CN110373332A - 一种紫色红曲菌及其共酵产洛伐他汀的方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种紫色红曲菌及其共酵产洛伐他汀的方法与应用，属于发酵工程与生物技术领域。本发明的紫色红曲菌已于2018年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2018910，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。该种红曲菌固态发酵制备红曲发酵剂中洛伐他汀产量可达6～12mg/g，色价可达1500～2500μ/g，均处于较高水平且无桔霉素检出。

Description

一种紫色红曲菌及其共酵产洛伐他汀的方法与应用
技术领域
本发明涉及一种紫色红曲菌及其共酵产洛伐他汀的方法与应用，属于发酵工程与生物技术领域。
背景技术
红曲菌是一种小型丝状腐生真菌，传统的红曲生产是以大米为原料，经过浸米、蒸饭、冷却后接种红曲霉菌种，再通过固体发酵的方法得到的产物为红曲米。红曲米在我国应用于传统食品着色、防腐和治疗消化不良、腹泻、脾胃不和等疾病，已有几百年的历史了。红曲菌在红曲发酵过程中代谢产生多种生理活性物质。洛伐他汀作为红曲中一种有效的降血浆胆固醇的活性物质，1979年由日本教授远藤章首次报导从红色红曲霉发酵液中分离得到。目前已经广泛应用于开发各种治疗药物和保健食品。除了作为胆固醇生物合成的抑制剂，调节血脂生理功能外，也有改善内皮细胞功能、抗炎抗增殖的功能等。
红曲菌代谢过程中产生的红曲色素作为一种应用广泛的天然色素，由于其颜色鲜艳且安全性高的特点，一直深受人们的重视。与其他天然色素相比，红曲色素着色力强，热稳定性好，在酸碱条件下也能稳定存在，在食品方面的应用十分广泛。红曲色素还具有抑菌防腐、抗氧化和抗肿瘤等功能特性。
随着红曲产品中一种真菌毒素桔霉素的发现，引起了各国对红曲安全性的重视。研究发现先，由于红曲菌代谢产生的桔霉素具有的肾毒性和致畸形，可能会对人体造成一些潜在危害，因此桔霉素也被一些国家作为评价红曲产品安全性的重要指标。
紫色红曲菌一直是食品工业上常见的红曲菌种，应用于工业发酵可产洛伐他汀和色素。紫色红曲菌是“药用”红曲产业的唯一生产菌种，但研究多局限于色曲和酿造曲的生产菌种选育和发酵制作工艺等领域。高产洛伐他汀且红曲色素含量较高，同时不产或低产桔霉素的紫色红曲菌生产菌株的成功利用至今少有报道。
在我国传统发酵食品的生产中常采用多菌种共酵体系，微生物共酵能通过影响微生物的代谢来影响发酵，进一步影响发酵食品的品质。推断其他微生物代谢的某些产物或是酶类可能对红曲菌生长及次级代谢产物的产生有调控作用。然而目前将微生物共酵模式应用于紫色红曲菌固态发酵的研究少有报道。将菌株共酵与红曲菌固态发酵制曲相结合对相关次级代谢产物的正向调控有重要意义，为提升相关红曲发酵产品品质提供了研究方向。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株产洛伐他汀和红曲色素能力较高，且不产桔霉素的紫色红曲菌H8-2，已于2018年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO： M 2018910，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
本发明的第二个目的是提供含有所述紫色红曲菌H8-2的组合物。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物是发酵剂，所述发酵剂中含有紫色红曲菌H8-2 和酿酒酵母CCTCC NO:M 2015119。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母CCTCC NO:M 2015119已公开于公开号为 CN104911116B的专利中。
在本发明的一种实施方式中，每g发酵剂中含有≥1×106个孢子。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂中含有紫色红曲菌H8-2和乳酸菌。
在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为植物乳杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌CGMCC No.8097，已公开于公开号为CN103421723B的专利中。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂中含有紫色红曲菌H8-2和芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017209，已公开于公开号为CN107418909A的专利申请文件中。
本发明的第三个目的是提供一种制备紫色红曲菌与酿酒酵母共酵红曲发酵剂的方法。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将籼米浸泡、蒸煮后，拍散，接种≥106个孢子 /g(大米干重)，调节含水量为40％～50％；接种105～106CFU/g大米干重的酿酒酵母，28-30℃静置培养24-48h后摇散、摊平；此后每18-24h振荡1至2次，直到14-20d发酵结束；所述振荡是使培养体系通过振荡过程摇下容器内部的水分，并促进培养体系与氧气的接触。
在本发明的一种实施方式中，所述红曲发酵剂制备方法具体是：0.1％无菌吐温水洗下斜面上的紫色红曲菌孢子，将30g籼米浸泡2h后转入250mL锥形瓶，封口后于121℃，0.08 MPa灭菌20min后，趁热将米粒拍散，接种106个孢子/g(大米干重)接种于冷却至室温的固态发酵培养基，补加无菌水调节含水量在40％～50％；拌匀后使培养基堆至瓶内一角，同时将活化后的酿酒酵母菌液以2-8％接种量接入固态发酵培养基与紫色红曲菌H8-2进行共酵制曲，28-30℃静置培养24-48h后摇散、摊平；此后每18-24h摇瓶1至2次，直到14-20d发酵结束。所述固体发酵培养基为市售籼米制备。
在本发明的一种实施方式中，上述酿酒酵母菌液采用马铃薯葡萄糖水培养基活化，28℃活化18-36h至培养基浑浊。
在本发明的一种实施方式中，上述马铃薯葡萄糖水培养基配方：马铃薯(去皮)200g、蔗糖15—20g、琼脂20—30g、蒸馏水1000mL。PH自然。
本发明的第四个目的是提供所述红曲发酵剂在食品领域的应用，尤其在制备红曲黄酒、红曲醋方面的应用。
本发明还要求保护应用所述紫色红曲菌或所述红曲发酵剂制备的红曲黄酒、红曲醋。
区别于现有技术，本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种紫色红曲菌H8-2，该种红曲菌固态发酵制备红曲发酵剂中洛伐他汀产量可达6～12mg/g，色价可达1500～2500μ/g，均处于较高水平且无桔霉素检出。
(2)本发明提供了一种紫色红曲菌H8-2与酿酒酵母共酵制备红曲发酵剂的方法。该方法相比纯种制曲产洛伐他汀含量提高30％以上，且不影响红曲色价，其红曲发酵剂洛伐他汀产量可达12.93mg/g，色价可达2096.03μ/g，无桔霉素检出。该方法提高发酵产能，提高发酵效率，可广泛应用于食品、酿酒等领域，能改善发酵产品色泽，强化发酵产品的保健功能，同时增加产品的安全性。
(3)本发明提供的所述红曲发酵剂在红曲黄酒和红曲醋方面的应用大大提高了红曲黄酒和红曲醋中洛伐他汀含量，多数市售红曲黄酒和红曲醋中未检测到洛伐他汀，该应用能有效强化红曲黄酒和红曲醋的降脂保健功能，提升产品价值。
生物材料保藏
一株紫色红曲菌(Monascus purpureus)H8-2，分类命名为紫色红曲菌(Monascuspurpureus)H8-2，已于在2018年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018910。
附图说明
图1：紫色红曲菌(Monascus purpureus)H8-2在不同培养基上的菌落形态。
图2：HPLC测定的洛伐他汀标准品的色谱图。
图3：HPLC测定的洛伐他汀标准品的标准曲线。
具体实施方式
实施例1：红曲中高产洛伐他汀菌株的筛选及鉴定
步骤1，样品采集及处理：
红曲米采自福建省宁德市古田县，采集的红曲米置于密封的无菌塑料袋中4℃保存。称取5g红曲样品，在无菌研钵中研磨成粉末后置于95mL带玻璃珠的无菌生理盐水的三角瓶中，在摇床上振荡30min。后进行梯度稀释。
PDA培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，蒸馏水1000毫升，自然 PH，121℃灭菌15min。
步骤2，菌株的筛选：
在无菌操作环境下，将三角瓶摇匀，从中吸取5mL菌悬液用无菌水进行系列梯度稀释，得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍样品稀释液，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五个稀释梯度样液各0.1-0.15mL涂布于PDA培养基上，倒置在28-30℃培养箱内培养1-7d，观察平板上菌落的生长情况，挑取具有红曲菌典型特征的菌株，反复划线确定纯菌落，甘油管保藏至-80℃。
步骤3，固态发酵制备红曲发酵剂：
用无菌接种环刮取保藏管里的菌种划线于麦芽汁斜面上。25-30℃培养5-7d，培养至红曲菌长出孢子。
固态发酵：用0.1％无菌吐温水洗下斜面上的孢子，30g籼米浸泡2h后转入250mL锥形瓶，封口后于121℃，0.08MPa灭菌20min后，趁热将米粒拍散，接种106个孢子/g(大米干重)接种于冷却至室温的固态发酵培养基，补加无菌水调节含水量在40％～50％；拌匀后使培养基堆至瓶内一角，28-30℃静置培养24-48h后摇散、摊平；此后每18-24h摇瓶1至 2次，直到14-20d发酵结束。
步骤4，测定红曲发酵剂中洛伐他汀含量，色价以及桔霉素含量，测定方法如下：
洛伐他汀的液相测定方法：采用HPLC法，称取红曲粉0.5g置于50mL离心管中，加入甲醇30mL，50℃震荡水浴2h，摇匀，常温条件下8000r/min离心5min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜。色谱条件：色谱柱：Athena C18-WP(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.1％的磷酸水溶液(65∶35，V/V)；流速：1.0mL/min；紫外检测波长：238nm；进样量：5μL；柱温：(30.0±0.5)℃。以70％乙醇溶液配制400mg/L的洛伐他汀标准储备液，等比稀释制得浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400mg/L的洛伐他汀标准工作液，进行外标定量。将洛伐他汀浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，得到回归方程为：Y＝1.55×104X-2.96×104，R2≈0.9995。按照标准曲线回归方程求得样品中洛伐他汀浓度。
桔霉素的测定方法：按照GB/T 5009.222-2008《红曲类产品中桔青霉素的测定》进行。
色价的测定方法：按照GB 1886.19-2015《食品添加剂红曲米》中色价检测方法进行。
红曲菌筛选结果如表1所示，其中紫色红曲菌H8-2发酵所得红曲发酵剂洛伐他汀和色价水平均较高，且无桔霉素检出。连续发酵可得洛伐他汀含量均值达到9.79mg/g的红曲发酵剂，远高于市售红曲的洛伐他汀含量。色价可达1805.43μ/g。
表1不同菌株的发酵效果
实施例2：酿酒酵母与红曲菌共酵制备红曲发酵剂
制备含酿酒酵母与红曲菌的发酵剂。所述酿酒酵母CCTCC NO:M 2015119已公开于公开号为CN104911116B的专利中。
将酿酒酵母CCTCC NO:M 2015119接种到马铃薯葡萄糖水液体培养基中，于28±2℃培养24～32h，即为发酵菌液。
无菌接种环刮取保藏管里的红曲菌菌种划线于麦芽汁斜面上。30℃培养7d，培养至红曲菌长出孢子。
用0.1％无菌吐温水洗下斜面上的孢子，30g籼米浸泡2h后转入250mL锥形瓶，封口后于121℃，0.08MPa灭菌20min后，趁热将米粒拍散，接种106个孢子/g(大米干重)接种于冷却至室温的固态发酵培养基，补加无菌水调节含水量在40％～50％；同时将活化后的酿酒酵母菌液以2％接种量接入固态发酵培养基与红曲菌进行共酵。拌匀后使培养基堆至瓶内一角，28-30℃静置培养24h后摇散、摊平；此后每24h摇瓶1至2次，直到14d发酵结束。利用高效液相色谱法测定红曲固态发酵产物中的洛伐他汀和桔霉素含量，利用紫外分光光度法测定红曲色价。共酵红曲洛伐他汀含量可达12.93mg/g，与红曲菌H8-2纯种发酵相比提高34.5％；色价可达2096.03μ/g，与纯种发酵相比提高16.10％；且无桔霉素检出。
实施例3：乳酸菌与红曲菌共酵制备红曲发酵剂
以植物乳杆菌为例，制备含植物乳杆菌与红曲菌的发酵剂。所述植物乳杆菌为植物乳杆菌CGMCC No.8097，已公开于公开号为CN103421723B的专利中。
将乳酸菌接种到马铃薯葡萄糖水液体培养基中，于28±2℃培养24～32h，即为发酵菌液。
无菌接种环刮取保藏管里的红曲菌菌种划线于麦芽汁斜面上。30℃培养7d，培养至红曲菌长出孢子。
用0.1％无菌吐温水洗下斜面上的孢子，30g籼米浸泡2h后转入250mL锥形瓶，封口后于121℃，0.08MPa灭菌20min后，趁热将米粒拍散，接种106个孢子/g(大米干重)接种于冷却至室温的固态发酵培养基，补加无菌水调节含水量在40％～50％；同时将活化后的乳酸菌菌液以2％接种量接入固态发酵培养基与红曲菌进行共酵。拌匀后使培养基堆至瓶内一角，28-30℃静置培养24h后摇散、摊平；此后每24h摇瓶1至2次，直到14d发酵结束。利用高效液相色谱法测定红曲固态发酵产物中的洛伐他汀和桔霉素含量，利用紫外分光光度法测定红曲色价。共酵红曲洛伐他汀含量可达10.48mg/g，色价可达1924.37μ/g，无桔霉素检出。
实施例4：芽孢杆菌与红曲菌共酵制备红曲发酵剂
制备含有芽孢杆菌和红曲菌的红曲发酵剂。所述芽孢杆菌为芽孢杆菌CCTCC NO:M2017209，已公开于公开号为CN107418909A的专利申请文件中。
将芽孢杆菌接种到马铃薯葡萄糖水液体培养基中，于28±2℃培养24～32h，即为发酵菌液。
无菌接种环刮取保藏管里的红曲菌菌种划线于麦芽汁斜面上。30℃培养7d，培养至红曲菌长出孢子。
用0.1％无菌吐温水洗下斜面上的孢子，30g籼米浸泡2h后转入250mL锥形瓶，封口后于121℃，0.08MPa灭菌20min后，趁热将米粒拍散，接种106个孢子/g(大米干重)接种于冷却至室温的固态发酵培养基，补加无菌水调节含水量在40％～50％；同时将活化后的芽孢杆菌菌液以2％接种量接入固态发酵培养基与红曲菌进行共酵。拌匀后使培养基堆至瓶内一角，28-30℃静置培养24h后摇散、摊平；此后每24h摇瓶1至2次，直到14d发酵结束。利用高效液相色谱法测定红曲固态发酵产物中的洛伐他汀和桔霉素含量，利用紫外分光光度法检测红曲色价。共酵红曲洛伐他汀含量可达9.54mg/g，色价可达1608.72μ/g，无桔霉素检出。
实施例5：紫色红曲菌与酿酒酵母共酵制备的红曲发酵剂在红曲黄酒中的应用
红曲发酵剂的制备如实施例2。
利用紫色红曲菌H8-2和酿酒酵母CCTCC NO:M 2015119共酵制备的红曲发酵剂进行红曲黄酒的酿造，以糯米为基准，将蒸熟的米饭(140％)、活化酵母(15％)、麦曲(8％)、红曲(8％)、水(123％)等混匀进行落料。前发酵28℃进行4d，每天进行开耙；后发酵15℃进行20d，开耙间隔2d。发酵结束后压榨出原酒，80℃水浴杀菌30min，冷却后密封。取样检测酒样中酒精度、pH、总酸、氨基酸态氮、洛伐他汀、色价、桔霉素等指标。
酒精度、pH、总酸、氨基酸态氮的测定：按GB/T 13662-2008《黄酒》进行检测。
洛伐他汀、色价、桔霉素按实施例1中方法进行检测。
经检测，酒体酒精度达16.3％vol，pH3.77，总酸含量5.33g/L，氨基酸态氮0.72g/L，均达到国家标准。洛伐他汀含量达42.23mg/L，色价达20.90μ/mL，无桔霉素检出。
实施例6：紫色红曲菌与酿酒酵母共酵制备的红曲发酵剂在红曲黄酒中的应用
红曲发酵剂的制备如实施例2。
利用紫色红曲菌H8-2和酿酒酵母CCTCC NO:M 2015119共酵制备的红曲发酵剂进行红曲黄酒的酿造，以糯米为基准，将蒸熟的米饭(140％)、活化酵母(10％)、麦曲(8％)、红曲(5％)、水(123％)等混匀进行落料。前发酵28℃进行4d，每天进行开耙；后发酵15℃进行20d，开耙间隔2d。发酵结束后压榨出原酒，80℃水浴杀菌30min，冷却后密封。取样检测酒样中酒精度、pH、总酸、氨基酸态氮、洛伐他汀、色价、桔霉素等指标。
酒精度、pH、总酸、氨基酸态氮的测定：按GB/T 13662-2008《黄酒》进行检测。
洛伐他汀、色价、桔霉素按实施例1中方法进行检测。
经检测，酒体酒精度达14.8％vol，pH3.89，总酸含量4.93g/L，氨基酸态氮0.61g/L，均达到国家标准。洛伐他汀含量达35.42mg/L，色价达17.95μ/mL，无桔霉素检出。
实施例7：紫色红曲菌与酿酒酵母共酵制备的红曲发酵剂在红曲醋中的应用
采用实施例6中落料比例，进行糖化酒精发酵8d。发酵醪液作为红曲醋液态深层发酵的基质，接种10％醋酸菌菌液进行醋酸发酵15d。接着加盐4％后盖紧缸盖放置2天后，采用淋缸三套循环法进行淋醋，先在第三组醅中加自来水浸淋，淋出液加入第二组醅中浸泡10h，淋出二级醋，再以二级醋加入第一组醅中浸泡20h后淋出，即为一级醋。在90℃条件下灭菌 30min，冷却、澄清、装坛封口。制备所得红曲醋中洛伐他汀含量达30.62mg/L，无桔霉素检出。
实施例8：紫色红曲菌与酿酒酵母共酵制备的红曲发酵剂在红曲醋中的应用
采用实施例5中落料比例，进行糖化酒精发酵6d。发酵醪液作为红曲醋液态深层发酵的基质，接种10％醋酸菌菌液进行醋酸发酵18d。接着加盐4％后盖紧缸盖放置2天后，采用淋缸三套循环法进行淋醋，先在第三组醅中加自来水浸淋，淋出液加入第二组醅中浸泡10h，淋出二级醋，再以二级醋加入第一组醅中浸泡20h后淋出，即为一级醋。在90℃条件下灭菌 30min，冷却、澄清、装坛封口。制备所得红曲醋中洛伐他汀含量达35.45mg/L，无桔霉素检出。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种紫色红曲菌，分类命名为紫色红曲菌(Monascus purpureus)H8-2，所述菌株已于在2018年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018910。
2.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的紫色红曲菌H8-2。
3.一种发酵剂，其特征在于，含有权利要求1所述的紫色红曲菌H8-2，和酿酒酵母、乳酸菌、芽孢杆菌中的任一种。
4.根据权利要求3所述的发酵剂，其特征在于，每g发酵剂中含有≥1×106个孢子。
5.根据权利要求3所述的发酵剂，其特征在于，所述组合物含有紫色红曲菌H8-2和植物乳杆菌。
6.一种制备权利要求4所述发酵剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将紫色红曲菌H8-2在固体发酵培养基中进行发酵培养；
(2)将活化后酿酒酵母菌液接种至步骤(1)的发酵培养基与红曲菌进行共酵培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将籼米浸泡、蒸煮后，拍散，接种≥106个孢子/g(大米干重)紫色红曲菌，调节含水量为40％～50％；接种≥106CFU/g大米干重的酿酒酵母，28-30℃静置培养24-48h后摇散、摊平；此后每18-24h振荡1至2次，直到14-20d发酵结束。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母菌采用马铃薯葡萄糖水培养基，26～28℃活化18-36h。
9.权利要求1所述的紫色红曲菌或权利要求2～5任一所述的组合物在制备包括酒、醋在内的发酵食品方面的应用。
10.权利要求1所述的紫色红曲菌或权利要求3～5任一所述发酵剂制备的红曲黄酒、红曲醋。
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