CN112852646A - 一株高产洛伐他汀的紫色红曲菌h5-3及其应用 - Google Patents
一株高产洛伐他汀的紫色红曲菌h5-3及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株高产洛伐他汀的紫色红曲菌H5‑3及其应用，属于发酵工程与生物技术领域。本发明提供的紫色红曲菌H5‑3，利用此紫色红曲菌制备出的红曲菌固态发酵制备红曲发酵剂中洛伐他汀产量可达14～18mg/g，色价可达2800～3200μ/g，制备出的产品中洛伐他汀含量高且无桔霉素检出。将其应用于红曲黄酒和红曲醋的制备，大大提高了红曲黄酒和红曲醋中洛伐他汀含量，能有效强化红曲黄酒和红曲醋的降脂保健功能，提升产品价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株高产洛伐他汀的紫色红曲菌H5-3及其应用，属于发酵工程与生物技术领域。
背景技术
红曲菌，属于红曲科腐生丝状真菌，是多种具有聚酮结构的次生代谢产物的产生菌，作为一种传统的食品酿造微生物，其主要发酵产品为红曲。红曲是以大米为原料，将红曲菌种接入蒸熟冷却后的米饭中，在合适的发酵温度和湿度条件下，固态发酵一段时间而制成。红曲菌在发酵制曲过程中，产生了多种功能成分，如降脂活性物质洛伐他汀、食品着色剂红曲色素等，其中洛伐他汀由于具有显著降脂功效，安全性高等优点备受国内外学者的重视。
日本教授远藤章首次从红曲菌培养液中提取出的一种可显著抑制胆固醇合成的功能活性物质，将其命名为莫纳可林K(Monacolin K)，后来证明它就是洛伐他汀。作为一种有效的降血脂胆固醇的生物活性物质，洛伐他汀可通过抑制肝脏中过多胆固醇的合成来预防冠心病、动脉硬化等心脑血管疾病。人体中调节胆固醇合成的关键限速酶是HMG-CoA还原酶，洛伐他汀的结构与HMG-CoA还原酶的结构类似，因此在胆固醇合成过程中对其有着竞争性抑制作用，可有效降低低密度脂蛋白胆固醇水平。目前洛伐他汀的降血脂功能已广泛应用于治疗高脂血症，其代表性产品是血脂康胶囊和脂必妥片等。近年来红曲发酵产品也广泛应用于传统酿造食品行业，比如黄酒、腐乳、醋等传统食品。然而，传统红曲发酵食品品质不突出，洛伐他汀含量较低，红曲菌发酵产洛伐他汀等活性功能物质的能力仍有待提高，目前国内仍缺乏优良高效菌种，因此筛选高产洛伐他汀的红曲霉菌株对红曲菌菌种资源的开发及其应用具有重要意义。
紫色红曲菌是食品工业上常见的红曲菌种之一，也是大多数红曲产品标准中的指定菌株，具有较高的安全性，产洛伐他汀和红曲色素能力较强。高产洛伐他汀且红曲色素含量较高，同时不产或低产桔霉素的紫色红曲菌生产菌株的成功利用至今少有报道。因此筛选出一株高产洛伐他汀且色素含量不低的安全红曲霉菌，这对传统红曲霉菌种资源的发掘和利用具有重要意义。
发明内容
为了解决目前红曲菌产洛伐他汀含量低、或红曲色素含量较低的问题，本发明从红曲米样品中筛选出了一株紫色红曲菌，能够在提高洛伐他汀的同时能确保红曲色素含量在较高水平，且不产桔霉素。
本发明提供了一株紫色红曲菌(Monascus purpureus)，已于12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020815。
本发明提供了含有权利要求1所述紫色红曲菌的红曲发酵剂。
在一种实施方式中，所述红曲发酵剂中含有≥1×106个孢子。
本发明提供了一种制备发酵产品的方法，利用所述紫色红曲菌、或含有紫色红曲菌的提取液或红曲米、或权利要求2所述红曲发酵剂发酵制备产品。
在一种实施方式中，所述发酵产品以米、豆类、面粉为原料。
在一种实施方式中，所述产品包括酱油、豆瓣酱、面包、红曲黄酒、红曲醋。
本发明提供了制备所述红曲发酵剂的方法，调节灭菌后的大米的水分含量，并添加所述紫色红曲菌，混匀后静置培养、再进行发酵，发酵后制备得到红曲发酵剂。
在一种实施方式中，添加所述红曲发酵剂后使得每克大米中含有不少于1×106个孢子。
在一种实施方式中，所述静置培养为将添加了紫色红曲菌的大米在28-30℃静置培养24-48h；所述发酵为将培养基每18-25h进行摇瓶，总共发酵14-20h。
本发明提供了所述紫色红曲菌在制备以米、豆类、面粉为原料的产品中的应用。
区别于现有技术，本发明的有益效果：
本发明提供的紫色红曲菌H5-3，利用此紫色红曲菌制备出的红曲菌固态发酵制备红曲发酵剂中洛伐他汀产量可达14～18mg/g，色价可达2800～3200μ/g，制备出的产品中洛伐他汀含量高且无桔霉素检出。可广泛应用于食品、酿酒、调味品等领域，能改善发酵产品色泽，强化发酵产品的保健功能和安全性。
生物材料保藏
本发明所提供的紫色红曲菌，分类学命名为紫色红曲菌H5-3Monascus purpureusH5-3，已于2020年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020815，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1为紫色红曲菌(Monascus purpureus)H5-3在不同培养基上的菌落形态图。
图2为HPLC测定的洛伐他汀标准品的色谱图。
图3为HPLC测定的洛伐他汀标准品的标准曲线。
图4为红曲菌固态发酵产洛伐他汀(a)、红曲色素(b)和桔霉素(c)的情况。
图5为红曲菌固态发酵产糖化酶(a)、液化酶(b)和酸性蛋白酶(c)的情况。
具体实施方式
PDA培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，蒸馏水1000毫升，自然PH，121℃灭菌15min。
洛伐他汀的液相测定方法：采用HPLC法，称取红曲粉0.5g置于50mL离心管中，加入甲醇30mL，50℃震荡水浴2h，摇匀，常温条件下8000r/min离心5min，取上清液过0.22μm微孔滤膜。色谱条件：色谱柱：Athena C18-WP(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.1％的磷酸水溶液(65∶35，V/V)；流速：1.0mL/min；紫外检测波长：238nm；进样量：5μL；柱温：(30.0±0.5)℃。以70％乙醇溶液配制400mg/L的洛伐他汀标准储备液，等比稀释制得浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400mg/L的洛伐他汀标准工作液，进行外标定量。将洛伐他汀浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，得到回归方程为：Y＝1.55×104X-2.96×104，R2≈0.9995。按照标准曲线回归方程求得样品中洛伐他汀浓度。
桔霉素的测定方法：按照GB/T 5009.222-2008《红曲类产品中桔青霉素的测定》进行。
色价的测定方法：按照GB 1886.19-2015《食品添加剂红曲米》中色价检测方法进行。
糖化力的测定方法：按照轻工行业标准QB/T 5188—2017《酿造红曲》中糖化力检测方法进行。
液化力、酸性蛋白酶活的测定方法：按照轻工行业标准QB1803—93《工业酶制剂通用试验方法》中淀粉酶、蛋白酶检测方法进行。
酒精度、总酸、氨基酸态氮的测定：按GB/T 13662-2008《黄酒》进行检测。
实施例1：高产洛伐他汀红曲菌株的筛选
(1)样品采集
红曲米采自福建省宁德市古田县，采集的红曲米置于密封的无菌塑料袋中4℃保存。称取5g红曲样品，在无菌研钵中研磨成粉末后置于95mL带玻璃珠的无菌生理盐水的三角瓶中，在摇床上振荡30min。后进行梯度稀释。
(2)菌株分离纯化
在无菌操作环境下，将三角瓶摇匀，从中吸取5mL菌悬液用无菌水进行系列梯度稀释，得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍样品稀释液，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五个稀释梯度样液各0.1-0.15mL涂布于PDA培养基上，倒置在28-30℃培养箱内培养1-7d，观察平板上菌落的生长情况，挑取具有红曲菌典型特征的菌株，反复划线确定纯菌落，甘油管保藏至-80℃。
(3)固态发酵筛选
用无菌接种环刮取保藏管里的菌种划线于麦芽汁斜面上。25-30℃培养7-10d，培养至红曲菌长出孢子。
固态发酵：用0.1％无菌吐温水洗下斜面上的孢子，30g籼米浸泡2h后转入250mL锥形瓶，封口后于121℃，0.08MPa灭菌20min后，趁热将米粒拍散(即为籼米发酵培养基)，接种106个孢子/g(大米干重)接种于冷却至室温的籼米发酵培养基，补加无菌水调节含水量在40％～50％；拌匀后使培养基堆至瓶内一角，28-30℃静置培养24-48h后摇散、摊平；此后每18-24h摇瓶1至2次，直到14-18d发酵结束，制备得到红曲，烘干备用。
(4)测定红曲中洛伐他汀含量，色价以及桔霉素含量、糖化酶，液化酶以及酸性蛋白酶活力。
红曲菌筛选结果如图4所示，其中紫色红曲菌H5-3发酵所得红曲发酵剂洛伐他汀和色价水平均较高，洛伐他汀含量均值达到17.90mg/g的红曲发酵剂，远高于市售红曲的洛伐他汀含量。红色价可达3195.27μ/g，符合我国红曲米国家标准(GB 1886.19—2015)。菌株H5-3不产桔霉素，在QBT 2847—2007《功能红曲米》中对功能红曲米中的桔霉素限量为50μg/kg，符合轻工行业标准。故优先选择H5-3作为高产洛伐他汀的红曲菌进行后续研究。
红曲菌产酶情况如图5所示，高产洛伐他汀的红曲菌H5-3产糖化酶、酸性蛋白酶能力显著高于其他菌株(P<0.05)，其糖化力、酸性蛋白酶活分别为2514.26U/g、300.19U/g，符合酿造红曲要求(QB/T 5188—2017)。虽然高产洛伐他汀的菌株H5-3产液化酶能力较低，为0.32U/g，但一般红曲的液化力较弱，在后期红曲黄酒的酿造实验中可适当添加麦曲与其进行共酵，提升黄酒品质。
实施例2：红曲发酵剂的制备
将紫色红曲霉菌H5-3划线于麦芽汁斜面上，25-30℃培养7-10d，培养至红曲菌长出孢子。用0.1％无菌吐温水洗下斜面上的孢子，将100g籼米浸泡2h后转入1000mL锥形瓶，封口后于121℃，0.08MPa灭菌20min后，趁热将米粒拍散，补加无菌水调节含水量在40％～50％，接种106个孢子/g(大米干重)接种于冷却至室温的籼米发酵培养基，混匀后使培养基堆至瓶内一角，28-30℃静置培养24-48h后摇散、摊平；此后在28-30℃下每18-24h摇瓶1至2次，14-18d发酵结束，制备获得红曲发酵剂。
实施例3：紫色红曲菌H5-3制备的红曲发酵剂在红曲黄酒中的应用
利用实施例2制备得到的红曲发酵剂制备黄酒。
利用紫色红曲菌H5-3制备的红曲发酵剂进行红曲黄酒的酿造，以糯米为基准，将蒸熟的米饭(140％)、活化酵母(10％)、麦曲(5％)、红曲(8％)、水(123％)等混匀进行落料。前发酵28℃进行4d，每天进行开耙；后发酵15℃进行20d，开耙间隔2d。发酵结束后压榨出原酒，80℃水浴杀菌30min，冷却后密封。取样检测酒样中酒精度、总酸、氨基酸态氮、洛伐他汀、色价、桔霉素等指标。
经检测，酒体酒精度达15.8％vol，总酸含量3.93g/L，氨基酸态氮0.61g/L，均达到国家标准。洛伐他汀含量达57.42mg/L，色价达20.95μ/mL，无桔霉素检出。
实施例4：紫色红曲菌H5-3制备的红曲发酵剂在红曲黄酒中的应用
利用实施例2制备得到的红曲发酵剂制备黄酒。
利用紫色红曲菌H5-3制备的红曲发酵剂进行红曲黄酒的酿造，以糯米为基准，将蒸熟的米饭(140％)、活化酵母(10％)、麦曲(5％)、红曲(12％)、水(123％)等混匀进行落料。前发酵28℃进行4d，每天进行开耙；后发酵15℃进行20d，开耙间隔2d。发酵结束后压榨出原酒，80℃水浴杀菌30min，冷却后密封。取样检测酒样中酒精度、总酸、氨基酸态氮、洛伐他汀、色价、桔霉素等指标。
经检测，酒体酒精度达16.64％vol，总酸含量4.60g/L，氨基酸态氮0.87g/L，均达到国家标准。洛伐他汀含量达63.75mg/L，色价达22.86μ/mL，无桔霉素检出。
实施例5：紫色红曲菌H5-3制备的红曲发酵剂在红曲醋中的应用
利用实施例2制备得到的红曲发酵剂制备红曲醋。
采用实施例3中落料比例，进行糖化酒精发酵8d。发酵醪液作为红曲醋液态深层发酵的基质，接种10％醋酸菌菌液进行醋酸发酵15d。接着加盐4％后盖紧缸盖放置2天后，采用淋缸三套循环法进行淋醋，先在第三组醅中加自来水浸淋，淋出液加入第二组醅中浸泡10h，淋出二级醋，再以二级醋加入第一组醅中浸泡20h后淋出，即为一级醋。在90℃条件下灭菌30min，冷却、澄清、装坛封口。制备所得红曲醋中洛伐他汀含量达55.69mg/L，无桔霉素检出。
实施例6：紫色红曲菌H5-3制备的红曲发酵剂在红曲醋中的应用
利用实施例2制备得到的红曲发酵剂制备红曲醋。
采用实施例4中落料比例，进行糖化酒精发酵8d。发酵醪液作为红曲醋液态深层发酵的基质，接种10％醋酸菌菌液进行醋酸发酵15d。接着加盐4％后盖紧缸盖放置2天后，采用淋缸三套循环法进行淋醋，先在第三组醅中加自来水浸淋，淋出液加入第二组醅中浸泡10h，淋出二级醋，再以二级醋加入第一组醅中浸泡20h后淋出，即为一级醋。在90℃条件下灭菌30min，冷却、澄清、装坛封口。制备所得红曲醋中洛伐他汀含量达62.82mg/L，无桔霉素检出。
实施例7：紫色红曲菌H5-3制备的红曲发酵剂在酱油中的应用
利用实施例2制备得到的红曲发酵剂制备酱油。
挑选豆料：挑选饱满大豆，洗净后加水浸泡3-5h，以豆粒胀至无皱纹为度，沥干水后加压蒸熟，蒸至熟而不烂，手捻则分开时为宜。
制曲：将麸皮、面粉、水混合，常压蒸煮1h，焖30min，出锅过筛移至拌合台上，摊开，适当翻拌使之快速冷却，在30～40℃接入三角瓶菌种，用量为0.2％～0.5％，翻拌均匀，使米曲霉孢子均匀分布在曲料上。接种后，装入曲匾，品温不低于25℃，料层厚度为1～1.5cm，室温保持在28～30℃，培养16h左右。当品温升到36℃左右，曲料表层稍有发白及结块时，进行第一次翻曲，室温保持在28～30℃，翻曲4～5h后，品温又上升到36℃左右，再进行第二次翻曲，将曲匾上下调换位置，保持32～35℃。从接种装入曲匾培养65h后，将纱帘揭下，移入干燥、阴凉、通风的室内备用，贮藏时间＜10d。
接种、拌面粉：经过蒸煮的黄豆出锅后，经过料斗进入风冷机冷却，调整品温至45℃以下，再与面粉混合，通过种曲机接种。种曲粉预先与适量的面粉混合、拌匀，种曲粉用量为0.2％～0.4％。
发酵：天然晒制的酱油采用“白天晒、晚上露”缸内发酵工艺。成熟的头套油氨基酸态氮的含量在1.0g/100mL以上。在头套油发酵成熟后取样化验，确认合格后淋出头套油备用。
加糖晒制：在浸淋出的头套油中加入适当比例的白糖、红糖、麦芽糖、果葡糖浆、葡萄糖及其他糖，或者组合组分的糖，晒制2～3个月，直到酱油色度达到2000EBC。
加曲晒制：在酱油色度达到2000EBC后，加入一定量的红曲米或红曲米磨细后的颗粒、红曲米萃取物，进行晒制，直到红色指数达到要求。
成品：加热灭菌、配制和澄清。
经过加糖的老抽色度达到2000EBC以上时，按照成品色度和红色指数的要求，在每毫升酱油中添加430nm的OD值为40的红曲色素即可达到相关要求，然后经过传统晒制方法处理可以得到色彩浓郁的成品酱油。制备所得酱油采用红曲色素替代人工焦糖色素，其中洛伐他汀含量达50.72mg/L，并且无桔霉素检出。
实施例8：紫色红曲菌H5-3制备的红曲发酵剂在豆瓣酱中的应用
原料预处理：所选用的大豆为东北优质大豆，要求新鲜，颗粒饱满，无霉烂和虫蛀；选用的面粉、食盐均为市场销售的优质面粉和无碘精制盐。将优质新鲜的东北大豆清洗干净,除去表面的泥土杂物及其上浮物，加水浸泡，至大豆内无白心，用手捏容易成两瓣为度。
蒸煮：常压蒸煮，蒸熟的程度为大豆全均匀熟透，既软又不烂，保持整粒且又无夹心的程度为宜。
制曲：采用米曲霉、黑曲霉双菌种制曲方式，以大豆和熟面粉为主要原料，米曲霉和黑曲霉双菌种制曲(质量比为1∶1)，接种量0.04％。在此基础上，加入红曲霉菌种H5-3，制曲时间为28h，制曲温度为32～36℃，pH接近于6，接种量为混合料的0.3％，大豆:面粉＝6:4(质量比)，混合菌曲中酶的活性高于单一的米曲霉曲。在制曲过程中一定要加入一定量的熟面粉,这样可调节曲料的水分，有利于红曲霉的生长。红曲霉在代谢过程中会产生次级代谢产物红曲色素,赋予豆瓣酱独特的色泽。
发酵：采用固态低盐法进行传统发酵。制得的豆瓣酱具有颜色红润、味道醇厚、香气浓郁等特点，其中洛伐他汀含量达48.79mg/L，并且无桔霉素检出。
实施例9：紫色红曲菌H5-3制备的红曲发酵剂在腐乳中的应用
利用实施例2制备得到的红曲发酵剂制备腐乳。
将接种毛霉发酵成熟并经凉花、搓毛、盐腌后的盐胚(每块约22g)装入坛子，加入用黄酒、玫瑰花和红曲米磨浆制成的汤料，浸没后在常温下封坛发酵6个月以上，得到玫瑰腐乳成品。制备所得红曲腐乳中洛伐他汀含量达52.98mg/L，无桔霉素检出。
实施例10：紫色红曲菌H5-3制备的红曲发酵剂在面包中的应用
利用实施例2制备得到的红曲发酵剂制备面包。
红曲粉的制备：将实施例2中的红曲粉碎制成红曲粉，含红曲菌106个孢子/g。
调粉：将1000～1200g面粉、40～45g砂糖、100～110g牛奶、50～60g奶油，20～25g食盐，8～10g酵母，8～10g麦芽浸提物，600～700g水，5～10g红曲粉进行调配。
二次发酵：28℃发酵1h，再28℃发酵0.5h，调制整形。
醒发：37℃发酵1～1.2h。
烘烤：180℃烘烤15～20min，冷却为成品。制得到的面包中洛伐他汀含量达14.35mg/g，无桔霉素检出。
实施例11：紫色红曲菌H5-3制备的红曲发酵剂在面包中的应用
利用实施例2制备得到的红曲发酵剂制备面包。
红曲水浸提液的制备：将实施例10中的红曲粉，每10g红曲粉添加100mL水，70℃恒温水浴条件下浸提2h,真空过滤后得红曲水浸提液。
调粉：将1000～1200g面粉、40～45g砂糖、100～110g牛奶、50～60g奶油，20～25g食盐，8～10g酵母，8～10g麦芽浸提物，600～700g水，20～30mL红曲水浸提液进行调配。
二次发酵：28℃发酵1h，再28℃发酵0.5h，调制整形。
醒发：37℃发酵1～1.2h。
烘烤：180℃烘烤15～20min，冷却为成品。制得到的面包中洛伐他汀含量达15.74mg/g，无桔霉素检出。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株紫色红曲菌(Monascus purpureus)，已于2020年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020815。
2.含有权利要求1所述紫色红曲菌的红曲发酵剂。
3.根据权利要求2所述的红曲发酵剂，其特征在于，所述红曲发酵剂中含有≥1×106个孢子。
4.一种制备发酵产品的方法，其特征在于，利用权利要求1所述紫色红曲菌、或含有权利要求1所述紫色红曲菌的提取液或红曲米、或权利要求2所述红曲发酵剂发酵制备产品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵产品以米、豆类、面粉为原料。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述产品包括酱油、豆瓣酱、面包、红曲黄酒、红曲醋。
7.制备权利要求2或3所述红曲发酵剂的方法，其特征在于，调节灭菌后的大米的水分含量，并添加权利要求1所述紫色红曲菌，混匀后静置培养、再进行发酵，发酵后制备得到红曲发酵剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，添加所述红曲发酵剂后使得每克大米中含有不少于1×106个孢子。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述静置培养为将添加了紫色红曲菌的大米在28-30℃静置培养24-48h；所述发酵为将培养基每18-25h进行摇瓶，总共发酵14-20h。
10.权利要求1所述紫色红曲菌在制备以米、豆类、面粉为原料的产品中的应用。
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