CN110684672B - 一种抗氧化蝉花菌丝体的发酵方法 - Google Patents
一种抗氧化蝉花菌丝体的发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种抗氧化蝉花菌丝体的发酵方法，包括如下步骤：分别制备PDA斜面培养基、种子培养液与发酵培养基；将蝉拟青霉母种无菌操作分割，接种至PDA斜面培养基上活化培养得到活化菌种；将活化菌种接种到种子培养液中，得到一级种；将所述一级种接种到种子培养液中，按照培养所述活化菌种的方法培养所述一级种，得到二级种；将一级种或二级种接种到种子培养液中进行培养，得发酵罐种子液；将发酵罐种子液接种于发酵培养基中，进行发酵培养，得蝉花发酵液；将蝉花发酵液放出，进行半固体发酵培养，即得到抗氧化蝉花菌丝体的发酵物。本发明的发酵方法适合发酵生产蝉花菌丝体，获得的菌丝体生物量高，抗氧化活性强，能显著提高活性物质多糖和虫草酸产量，增加保健食品原料的来源。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌丝体发酵方法，尤其涉及一种抗氧化蝉花菌丝体的发酵方法。
背景技术
蝉花，即Cordyceps cicadae是一种药食两用真菌，亦是我国传统名贵中药材之一。蝉花具有广泛的药理活性，蝉花能增强机体免疫调节功能、滋补强壮，提升机体的营养状况，解热镇痛，改善肾功能，抗辐射、抗疲劳、抗应激、抗氧化，抑菌，抗肿瘤、抗病毒，调节脂质代谢，降血压、降血糖，抗惊厥等作用，临床应用广泛。蝉花的所含成分和药用价值能够与冬虫夏草媲美，具有较高的食用、营养和药用价值，被认为可以替代冬虫夏草的最具开发利用前景的真菌之一。
蝉拟青霉，即Paecilomyces cicadae是蝉花的无性型时期，蝉拟青霉寄生于一些蝉若虫后形成的复合体即为蝉花。据葛飞等报道，发酵的蝉花菌丝体化学成分与天然蝉花的基本一致，与天然蝉花相比，发酵菌丝体中虫草多糖、甘露醇、麦角甾醇、腺苷等活性成分的含量明显高于天然蝉花。
在自然条件下，蝉花生长需要特定的生态环境和寄主昆虫，至少5-6年时间才长成，每年只能在夏季6-8月份采摘1次，天然的资源有限，生长周期长，不能满足市场的需求。为解决这个矛盾，近年来人工方法培养的菌丝体、子实体等蝉花培养物成为有效缓解自然资源匮乏的现状，目前蝉花的研究主要集中在人工固体培养蝉花子实体和发酵蝉花菌丝体。蝉花人工固体培养需35-40天，同时需要较大的空间，且条件难以控制，转化率约8-12％。发酵蝉花菌丝体时间短，约14天左右，菌丝体可以100％利用。
因此，发酵技术可通过控制最佳条件来获得大量的蝉花菌丝体和代谢产物，实现对蝉花资源的可持续利用和大规模的工厂化生产。目前，蝉花人工发酵培养研究主要是对菌丝生长的培养基组分和生长条件进行了探索，但存在菌丝体产量不高，发酵液排放污染环境问题。本发明获得蝉花发酵物近似为固体，可完全利用，无环境污染问题，且蝉花菌丝体和有效成分产量高。发酵蝉花菌丝体可作为原料直接加工成蝉花超细粉冲剂、片剂等制剂，也可作为药物的中间材料，进一步提取其中的活性成分。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种获得蝉花发酵物近似为固体，可完全利用没有浪费，无环境污染问题，可以周年化生产，工艺过程无过滤或离心操作，工艺简单、易控制，适合大规模的工厂化生产和推广的抗氧化蝉花菌丝体的发酵方法。
技术方案：一种抗氧化蝉花菌丝体的发酵方法，包括如下步骤：
(1)培养基制备：制备PDA斜面培养基、种子培养液与发酵培养基；
(2)菌种活化：将蝉拟青霉母种无菌操作分割，接种至步骤(1)中所述PDA斜面培养基上活化培养得到活化菌种；
(3)摇瓶种子液制备：将步骤(2)中所述活化菌种接种到步骤(1)中所述种子培养液中，得到一级种；将所述一级种接种到步骤(1)所述种子培养液中，按照培养所述活化菌种的方法培养所述一级种，得到二级种；
(4)发酵罐种子液制备：将步骤(3)中所述一级种或二级种接种到步骤(1)中所述种子培养液中进行培养，得发酵罐种子液；
(5)发酵罐培养：将步骤(4)中所述发酵罐种子液接种于步骤(1)所述发酵培养基中，进行发酵培养，得蝉花发酵液；
(6)静置培养：将步骤(5)中所述蝉花发酵液放出，进行半固体发酵培养，即得到抗氧化蝉花菌丝体的发酵物。
优选地，步骤(1)所述PDA斜面培养基，包含以下质量分数原料：马铃薯20％，葡萄糖2％，琼脂粉1.5-2％，溶剂为水，121℃灭菌30min；所述种子培养液，包含以下质量分数原料：蔗糖2％，可溶性淀粉3％，大豆粉2％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O0.05％，溶剂为水；摇瓶装液量为40％，121℃灭菌30min；种子罐投料量70％，121℃实罐灭菌30min；所述发酵培养基，包含以下质量分数原料：质量分数分别为葡萄糖4％、铁棍山药粉5％、蛋白胨4％、MgCl2·6H2O 0.1％，溶剂为水；发酵罐投料量50-70％，121℃实罐灭菌30min。
优选地，摇瓶中，每瓶可加3-5颗玻璃珠。
优选地，上述培养基或培养液的pH值均为自然，即培养基或培养液配置好后直接获得的pH值。
其中，步骤(2)中的所述蝉拟青霉母种由江苏食用菌研究所提供，可以采用市售的蝉拟青霉菌株，或者采用常规的自然界分离的野生型蝉拟青霉均可。所述分割为分割成绿豆大小。
进一步地，步骤(3)所述一级种为每个培养瓶接种3-8块黄豆粒大小活化菌种，于22-28℃，摇床转速120-210r/min振荡培养2-3天，得一级种。
优选地，步骤(3)所述二级种为每个培养瓶按体积分数5-10％接种，于22-28℃，摇床转速120-210r/min振荡培养1-2天，得二级种。
优选地，步骤(4)所述发酵罐种子液，按体积分数5-10％接种，于22-28℃，摇床转速120-210r/min，通气量0.5-1V/(V·min)，培养1天后，得发酵罐种子液。
进一步地，步骤(5)中所述将发酵罐种子液接种于步骤(1)所述发酵培养基中，接种的量为按发酵培养基的10％体积分数接种发酵罐种子液。
优选地，步骤(5)所述发酵罐培养条件为：接种发酵温度为22-28℃，转速120-210r/min，通气量0.5-1.2V/(V·min)，1-5天后，添加1％碳酸钙调节pH至6-7。
进一步地，步骤(6)所述半固体发酵培养为：将发酵液放入无菌的培养盘中，22-28℃静置培养5-20天。
进一步地，所述步骤(6)进行半固体发酵培养后还包括灭除活性，得到灭活蝉花发酵物。
优选地，所述灭除活性为微波高火处理30-60s或121℃高压蒸汽处理5-10min。
进一步地，上述灭活后还包括步骤(8)干燥粉碎：将灭活得到的灭活蝉花发酵物干燥，得干燥蝉花菌丝体，并进行初步粉碎；(9)干燥超微粉碎：将初步粉碎的蝉花菌丝体粗粉进一步干燥，进行超微粉碎，过筛，得蝉花菌丝体微粉；(10)包装辐照灭菌：将蝉花菌丝体微粉进行包装，包装产品进行辐照，得蝉花菌丝体冲剂成品。
进一步地，上述步骤(9)所述超微粉碎过筛后，制成500目以上的微粉。
有益效果：1、本发明的抗氧化蝉花菌丝体的发酵方法适合发酵生产蝉花菌丝体，获得的菌丝体生物量高，抗氧化活性强，能显著提高活性物质多糖和虫草酸产量，增加保健食品原料的来源。通过改进发酵培养条件，发酵所得蝉花菌丝体生物量达102.90g/L，多糖产量和虫草酸产量分别达21.14g/L、7.41g/L，蝉花菌丝体提取物清除DPPH自由基活性为95.13％。发酵环境条件优化后，蝉花菌丝体生物量是优化前的1.26倍，多糖产量是优化前的1.35倍，虫草酸产量是优化前的5.22倍，蝉花菌丝体的抗氧化活性很强。
2、本发明利用发酵获得蝉花发酵物近似为固体，可完全利用没有浪费，无环境污染问题。天然蝉花至少5-6年时间才长成，每年只能在夏季6-8月份采摘1次，而发酵获得蝉花菌丝体仅需14天，可以周年化生产。工艺过程无过滤或离心操作，工艺简单、易控制，适合大规模的工厂化生产和推广。
3、本发明利用发酵技术获得蝉花菌丝体超细粉，完全没有天然蝉花的土腥味和坚硬蝉壳，有特别诱人食用的香味，口感好易吸收利用，具有滋补强壮的功效。
具体实施方式
下面针对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
(1)培养基制备：制备PDA斜面培养基、种子培养液与发酵培养基；马铃薯煮15min，过滤取汁其中，PDA斜面培养基中含有质量分数占培养基总质量20％的马铃薯汁，占培养基总质量2％的葡萄糖，占培养基总质量1.5％的琼脂粉，溶剂为水，pH自然，121℃灭菌30min；种子培养液含有质量分数占培养基总质量2％的蔗糖，含有质量分数占培养基总质量3％的可溶性淀粉，含有质量分数占培养基总质量2％的大豆粉，含有质量分数占培养基总质量0.1％的KH2PO4，含有质量分数占培养基总质量0.05％的MgSO4·7H2O，溶剂为水，pH自然。摇瓶装液体积为瓶体积的40％，每瓶可加3-5颗玻璃珠，121℃灭菌30min。种子罐投料体积为罐体积的70％，121℃实罐灭菌30min；所述发酵培养基，包含以下质量分数原料：质量分数分别为葡萄糖4％、铁棍山药粉5％、蛋白胨4％、MgCl2·6H2O 0.1％，溶剂为水，pH自然。发酵罐投料量50％，121℃实罐灭菌30min。
(2)菌种活化：将蝉拟青霉母种无菌操作分割成绿豆粒大小，接种至步骤(1)中所述PDA斜面培养基上活化培养得到活化菌种；所述蝉拟青霉母种由江苏食用菌研究所提供，可以采用市售的蝉拟青霉菌株，或者采用常规的自然界分离的野生型蝉拟青霉均可。
(3)摇瓶种子液制备：将步骤(2)中所述活化菌种接种到步骤(1)中所述种子培养液中，每个培养瓶接种3块黄豆粒大小活化菌种，于22℃，摇床转速120r/min振荡培养2天，得一级种；将所述一级种接种到步骤(1)所述种子培养液中，按照培养所述活化菌种的方法培养所述一级种，每个培养瓶按瓶中发酵培养基的总体积的5％接种，于22℃，摇床转速120r/min振荡培养1天，得二级种。
(4)发酵罐种子液制备：将步骤(3)中所述一级种或二级种接种到步骤(1)中所述种子培养液中进行培养，即按体积分数5％将一级种或二级种接种到所述种子培养液中，于22℃，摇床转速120r/min，通气量0.5V/(V·min)，培养1天后，得发酵罐种子液。
(5)发酵罐培养：将步骤(4)中所述发酵罐种子液接种于步骤(1)所述发酵培养基中，进行发酵培养，得蝉花发酵液，接种的量为按发酵培养基的10％体积分数接种于发酵培养基；发酵培养的条件为：接种发酵温度为22℃，转速120r/min。通气量0.5V/(V·min)，1天后，添加1％碳酸钙调节pH至6。
(6)静置培养：将步骤(5)中所述蝉花发酵液放出，进行半固体发酵培养，将发酵液放入无菌的培养盘中，22℃静置培养5天，得蝉花发酵物。
(7)灭活：将步骤(6)中所述蝉花发酵物进行微波高火处理30s或121℃高压蒸汽处理5min的灭活处理，得灭活蝉花发酵物。
(8)干燥粉碎：将步骤(7)所述得到的所述灭活蝉花发酵物干燥，得干燥蝉花菌丝体，用粉碎机初步粉碎，至100目左右，得到蝉花菌丝体粗粉。
(9)干燥超微粉碎：将步骤(8)所述蝉花菌丝体粗粉干燥，进行超微粉碎，过筛后，制成500目以上的微粉，即得蝉花菌丝体微粉。
(10)包装辐照灭菌：将步骤(9)所述蝉花菌丝体微粉进行包装，包装产品进行辐照，得蝉花菌丝体冲剂成品。
实施例2
(1)培养基制备：制备PDA斜面培养基、种子培养液与发酵培养基；马铃薯煮30min，过滤取汁其中，PDA斜面培养基中含有质量分数占培养基总质量20％的马铃薯汁，占培养基总质量2％的葡萄糖，占培养基总质量2％的琼脂粉，溶剂为水，pH自然，121℃灭菌30min；种子培养液含有质量分数占培养基总质量2％的蔗糖，含有质量分数占培养基总质量3％的可溶性淀粉，含有质量分数占培养基总质量2％的大豆粉，含有质量分数占培养基总质量0.1％的KH2PO4，含有质量分数占培养基总质量0.05％的MgSO4·7H2O，溶剂为水，pH自然。摇瓶装液体积为瓶体积的40％，每瓶可加5颗玻璃珠，121℃灭菌30min。种子罐投料体积为罐体积的70％，121℃实罐灭菌30min；所述发酵培养基，包含以下质量分数原料：质量分数分别为葡萄糖4％、铁棍山药粉5％、蛋白胨4％、MgCl2·6H2O 0.1％，溶剂为水，pH自然。发酵罐投料量70％，121℃实罐灭菌30min。
(2)菌种活化：将蝉拟青霉母种无菌操作分割成绿豆粒大小，接种至步骤(1)中所述PDA斜面培养基上活化培养得到活化菌种；所述蝉拟青霉母种由江苏食用菌研究所提供，可以采用市售的蝉拟青霉菌株，或者采用常规的自然界分离的野生型蝉拟青霉均可。
(3)摇瓶种子液制备：将步骤(2)中所述活化菌种接种到步骤(1)中所述种子培养液中，每个培养瓶接种3-8块黄豆粒大小活化菌种，于28℃，摇床转速210r/min振荡培养3天，得一级种；将所述一级种接种到步骤(1)所述种子培养液中，按照培养所述活化菌种的方法培养所述一级种，每个培养瓶按瓶中发酵培养基的总体积的10％接种，于28℃，摇床转速210r/min振荡培养2天，得二级种。
(4)发酵罐种子液制备：将步骤(3)中所述一级种或二级种接种到步骤(1)中所述种子培养液中进行培养，即按体积分数10％将一级种或二级种接种到所述种子培养液中，于28℃，摇床转速210r/min，通气量1V/(V·min)，培养1天后，得发酵罐种子液。
(5)发酵罐培养：将步骤(4)中所述发酵罐种子液接种于步骤(1)所述发酵培养基中，进行发酵培养，得蝉花发酵液，接种的量为按发酵培养基的10％体积分数接种于发酵培养基；发酵培养的条件为：接种发酵温度为28℃，转速210r/min。通气量1.2V/(V·min)，5天后，添加1％碳酸钙调节pH至7。
(6)静置培养：将步骤(5)中所述蝉花发酵液放出，进行半固体发酵培养，将发酵液放入无菌的培养盘中，28℃静置培养20天，得蝉花发酵物。
(7)灭活：将步骤(6)中所述蝉花发酵物进行微波高火处理60s或121℃高压蒸汽处理10min的灭活处理，得灭活蝉花发酵物。
(8)干燥粉碎：将步骤(7)所述得到的所述灭活蝉花发酵物干燥，得干燥蝉花菌丝体，用粉碎机初步粉碎，至100目左右，得到蝉花菌丝体粗粉。
(9)干燥超微粉碎：将步骤(8)所述蝉花菌丝体粗粉干燥，进行超微粉碎，过筛后，制成500目以上的微粉，即得蝉花菌丝体微粉。
(10)包装辐照灭菌：将步骤(9)所述蝉花菌丝体微粉进行包装，包装产品进行辐照，得蝉花菌丝体冲剂成品。
实施例3
(1)培养基制备：制备PDA斜面培养基、种子培养液与发酵培养基；马铃薯煮20min，过滤取汁其中，PDA斜面培养基中含有质量分数占培养基总质量20％的马铃薯汁，占培养基总质量2％的葡萄糖，占培养基总质量1.9％的琼脂粉，溶剂为水，pH自然，121℃灭菌30min；种子培养液含有质量分数占培养基总质量2％的蔗糖，含有质量分数占培养基总质量3％的可溶性淀粉，含有质量分数占培养基总质量2％的大豆粉，含有质量分数占培养基总质量0.1％的KH2PO4，含有质量分数占培养基总质量0.05％的MgSO4·7H2O，溶剂为水，pH自然。摇瓶装液体积为瓶体积的40％，每瓶可加5颗玻璃珠，121℃灭菌30min。种子罐投料体积为罐体积的70％，121℃实罐灭菌30min；所述发酵培养基，包含以下质量分数原料：质量分数分别为葡萄糖4％、铁棍山药粉5％、蛋白胨4％、MgCl2·6H2O 0.1％，溶剂为水，pH自然。发酵罐投料量65％，121℃实罐灭菌30min。
(2)菌种活化：将蝉拟青霉母种无菌操作分割成绿豆粒大小，接种至步骤(1)中所述PDA斜面培养基上活化培养得到活化菌种；所述蝉拟青霉母种由江苏食用菌研究所提供，可以采用市售的蝉拟青霉菌株，或者采用常规的自然界分离的野生型蝉拟青霉均可。
(3)摇瓶种子液制备：将步骤(2)中所述活化菌种接种到步骤(1)中所述种子培养液中，每个培养瓶接种6块黄豆粒大小活化菌种，于26℃，摇床转速190r/min振荡培养2.5天，得一级种；将所述一级种接种到步骤(1)所述种子培养液中，按照培养所述活化菌种的方法培养所述一级种，每个培养瓶按瓶中发酵培养基的总体积的8％接种，于26℃，摇床转速200r/min振荡培养1.5天，得二级种。
(4)发酵罐种子液制备：将步骤(3)中所述一级种或二级种接种到步骤(1)中所述种子培养液中进行培养，即按体积分数6％将一级种或二级种接种到所述种子培养液中，于25℃，摇床转速200r/min，通气量0.8V/(V·min)，培养1天后，得发酵罐种子液。
(5)发酵罐培养：将步骤(4)中所述发酵罐种子液接种于步骤(1)所述发酵培养基中，进行发酵培养，得蝉花发酵液，接种的量为按发酵培养基的10％体积分数接种于发酵培养基；发酵培养的条件为：接种发酵温度为25℃，转速200r/min。通气量0.7V/(V·min)，4天后，添加1％碳酸钙调节pH至6.5。
(6)静置培养：将步骤(5)中所述蝉花发酵液放出，进行半固体发酵培养，将发酵液放入无菌的培养盘中，26℃静置培养15天，得蝉花发酵物。
(7)灭活：将步骤(6)中所述蝉花发酵物进行微波高火处理50s或121℃高压蒸汽处理8min的灭活处理，得灭活蝉花发酵物。
(8)干燥粉碎：将步骤(7)所述得到的所述灭活蝉花发酵物干燥，得干燥蝉花菌丝体，用粉碎机初步粉碎，至100目左右，得到蝉花菌丝体粗粉。
(9)干燥超微粉碎：将步骤(8)所述蝉花菌丝体粗粉干燥，进行超微粉碎，过筛后，制成500目以上的微粉，即得蝉花菌丝体微粉；
(10)包装辐照灭菌：将步骤(9)所述蝉花菌丝体微粉进行包装，包装产品进行辐照，得蝉花菌丝体冲剂成品。
实施例4
将发酵培养基的pH分别调整为4、5、6、7、8共5个梯度，接种后在25℃、180r/min条件下振荡培养7天。
由表1可知，不同pH对蝉花菌丝体的生物量、多糖产量、虫草酸产量影响差异很显著。培养基为pH＝6发酵所得蝉花菌丝体的生物量和虫草酸产量最多，分别为83.10g/L、5.70g/L；培养基为pH＝7发酵所得蝉花菌丝体的多糖产量最高，pH＝6次之，分别为17.70g/L、17.25g/L。在pH＝4-7的培养基中，发酵所得蝉花菌丝体提取物的抗氧化活性差异不显著，即清除DPPH自由基活性均很强，能达到95.78％。
配制的发酵培养基自然pH为6，因此，配制的发酵培养基不调节pH，pH为自然。后期可以通过添加1％碳酸钙调节pH至7，来增加代谢产物多糖和虫草酸产量，得到的结果如表1所示。
表1不同pH发酵蝉花菌丝体的生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率
| pH | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 生物量(g/L) | (66.08±0.30)d | (69.30±0.58)c | (83.10±0.69)a | (76.33±1.85)b | (66.97±1.54)d |
| 多糖产量(g/L) | (7.48±0.09)e | (11.05±0.25)d | (17.25±0.11)b | (17.70±0.09)a | (13.03±0.22)c |
| 虫草酸产量(g/L) | (4.12±0.02)e | (4.49±0.01)d | (5.70±0.02)a | (5.38±0.01)b | (4.61±0.01)c |
| DPPH清除率(％) | (95.73±0.50)a | (95.78±0.28)a | (95.72±0.10)a | (95.51±0.11)a | (94.31±0.45)b |
注：小写英文字母在标记a处的数值水平显著，a＝0.05。
实施例5
发酵培养基接种后，在25℃、180r/min条件下振荡培养5天，后期分别以19℃、22℃、25℃、28℃、31℃继续振荡培养3天。
由表2可知，后期不同温度对蝉花菌丝体的生物量、多糖产量、虫草酸产量影响差异很显著。25℃-28℃有利于蝉花菌丝体生物量的积累，后期适当提高温度有利于代谢产物多糖和虫草酸的积累。28℃时发酵所得蝉花菌丝体的多糖产量最高，为14.52g/L；28-31℃时发酵所得蝉花菌丝体的虫草酸产量最高，分别为4.48g/L、4.44g/L。后期采用不同温度发酵所得蝉花菌丝体，其提取物的抗氧化活性差异不显著，即清除DPPH自由基活性均很强，能达到95.50％。
综合考虑，后期选择28℃为最优温度，其发酵的蝉花菌丝体多糖产量、虫草酸产量均最高，及抗氧化活性很强，得到的结果如表2所示。
表2后期不同温度发酵蝉花菌丝体的生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率
| 后期温度(℃) | 19 | 22 | 25 | 28 | 31 |
| 生物量(g/L) | (84.88±0.97)d | (89.34±0.52)bc | (90.63±0.02)ab | (93.82±2.54)a | (86.51±3.06)cd |
| 多糖产量(g/L) | (8.89±0.21)d | (11.23±0.29)c | (11.99±0.05)b | (14.52±0.24)a | (9.33±0.23)d |
| 虫草酸产量(g/L) | (2.87±0.02)d | (4.06±0.03)c | (4.25±0.02)b | (4.48±0.03)a | (4.44±0.03)a |
| DPPH清除率(％) | (95.26±0.94)a | (94.29±1.28)a | (95.50±0.65)a | (93.95±0.35)a | (95.21±0.29)a |
注：小写英文字母在标记a处的数值水平显著，a＝0.05。
实施例6
发酵培养基接种后，在25℃、180r/min条件下振荡培养5天后，后期分别以0、120r/min、150r/min、180r/min、210r/min继续静置或振荡培养3天。
由表3可知，后期不同转速对蝉花菌丝体的生物量、多糖产量、虫草酸产量影响差异很显著。后期静置发酵所得蝉花菌丝体的生物量、多糖产量、虫草酸产量最高，分别为93.49g/L、20.17g/L、6.30g/L。后期采用不同转速发酵所得蝉花菌丝体，其提取物的抗氧化活性差异不显著，即清除DPPH自由基活性均很强，能达到95.84％。
因此，后期选择静置培养为最佳培养方式，其发酵的蝉花菌丝体多糖产量、虫草酸产量均最高，及抗氧化活性很强，得到的结果如表3所示。
表3后期不同转速发酵蝉花菌丝的生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率
| 后期转速(r/min) | 0 | 120 | 150 | 180 | 210 |
| 生物量(g/L) | (93.49±0.32)a | (82.74±1.21)b | (83.41±0.25)b | (83.14±0.52)b | (75.29±2.140)c |
| 多糖产量(g/L) | (20.17±0.19)a | (14.26±0.05)b | (9.90±0.18)c | (9.98±0.04)c | (9.59±0.13)d |
| 虫草酸产量(g/L) | (6.30±0.01)a | (5.22±0.02)b | (4.78±0.02)c | (4.22±0.07)d | (3.90±0.02)e |
| DPPH清除率(％) | (94.67±0.48)a | (94.45±1.10)a | (94.26±0.43)a | (95.50±0.65)a | (95.84±1.43)a |
注：小写英文字母在标记a处的数值水平显著，a＝0.05。
实施例7
发酵培养基接种后，在25℃、180r/min条件下振荡培养5天，后期静置培养，时间分别为7、9、11、13、15、17天。
由表4可知，后期不同静置时间对蝉花菌丝体的生物量、多糖产量、虫草酸产量影响差异很显著。静置9天得到的蝉花菌丝体的生物量、多糖含量、虫草酸含量最多，分别为80.44g/L、10.63g/L、5.05g/L。后期采用不同静置时间发酵所得蝉花菌丝体，其提取物的抗氧化活性差异不显著，即清除DPPH自由基活性均很强，能达到95.51％。
由此可见，后期选择静置9天为最佳静置培养时间，其发酵的蝉花菌丝体多糖产量、虫草酸产量均最高，及抗氧化活性很强，表明此时蝉花菌丝体活性很强，并未老化，实验结果如表4所示。
表4不同静置时间发酵的蝉花菌丝生物量、多糖含量、虫草酸含量和DPPH清除率
注：小写英文字母在标记a处的数值水平显著，a＝0.05。
实施例8
利用正交试验对发酵蝉花菌丝体的发酵环境条件进行了优化，结果见表6。从发酵所得蝉花菌丝体的生物量来考察各因素水平值，最佳发酵环境条件为A1B1C2D2，据极差分析结果R1可知，各因素对蝉花菌丝体生物量的影响大小依次为A>C>D>B。从发酵所得蝉花菌丝体的多糖产量来考察各因素水平值，最佳发酵环境条件为A1B1C2D3，据极差分析结果R2可知，各因素对蝉花菌丝体多糖产量的影响大小依次为C>A>B>D；从发酵所得蝉花菌丝体的虫草酸产量来考察各因素水平值，最佳发酵环境条件为A1B2C3D2，据极差分析结果R4可知，各因素对蝉花菌丝体虫草酸产量的影响大小依次为A>B>D>C。
A因素对蝉花菌丝体生物量、多糖产量、虫草酸产量三者影响一致，因此选择A1；B因素对蝉花菌丝体虫草酸产量影响较大，对生物量、多糖产量两者影响为次要因素，因此选择B2；C因素对蝉花菌丝体生物量、多糖产量影响为主要因素，对虫草酸产量的影响为次要因素，因此选择C2；D因素对蝉花菌丝体生物量、虫草酸产量比对多糖产量影响大，因此选择D2。所以，确定最佳发酵环境条件为A1B2C2D2，即前期转速150r/min，振荡时间5天，后期温度28℃，静置时间8d。
综合上所述，发酵培养基接种后，在25℃、150r/min条件下振荡培养5天后，添加1％碳酸钙调节pH至7，28℃静置培养8天。实验结果如表5、6所示。
表5发酵环境条件优化的因素水平表
表6蝉花菌丝体的生物量、多糖和虫草酸产量正交试验结果
注：K11表示第1水平生物量平均值，K12表示第2水平生物量平均值；K13表示第3水平生物量平均值；R1表示生物量平均值的极差。K21表示第1水平多糖产量平均值，K22表示第2水平多糖产量平均值；K23表示第3水平多糖产量平均值；R2表示多糖产量平均值的极差。K31表示第1水平虫草酸产量平均值，K32表示第2水平虫草酸产量平均值；K33表示第3水平虫草酸产量平均值；R4表示虫草酸产量平均值的极差。
实施例9
常规发酵环境条件：发酵培养基接种后，在25℃、180r/min条件下振荡培养7天。最佳发酵环境条件：葡发酵培养基接种后，在25℃、150r/min条件下振荡培养5天后，添加1％碳酸钙调节pH至7，28℃静置培养8d。
由表7可知，发酵环境条件优化后蝉花菌丝体生物量是优化前的1.26倍，多糖产量是优化前的1.35倍，虫草酸产量是优化前的5.22倍，蝉花菌丝体的抗氧化活性很强。表明优化后的发酵环境条件更有利于蝉花菌丝体生物量的增加，促进了生物活性物质多糖和虫草酸的积累。
表7最佳发酵环境条件结果验证
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Claims (3)
1.一种抗氧化蝉花菌丝体的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）培养基制备：制备PDA斜面培养基、种子培养液与发酵培养基；
（2）菌种活化：将蝉拟青霉母种无菌操作分割，接种至步骤（1）中所述PDA斜面培养基上活化培养得到活化菌种；
（3）摇瓶种子液制备：将步骤（2）中所述活化菌种接种到步骤（1）中所述种子培养液中，得到一级种；将所述一级种接种到步骤（1）所述种子培养液中，按照培养所述活化菌种的方法培养所述一级种，得到二级种；
（4）发酵罐种子液制备：将步骤（3）中所述一级种或二级种接种到步骤（1）中所述种子培养液中进行培养，得发酵罐种子液；
（5）发酵罐培养：将步骤（4）中所述发酵罐种子液接种于步骤（1）所述发酵培养基中，进行发酵培养，得蝉花发酵液；
（6）静置培养：将步骤（5）中所述蝉花发酵液放出，进行半固体发酵培养，即得到抗氧化蝉花菌丝体的发酵物；
发酵培养基接种后，在25℃、150r/min条件下振荡培养5天后，添加1%碳酸钙调节pH至7，28℃静置培养8天；
所述步骤（3）所述得到一级种为每个培养瓶接种3-8块黄豆粒大小活化菌种，于22-28℃，摇床转速120-210 r/min振荡培养2-3 天，得一级种；
所述步骤（3）所述得到二级种为按照培养基总体积的5-10 %接种，于22-28℃，摇床转速120-210 r/min振荡培养1-2天，得二级种；
所述步骤（4）所述接种为按照培养基总体积的5-10 %将一级种或二级种接种到所述种子培养液中，于22-28℃，摇床转速120-210 r/min，通气量0.5-1V/(V·min)，培养1天后，得发酵罐种子液；
所述步骤（5）中所述将发酵罐种子液接种于步骤（1）所述发酵培养基中，接种的量为按发酵培养基的10%体积分数接种于发酵培养基；
所述步骤（5）所述发酵培养条件为：接种发酵温度为22-28℃，转速120-210 r/min，通气量0.5-1.2 V/(V·min)，1-5 天后，添加1%碳酸钙调节pH至6-7；
所述步骤（6）所述半固体发酵培养为：将发酵液放入无菌的培养盘中，22-28℃静置培养5-20d；
步骤（1）所述PDA斜面培养基，包含以下质量分数的原料：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂粉1.5-2%，溶剂为水，121℃灭菌30min；所述种子培养液，包含以下质量分数原料：蔗糖2%，可溶性淀粉3%，大豆粉2%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，溶剂为水；瓶装液量为40%，121℃灭菌30min；种子罐投料量70%，121℃实罐灭菌30min；所述发酵培养基，包含以下质量分数原料：质量分数分别为葡萄糖4%、铁棍山药粉5%、蛋白胨4%、MgCl2·6H2O 0.1%，溶剂为水，发酵罐投料量50-70%，121℃实罐灭菌30min。
2.根据权利要求1所述一种抗氧化蝉花菌丝体的发酵方法，其特征在于：所述步骤（6）进行半固体发酵培养后还包括灭除活性。
3.根据权利要求2所述一种抗氧化蝉花菌丝体的发酵方法，其特征在于：所述灭除活性为微波高火处理30-60 s或121℃高压蒸汽处理5-10 min。
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