CN109468232A - 一株产阿魏酸酯酶谢瓦散囊菌及其在白酒大曲中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株产阿魏酸酯酶的谢瓦散囊菌及其在白酒大曲生产中的应用，属于生物技术领域。本发明的谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）分离自白酒大曲中，具有产阿魏酸酯酶特征，菌株原始编号为M6，菌种保藏编号为CGMCC No.14125。本发明的优点在于：提供了一株产阿魏酸酯酶的谢瓦散囊菌，并将其制备成谢瓦散囊菌菌粉，将该菌粉按一定比例应用于白酒大曲生产中，可制得高阿魏酸酯酶活性的优质大曲，该大曲曲心具明显的谢瓦散囊菌金黄色菌斑，由该大曲发酵的酒液较对照曲具有酒度高、己酸和己酸乙酯含量高等特征。

Description

一株产阿魏酸酯酶谢瓦散囊菌及其在白酒大曲中的应用

技术领域

本发明涉及一株产阿魏酸酯酶谢瓦散囊菌及其在白酒大曲中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

白酒大曲为传统酿造用曲中的一种，又称块曲或砖曲，是白酒发酵生产中至关重要的元素，以小麦、大麦、豌豆等为原料，经过粉碎，加水混捏，压成曲醅，形似砖块。根据生产温度的不同，大曲可分为低温曲、中温曲、中偏高温曲和高温曲；在成曲的过程中，微生物大量生长，将原料中的大分子物质（淀粉、脂类、蛋白质等）降解为可吸收的小分子物质，为后期的发酵生产提供丰富的底物、微生物、生物酶。

阿魏酸酯酶（feruloyl esterase，FAE）又名肉桂酸酯酶，属羧酸酯水解酶的亚类之一，指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来的一种酶。其能够水解植物细胞壁中多糖-多糖、多糖-木质素间之间通过阿魏酸或双阿魏酸形成的酯键，导致植物细胞壁复杂网络结构的破坏，使得其他水解酶更容易接近底物的作用中心，从而提高了植物细胞壁的降解效率。阿魏酸酯酶在饲料、食品、造纸、纺织、生物能源、化妆和医药工业等领域具有广泛的应用前景，其应用于白酒大曲生产中，可以使大曲中原料细胞壁的降解效率提高，从而使大曲中的微生物转化反应更彻底。

散囊菌属真菌大量存在于传统发酵食品生产过程中，具有产多酚氧化酶、果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶以及抑制杂菌生长等作用，作为有效的生化动力，可催化发酵食品中各种相关物质发生氧化、聚合、降解、转化，改善发酵食品的品质。如冠突散囊菌（Eurotium cristatum）、谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）、蜡叶散囊菌（Eurotium herbariorum）等大量存在于黑茶发酵工艺中，具有改善茶叶品质和一定的保健功能，特别是茯砖茶中的金花菌（冠突散囊菌）的含量已作为茯砖茶品质标志的金标准。

谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）属于真菌界、子囊菌门、散囊菌纲、散囊菌目、发菌科、散囊菌属。该菌种无性型名称为谢瓦曲霉（Aspergillus chevalieri），为嗜高渗透压菌种，在一般的培养基上生长不良或不能生长，在低水活度培养基上可以正常生长。谢瓦散囊菌主要以闭囊壳方式产生有性孢子，菌种在生长过程中形成大量球形闭囊壳，每个闭囊壳中包含上千个子囊，每个子囊中含有八个子囊孢子，在菌剂制备过程中选取一定的破壁方法，可以极大提高菌剂的孢子浓度。

谢瓦散囊菌主要与茶叶、烟草、白酒、豆酱等发酵生产相关，已有大量文献报道谢瓦散囊菌存在于白酒发酵生产过程中（酱香型、浓香型、清香型大曲中均分离到），如黄小宁等（2016年）通过PCR-DGGE研究显示谢瓦散囊菌存在于浓香型大曲和酱香型大曲中，且为浓香型大曲中的优势真菌；胡佳音等（2016）通过传统可培养方法结合高通量测序分析方法显示谢瓦散囊菌为浓香型大曲和酱香型大曲中的主体真菌；周森等（2016）通过高通量测序分析显示其存在于清香型大曲中；张晓娟等（2015）通过可培养分离方法研究显示其存在于浓香型大曲中；班世栋等（2014）研究显示其存在于酱香型大曲中；孙剑秋等（2013）通过平板培养方法研究显示其存在于酱香型白酒酒醅中，分离率达16%。目前对谢瓦散囊菌的研究主要处于分离鉴定的水平，其在白酒生产中的应用方式和具体功能值得进一步研究。

目前已有研究显示谢瓦散囊菌可产纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶，但没有其产阿魏酸酯酶的报道，一些其他种类的微生物如黑曲霉、烟曲霉、棒曲霉、米曲霉、枝孢霉等可以产阿魏酸酯酶，如专利CN 102286442A研究显示烟曲霉阿魏酸酯酶酶活为61.89 mU/ mL，黑曲霉阿魏酸酯酶酶活为53.26 mU/ mL，米曲霉阿魏酸酯酶酶活为0.78 mU/ mL。

发明内容

本发明提供了一株产阿魏酸酯酶的谢瓦散囊菌；将该菌种麸皮培养物通过旋转蒸发干燥、机械粉碎方式制备了其高活性、低含水量的菌粉；将该菌粉以拌料或喷洒的方式应用于白酒大曲生产中，提高了大曲的品质，该强化大曲特征为：曲心具有明显的谢瓦散囊菌金黄色菌斑；较对照大曲阿魏酸酯酶活性提高；发酵酒液酒度、己酸、己酸乙酯含量均提高。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明的菌株M6是将白酒大曲中分离得到的谢瓦散囊菌，接种于含阿魏酸乙酯的培养基平板上， 28℃培养5～7 d，根据菌落周围透明圈的大小，筛选出的产阿魏酸酯酶能力较强的菌株，其保藏编号为CGMCC No. 14125和CICC 41584，其发酵液阿魏酸酯酶活力可达到84.97 mU/ mL。

本发明的菌株M6是通过形态学特征和核酸序列系统发育分析来准确确定其分类学地位的。菌株M6的形态学特征为：CYA培养基上，25℃培养7天，菌落直径30～31mm，中央黄褐色，周围蛋黄色；中心凸起；质地丝绒状；反面浅橙黄色；无渗出液产生，无可溶性色素产生。菌丝黄色具饰，缠绕、较细；闭囊壳大量，黄褐色，存在于具饰菌丝网中，直径150～200μm，成熟后破裂释放出大量子囊；子囊近球形或椭圆形，长轴直径10～20μm，内含8个子囊孢子；子囊孢子双凸镜形，中部具鸡冠状凸起，长轴直径为5.0～7.5μm；未见分生孢子结构。菌株M6的分子生物学特征为：ITS rDNA序列NCBI登录号为MF324890；β-tubulin基因序列NCBI登录号为MF324896。

本发明中谢瓦散囊菌M6的菌剂制备方法如下：

步骤1：将麸皮与蒸馏水按1:(1～1.2)的比例润湿，称取20-25g于500 mL三角瓶中，121℃灭菌40分钟，隔夜，按同样条件再灭菌一次；

步骤2：待麸皮培养基冷却后，接种5 mL在 28℃培养7d的谢瓦散囊菌发酵液，28℃培养14-20d，培养期间观察有无杂菌污染；

步骤3：随机选取一瓶培养好的麸皮培养物称取5g，10%稀释，吸取1 mL涂布于直径20cm的PDA平皿上，28℃培养3～5天，观察有无杂菌生长；

步骤4：检验合格后，用无菌长柄勺将麸皮培养物扣取至20L的旋转蒸发仪中，40℃水浴真空干燥24h～30h，水分控制到8%～10%之间；

步骤5：通过250W微型粉碎机粉碎30s，过20目筛，菌粉封装于无菌自封袋中（粉碎机粉碎有助于谢瓦散囊菌闭囊壳和子囊的破裂而释放出大量子囊孢子，提高菌粉浓度）；

步骤6：称取上述菌粉产品按照GB4789（霉酵计数方法）进行计数，其活菌落数应为1×10⁷ CFU/g以上，杂菌数应低于1%。

本发明的谢瓦散囊菌菌粉强化方式为拌料或喷洒的方式。

本发明谢瓦散囊菌的强化大曲特征为：曲心具有明显的谢瓦散囊菌黄色菌斑；谢瓦散囊菌活菌数应为1×10⁵～1×10⁷ CFU/g；阿魏酸酯酶活性高，达到69～77 mU/ kg；与对照曲比较，强化大曲发酵酒液的酒度提高15.7%，己酸含量提高95.9%，己酸乙酯含量提高95.5%。

附图说明

图1谢瓦散囊菌菌株M6的形态学照片（A: CYA培养基25℃培养7d的菌落照片；B：光学显微照片，闭囊壳和子囊；C：扫描电镜照片，闭囊壳；D：扫描电镜照片，子囊孢子）。

图2谢瓦散囊菌菌株M6与相关种的ITS rDNA (图2a)和β-tubulin (图2b)基因序列系统发育树。

图3谢瓦散囊菌菌株M6在含0.1%阿魏酸乙酯的培养基平板上产生的透明圈。

图4谢瓦散囊菌菌株M6发酵菌液阿魏酸酯酶活性测定液相色谱图：图4（a）为含0.25%的阿魏酸乙酯的空白培养基的阿魏酸液相色谱测定图（色谱峰1）；图4（b）为M6发酵菌液与含0.25%的阿魏酸乙酯的培养基反应后的阿魏酸液相色谱测定图（色谱峰1）。

图5谢瓦散囊菌菌株M6强化曲和对照曲曲心照片。

图6谢瓦散囊菌菌株M6与强化大曲黄心菌种的RAPD分型图谱。

具体实施方式

结合实施例对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1 菌种鉴定

本发明的菌株M6分离自山东扳倒井股份有限公司中高温大曲中，菌种已保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC No. 14125）和中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC 41584）。

（1）形态学鉴定

将菌株M6接种在察氏酵母膏培养基上（CYA培养基），25℃培养7d，进行菌落拍照，菌体显微观察以及扫描电镜观察，具体形态特征详见图1。

（2）分子生物学鉴定

菌株M6通过ITS rDNA和β-tubulin基因序列系统发育分析，将其准确鉴定到种，系统发育树详见图2(a-b)。

实施例2 菌种产阿魏酸酯酶研究

（1）酶活定性检测

将分离自山东扳倒井股份有限公司白酒大曲中的谢瓦散囊菌菌株M1、M6、M9接种于含阿魏酸乙酯的察氏琼脂基平板上 [0.01 g Fe SO4·7H2O，2.0 g Na NO3，0.5 g KCl，0.5g Mg SO4·7H2O，1.0 g K2HPO4，30 g 蔗糖，20 g 琼脂， 0.1 g罗丹明B，1 L 蒸馏水，自然pH 值，1000 mL 培养基冷却至 50~60 ℃，加入10 mL含10%阿魏酸乙酯的二甲基甲酰胺溶液（0.22μm膜过滤）]，在28℃培养5d，若在菌落周围出现透明圈，则表明菌株可以产生阿魏酸酯酶，根据透明圈的大小来判断菌株的产酶能力，筛选出阿魏酸酯酶活性较高的菌株M6（见图3）。

（2）酶活定量检测

接种菌株M6于5%蔗糖麦芽浸粉（MEB）培养基中，28℃培养7d，吸取菌株发酵菌液2 mL加入4 mL含0.25%的阿魏酸乙酯的MEB （5%蔗糖）对照培养基，40℃温浴振荡10min，吸取反应液3 mL加入3 mL 甲醇-冰醋酸（19∶1），混匀，0.45 μm有机相滤膜过滤，通过高效液相色谱进行阿魏酸产量的测定（见图4, a-b）。

阿魏酸酯酶酶活定义：在40℃条件下，每分钟催化阿魏酸乙酯生成1 μmol阿魏酸所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

注：反应生成的阿魏酸浓度为27.8405 μg/mL（图4a）；对照培养基中阿魏酸浓度为0.3415 μg/mL（图4b）；稀释倍数为2；反应总体积为6 mL；阿魏酸分子量为194.19；反应时间为10 min；反应体系中菌种发酵液的体积2 mL。

根据上公式，菌株M6阿魏酸酯酶酶活测定结果：84.97 mU/ mL。

实施例3 谢瓦散囊菌菌株M6的中高温大曲强化试验

（1）强化方式及取样方式

取制备好的谢瓦散囊菌菌粉100 g溶解于15 L含2% NaCl的蒸馏水中，通过喷洒和拌料两种方式强化山东扳倒井股份有限公司的中高温大曲（编号分别为19#喷洒，19#拌料），每块大曲大约分配到8～9 mL 终浓度为1.2×10⁵ CFU/mL的菌液，选取未强化谢瓦散囊菌的大曲作为对照（编号分别为19#对照）。取样方式为在曲房的四角和中间5个位置各取1块长势良好的曲块，粉碎后混合均匀，四分法进行采样。

（2）强化大曲的感官指标

按照扳倒井股份有限公司的企业标准《大曲评分标准》（BDJ/JW-WSW-06）对强化曲和对照曲感官进行评价，评价结果见表1，根据表1可知喷洒和拌料的强化曲典型特征为曲心具有大量金黄色菌斑（见图5）。

利用接种针挑取一点黄色菌斑上的菌丝转接至PDA培养基上，分离纯化得到黄色菌落，通过实施例1的鉴定方法证明该菌种为谢瓦散囊菌。将分离到的谢瓦散囊菌和初始强化菌种M6利用RAPD方法进行分型试验（分型图谱见图6），结果显示分离到的谢瓦散囊菌和初始强化菌种M6为同一型，及大曲中央黄色菌斑是由初始强化菌M6发育形成。

表1 谢瓦散囊菌强化曲及对照曲的感官特征及评价结果

（3）强化大曲中谢瓦散囊计数

称取25g大曲样品溶解于225 mL生理盐水中，摇床130rpm/min混匀30 min, 吸取1 mL混合液加入含有9 mL生理盐水的试管中，涡旋震荡混匀，依次稀释至10^-6稀释度，分别吸取10^-4、10^-5、10^-6稀释液100 mL涂布于孟加拉红培养基上，每个稀释度涂布两个平皿，28℃培养至5d进行谢瓦散囊菌计数，将纯种谢瓦散囊菌菌株接种于孟加拉红培养基上相同条件培养作为形态判定参照物。计数结果见表2，由表2可知强化曲中谢瓦散囊菌均为10⁵以上，对照曲中散囊菌在10^-3稀释度上未观测到。

表2 中高温大曲中扣囊复膜孢酵母计数结果

（4）强化大曲的阿魏酸酯酶活性测定

取5g大曲加入20 mL含20%阿魏酸乙酯的蒸馏水，40 ℃水浴锅中浸提2h，中间进行混匀几次，取上清液3 mL，再加 3 mL甲醇-冰醋酸（19∶1）的混合，混匀，过 0.45μm 膜过滤（有机相），放入进样瓶，冰箱避光保存，备用（每个样品进行3次平行试验）。

用高效液相色谱（HPLC）法测定样品中的阿魏酸含量。色谱条件：流动相为甲醇-1%冰醋酸 （28∶72），波长 314 nm，流速 1.0 mL/min，进样量 10 μL，柱温 30 ℃。

阿魏酸酯酶酶活定义：每1kg大曲，在40℃反应1min，催化阿魏酸乙酯生成1 μmol阿魏酸为一个酶活力单位（U）。测定结果见表3，由表3可知两种强化大曲中阿魏酸酯酶较对照曲均明显增高。

表3 谢瓦散囊菌强化曲及对照曲中阿魏酸酯酶酶活及催化阿魏酸乙酯生成阿魏酸的含量

（5）强化大曲的发酵酒液制备及分析

大米发酵液的制备：取碎大米240g，加入4.5倍水。放入电锅中熬制，直至大米完全糊化。再加入2倍水，搅拌均匀，温度降至70℃左右，加入适量液化酶液化，用碘液判断液化是否完全。 液化完全的大米发酵液混合均匀，后分装到1000 mL的平底烧瓶中，装液量500mL/瓶，共装3瓶。盖好棉塞，外包牛皮纸。放入高压蒸汽灭菌锅中，115℃，15min灭菌。灭菌结束，冷却备用。

接种与发酵：每瓶的大曲接种量是21.6g，接种完毕后，将烧瓶放入30℃，40r/min的摇床中进行发酵，发酵7d。

蒸馏：发酵结束的发酵醪，用单层纱布过滤至1000 mL的平底烧瓶中，接好玻璃蒸馏装置进行蒸馏，取蒸馏出的酒液50 mL作为最终产品，进行气相色谱分析风味成分，根据国标GB/T 10345.3的方法进行酒度测定，分析结果见表4。由表4可知两个强化曲的发酵酒液酒精度、己酸和己酸乙酯含量均较对照曲高，其中己酸乙酯为浓香型白酒重要的呈味物质，己酸为己酸乙酯的前体物质。

表4 谢瓦散囊菌强化曲及对照曲的发酵酒液分析结果

序列表

<110> 山东扳倒井股份有限公司

中国食品发酵工业研究院有限公司

<120> 一株产阿魏酸酯酶谢瓦散囊菌及其在白酒大曲中的应用

<130> 20180207

<141> 2018-02-07

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 505

<212> DNA

<213> 谢瓦散囊菌(Eurotium chevalieri)

<400> 1

tgcgggccct ctgggtccaa cctcccatcc gtgtctatct gtaccctgtt gcttcggcgt 60

ggccacggcc cgccggagac taacatttga acgctgtctg aagtttgcag tctgagtttt 120

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<210> 1

<211> 384

<212> DNA

<213> 谢瓦散囊菌(Eurotium chevalieri)

<400> 1

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tcccccgtgc cgtcctcgtc gaccttgagc ccggtaccat ggacgccgtc cgtgccggtc 360

ccttcggcca gctcttccgt cccg 384

Claims (4)

1.一株产阿魏酸酯酶的谢瓦散囊菌，学名为Eurotium chevalieri，分离自白酒大曲中，2017年05月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.14125。

2.如权利要求1所述的谢瓦散囊菌，其特征在于：发酵液阿魏酸酯酶活力达到84.97mU/ mL。

3.如权利要求1所述的谢瓦散囊菌的应用，其特征在于：通过其强化得到的白酒生产大曲曲心具有明显的金黄色菌斑；谢瓦散囊菌活菌数达到1×10⁵～1×10⁷ CFU/g；阿魏酸酯酶活力达到69～77 mU/ kg。

4.如权利要求3所述的强化大曲的应用，其特征在于：与对照曲比较，强化大曲发酵酒液的酒度提高15.7%，己酸含量提高95.9%，己酸乙酯含量提高95.5%。