CN105368723B - 灵芝高产菌株选育方法 - Google Patents
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Abstract
本专利公开了灵芝高产菌株选育方法，操作方法采用菌种活化、培养、选择原始高产菌种用于发酵生产、四至五代传代培养，当菌种的质量下降时，对其进行外部刺激，经过外部刺激选择筛选优质的菌株进行扩培培养；当新的复合培养液中的菌种出现质量下降时，重复进行外部刺激的方法。本发明为了意在提供一种缩短菌株保藏环节，降低了菌种活化的培养周期，能大量筛选出高产灵芝多糖的菌株选育方法。
Description
技术领域
本发明涉及微生物的发酵技术领域，具体为一种灵芝高产菌株选育方法。
背景技术
目前，不管是在实验室的研究或者工厂工业化生产过程中，发酵产业尤其是丝状真菌发酵都是一个操作复杂，稳定性较差的生产方式，主要存在菌种保存过程中活力会逐渐降低、菌种传代过程中也会随传代次数增加而显著降低、菌种突变率高（这些突变中生长能力减弱和次级代谢产物的降低往往占据了突变的绝大部分比重）等问题，导致很多实验研究或者发酵生产都很难精确预测出发酵终点时的生长状况。而常见的检测方法也难以在短时间内得出结论，即便得出结论需要调整，也难以在为期数日的发酵时间内对发酵结果产生明显的改善，导致发酵过程控制对发酵结果的影响力就相对更弱。因此，菌种的质量就成了影响发酵的十分重要甚至决定性的因素。
而目前的菌种选育通常是通过自然突变高产菌株或者人工诱变手段进行，往往存在诱变周期长，成功率低，工作量大的问题。同时又导致保存过程繁杂，保存菌株在使用前又需要冗长的活化工作，加剧了菌株选育的难度和工作量。
发明内容
本发明为了意在提供一种缩短菌株保藏环节，降低了菌种活化的培养周期，能大量筛选出高产灵芝多糖的菌株选育方法。
本发明提供基础方案是：灵芝高产菌株选育方法，其操作步骤如下：
A、菌种活化：取韩国短柄赤芝菌种和日本鹿角灵芝菌种，韩国短柄赤芝菌种与日本鹿角灵芝菌种的比例关系为1:1，将两种菌种用PDA基础培养基于28℃震荡培养5~7d；
B、在其中一种菌种的稳定期将其接种在PDA复合培养基中，放置在28℃的摇床中震荡培养4~6d，另一种菌种在对数生长期将其接种在PDA复合培养基中，放置在28℃的摇床中震荡培养2~4d，PDA复合培养基是在PDA基础培养基的基础之上加入1.5%磷酸二氢钾和0.75%硫酸镁；
C、选择原始高产菌种用于发酵生产；
D、将步骤C的高产菌种通过四至五代传代培养，当菌种的质量下降时，对其进行外部刺激，
E、外部刺激：在无菌环境下，使用20ml匀浆器对菌液进行匀浆处理，再将匀浆后的菌液按照10%的接种量接种在多个新的复合培养液培养；
F、选择筛选优质的菌株进行扩培培养；
G、当步骤Ｅ中新的复合培养液中的菌种出现质量下降时，重复操作步骤E、F。
本发明灵芝高产菌株选育方法，步骤A，韩国短柄赤芝菌种、日本鹿角灵芝菌种的选择，从窄义的理解来说，因为灵芝科中的一个品种是赤芝，是常见的代表品种，被人们称习惯了叫灵芝，实际上它的学名是赤芝；野生赤芝并不是都有菌柄，有柄或近无柄或无柄；灵芝菌柄红褐色至黑色，都有漆样光泽，坚硬；我国是灵芝的故乡，但目前我国灵芝产业中所用的菌种存在着严重的品种退化及质量下降等问题，品质较高的灵芝种大多依靠从日本、韩国引进，将两种菌种用PDA基础培养基震荡培养将其活化。步骤B，通过不同生长阶段和不同菌株种群之间在共同生长环境中的竞争性作用，自然激发其生长能力，从而有更高的几率培养出高产混合菌株。步骤C，对混合菌种生长能力进行进一步择优筛选，从而获得原始高产母种用于发酵生产。步骤D，对高产菌种进行扩大培养，当菌种质量下降时，采取外部刺激的方式达到选择优质菌株的目的。步骤E，外部刺激操作的目的在于打破原有菌球形态，将过大的细胞匀浆破裂死亡，留下活力较好的体积较小的新生细胞和孢子，使破碎的大细胞中的生物活性大分子释放出来，刺激或供给活力好的细胞及孢子进行生长，从而达到在不重新开始发酵选育过程的情况下就能够直接对菌种进行原位处理，同时在多个培养容器中再次进行各项指标验证，从而达到筛选优质菌株的目的。步骤F，从中选择优质的菌株进行移植扩大培养，而其余的菌株则继续培养。步骤G，当菌种的质量出现下降时，再次外部刺激选择优质的菌种，从而可反复选择、保存。
本发明是集“菌种活化”、“菌种保藏”、“菌种诱变”、“菌种筛选”、“菌种传代保种”等一系列内容为一体的整体实验体系。相比传统的菌种“活化-传代-筛选-保存”方法，本方法的优势在于：一是活化过程中不需要多次传代，从而节约了大量精力和时间，能够随时直接应用于生产或者研究；二是保存过程只需要冷藏保种，时间短，通常是在高产菌株选育出太多难以用完的情况下进行暂时保存，不存在传统的保藏操作繁琐，保存中活力变化不稳定等劣势；三是菌种筛选并非盲目的“鸟枪法”，而是更有针对性进行筛选，成功率和高产获得率都高于传统方法（通常在所有选育样本中有10%-15%的几率出现高产菌株）；四是传代过程中出现问题不需要舍弃该菌株，而是直接可以通过操作对该菌株进行处理，刺激其本身活力恢复，不需要另外使用保存菌株进行活化。
进一步，所述步骤C中选择原始高产菌种是选择细胞形态为球型或椭球型，菌丝蔓延速度≥1cm/d，色素产生能力为第2-3d开始产生黄色色素、培养结束时为深黄色，灵芝多糖产量为同批次中最高和胞内灵芝多糖为90%以上的菌种。仅是判断的基本量化选择，也可根据经验相对选择高产菌种。
进一步，所述步骤D中当菌种的质量下降时的依据为：培养液中pH值为2.8-3.0，菌体干重低于5g/L，灵芝多糖产率低于20%，灵芝菌球静置密度为摇瓶静置后发酵液总体积减去上清液后所占体积低于90%，灵芝菌球直径低于2mm或者高于5mm，多个灵芝菌球直径标准差大于2mm，灵芝菌球表面形态趋于光滑，外延菌丝长度低于0.5mm，菌球颜色趋于白色或者褐色。仅是基本的量化选择，也可根据经验相对判断菌种的质量下降。
进一步，所述步骤E中匀浆处理的时间为10~15个往返。
附图说明
图1是本发明灵芝高产菌株选育方法实施例的菌种活化的形态示意图；
图2是菌种在PDA复合培养基中的培养形态示意图；
图3是菌种质量下降时的形态示意图一；
图4是菌种质量下降时的形态示意图二；
图5是菌种质量下降时的形态示意图三；
图6是优质菌株的形态示意图；
图7是优质菌株的菌球放大示意图；
图8是菌体干重随培养时间的变化趋势图。
具体实施方式
本发明灵芝高产菌株选育方法各实施例的工艺参数如表1所示：
表1
以实施例一为例具体操作步骤为：
A、菌种活化：取韩国短柄赤芝菌种和日本鹿角灵芝菌种，韩国短柄赤芝菌种与日本鹿角灵芝菌种的比例关系为1:1，将两种菌种用PDA基础培养基于28℃震荡培养5d，培养形态如图1所示；
B、在其中一种菌种的稳定期将其接种在PDA复合培养基中，放置在28℃的摇床中震荡培养4d，另一种菌种在对数生长期将其接种在PDA复合培养基中，放置在28℃的摇床中震荡培养2d， PDA复合培养基是在PDA基础培养基的基础之上加入1.5%磷酸二氢钾和0.75%硫酸镁，培养形态如图2所示；
C、选择细胞形态为球型或椭球型，菌丝蔓延速度≥1cm/d，色素产生能力为第2~3d开始产生黄色色素、培养结束时为深黄色，灵芝多糖产量为同批次中最高和胞内灵芝多糖为90%以上的原始高产菌种用于发酵生产；
D、将步骤C的高产菌种通过四至五代传代培养，如图3~图5所示，当出现培养液中pH值为2.8-3.0，如图8所示，菌体干重低于5g/L，灵芝多糖产率低于20%，灵芝菌球静置密度为摇瓶静置后发酵液总体积减去上清液后所占体积低于90%，灵芝菌球直径低于2mm或者高于5mm，多个灵芝菌球直径标准差大于2mm，灵芝菌球表面形态趋于光滑，外延菌丝长度低于0.5mm，菌球颜色趋于白色或者褐色时，说明其菌种的质量下降，则对其进行外部刺激；
E、外部刺激：在无菌环境下，使用20ml匀浆器对菌液进行10个往返的匀浆处理，再将匀浆后的菌液按照10%的接种量接种在多个新的复合培养液培养；
F、如图6、7所示，选择筛选优质的菌株进行扩培培养；
G、当步骤Ｅ中新的复合培养液中的菌种再次出现质量下降时，重复操作步骤E、F。
当然，步骤C中的选择原始高产菌种的依据也可以根据人工经验对比判断，选择高产菌种的形态即可；步骤D中的判断菌种质量下降时也可根据人工经验对比判断，此种判断方法为本领域技术人员的常规经验选择。
通过本发明实施例一~六的菌种选育与传统的菌种选育方式相比，其本发明的选育方法具体优势如表2所示：
表2
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (1)
1.灵芝高产菌株选育方法，其特征在于：其操作步骤如下：
A、菌种活化：取韩国短柄赤芝菌种和日本鹿角灵芝菌种，韩国短柄赤芝菌种与日本鹿角灵芝菌种的比例关系为1:1，将两种菌种用PDA基础培养基于28℃震荡培养5～7d；
B、在其中一种菌种的稳定期将其接种在PDA复合培养基中，放置在28℃的摇床中震荡培养4～6d，另一种菌种在对数生长期将其接种在PDA复合培养基中，放置在28℃的摇床中震荡培养2～4d，PDA复合培养基是在PDA基础培养基的基础之上加入1.5％磷酸二氢钾和0.75％硫酸镁；
C、选择原始高产菌种用于发酵生产；
D、将步骤C的高产菌种通过四至五代传代培养，当菌种的质量下降时，对其进行外部刺激，
E、外部刺激：在无菌环境下，使用20ml匀浆器对菌液进行匀浆处理，再将匀浆后的菌液按照10％的接种量接种在多个新的复合培养液培养；
F、选择筛选优质的菌株进行扩培培养；
G、当步骤E中新的复合培养液中的菌种出现质量下降时，重复操作步骤E、F；
所述步骤C中选择原始高产菌种是选择细胞形态为球型或椭球型，菌丝蔓延速度≥1cm/d，色素产生能力为第2-3d开始产生黄色色素、培养结束时为深黄色，灵芝多糖产量为同批次中最高和胞内灵芝多糖为90％以上的菌种；
所述步骤D中当菌种的质量下降时的依据为：培养液中pH值为2.8-3.0，菌体干重低于5g/L，灵芝多糖产率低于20％，灵芝菌球静置密度为摇瓶静置后发酵液总体积减去上清液后所占体积低于90％，灵芝菌球直径低于2mm或者高于5mm，多个灵芝菌球直径标准差大于2mm，灵芝菌球表面形态趋于光滑，外延菌丝长度低于0.5mm，菌球颜色趋于白色或者褐色；所述步骤E中匀浆处理的时间为10～15个往返。
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| 灵芝发酵终点的确定及高产灵芝多糖菌种的筛选;程秀芳等;《齐鲁药事》;20081231;第27卷(第8期);摘要，第1.1.1、1.1.4、1.2、2.1节，第488页右栏第1-2段，表2，图1-5 * |
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