好性优化上述核酸序列(密码子优化过程避免HindIII和EcoRI位点的形成)并作为模板，设计上下游长引物(序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)并分别在上下游引物中引入EcoRI和HindIII位点，获得的易错PCR片段克隆入表达载体pET-22b的EcoRI和HindIII位点。筛选获得转化效率最高的阳性转化子，命名为重组大肠杆菌15134，其所含的C15α位羟化酶如SEQ ID No.3所示。获得的重组菌按照实施方案步骤12描述的方案进行甾体转化。结果如图2所示，经HPLC分析确认，以0.1％左旋乙基甾烯双酮为底物，转化40h时，底物全部转化完成，15α-羟基左旋乙基甾烯双酮的终浓度达到0.985g，转化率达98％以上。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种甾体羟化酶基因的高效筛选方法
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccggaattca tggtactctt ccatagtcct tccatagtcc ttcactttgc ttggcagact 60
tg 62
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccaagctta gacaggtaac gtccgcgtcg ctgccatgga ttttggccca ctgtggctac 60
ttcggccc 68
<210> 3
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggttctgg ctctggctat ggctcgttct gctaacttcg actctatccc gccgatgcgt 60
gctgcttctt gcctggctgg ttgccacaac aaacacctgg gtcgttactc tggtaccttc 120
aaaaccggtt gggaatttac caacaaaaaa gctaaatctc gtttcaccga atcttgccgt 180
gacctgatcg ctatgccgcg ttctgaccgt cgtggtgttt gcaaaggtat gccgccggaa 240
aaacgtgctg aagttgctcg tgctacccag ccgatcatcg ttctgcaccc gaaatacatc 300
gacgaaatca aatctcaccc ggacctgtct ttcgctgacg ctgttaaaaa agttgacacc 360
cagccggaaa tgtctggtac ccgtgaaggt ttcgctaaat gctctggtct gtctgcttct 420
ccgcagtgga acggtgacga atgctaccgt gttgcttctc tgaccgtttt ccgtgctctg 480
tctcactcta ccgttgaacg tcgttaccag gctgaacgtc tggttacccc ggacctgccg 540
aaagacaccc tgcaccgtat gatcctgggt ctgcacaacc gtcagcgtca ctctatctac 600
aacggtgaag ttgttcgtat cgctccggac gaactgtctc gtaccggtca cggtcagaaa 660
cgtaaactgc gtttctaccc gccgaacgct tctcgtgaaa tgcgtatgat cctgggtgac 720
ctgcacaacc gtcagcgtca ctctatctac aacggtgaag ttgttcgtat cgctccggac 780
gaactgtctt tcacctctgg tgaagcgtgg aaaccgatca ccctgcacct gcagtggcgt 840
ggttcttctc actgcccgcg tcgtaccttc ctgtacgaat ggcgtggtct ggaagctaac 900
ctgtggtact ctcactggcc gtggccggaa gctcagacct ctatcctgtc tccgcagtgc 960
gaaccgcgtg ttgctctgct ggctgttatc acctctatct ggggtgacat cgttgacgaa 1020
atcccgcacc gtcgtatccc gctggttggt aacggttggg aatttaccaa caaaaaagct 1080
aaatctcgtt tcaccgaatc ttgccgtgac ctgatcgctg aatttgctaa aggtgcttct 1140
gctttccaga tcatcgctac ccagccgatc atcgttctgc acccgaaata catcgacgaa 1200
atcaaacacc cggacctgtc tttcgctgac gctgttaaaa aaatgttctt ctctaaccgt 1260
gttccggttg aaccgttcca ctctggtacc gctatgaacg ttaccgttga agttgttcgt 1320
accaaactga cccaggctcg ttacctgtct 1350

Claims (6)

1.一种C15α位羟化酶基因的筛选方法，其特征在于，筛选获得C15α位羟化酶基因的方法具体如下：
（1）采用产孢培养基培养雷斯青霉产孢
所述产孢培养基是在雷斯青霉常用培养基的基础上添加固型粉料1-10g/L;
所述固型粉料由玉米芯粉碎物和木屑粉碎物组成；比例为：0.3~6；或者,
所述固型粉料由豆粕粉碎物和小麦秸秆粉碎物组成；比例为：0.8~4；
所述常用培养基为PDA培养基、麦芽汁培养基，牛肉浸膏培养基，马丁氏培养基，察氏培养基或沙氏培养基；
产孢条件为：25～28℃，湿度60～65％，培养72h；
（2）雷斯青霉菌丝体培养
制备孢子悬液并接种到培养基中，进行菌丝体培养；
（3）诱导转化
诱导组菌丝体培养24h后添加0.01-0.02%的底物左旋乙基甾烯双酮进行诱导3.5~7.0h，之后再投加0.1%的底物左旋乙基甾烯双酮进行甾体转化，并以不进行诱导的转化过程做对照组，转化完成后取样分析转化率；
所述底物由助溶剂溶解，所述的助溶剂为甲醇、乙醇、乙二醇、乙酸乙酯、己酸己酯、二甲亚砜、N,N-二甲基酰胺、乙腈或丙酮中的至少一种；
（4）雷斯青霉总RNA的提取、纯化和cDNA的合成
转化完成后，分别提取诱导组和对照组雷斯青霉的总RNA；去除基因组DNA后进行转录组测序和cDNA的合成；
（5）qRT-PCR分析筛选目的基因
①转录组测序后挑选开放阅读框完整的基因作为候选基因，将候选基因与已报道的P450酶家族基因进行比对，获得目标基因；
②根据筛选出的目标基因设计qRT-PCR引物，选择内参基因做对照，计算目标基因诱导组与对照组的表达差异倍数，确定最终的目的基因；
③以cDNA为模板，扩增获得目的基因的完整核苷酸序列，并通过筛选获得C15α位羟化酶基因。
2.如权利要求1所述的一种C15α位羟化酶基因的筛选方法，其特征在于，所述助溶剂的添加量为底物的1%；助溶剂为甲醇、二甲亚砜或DMF。
3.如权利要求1所述的一种C15α位羟化酶基因的筛选方法，其特征在于，所述诱导时间为6~7 h。
4.如权利要求1所述的一种C15α位羟化酶基因的筛选方法，其特征在于，所述的内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因；表达差异倍数通过2—△△Ct法算出。
5.如权利要求1所述的一种C15α位羟化酶基因的筛选方法，其特征在于，扩增目的基因前以诱导组与对照组的总RNA为模板，反转录合成第一链cDNA，分别以两种cDNA为模板，PCR扩增内标基因，确定反转录合成cDNA的质量。
6.如权利要求1所述的一种C15α位羟化酶基因的筛选方法，其特征在于，在权利要求1获得的目的基因的基础上进行易错PCR、定点突变、紫外诱变、亚硝基胍诱变、钴60诱变或等离子束诱变。
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