CN109777847B - 体细胞亲和灵芝菌株对共发酵生产强抗氧化活性多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种体细胞亲和灵芝菌株对共发酵生产强抗氧化活性多糖的方法。创新性的将体细胞亲和的，但具遗传差异以及多糖发酵的偏好碳源不同的2株灵芝菌株同时接入液体培养基中共发酵生产强抗氧化活性多糖（胞外）的方法。主要步骤为：制备灵芝菌株对的固体菌种、罐上两菌共发酵以及沉淀法制备灵芝多糖。本发明共发酵灵芝多糖的抗氧化活性显著高于单菌发酵，适合用于保健品和药品生产。迄今为止，未见采用基于体细胞亲和的灵芝共发酵生产多糖的方法，本发明具有极大的应用推广前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程应用领域，涉及一种体细胞亲和灵芝菌株对共发酵生产强抗氧化活性多糖的方法。
背景技术
灵芝 (Ganoderma lingzhi) 又称为灵芝草、仙草、神芝，属担子菌纲、伞菌目、多孔菌科、灵芝属真菌，是我国著名的一种中药材，在我国和东南亚国家有几千年的药用历史。我国古代《神农本草经》就记载灵芝具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿等功效。现代研究证实灵芝具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血脂、降血糖等作用。灵芝含有丰富的活性成分，如多糖、三萜、甾醇、核酸、蛋白质、维生素、微量元素等，其中多糖和三萜是灵芝活性的主要来源。目前，灵芝已广泛用于保健品和药品生产，在预防和辅助治疗癌症方面的成效极为显著。
近年来，由于灵芝显著的保健及药用价值，市场需求不断增长。目前，灵芝生产主要采用代料及短椴木栽培技术，可收获灵芝子实体及其孢子。但栽培法具有一些明显缺点，主要表现为生产周期长（通常需6个月以上），占地大，以及产品质量不稳定（如活性成分变化大）等，已成为灵芝产业健康发展的主要制约因素；此外，灵芝栽培需耗废大量林木资源，不利于森林资源保护，因此，灵芝大规模栽培的发展模式难以为继，开发新的灵芝生产方法十分必要。
与栽培法相比，灵芝液体发酵具有生产周期短、生产场所要求少、易工业自动化生产以及产品质量稳定等优点。尤其重要的是液体发酵法生产的灵芝多糖和三萜具有与子实体来源的多糖及三萜相近的生物活性，因此，灵芝液体深层发酵法作为一种新的灵芝生产方法得到人们认可，可作为栽培法之外的灵芝生产新方法，发展潜力大。
当前，灵芝液体发酵法主要用于灵芝多糖、三萜以及菌丝体生产，均采用单菌种接种的发酵方法，但产率偏低，难以达到工业化生产所要求的经济效益，制约了灵芝液体发酵的工业应用，进一步开发高效的液体发酵方法显得紧迫。通过前期实验，即基于拮抗试验从大量灵芝菌株中筛选体细胞亲和的灵芝菌株，并分析其遗传差异和多糖发酵的偏好碳源。本发明选择体细胞亲和、但具遗传差异以及多糖发酵的偏好碳源不同的灵芝菌株对，将两者同时接入液体培养基发酵生产多糖（胞外），与单菌种接种的发酵方法相比，可提高多糖产量且显著提高其抗氧化活性。本发明是一种全新的灵芝液体发酵生产灵芝多糖的方法，且所生产的灵芝多糖具有强抗氧化活性，该发酵方法具有极大的推广应用前景。
发明内容
本发明提供了一种不同于常规的采用单一灵芝菌株接种的灵芝液体发酵方法，创新性的将体细胞亲和的，但具遗传差异以及多糖发酵的偏好碳源不同的2株灵芝菌株同时接入液体培养基中共发酵生产强抗氧化活性多糖（胞外）的方法。
一种体细胞亲和灵芝菌株对共发酵生产强抗氧化活性多糖的方法，包括以下步骤：
（1）制备灵芝菌株对的固体菌种；所述灵芝菌株对由体细胞亲和的NA8菌株Ganoderma lingzhi CICC 14021 和NA16菌株 Ganoderma lingzhi CICC 14027组成；
（2）接种、罐上发酵及多糖回收。
步骤（1）所述制备灵芝菌株对的固体菌种的方法为：将保藏的菌种接种至斜面PDA培养基，28℃培养5-7 d，切取1 cm2活化的菌种块接种至灭过菌的固体培养料，培养料装于三角瓶中， 在25℃，60%相对湿度的暗环境培养，菌丝吃料完全后即获得固体菌种。
所述固体培养料的制备方法为：杂木屑先用中药粉碎机粉碎，过40目筛；木屑粉和玉米粉按质量比7:3混匀，调含水量至55%，装至三角瓶或750 mL玻璃菌种瓶，121℃灭菌30min。
步骤（2）所述罐上发酵及多糖回收包括以下步骤：
（1）培养基配制：每升培养基中含有葡萄糖10 g，蔗糖20 g，乳糖 10 g，豆油5 g，玉米粉5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.25 g；
（2）灭菌：10 L发酵罐，121℃，30 min空消，装入7 L发酵培养基，121℃，30 min℃实消，冷却后将35-50 g NA8菌株的固体菌种和35-50 g NA16菌株的固体菌种同时接入发酵罐进行发酵；
（3）发酵：温度28℃，转速150 rpm，通气量为 0.5 vvm，pH自然，培养5 d。
（4）多糖回收：8000 ×g离心5 min或过滤去除发酵液中的菌丝体，在上清或滤液加入4倍体积的95% v/v乙醇，4℃过夜，8000 ×g离心5 min收集沉淀，即为灵芝多糖。本发明的优点在于：本发明首次提出基于体细胞亲和的方法选择共发酵菌株应用于灵芝液体发酵生产灵芝多糖；依据不同菌株多糖发酵适宜碳源的差异，发酵培养基采用混合碳源，以充分发挥每一菌株的生产性能；共发酵的多糖产量高于单菌发酵；相同浓度下，共发酵生产的灵芝多糖比单菌发酵生产的灵芝多糖具有更强的抗氧化活性，更适合用于保健品以及药品生产。
具体实施方式
本发明提供了一种体细胞亲和灵芝菌株对共发酵生产强抗氧化活性多糖的方法，下面实施例来进一步描述本发明的使用方法，但这些实施例仅是规范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。此外，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换仍在本发明保护范围。
实施例1
体细胞亲和的两株灵芝菌株按1:1（固体菌种重量比）接种的共发酵
1. 采用体细胞亲和的灵芝菌株对NA8和NA16为共发酵菌株，2菌株菌丝生长速度快，同时具遗传差异且多糖发酵的偏好碳源不同。
2. 菌种活化，将保藏的菌种接种至斜面PDA培养基，28℃培养5-7 d。
3. 固体菌种制备，杂木屑用中药粉碎机粉碎，过40目筛；木屑粉和豆粉以80%和20%比例混匀，调含水量至55%，装入750 mL玻璃菌种瓶，稍微压实，灭菌，冷却后接入活化的菌种，25℃和60%相对湿度的暗环境培养，菌丝吃料完全后即可作为共发酵的接种物，即为固体菌种。
4. 共发酵
采用10 L发酵罐，121℃，30 min空消，随后装入7 L发酵培养基，121℃，30 min℃实消，冷却后将2固体菌种各50 g同时接入发酵罐中。发酵培养基配方（每升）：葡萄糖10 g，蔗糖20 g，乳糖 10 g，豆油5 g，玉米粉5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.25 g。
发酵条件为温度28℃，转速150 rpm，通气量0.5 vvm，pH自然，培养5 d。
发酵结束后，苯酚-硫酸法检测显示发酵液中多糖浓度为1.06 g/L，作为对照的单菌发酵，NA8发酵产量仅为0.83 g/L，NA16为0.71 g/L。此外，在相同浓度下（0.1 mg/mL），共发酵多糖的DPPH自由基清除法性均高出两单菌发酵法所生产多糖的20%以上。
实施例2 两菌株按1:0.7（固体菌种重量比）接种的共发酵
1. 菌株、菌株的活化以及固体菌株制备同上。
2. 共发酵
采用10 L发酵罐，121℃，30 min空消，随后装入7 L发酵培养基，121℃，30 min实消，冷却后将菌株NA8的固体菌种50 g、NA16 菌株的固体菌种35 g同时接入发酵罐。发酵培养基配方为（每升）：葡萄糖10 g，蔗糖20 g，乳糖 10 g，豆油5 g，玉米粉5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.25 g。
发酵条件为温度28℃，转速150 rpm，通气量为 1.0 vvm，pH自然，培养5 d。
发酵结束后，发酵液中多糖浓度为1.08 g/L，作为对照的单菌发酵，NA8发酵产量仅为0.82 g/L，NA16为0.69 g/L。此外，相同浓度下（0.2 mg/mL），共发酵多糖的DPPH抗氧化活性均高出两单菌发酵所生产多糖的20%以上。
实施例3 采用不同体细胞亲和灵芝菌株对的共发酵
1. 采用灵芝菌株NA32 (Ganoderma lingzhi CICC 14020) 和NA39 (Ganoderma lingzhi CICC 14045)，两菌株体细胞亲和、但两者具遗传差异。
2. 菌种活化和固体菌种制备方法同上；
3. 共发酵
采用10 L发酵罐，121℃，30 min空消，随后装入7 L发酵培养基，121℃，30 min℃实消，冷却后将菌株NA32的固体菌种50 g、菌株NA39的固体菌种50 g接入发酵罐。发酵培养基配方为（每升）：葡萄糖10 g，蔗糖20 g，麦芽糖 10 g，豆油5 g，玉米粉5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.25 g。
发酵条件为温度30℃，转速为160 rpm，通气量为 1.0 vvm，pH自然，培养6 d。
发酵结束后，发酵液中多糖浓度为1.18 g/L，单菌发酵NA32仅为0.82 g/L，NA39仅为0.78 g/L。此外，相同多糖浓度下（0.2 mg/mL），共发酵多糖的DPPH抗氧化活性均高于两单菌发酵所生产多糖，高出约30%以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种体细胞亲和灵芝菌株对共发酵生产强抗氧化活性多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备灵芝菌株对的固体菌种；所述灵芝菌株对由体细胞亲和的NA32菌株Ganoderma lingzhi CICC 14020和NA39 菌株 Ganoderma lingzhi CICC 14045组成；
（2）接种、罐上发酵；
步骤（2）所述罐上发酵包括以下步骤：
（1）培养基配制：每升培养基中含有葡萄糖10 g，蔗糖20 g，麦芽糖10 g，豆油5 g，玉米粉5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.25 g；
（2）灭菌：10 L发酵罐，121℃，30 min空消，装入7 L发酵培养基，121℃，30 min℃实消，冷却后将菌株NA32的固体菌种50 g、菌株NA39的固体菌种50 g接入发酵罐；
（3）发酵：温度30℃，转速为160 rpm，通气量为 1.0 vvm，pH自然，培养6 d。
2.根据权利要求1所述一种体细胞亲和灵芝菌株对共发酵生产强抗氧化活性多糖的方法，其特征在于，步骤（1）所述制备灵芝菌株对的固体菌种的方法为：将保藏的菌种接种至斜面PDA培养基，28℃培养5-7 d，取活化的菌种块接种至灭过菌的固体培养料，在25℃，60%相对湿度的暗环境培养，菌丝吃料完全后即获得固体菌种。
3.根据权利要求2所述一种体细胞亲和灵芝菌株对共发酵生产强抗氧化活性多糖的方法，其特征在于，所述固体培养料的制备方法为：杂木屑先用中药粉碎机粉碎，过40目筛；木屑粉和豆粉以80%和20%比例混匀，调含水量至55%，装入750 mL玻璃菌种瓶，稍微压实，灭菌。
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