JP4642351B2 - 共培養による没食子酸の調製法 - Google Patents

Description

本発明は、共培養によって没食子酸を調製するための方法に関する。

酵素は、生体触媒として作用する、生体組織の特異的なタンパク質である。酵素は、費用がかかり、多くのエネルギーが必要な高温および／または高圧を他に必要とするような、あるいは全く不可能であるような反応を、常温および常圧で実現することができる。こうした理由で、産業界における酵素の使用は伸びている。

多くの微生物は、細胞外酵素を生じる。これらは、主に加水分解酵素であり、主として、生細胞に取り込み可能な単位への巨大分子の分解に使用される。酵素の生成における微生物の多用性を用いて、産業上重要な多くの化学薬品を製造する新しい方法が探求されている。

現在のバイオテクノロジーの発達により、微生物酵素の新しい応用分野が生まれている。微生物酵素は、従来の食物発酵業界における応用分野以外に、有機溶媒培地、特に生理活性のある化合物を使用する生体内変換において重要な役割を持っている。バイオマスおよび微生物の代謝産物を生成するための微生物の使用の他に、微生物の細胞は、化合物の、より金銭的価値がある化合物への転換を触媒するためにも使用することができる。微生物プロセスは、化学薬品の使用に対して、特異性という利点、ならびに比較的低圧および低温で実施できるという利点を持つ。

様々な産業応用分野を持つ重要な酵素は、タンナーゼ（タンニンアシル加水分解酵素）であり、これは、酵素の加水分解酵素群の中に分類される細胞外酵素である。タンニンは、タンパク質、セルロース、ゼラチン、およびペクチンと結び付く性質を持つ、分子量５００〜３０００の水溶性のフェノール類であり、その構造配置に基づいて、２つの異なる群、すなわち加水分解性タンニンと縮合型タンニンに分類することができる。

タンナーゼは、食物および化学工業に広く使用される。さらに、タンナーゼは、ワイン製造に使用され、そこでは、タンナーゼはクロロゲン酸およびキナ酸を加水分解し、これは、ワイン製造プロセスにおける風味に好ましい影響を与える。タンナーゼはまた、殻斗ワイン（ａｃｏｒｎ ｗｉｎｅ）の製造における潜在的可能性も持つ。タンナーゼはまた、ブドウジュース（ｇｒａｐ ｊｕｉｃｅ）およびブドウ液（ｇｒａｐｅ ｍｕｓｔ）を処理するために、ラクターゼと共に使用される

飲料の安定化のためにフェノール類を除去するために、タンナーゼは、ビール中の寒冷混濁（ｃｈｉｌｌ ｈａｚｅ）の形成をかなり減少させる。ビールの保管中の変色および混濁の発生は、ワートのフェノール類の、タンナーゼを用いた酵素による加水分解によって予防できる。

さらに、タンナーゼは、インスタントティーの製造において、緑茶の新鮮な若葉（ｆｌｕｓｈ）の予備変換処理にも使用される。タンナーゼはまた、天然の没食子酸エステルの構造決定にも使用される。

通常タンナーゼと呼ばれるタンニンアシル加水分解酵素は、タンニン酸などの加水分解性タンニン中のエステル結合およびデプシド結合の加水分解を触媒し、それによってグルコースおよび没食子酸を放出する。

没食子酸（３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸）には、様々な用途がある。製薬産業では、没食子酸は、トリメトプリムの製造に使用される。トリメトプリムは、抗細菌性であり、スルホンアミドと共に投与され、共に医療治療に対する広範囲の作用を提供する。ＴＭＰは、ジヒドロ葉酸還元酵素を阻害し、それによってジヒドロ葉酸のテトラヒドロ葉酸への転換を妨げる。トリメトプリムの製造における没食子酸の消費率（ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｃｏ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）は、４．８である。皮なめし業界では、没食子酸は、高級革用タンニンを調製するための、タンニンの均質化のために使用される。没食子酸はまた、通常の筆記用インクおよび写真用現像液としての色素の製造にも使用される。没食子酸にはまた、没食子酸プロピルのような没食子酸エステル（油脂中、また飲料中で、主に酸化防止剤として使用される）の酵素的合成における用途もある。没食子酸は、無機酸、ジヒドロキシアセトン、およびアルカロイドの試験に、また、焦性没食子酸（毛皮、革、毛髪などを染色するために使用される）の生成のために使用される、焦性没食子酸生成用の合成中間体としても使用される。

タンナーゼを生成するための様々な真菌種の使用が、当技術分野で知られている。細菌（バチルス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ）、Ｂ．ポリミキサ（Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）、コリネバクテリウム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等）、真菌（アスコカイタ種（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｓｐ．）アオカビ種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．））、および酵母（カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．））を含めていくつかの微生物が、タンナーゼを生成することが報告されている。

クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のある株によるタンナーゼの生成が、Ｔｏｕｒｒａｔ他によって報告された。彼らは、発酵が、一定の空気流で、液内培養で実施される場合に、タンナーゼ活性が最大であることを発見した。酵素活性は気体図（ｇａｓ ｃｈａｒｔ）法によって求められ、最大酵素活性は５．５ｎＫａｔ／ｍｌと報告された。

Ｒ．Ｂａｎｅｒｊｅｅ他は、新しく分離したＲ．オリーゼ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）によるタンナーゼ生合成の活性を報告している。実験条件は、振盪フラスコ培養で最適化された。最大酵素活性は、６．１２Ｕ／ｍｌであることが判明した。

Ｒ．Ｂａｎｅｒｊｅｅ他はまた、Ｒ．オリーゼを用いた固体発酵によるタンナーゼの生成も報告している。

没食子酸およびグルコースを同時に放出する、培養後数時間以内の細菌株（Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．プミニス、クレブシクラ・プノン（ｋｌｅｂｓｉｃｌｌａ ｐｎｏｎ）、およびコリネバクテリウム）による細胞外タンナーゼの生成が、Ｄｅｓｃｈａｍｐ他によって報告されている。

Ｒａｊ Ｋｕｍａｒ他は、ペニシリウム・クリソグクナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｃｎｕｍ）タンナーゼの単離、精製、およびいくつかの性質を報告している。

この酵素は、３０℃まで安定であり、４．０〜６．０のｐＨ範囲内で基質としてタンニン酸を用いたＫｍ値は、０．４８×１０^−４Ｍであることが判明した。２０Ｍｍの金属塩は、酵素を阻害した。

アルギン酸ナトリウムおよびＣａＣｌ_２で固定化されたペニシリウム クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を用いた、バイオリアクター中でのタラ タンニンからの没食子酸の連続的な生成は、Ｙａｍａｄａ他から知ることができる。彼らはまた、ワイン製造業界におけるタンナーゼの使用も報告している。

タンニンの没食子酸への生体内変換については、それほど知られていない。入手可能な文献は、主に、没食子酸の収率が非常に低い化学的プロセスに関する。Ｋａｒ，Ｂ．他は、原料として没食子種皮およびリゾプス・オリーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を用いた、ＳＳＦおよびＳｍＦプロセスによるタンニンの没食子酸への生体内変換を報告している。

しかし、この技術のこれらのプロセスには、様々な欠点がある、すなわち、これらのプロセスは、長い時間を必要とし、報告されている収率も低い。

したがって、本発明の一目的は、従来の技術と比較して時間をそれほど必要としない、混合培養プロセスを用いて没食子酸を調製するための方法を提案することである。

本発明のさらなる目的は、収率がより高く、新規の基質を使用する、混合培養技術を用いて没食子酸を調製するための方法を提案することである。

したがって、本発明によれば、互いに流体中で接触しているタンニンが豊富な混合基質と培養培地を準備し、この基質に、真菌であるリゾプス・オリーゼおよびアスペルギルス・フェティドゥス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）を含む誘導された種菌を加えて発酵塊および没食子酸を得、有機溶媒を用いて培養培地および発酵塊から没食子酸を抽出し、続いて有機溶媒を蒸発させて没食子酸を得ることを含む、共培養を使用する没食子酸を調製するための方法が提供される。

本発明に従うと、混合基質として使用される原料は、１：３〜３：１の割合のミロバランの実粉末（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃｈｅｂｕｌａ、種無しタイプ、ＰＵＮＪＡＢ種）と没食子種皮粉末（Ｃａｅｓａｌｐｉｎｉａ ｄｉｇｙｎａ）である。これらは、タンニンが豊富な基質である。ミロバランの実は、タンニンを３３〜４５％含有し、没食子種皮は、タンニンを約５８％含有する。カラグブールキャンパス（Ｋｈａｒａｇｐｕｒ Ｃａｍｐｕｓ）のＩＩＴの土壌から分離された糸状菌であるリゾプス・オリーゼ（ＲＯ ＩＩＴ ＲＢ１３，ＮＲＲＬ−２１４９８）およびアスペルギルス・フェティドゥス（ＧＭＲＢ０１３）という２つの株が使用される。これらの微生物は、２％麦芽エキス寒天斜面に維持される。これらの微生物の継代培養は、斜面上で行われる。麦芽エキス寒天（ＭＥＡ）培地を滅菌し、その一部を滅菌した試験管に移し、斜めにして冷却させる。

凝固した後、滅菌斜面に、リゾプス・オリーゼ（ＲＯ ＩＩＩ ＲＢ１３，ＮＲＲＬ−２１４９８）およびアスペルギルス・フェティドゥス（ＧＭＲＲ ０１３，ＭＴＣＣ ３５５７）の純粋培養株を接種し、インキュベータ内に保持する。その後、斜面培養株を、さらなる研究のために使用する、あるいは保管する。タンナーゼは、適応酵素であるので、培養株のためのあらかじめ誘導された種菌を調製する。タンニン酸の入った改良されたＣｚａｐｅｋｄｏｘ培地を滅菌し、培養斜面に、調製された胞子懸濁液を接種する。その後、これらを振盪しながらＢＯＤインキュベータ内に保持し、誘導された種菌を生成する。その後のＭＳＳＦ（改良固体発酵（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ））を研究するために、この誘導された種菌を使用する。

これらの２つの微生物を、０．５：２〜１：１の比、最適比１：１で、共に使用した。一般に、共培養技術を実施する場合、生成されるタンナーゼおよび没食子酸は、純粋培養条件下で生成されるものより多く、また、必要とされるインキュベート時間は、より短いことが判明した。

改良されたトレータイプのリアクター内で、改良固体発酵で、回分プロセスで、発酵を実施する。混合基質として使用される原料は、１：３〜３：１の割合のミロバランの実粉末と没食子種皮粉末である。この基質混合物を、トレーリアクターのフロート上に乗せる。通常使用されるトレーリアクターを、穴の開いたフロートを提供することによって改良する。これにより、発酵中の熱のより大きな放散という独自の利点が提供され、バイオマスの変性が妨げられる。０．２：１〜０．８：１の固体−液体比の、改良されたＣｚａｐｅｋｄｏｘ液体培地を、トレー内のフロートの下に入れる。Ｃｚａｐｅｋｄｏｘ培地は、炭水化物源としてグルコースの代わりにタンニン酸を用いることによって改良される。したがって、フロート上に置いた混合基質は、トレー内の液体培地と接触する。その後、改良されたトレーリアクターをオートクレーブする。フロート上の基質の発酵を、適切な量のリゾプス・オリーゼおよびアスペルギルス・フェティドゥスの誘導された種菌を加えることによって実施する、すなわち、共培養法によって、約１×１０^５〜２×１０^８胞子／ｍｌ、好ましくは２×１０^６胞子／ｍｌを、２０グラムの基質に加える。基質に加えられた微生物は、基質を、所望の生成物に転換し、これを液体培地に浸出させる。発酵した材料を取り出し、水を加え、加熱する。その後、これを室温に冷却し、ジエチルエーテルおよび酢酸エチルなどの有機溶媒を用いて没食子酸を抽出する。

没食子酸の生成に対するｐＨ、温度、湿度、およびの種菌の量の影響、粒径、および水分の最適条件を評価した。

これ以降、本発明を、以下の非限定的な例によって、より詳細に説明する：

タンナーゼを生じる微生物の分離
糸状菌であるリゾプス・オリーゼ（ＲＯ ＩＩＴ ＲＢ １３，ＮＲＲＬ−２１４９８）およびアスペルギルス・フェティドゥス（ＧＭＲＢ０１３）の２つの株を、カラグブールキャンパス（Ｋｈａｒａｇｐｕｒ Ｃａｍｐｕｓ）のＩ．Ｉ．Ｔの土壌から、釣餌（ｂａｉｔｉｎｇ）技術によって分離した。これらの微生物を、２％麦芽エキス寒天斜面に維持した。

斜面上での微生物の継代培養：
麦芽エキス寒天（ＭＥＡ）培地１００ｍｌを滅菌した。滅菌後、これの５ｍｌを、滅菌した試験管に移し、斜めにして冷却させた。凝固した後、滅菌した斜面に１：１の比のリゾプス・オリーゼ（ＲＯ ＩＩＴ ＲＢ １３，ＮＲＲＬ−２１４９８）とアスペルギルス・フェティドゥス（ＧＭＲＢ０１３）の純粋培養株を画線培養によって接種し、３０℃で７２〜９６時間インキュベータ内に保持した。

その後、この斜面培養株を、さらなる研究のために使用した、あるいは冷蔵庫で４℃で保管した。

誘導された種菌の調製
タンナーゼは適応酵素であるので、あらかじめ誘導された種菌を調製する必要がある。２％タンニン酸の入ったＣｚａｐｅｋｄｏｘ培地５０ｍｌを、１００ｍｌのコニカルフラスコに入れた。次いで、これを１２１℃で１５分間滅菌し、培養斜面からの胞子懸濁液２ｍｌを接種した。その後、これを、振盪条件下で、３０℃で７２時間、ＢＯＤインキュベータ内に保持した。その後のＳＳＦの研究のために、この誘導された種菌を使用した。

共培養法による、混合基質を用いた改良固体発酵
発酵は、改良されたトレータイプのリアクター内で、改良固体発酵の回分プロセスで実施した。

混合基質として使用した原料は、１：３〜３：１の割合のミロバラン種子粉末（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃｈｅｂｕｌａ）と没食子種皮粉末（Ｃａｅｓａｌｐｉｎｉａ ｄｉｇｙｎａ）であった。この基質混合物を、トレーリアクターのフロート上に置いた。０．２：１〜０．８：１の固体−液体比の、液体Ｃｚａｐｅｋｄｏｘ培地を、トレー内のフロートの下に入れる。改良固体発酵を実施するために、基質を伴ったこのようなフロートを、トレー内の液体の上に保持する。したがって、フロート上に置いた混合基質は、トレー内の液体培地と接触する。その後、改良されたトレーリアクターを１２１℃で１５分間オートクレーブする。フロート上の基質の発酵を、基質２０グラムにつき２×１０^６胞子／ｍｌのリゾプス・オリーゼおよびアスペルギルス・フェティドゥス誘導された種菌を加えることによって、すなわち共培養方法によって実施する。基質に加えられた微生物は、基質を、所望の生成物に転換し、これを、液体培地に浸出させる。

没食子酸抽出
有機溶媒である酢酸エチルを用いて、没食子酸を単離した。発酵した材料を取り出し、水を加え、約６０〜７０℃に加熱した（没食子酸は、この温度で可溶性であり、冷水には可溶性でないため）。次いで、これを、室温に冷却した。その後、これに有機溶媒を加え、この混合物全体を、分液漏斗に入れた。この混合物を、勢い良く振ることによって直ちに完全に混合した。没食子酸は、有機溶媒に可溶であるので、有機相に移り、残りの物質は、水相に残る。水相を捨て、有機層を収集した。没食子酸が完全に有機層に移動するまでこのプロセスを続けた。次に、収集された量の有機層を、酢酸エチルからの没食子酸の分離のために、真空ロータリーエバポレータに入れた。この分離を行った圧力および温度は、２００ｍｂａｒおよび７０℃であった。あるいは、ジエチルエーテルを用いて酢酸エチル層を抽出し、エーテル層を、ロータリーエバポレータで蒸発させて、純粋な没食子酸を得た。得られた没食子酸の収率は、６５．４〜９４．８％であることが判明した。最大量の没食子酸を生成するため、様々な環境パラメータを最適化するために研究を行った。

改良固体発酵によるタンナーゼおよび没食子酸生成のための物理化学的パラメータの最適化：
混合基質を用いる、両微生物によるＭＳＳＦを、純粋培養と共培養の両条件下で実施する場合の、タンナーゼおよび没食子酸の生成に対する様々な環境パラメータの影響を研究した：

ｐＨの影響：タンナーゼの生成に対するｐＨの影響を、Ｃｚａｐｅｋｄｏｘ培地の最初のｐＨを３．５〜７．０に変えることによって研究した。最適ｐＨは、５であることが判明し、そのときのタンナーゼ活性は、３５．１Ｕ／ｍｌであり、生成された没食子酸は、９１．８１％であった。

温度の影響：タンナーゼおよび没食子酸生成に対する温度の影響を、湿潤試験器（ｈｕｍｉｄｉｔｙ ｃａｂｉｎｅｔ）中の温度を２５℃〜４０℃に変えることによって調べ、最適温度は３０℃であることが判明した。生成されたタンナーゼおよび没食子酸の量はそれぞれ、３６．４Ｕ／ｍｌおよび９３．２５％であった。

湿度の影響：タンナーゼ生成および没食子酸の収率に対する湿度の影響を、恒湿器（ｈｕｍｉｄｉｔｙ ｃｈａｍｂｅｒ）中の湿度を７０％〜９０％に変えることによって研究し、最適湿度は、８０％の間にあった。生成されたタンナーゼおよび没食子酸の量はそれぞれ、３６．４Ｕ／ｍｌおよび９３．２５％であった。

種菌量の影響：種菌の量を１ｍｌ〜４ｍｌ（３ｍｌが最適）に変えて、最大タンナーゼ生成に必要とされる種菌の最適な量を求めた。

水分の影響：タンナーゼの生成に対する水分の影響を研究するために、ミロバラン基質に加えるＣｚａｐｅｋｄｏｘ培地を、０．２：１〜０．８：１に変えた（０．４：１までが最適であった）。この水分条件で、生成されたタンナーゼおよび没食子酸はそれぞれ、３５．３Ｕ／ｍｌおよび９２．４１であった。混合基質を用いる、共培養方法による没食子酸生成にとって、４８時間のインキュベート時間が最適であることが判明し、このとき３３．１Ｕ／ｍｌのタンナーゼ活性がもたらされた。

表１に強調したように、純粋培養法と共培養法とを比較すると、共培養法の以下の利点が示される。

Claims (13)

1. 互いに液体中で接触しているタンニンが豊富な混合基質と培養培地を準備し、真菌リゾプス・オリーゼおよびアスペルギルス・フェティドゥスを含む誘導された種菌を基質に加えて発酵塊および没食子酸を得、有機溶媒を用いて培養培地および発酵塊から没食子酸を抽出し、続いて有機溶媒を蒸発させて没食子酸を得ることを含む、共培養を使用して没食子酸を調製するための方法であって、タンニンが豊富な混合基質は、ミロバランの実粉末（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃｈｅｂｕｌａ）と没食子種皮粉末（Ｃａｅｓａｌｐｉｎｉａ ｄｉｇｙｎａ）を１：３〜３：１の割合で含むものである、方法。
2. 前記培養培地が、炭水化物源としてタンニン酸を含むシザペクドックス（Ｃｚａｐｅｋｄｏｘ）培地である、請求項１記載の方法。
3. 基質と培養培地が、０．２：１〜０．８：１の比で存在する、請求項１記載の方法。
4. 真菌が、２％麦芽エキス寒天斜面上に維持される、請求項１記載の方法。
5. タンニン酸基質の入ったシザペクドックス（Ｃｚａｐｅｋｄｏｘ）培地を準備し、それを既知の方式で滅菌し、続いて、真菌であるリゾプス・オリーゼおよびアスペルギルス・フェティドゥスの胞子懸濁液を基質に接種して、接種された基質を得、この接種された基質をインキュベートして誘導された種菌を得ることによって、誘導された種菌が得られる、請求項１記載の方法。
6. １×１０^５胞子／ｍｌ〜２×１０^８胞子／ｍｌを含有する誘導された種菌が、混合基質２０グラムに加えられる、請求項１記載の方法。
7. 使用される有機溶媒が酢酸エチルである請求項１記載の方法。
8. 培養培地および発酵塊に水を加え、続いて６０〜７０℃の範囲の温度で加熱して没食子酸の水溶液を得、有機溶媒を用いて没食子酸の水溶液を抽出して没食子酸の有機溶媒溶液を得、続いて溶媒を蒸発させて没食子酸を得る工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
9. 使用される有機溶媒が酢酸エチルである請求項８記載の方法。
10. 没食子酸の有機溶媒溶液を第２の異なる溶媒を用いて、当該第２の溶媒中に没食子酸の溶液を形成させることからなる付加的な抽出工程をさらに含む、請求項８記載の方法。
11. 使用される第２の異なる溶媒がエチルエーテルである請求項１０記載の方法。
12. 真菌であるリゾプス・オリーゼとアスペルギルス・フェティドゥスが、０．５：２〜１：１の比で存在する、請求項１記載の方法。
13. 互いに液体中で接触しているタンニンが豊富な混合基質と培養培地を準備する工程であって、タンニンが豊富な混合基質は、ミロバランの実粉末（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃｈｅｂｕｌａ）と没食子種皮粉末（Ｃａｅｓａｌｐｉｎｉａ ｄｉｇｙｎａ）を１：３〜３：１の割合で含むものである、
    真菌リゾプス・オリーゼおよびアスペルギルス・フェティドゥスを含む誘導された種菌を基質に加えて発酵塊および没食子酸を得る工程であって、真菌であるリゾプス・オリーゼとアスペルギルス・フェティドゥスが、０．５：２〜１：１の比で存在する、
    有機溶媒を用いて培養培地および発酵塊から没食子酸を抽出する工程、および
    有機溶媒を蒸発させて没食子酸を得ること、
    を含む、共培養を使用して没食子酸を調製するための方法。