CN114395483B - 一种谢瓦散囊菌固态菌剂制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种谢瓦散囊菌固态菌剂的制备。具体发明步骤如下：首先将谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）通过液体扩大培养法制备成一级种子液；然后将一级种子液以20%接种量接种至固态发酵培养基中，28℃‑30℃发酵培养8 d‑10 d后，制备为二级固态菌培养物；二级固态培养物通过30℃‑35℃干燥，再通过物理研磨破碎后制成最终的固态菌剂。本发明制备的谢瓦散囊菌固态菌剂活菌数可达到3.745×108 CFU/g。本发明制备的谢瓦散囊菌固态菌剂可应用于白酒生产和发酵茶领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种谢瓦散囊菌菌剂的制备，属于生物技术领域。
背景技术
散囊菌属真菌多存在于我国传统发酵食品，根据文献可从发酵茶、白酒大曲中分离得到，分泌包括多酚氧化酶、过氧化物酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶及淀粉酶等多种胞外酶，对发酵食品风味和香气的形成起重要作用。谢瓦散囊菌（Eurotium chevalieri）属于真菌界、子囊菌门、散囊菌纲、散囊菌目、发菌科、散囊菌属。该菌种无性型名称为谢瓦曲霉（Aspergillus chevalieri），为嗜高渗透压菌种，在一般的培养基上生长不良或不能生长，在低水活度培养基上可以正常生长。根据文献报道，酱香型、浓香型、清香型大曲中均有分离出谢瓦散囊菌，是浓香型和酱香型大曲中的优势真菌，对改善白酒大曲风味具有重要作用。
发明专利（CN 110699208 A）中涉及到一种利用谢瓦散囊菌发酵生产白酒的方法，这种方法使风味更加丰富协调，酒质更加稳定。发明专利(CN10967855A)中谢瓦散囊菌菌株CICC 41587应用于生产茶香风味的大曲。发明专利 (CN 109468232 A)提供了一株产阿魏酸酯酶的谢瓦散囊菌，强化应用于白酒大曲后，发酵白酒酒度高、己酸和己酸乙酯含量提高。目前，已有较多的研究报道将谢瓦散囊菌强化应用于白酒生产中，并取得了良好应用效果，但关于谢瓦散囊菌菌剂制备的方法鲜有报道。
发明内容：
本发明提供了一种谢瓦散囊菌固态菌剂的制备方法，通过对该菌种的发酵培养基、接种量、发酵温度、发酵时间、固体培养物粉碎时间进行研究，制备出了高活性、高纯度的谢瓦散囊菌固态菌剂。
本发明是通过以下技术方案实现：
步骤1：称取酵母浸粉40 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO4 2 g，溶解于1 L蒸馏水中，分装后121℃灭菌15 min，制成营养液。
步骤2：称取麸皮12 g、蔗糖8 g于500 mL三角瓶中，将固体混匀后添加15.4 mL营养液充分润湿，充分混匀后121℃灭菌40 min，隔夜室温静置，按同样条件再灭菌一次。
步骤3：待麸皮培养基冷却后，接种8 mL在28℃培养8 d-10 d的谢瓦散囊菌发酵液，28℃培养10 d，培养期间观察有无杂菌污染。
步骤4：随机选取一瓶培养好的麸皮培养物称取5 g，10%稀释后，吸取1 mL涂布于PDA培养基平皿上，28℃培养3 d -5 d，观察有无杂菌生长。
步骤5：检验合格后，用无菌长柄勺将麸皮培养物扣取至灭菌呼吸袋中，置于30℃-35℃环境下烘干。
步骤6：将步骤5得到的烘干物通过微型粉碎机粉碎30 s，封装于无菌自封袋中，制成谢瓦散囊菌菌粉产品。粉碎机粉碎有助于谢瓦散囊菌闭囊壳和子囊的破裂而释放出大量子囊孢子，提高菌粉浓度。
步骤7：称取步骤6中菌粉产品，按照《GB 4789霉酵计数方法》进行计数，其活菌落数应为3×108 CFU/mL以上，杂菌数应低于1%。
本发明谢瓦散囊菌的固态菌剂特征为：菌剂制备方法简单，制成的固态菌剂中目标菌含量高，杂菌率低，性状稳定，便于运输和保藏，具有大规模生产应用前景。
附图说明
图1不同固态培养基原料对谢瓦散囊菌生长的影响
图2 “营养液+麸皮+蔗糖”培养基接种前和接种后培养物外观比较
图3 在PDA平板上谢瓦散囊菌的高温耐受实验
图4 在“营养液+麸皮+蔗糖”培养基中谢瓦散囊菌的高温耐受实验
图5 谢瓦散囊菌固态菌剂物理破碎前和破碎后显微形态观察
图6 谢瓦散囊菌固态菌剂物理破碎10 s-60 s菌落计数结果
具体实施方式
结合实施例对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1 不同固态培养基原料对谢瓦散囊菌生长的影响
（1）培养基配制和接种
分别按照表1中原料配方制备固态发酵培养基，灭菌前充分摇匀，121℃灭菌40min，间歇式灭菌两次。将甘油保藏的谢瓦散囊菌菌株接种于PDA平板培养基上进行活化，25℃恒温培养7 d。挑取一环活化的谢瓦散囊菌接种于含有4%蔗糖的MEB培养基中，28℃、120r/min恒温振荡培养10 d，制备为一级液体种子培养液，菌落计数可达4.9×103 CFU/mL。然后，以20%接种量将种子培养液接种到固态发酵培养基中，28℃-30℃发酵培养8 d -10 d。参考国标GB 4789.15《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》方法进行微生物计数，计数培养基采用PDA培养基。
（2）发酵培养和计数
如图1所示，通过比较不同培养基原料成分中的菌落计数结果，确定最佳发酵培养基成分为4号“营养液+麸皮+蔗糖”，其中培养物的菌落计数值最高，为1.185 ×107 CFU/g。如图2所示，谢瓦散囊菌接种在“营养液+麸皮+蔗糖”培养基中培养10 d后，培养基表面和内部长满黄色菌落。
表1不同固态培养基原料配方
| 序号 | 麸曲制备培养基 | 营养液(mL) | 水(mL) | 麸皮(g) | 面粉(g) | 豆粕(g) | 玉米粉(g) | 蔗糖(g) |
| 1 | 水+麸皮 | - | 15.38 | 20 | - | - | - | - |
| 2 | 营养液+麸皮 | 15 | - | 20 | - | - | - | - |
| 3 | 水+麸皮+蔗糖 | - | 15.38 | 12 | - | - | - | 8 |
| 4 | 营养液+麸皮+蔗糖 | 15.38 | - | 12 | - | - | - | 8 |
| 5 | 水+麸皮+面粉 | - | 15.38 | 12 | 8 | - | - | - |
| 6 | 营养液+麸皮+面粉 | 15.38 | - | 12 | 8 | - | - | - |
| 7 | 营养液+麸皮+豆粕 | 15.38 | - | 12 | - | 8 | - | - |
| 8 | 营养液+麸皮+玉米粉 | 15.38 | - | 12 | - | - | 8 | - |
| 9 | 营养液+麸皮+（豆粕+面粉+玉米粉） | 15.38 | - | 12 | 2.7 | 2.7 | 2.7 | - |
注：“-”表示未添加。
实施例2 谢瓦散囊菌菌株高温耐受性分析
菌液的制备和实施例1中方法相同。
（1）菌株在琼脂平板上对高温的耐受性实验
将菌液接种于PDA平板，分别放置于28℃、45℃、50℃、55℃培养箱中培养5 d，再将上述平板置于28℃培养箱中培养5 d。由图3中（2）、（3）、（4）可见，谢瓦散囊菌接种在PDA平板上于45℃、50℃和55℃培养5 d后放于28℃培养5 d，平板上均未有菌丝生长，而在28℃培养10 d的对照组生长良好，菌落直径为44 mm -47 mm。上述结果表明，谢瓦散囊菌CICC41584菌株在平板上无法耐受持续5 d的45℃以上的高温。
（2）菌株在“营养液+麸皮+蔗糖”培养基中对高温的耐受性实验
将8 mL种子培养液分别接种于“营养液+麸皮+蔗糖”培养基中，放置于28℃、45℃、50℃、55℃培养箱中培养10 d，观察菌落生长情况，再将上述固态发酵培养基置于28℃培养箱中培养10 d。由图4所示，谢瓦散囊菌接种在“营养液+麸皮+蔗糖”培养基中，分别置于45℃、50℃和55℃环境下培养10 d后，均未长出菌落，之后放于28℃培养10 d，45℃和50℃瓶中培养物长出谢瓦散囊菌特有的金黄色菌丝，55℃瓶中未见生长。谢瓦散囊菌在“营养液+麸皮+蔗糖”培养基中于45℃、50℃温度下生长受到了抑制，但在适宜温度下可继续生长，谢瓦散囊菌不耐受55℃高温，放于适宜温度下也无法恢复生长。由此推断，谢瓦散囊菌对45℃以上的高温耐受性差。
实施例3 谢瓦散囊菌菌剂的制备
（1）培养基的制备
称取酵母浸粉40 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO4 2 g，溶解于1 L蒸馏水中，分装后121℃灭菌15 min，制成营养液。称取麸皮12 g、蔗糖8 g于500 mL三角瓶中，将固体混匀后添加15.4 mL营养液充分润湿，充分混匀后121℃灭菌40 min，隔夜室温静置，按同样条件再灭菌一次。
（2）接种和培养
待麸皮培养基冷却后，接种8 mL如实施例1中所述的一级种子培养液，在28℃培养10 d。培养过程中，随机选取一瓶培养物，按照GB 4789（霉酵计数方法）进行稀释涂布计数，观察有无杂菌生长。
（3）干燥和粉碎
检验合格后，用无菌长柄勺将固体培养物刮取至灭菌呼吸袋中，置于30℃-35℃环境下烘干。通过微型粉碎机粉碎10 s - 60 s，封装于无菌自封袋中。如图5所示，粉碎机粉碎有助于谢瓦散囊菌闭囊壳和子囊的破裂而释放出大量子囊孢子，提高菌粉浓度。称取上述菌粉产品按照GB 4789（霉酵计数方法）进行计数，如图6所示，随着粉碎时间的增加菌落计数值也逐渐增加，在粉碎30 s后其活菌落数达到最大值3.75×108 CFU/g，之后菌落数随着粉碎时间的增长而下降，杂菌数低于1%。定。发明专利(CN10967855A)中谢瓦散囊菌菌株CICC 41587应用于生产茶香风味的大曲。发明专利 (CN 109468232 A)提供了一株产阿魏酸酯酶的谢瓦散囊菌，强化应用于白酒大曲后，发酵白酒酒度高、己酸和己酸乙酯含量提高。目前，已有较多的研究报道将谢瓦散囊菌强化应用于白酒生产中，并取得了良好应用效果，但关于谢瓦散囊菌菌剂制备的方法鲜有报道。
Claims (3)
1.一种谢瓦散囊菌固态菌剂制备方法，其特征在于，所述的固态菌剂制备方法包括如下步骤：
（1）将谢瓦散囊菌接种至液体培养基中放大培养；
（2）将步骤（1）得到的培养物以20%接种量接种至固态发酵培养基中，28℃-30℃发酵培养8 d-10 d，固态发酵培养基配方为：麸皮质量占比33.9%、蔗糖质量占比22.6%、酵母浸粉质量占比1.7%，MgSO4·7H2O质量占比0.04%，KH2PO4质量占比0.09%，添加蒸馏水质量占比为43.5%；
（3）将步骤（2）得到的培养物30℃-35℃干燥；
（4）将步骤（3）得到的产物通过物理研磨方式破碎谢瓦散囊菌闭囊壳，释放子囊孢子。
2.根据权利要求1所述的固态菌剂制备方法，其特征在于，固态发酵培养基配置方式为：先将酵母浸粉、MgSO4·7H2O和KH2PO4按比例溶解于蒸馏水中配置为营养液，再吸取配置好的营养液与麸皮和蔗糖按比例混合。
3.根据权利要求1所述的固态菌剂制备方法，其特征在于，所述菌剂中谢瓦散囊菌活菌含量达到3×108 CFU/mL以上，杂菌数应低于1%。
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