CN112931044B - 白囊耙齿菌的培养基及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及白囊耙齿菌的培养基及培养方法。生物体的共同生长发育规律是由幼龄期到发育旺盛期，最终到衰老期，直至衰亡。真菌类生物发酵工程原理，就是应用发酵法，促进菌丝的不断繁殖及代谢产物的积累，提取有效活性成分，为制药及其他相关产品的开发提供可靠的原料。优良的培养基搭配是菌种生长发育的基础，对发酵生产是重要的关键技术问题。

Description

白囊耙齿菌的培养基及培养方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及白囊耙齿菌的培养基及培养方法。
背景技术
白耙齿菌Irpexlacteus Fr.属齿菌科，耙齿菌属、白耙齿菌种的一种真菌，别名白囊孔。异名：Hirschioporuslacteus(Fr.)Teng；邓叔群，中国的真菌，484.1963。白耙齿菌子实体生于阔叶树的枯立木或枯倒木上。形态特征：担子果(子实体)平伏，扩展，白色，软革质；或平伏而反卷，反卷部分为8～15×10～20mm。有时倒生，呈复瓦状叠生，扇形，有狭小的基部，横径2～4cm，原2～3mm；盖面乳白色，有短绒毛，有绢丝状光泽，有环纹，边缘薄，下弯，波状至浅裂。菌肉白色，原1mm左右。刺呈耙齿状，短，不整齐，白色至黄白色，长1～2cm，孢子椭圆形，平滑，无色，4～5×2～3mm。囊状体棒形或纺锤形，50～150×5～10μm，有时被有结晶。白耙齿菌主要分布于长白山林区和黑龙江、河北、山西、甘肃、江西、福建、云南和西藏等省区。
白囊耙齿菌具有很高的医学价值，治疗尿少，浮肿，腰痛，血压升高等症，具抗炎活性。此外，白耙齿菌还具有调节免疫作用，如增强单核巨噬细胞系统功能、增强细胞免疫功能、促进细胞因子产生、增强体液免疫反应等。
白囊耙齿菌液体发酵物经提取所得多糖是中成药“益肾康”的原料，吉林省有9家企业生产。但近些年呈现萎缩状态，主要因为原有发酵工艺产量低，生产成本高，难以满足“益肾康”的原料需求，企业大规模生产面临窘境。而菌种的老化造成这一问题的重要原因。生物体的共同生长发育规律是由幼龄期到发育旺盛期，最终到衰老期，直至衰亡。真菌类生物发酵工程原理，就是应用发酵法，促进菌丝的不断繁殖及代谢产物的积累，提取有效活性成分，为制药提供可靠的原料。因此，利用真菌的生物学特性、结合白囊耙齿菌生长发育过程中靠菌丝体吸收营养繁殖的特点，进行白囊耙齿菌的液体发酵工艺优化，增强菌种活力，提高产量，降低生产成本，具有重要的经济意义和社会意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供白囊耙齿菌的培养基及培养方法，以期提高发酵效率。
在以发酵罐进行液态发酵培养前，需先制备种子液。本发明提供的种子培养基能够恢复菌种活力，培养获得的菌液中，白囊耙齿菌菌丝均匀，粗壮。
本发明提供的白囊耙齿菌的种子培养基由斜面培养基、摇瓶培养基和种子罐培养基组成。其中：
所述斜面培养基为PDA培养基。所述PDA培养基由水和葡萄糖2wt％，马铃薯20wt％，琼脂2wt％制得，pH自然。
所述摇瓶培养基包括水和2wt％～3wt％碳源、1wt％～2wt％氮源、0.1wt％～0.2wt％KH2PO4、0.1wt％～0.15wt％MgSO4，自然pH值。所述摇瓶培养基中，碳源为葡萄糖；氮源为蛋白胨或酵母粉。
一些实施例中，所述摇瓶培养基由水和葡萄糖2wt％～3wt％，蛋白胨1wt％～2wt％，KH2PO40.1wt％～0.2wt％，MgSO4 0.1wt％～0.15wt％制成，自然pH值。
一些具体实施例中，所述摇瓶培养基由水和葡萄糖3wt％，蛋白胨2wt％，KH2PO40.2wt％，MgSO4 0.1wt％制成，自然pH值。
另一些实施例中，所述摇瓶培养基由水和葡萄糖2wt％～3wt％，酵母粉1wt％～2wt％，KH2PO4 0.1wt％～0.2wt％，MgSO4 0.1wt％～0.15wt％制成，自然pH值。
一些具体实施例中，所述摇瓶培养基由水和葡萄糖3wt％，酵母粉2wt％，KH2PO40.2wt％，MgSO4 0.15wt％制成，自然pH值。
所述种子罐培养基包括水和1wt％～4wt％碳源、7wt％～8wt％氮源、0.1wt％～0.2wt％CaCl2、0.1wt％～0.2wt％KH2PO4、0.1wt％～0.15wt％MgSO4制得，自然pH值。所述种子罐培养基中，碳源选自葡萄糖、淀粉或玉米粉中至少一种；氮源选自麦麸汁、蛋白胨或豆饼粉中至少一种。
一些实施例中，所述种子罐培养基由水和1wt％～4wt％葡萄糖、1wt％～5wt％氮源、0.1wt％～0.2wt％CaCl2、0.1wt％～0.2wt％KH2PO4、0.1wt％～0.15wt％MgSO4制得，自然pH值。其中氮源为蛋白胨和麦麸；所述蛋白胨和麦麸的质量比为1:2。
一些具体实施例中，所述种子罐培养基由水和葡萄糖3wt％、蛋白胨1wt％、麦麸2wt％、豆饼粉5wt％、CaCl20.2wt％、KH2PO4 0.2wt％、MgSO40.15wt％制成。
一些实施例中，所述种子罐培养基由水和1wt％～4wt％葡萄糖、7wt％～8wt％氮源、0.1wt％～0.2wt％CaCl2、0.1wt％～0.2wt％KH2PO4、0.1wt％～0.15wt％MgSO4制得，自然pH值。其中氮源为麦麸和豆饼粉；所述麦麸和豆饼粉的质量比为(1～3):5。优选的，所述麦麸和豆饼粉的质量比为2:5。
一些具体实施例中，所述种子罐培养基由水和葡萄糖3wt％，麦麸汁2％，豆饼粉5wt％，CaCl20.2wt％，KH2PO4 0.2wt％，MgSO4 0.15wt％制成。
一些实施例中，所述种子罐培养基由水和1wt％～4wt％碳源、1wt％～7wt％氮源、0.1wt％～0.2wt％CaCl2、0.1wt％～0.2wt％KH2PO4、0.1wt％～0.15wt％MgSO4制得，自然pH值。其中所述碳源为葡萄糖和淀粉，所述葡萄糖和淀粉的质量比为1:1。氮源为麦麸和豆饼粉；所述麦麸和豆饼粉的质量比为2:5。
一些具体实施例中，所述种子罐培养基由水和葡萄糖1.5wt％，淀粉1.5wt％，蛋白胨1wt％，麦麸2wt％，豆饼粉5wt％，CaCl20.2wt％，KH2PO40.2wt％，MgSO4 0.15wt％制成。
本发明还提供了白囊耙齿菌种子液的培养方法，其包括以下步骤：
将菌种接种于所述斜面培养基，28℃±1℃培养70h～72h，获得斜面菌丝；
将所述斜面菌丝接种于所述摇瓶培养基，28℃±1℃，转速160r/min～220r/min，培养60h～65h，获得摇瓶菌液；
将所述摇瓶菌液接种于所述种子罐培养基，通入无菌空气，气流量为1:1v/vmin，28℃±1℃培养60h～65h，获得种子液。
本发明中，所述斜面菌丝在接种于摇瓶培养基前可于2℃～4℃保存。在一些实施例中，斜面菌丝的保存时间不大于30d。
本发明中，斜面菌丝与摇瓶培养基的质量比为1:6。所述摇瓶培养基培养的体积为150ml，斜面培养基接种6个摇瓶。一些具体实施例中，摇瓶培养的温度为28℃±1℃，时间为63h。经步骤2培养，每升发酵液中菌丝干重不小于7g，菌液澄明，黄褐色，菌丝呈不规则丝状，有淡淡的水果香味，无杂菌污染。
本发明中，摇瓶菌丝与种子罐培养基的质量比为1:10。种子罐培养的温度为28℃±1℃，时间为70h。经过种子罐培养，每升发酵液中菌丝干重可达9g以上，pH值为5.5～6，还原糖的质量分数为3％～5％。
制得种子液后，将种子液接种于液态发酵培养基，进行发酵。本发明提供的液体发酵培养基营养充足且均衡。使得菌丝生长迅速，生物量大，代谢产物丰富。
本发明还提供的白囊耙齿菌的液体发酵培养基包括水和1wt％～4wt％碳源、CaCl2 0.2wt％、氮源7wt％～8wt％、KH2PO40.1wt％～0.15wt％，MgSO4 0.15wt％，自然pH值；
所述碳源选自葡萄糖、淀粉或玉米粉中至少一种；
所述氮源选自麦麸汁、蛋白胨、酵母粉或豆饼粉中至少一种。
一些实施例中，所述液体发酵培养基由水和3wt％碳源、氮源7wt％，CaCl20.2wt％，KH2PO4 0.2wt％，MgSO4 0.15wt％制成；其中，所述碳源为葡萄糖和淀粉，所述葡萄糖和淀粉的质量比为1:1。所述氮源为麦麸汁和豆饼粉，所述麦麸汁和豆饼粉的质量比为2:5。一些具体实施例中，所述液体发酵培养基由水和葡萄糖1.5wt％，淀粉1.5wt％，CaCl20.2wt％，麦麸汁2wt％，豆饼粉5wt％，KH2PO4 0.2wt％，MgSO4 0.15wt％制成；
一些实施例中，所述液体发酵培养基由水和3wt％碳源、氮源7wt％，CaCl20.2wt％，KH2PO4 0.1wt％制成；其中，所述碳源为葡萄糖。所述氮源为麦麸汁和豆饼粉，所述麦麸汁和豆饼粉的质量比为2:5。一些具体实施例中，所述液体发酵培养基由水和葡萄糖3wt％，CaCl20.2wt％，麦麸汁2wt％，豆饼粉5wt％，KH2PO4 0.2wt％，MgSO4 0.15wt％制成；
一些实施例中，所述液体发酵培养基由水和3wt％碳源、氮源7wt％，CaCl20.2wt％，KH2PO4 0.1wt％制成；其中，所述碳源为葡萄糖。所述氮源为蛋白胨、麦麸汁和豆饼粉，所述蛋白胨、麦麸汁和豆饼粉的质量比为1∶2∶5。一些具体实施例中，所述液体发酵培养基由水和葡萄糖3wt％，蛋白胨1wt％，CaCl20.2wt％，麦麸汁2wt％，豆饼粉5wt％，KH2PO4 0.2wt％，MgSO40.15wt％制成。
本发明还提供了一种白囊耙齿菌的液体发酵方法，其包括：
以本发明所述的种子培养基培养白囊耙齿菌菌种，获得种子液；
将所述种子液接种于本发明所述的液体发酵培养基，发酵获得发酵菌液。
在本发明中，所述种子液的制备包括：
将白囊耙齿菌菌种接种于所述斜面培养基，28℃±1℃培养70h～72h，获得斜面菌丝；
将所述斜面菌丝接种于所述摇瓶培养基，28℃±1℃，转速160r/min～220r/min，培养60h～65h，获得摇瓶菌液；
将所述摇瓶菌液接种于所述种子罐培养基，通入无菌空气，气流量为1:1v/vmin，28℃±1℃培养60h～65h，获得种子液。
在所述发酵步骤中，所述种子液的接种量为10vol％；所述发酵的条件为：通入无菌空气，气流量为1:1v/vmin，罐压0.5kg/cm2，28℃±1℃培养60h。
本发明所述发酵方法制得的发酵产物。
所述发酵产物包括发酵液，发酵上清液或发酵获得的菌丝体。
本发明还提供了所述发酵产物的提取物。
所述提取物为本发明所述发酵产物经水提或有机溶剂提取获得的产物。所述提取物中含有麦角甾醇、多糖和/或甘露醇中至少一种。
本发明所述的发酵产物或提取物在制备药品、食品、饮品、保健品或化妆品中的应用。
所述药品由所述发酵产物或提取物和药学上可接受的辅料制得。
所述药品的制备方法包括：发酵菌丝干燥，提取麦角甾醇(或甘露醇等)，与药学上可接受的辅料混合，制得白囊耙齿菌药品。
所述食品由所述发酵产物或提取物和食品中的配料制得。所述配料包括蜂蜜。
所述食品制备方法：发酵菌液(发酵菌丝和发酵液)，干燥，粉碎后，与蜂蜜混合，制得白囊耙齿菌食品。
所述饮品由所述发酵产物或提取物和饮品中的配料制得。所述配料包括水、柠檬酸和/或葡萄糖。
所述饮品的制备方法：发酵菌丝，利用水提取，提取液和发酵液合并，与水、柠檬酸、葡萄糖混合，经均质制得白囊耙齿菌饮料。
所述保健品由所述发酵产物或提取物和保健品中可接受的辅料制得。
白囊耙齿菌保健品的制备方法：发酵菌液(发酵菌丝和发酵液)，干燥，粉碎后，与保健品上可接受的辅料混合，压片制得白囊耙齿菌保健品。
本发明提供了白囊耙齿菌的种子培养基、液体发酵培养基和液体发酵方法，并提供了该菌种液体发酵产物及其用途。本发明提供的培养基能够很好的活化白囊耙齿菌种子，即使不经过复壮，也能够得到良好的活化。且发酵培养基营养充足，发酵过程中，菌丝生长迅速，所得次生代谢产物含量较高。
具体实施方式
本发明提供了白囊耙齿菌的培养基及培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明的种子培养基、液体发酵培养基或白囊耙齿菌的液体发酵方法适用于各种白囊耙齿菌菌株，特别适用于退化的白囊耙齿菌。利用本发明提供的培养基或方法对白囊耙齿菌进行培养和发酵，能够提高发酵效率，提高发酵液中菌丝体以及多糖含量。本发明实施例中，白囊耙齿菌种来自长春中医药大学，该菌种在此前的实验中活性与其他白囊耙齿菌种类似，于实验室传代50次，出现老化问题。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1种子的生产
(1)斜面菌种：
培养基：PDA培养基葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，pH自然。
将白囊耙齿菌种接种于PDA培养基，培养温度26℃～28℃，70小时菌丝长满斜面，放冰箱(2～4℃)保存备用。
(2)二级摇瓶菌种
培养基：葡萄糖3％，蛋白胨2％，KH2PO4 0.2％，MgSO4 0.1％，自然pH值。灭菌备用。
取菌龄短、菌丝粗壮茂密的斜面菌种，在无菌条件下，接入已灭菌的摇瓶培养基(按1:6比例，即1个斜面接6个摇瓶)，23℃～25℃温控培养，摇瓶转速为160～220r/min(旋转式)，当发酵液每100ml获得菌丝干重1.2g以上；镜检达到菌种项下标准，味感有淡淡的水果香味，无杂菌污染，培养时间为60小时，可转入种子罐发酵培养。
(3)三级种子罐菌种
培养基：葡萄糖3％、蛋白胨1％、麦麸2％、豆饼粉5％、CaCl20.2％、KH2PO4 0.2％、MgSO4 0.15％、pH自然。灭菌备用。
取新鲜摇瓶菌种，按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌的种子罐培养基中，25℃～28℃温控培养，通入无菌空气搅拌，气流量为1:1v/vmin。发酵时间为60小时。
实施例2种子的生产
(1)斜面菌种：
培养基：PDA培养基葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，pH自然。
将白囊耙齿菌种接种于PDA培养基，培养温度23℃～28℃，71小时菌丝长满斜面，放冰箱(2～4℃)保存备用。
(2)二级摇瓶菌种
培养基：葡萄糖3％，蛋白胨1％，KH2PO40.2％，MgSO4 0.15％，自然pH值。灭菌备用。
取菌龄短、菌丝粗壮茂密的斜面菌种，在无菌条件下，接入已灭菌的摇瓶培养基(按1:6比例，即1个斜面接6个摇瓶)，23℃～28℃温控培养，摇瓶转速为160～220r/min(旋转式)，当发酵液每100ml获得菌丝干重0.9g以上；镜检达到菌种项下标准，味感有淡淡的水果香味，无杂菌污染，培养时间为63小时，可转入种子罐发酵培养。
(3)三级种子罐菌种
培养基：葡萄糖3％，麦麸汁2％，CaCl2 0.2％，豆饼粉5％，KH2PO4 0.2％，MgSO40.15％，自然pH值。灭菌备用。
取新鲜摇瓶菌种，按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌的种子罐培养基中，25℃～28℃温控培养，通入无菌空气搅拌，气流量为1:1v/vmin。发酵时间为60小时。
实施例3种子的生产
(1)斜面菌种：
培养基：PDA培养基葡萄糖2％，马铃薯20％，琼脂2％，pH自然。
将白囊耙齿菌种接种于PDA培养基，培养温度25℃～28℃，72小时菌丝长满斜面，放冰箱(2～4℃)保存备用。
(2)二级摇瓶菌种
培养基：葡萄糖3％，酵母粉2％，KH2PO4 0.2％，MgSO4 0.15％，自然pH值。灭菌备用。
取菌龄短、菌丝粗壮茂密的斜面菌种，在无菌条件下，接入已灭菌的摇瓶培养基(按1:6比例，即1个斜面接6个摇瓶)，22℃～25℃温控培养，摇瓶转速为160～220r/min(旋转式)，当发酵液每100ml获得菌丝干重0.9g以上；镜检达到菌种项下标准，味感有淡淡的水果香味，无杂菌污染，培养时间为70小时，可转入种子罐发酵培养。
(3)三级种子罐菌种
培养基：葡萄糖1.5％，淀粉1.5％，蛋白胨1％，麦麸2％，豆饼粉5％，KH2PO4 0.1％～0.2％，MgSO4 0.15％，CaCl20.2％，自然pH值。灭菌备用。
取新鲜摇瓶菌种，按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌的种子罐培养基中，28℃温控培养，通入无菌空气搅拌，气流量为1:1v/vmin。发酵时间为60小时。
实施例4种子品质鉴定
取实施例1～3制备的种子液，通过16×100倍生物显微镜检查、观察发酵液情况，称量菌丝干重，鉴定所得种子的品质。结果如表1所示：
表1 种子品质鉴定结果
可见，本发明实施例3提供的种子最为健壮、活性高，以实施例3的培养基生产种子液，菌丝体的产量最高，与其他实施例相比存在显著性差异，p<0.05。
实施例5～6白囊耙齿菌的液体发酵
取实施例3制备的种子，发酵体积为60L。按10％比例，在无菌条件下接入已灭菌的液体培养基中，液体培养基如表2所示。28℃±1℃温控培养，通入无菌空气搅拌，气流量为1:1v/vmin，罐压：0.5kg/cm2。发酵60h，放罐。检测每升发酵液中菌丝的干重、干燥菌丝中白囊耙齿菌多糖的质量分数，结果见表3。
表2 实施例5～7培养基
表3 品质检测结果
结果表明，实施例5的培养基更有利于菌丝的发酵以及多糖的产生，相对于其他实施例存在显著性的差异(p<0.05)。
对比例1
采用常规培养基(葡萄糖3％、酵母膏2％、KH2PO4 0.2％、MgSO4 0.15％)摇瓶培养获得种子液。
发酵体积为120L，无菌条件下，将种子液接种于液体发酵培养基(葡萄糖3％，麦麸2％，豆饼5％，蛋白胨1％，KH2PO4 0.2％，MgSO40.15％)。28℃±1℃温控培养，通入无菌空气搅拌，气流量为1:1v/vmin，罐压：0.5kg/cm2。发酵60h，放罐。
经检测，发酵液pH值为5.0，发酵液中还原多糖质量分数为2％，菌丝干重为8.31g/L，多糖含量为3％。与各实施例发酵的效果存在较大的差异，说明实施例优化的培养基能够显著的恢复菌种的活力，提高发酵产物中菌丝体的含量以及多糖的产量。
实施例7白囊耙齿菌药品的制备
取实施例5制得的发酵菌液(发酵菌丝和发酵液)，提取多糖，与药学上可接受的辅料混合，制得白囊耙齿菌药品。
实施例8白囊耙齿菌保健品的制备
取实施例5制得的发酵菌液(发酵菌丝和发酵液)，干燥，粉碎后，与保健品上可接受的辅料混合，压片制得白囊耙齿菌保健品。
实施例9白囊耙齿菌食品的制备
取实施例5制得的发酵菌液(发酵菌丝和发酵液)，干燥，粉碎后，与蜂蜜混合，制得白囊耙齿菌食品。
实施例10白囊耙齿菌饮料的制备
取实施例5制得的发酵菌丝，利用水提取，提取液和发酵液合并，与水、柠檬酸、葡萄糖混合，经均质制得白囊耙齿菌饮料。
实施例11白囊耙齿菌化妆品的制备
取实施例5制得的发酵菌液(发酵菌丝和发酵液)，干燥，与化妆品基质混合，制得白囊耙齿菌化妆品。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.白囊耙齿菌的培养基，其由种子培养基和液体发酵培养基组成，
所述种子培养基由斜面培养基、摇瓶培养基和种子罐培养基组成，其中：
所述斜面培养基为PDA培养基；
所述摇瓶培养基由水和3wt％葡萄糖、2wt％酵母粉、0.2wt％KH2PO4、0.15wt％MgSO4制得，自然pH值；
所述种子罐培养基由水和1.5wt％葡萄糖、1.5wt％淀粉、1wt％蛋白胨、2wt％麦麸、5wt％豆饼粉、0.2wt％CaCl2、0.1wt％～0.2wt％KH2PO4、0.15wt％MgSO4制得，自然pH值；
所述液体发酵培养基由水和1.5wt％葡萄糖、1.5wt％淀粉、1wt％蛋白胨、CaCl20.2wt％、2wt％麦麸汁、5wt％豆饼粉、0.2wt％KH2PO4，0.15wt％MgSO4，自然pH值。
2.白囊耙齿菌的液体发酵方法，包括：
以权利要求1所述的种子培养基培养白囊耙齿菌菌种，获得种子液；
将所述种子液接种于权利要求1所述的液体发酵培养基，发酵获得发酵菌液。
3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述种子液的制备包括：
将白囊耙齿菌菌种接种于所述斜面培养基，28℃±1℃培养70h～72h，获得斜面菌丝；
将所述斜面菌丝接种于所述摇瓶培养基，28℃±1℃，转速160r/min～220r/min，培养60h～65h，获得摇瓶菌液；
将所述摇瓶菌液接种于所述种子罐培养基，通入无菌空气，气流量为1:1v/vmin，28℃±1℃培养60h～65h，获得种子液。
4.根据权利要求2或3所述的发酵方法，其特征在于，
所述种子液的接种量为10vol％；
所述发酵的条件为：通入无菌空气，气流量为1:1v/vmin，罐压0.5kg/cm2，28℃±1℃培养60h。
5.权利要求2～4任一项所述发酵方法制得的发酵产物。
6.权利要求2～4任一项所述发酵方法制得的发酵产物或其提取物在制备药品、食品、饮品、保健品或化妆品中的应用。
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