LU87203A1 - Procede pour la preparation de tannase destinee a la production d'acide gallique,a l'aide d'une culture d'aspergillus,tannase ainsi obtenue et utilisation de celle-ci pour la production d'acide gallique - Google Patents

Description

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Procédé pour la préparation de tannase destinée à la production d'acide gallique, à l'aide d'une culture d'Aspergillus, tannase ainsi obtenue et utilisation de celle-ci pour la production d'acide gallique.

La présente invention concerne un procédé pour la préparation d'une tannase à partir de microorganismes, à savoir par une souche particulière d*Aspergillus. L'invention s'étend à la tannase préparée par ce procédé 5 et à l'utilisation de cette tannase pour la préparation d'acide gallique.

La tannase, une enzyme découverte en 1786 par Scheele,présente la propriété d'hydrolyser le lien ester de même que le. lien dèpside de 1'acide tannique et du 10 glucose.

On a déjà décrit l'obtention de la tannase à partir de différents types d'Aspergillus ou Pénicillium.

- Freudenberg et al. (Z.Physiol.Chem. 164, 262, 1927) ont préparé la tannase à partir de Aspergillus niger, et 15 - K. Yamada et al: (J. Ferment. Tech., 45, 233, 1967); (Agr. Biol. Chem. 31, 513, 1967) ont préparé la tannase à partir d'Aspergillus oryzae.

La demanderesse a découvert que, de manière surprenante, le genre Aspergillus tamarii, en particulier 2 la souche CBS 10413, se caractérise par une productivité très élevée de tannase". Ladite souche se caractérise par une spécificité élevée de même qu'une activité volumétrique élevée en tannase au cours du processus de 5 fermentation.

Selon l'invention, la tannase est obtenue par fermentation d1 Aspergillus tamarii dans un milieu contenant des tannins destinés à induire la synthèse de la tannase. Le mycélium fongique peut être séparé du 10 milieu de fermentation et . utilisé de manière répétée, , sous forme d'un système enzymatique de tannase· immobi lisé sur un support, in situ, pour la bioconversion de tannins. La biomasse peut être recyclée et réutilisée sans addition d'agent nutritif particulier. L'acide 15 gallique obtenu présente les propriétés classiques des acides galliques commerciaux et se- présente sous forme d'une poudre cristalline pratiquement incolore, soluble dans l'eau, dans l'éthanol et dans l'acétone. Ce composé est utilisé entre autres pour la préparation d ' esters ; 20 galliques à usage alimentaire ainsi que, dans des composés. pharmaceutiques.

Les tannins de départ constituent un mélange complexe de composés polyphénoliques qui sont présents dans de nombreuses plantes. On les classifie en tannins condensés 25 et en tannins1 hydroly sables. Les gallotannins sont hydro-lysables, soit par voie enzymatique, soit par voie chimique, en produisant l'acide gallique et en libérant la molécule centrale du noyau (constitué de glucose ou d1 acide quinique).

. 30 II convient de noter qu'il est déjà connu et prouvé que les processus de fermentation peuvent réussir ou échouer en fonction du choix adéquat ou non d'une souche appropriée. La demanderesse s'est notamment aperçue que, parmi les nombreuses cultures sélectionnées 35 et isolées sur des plaques de culture- d'agar, ayant reçu une préparation de tannins, très peu' de composés présentent une productivité élevée de tannase en milieu 3 de culture liquide.

Le choix particulier pour la préparation de tannase de l'espèce Aspergillus tamarii permet, de manière surprenante, d'obtenir des caractéristiques de produc-5 tivité de tannase supérieures au résultat obtenu selon l'état de la technique.

L'invention sera décrite plus en détail à l'aide d'exemples spécifiques de mises en oeuvre de souches particulières selon l'invention du genre Aspergillus.

10 Mesure de l'activité en tannase L'activité en tannase peut être mesurée par différentes techniques, déjà décrites dans la littérature . Une technique particulière a été mise au point par IIBUCHI et al. (Agr.Biol.Chem.31,513, 1967). Pour 15 ce faire, l'hydrolyse d'une solution de tannins standardisée est suivie spectrophotométriquement et elle est en relation directe avec l'activité en tannase . L'activité en tannase est exprimée en termes d'unité tannase (tannase units = TU). Une unité TU est la quantité de 20 tannase qui hydrolyse une micromole de liens esters de l'acide gallique en une minute par incubation dans les conditions de réaction optimales. Cette technique telle que décrite initialement dans la référence ci-dessus a été légèrement modifiée comme suit : 25 1 gramme de mycélium fongique est incubé dans une solu tion à 1-2% de tara-tannin à pH 5,5 (tampon citrate 0,1 M) pendant 30 minutes à 30°C. Avant et après incubation, 50 P1 de la solution de tannin sont transférés à l'aide d'une pipette dans 10 ml d'éthanol à 90 %. La 30 chute de l'absorption est mesurée à 310 nm.

L'activité enzymatique peut être calculée à partir d'un standard de tannase purifiée servant de référence. L'activité de la tannase de référence est déterminée selon IIBUCHI et al.

35 Procédé de fermentation de 11 Aspergillus tamarii CBS 10413 en vue de la production de tannase .

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Du fait que la biosynthèse de la tannase constitue une opération qui doit être induite, il convient d'ajouter des tannins aux milieux de fermentation. Une addition de tannins à la préculture de même que dans le 5 milieu de germination est recommandée pour obtenir des phases ultérieures rapides de croissance et de production . La concentration en tannins dans le liquide de fermentation peut varier entre 1 et 30 % (poids/volume) bien que les milieux de germination et de préculture 10 ne doivent contenir que des niveaux faibles de tannins (1 à 5 % - poids/volume) pour l'induction.

En l'absence de sources de carbone complémentaires, les composés résultant de l'hydrolyse du tannin (acide gallique, glucose et acide quininique) peuvent être mé-15 tabolisés par le mycélium. L'opération de fermentation peut être accéléré par l'addition de sucres aux milieux de fermentation. Le saccharose, le glucose, le fructose et ses sources industrielles à savoir les mélasses et les sirops de glucose et de fructos-e, peuvent 20 être ajoutés à des concentrations de l'ordre de 2 à 4 % (poids/volume) en fonction du niveau d'azote alimenté.

Un rapport C/N élevé (de l'ordre de 10 à 15) favorise la production d'une biomasse fortement active. L'azote peut être alimenté sous forme de sels inorganiques 25 d'ammonium et nitrate te3s que : (NH^^SO^, (NH^^COg, (NH . )„HP0 ., NH .Cl; NH.N0o, KNO_ et NaN0o.

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Des sources azotées organiques (extrait de boeuf, peptone de soya, peptone, vinasse, résidus solubles séchés de distillation, liqueur d'extrait de mélasse 30 farinecfe sang, farine de soya) ne peuvent pas être utilisées du fait qu'on observe, pour tous ces composés, une réaction de précipitation avec les tannins.

L ' Aspergillus tamarii, en particulier la souche CBS 10413, est peu exigeante en minéraux. K, Mg , Zn, 35 P et S sont ajoutés au milieu de culture sous forme de sels de sulfate ou de phosphate inorganiques. L'acide folique et l'acide pantothénique peuvent être ajoutés t 5 en tant qu1 agents de croissance complémentaires.

L'invention sera décrite de manière plus précise en regard de deux exemples d'exécution particuliers de 1'invention : 5 Exemple 1. Fermentation de tannase au départ d'Aspergillus tamarii CBS 10413 Composition du milieu (g/1)

Tannins 10 à 300

Saccharose 30 10 KN03 8,5 KC1 1,0 (nh4)2hpo4 1,0

MgS04.7H20 0,5

ZnS04.7H20 0,3 15 Acide folique 1 mg/1

Acide panthoténique lmg/1.

La fermentation de production de tannase au départ d'Aspergillus tamarii CBS 10413 a été étudiée dans un réacteur classique agité (Applikon, Biolaffite).

20 La production de tannase est effectuée à 30°C.

Au cours de la fermentation (en particulier lors de la phase de croissance et de production exponentielle), le pH se modifie rapidement. NaOH (5 N) et H^SO. (5 N) £> "i sont ajoutés, au cours du processus de fermentation, afin 25 de maintenir le pH entre 3,5 et 4,5.

Le liquide de fermentation est aéré en insufflant 0, 5 à 1 vvm d'air saturé en oxygène dans le milieu de culture. La vitesse d'agitation est ajustée à la vitesse de transfert de l'oxygène. Le réacteur (10.1) est inoculé 30 avec 10 % (v/v) de milieu de préculture ou de germination qui à son tour est préparé à partir d'une suspension fraîche de spores (5 %/volume/volume) recueillie à partir d'un milieu agar malté. La composition du milieu liquide est identique pour les différentes étapes 35 de fermentation. A la fin de la fermentation,(épuisement du substrat carboné), la biomasse est séparée du 6 bouillon de fermentation par filtration sous vide.

La biomasse est lavée et gardée à -18°C. Une activité intracellulaire en tannase de 15.000 unités/1 peut être obtenue. Environ 3000 unités/1 sont secrétées 5 dans le bouillon de fermentation.

Exemple 2. Schéma de production de tannases au départ d1 Aspergillus taramii CBS 10413 Le schéma de préparation est illustré au tableau I annexé .

10 L'inoculum est préparé comme suit : des spores provenant d'une culture de spores initiale, ayant subi une croissance sur agar/extrait de malt (flacons de Roux) sont transférés dans une solution saline physiologique (150 ml). Le milieu de germination (g/1) consti-15 tué comme suit : tannins 50 glucose 30 KN03 8,5 k2hpo4 1,0 20 MgS04.7H20 0,5

ZnSO..7Ho0 0,5 4 2 '

NaCl 1,0 est inoculé à l'aide d'une suspension à 10 % (volume/ volume) desdits spores. Le milieu de. germination est 25 réglé à pH 5 avant la stérilisation. Après 16 à 24 heures d'incubation de la culture en flacons sur un agitateur mécaniquè a 30°C, le milieu de germination est transféré dans le réaction agité contenant 5 1 de préculture (à 10 % volume/volume), le volume total du 30 réacteur étant de 10 1. Le milieu de préculture (g/1) est constitué comme suit :

Tannins 50 glucose 30 NH4C1 3,75 35 KC1 1,0 (nh4)2hpo4 1,0 » » 7

MgS04.7H20 0,5

ZnS04.7H20 0,5

NaCl 1,0 acide folique 1 mg/1 5 acide panthoténique 1 mg/1.

Le réacteur de fermentation (contenant le milieu) est stérilisé à 121°C pendant 30 minutes . Du tannin est ajouté au milieu après stérilisation pour éviter l'hydrolyse chimique des molécules d'induction.

10 Après inoculation, la préculture est incubée pen dant 48 h à 30°C. Une aération de 1 vvm et une agitation de 400 tpm sont maintenues. On permet des variations entre des valeurs de 3 et 4,5 du pH du milieu de fermentation. Les ajustements de pH sont réalisés à 15 l'aide d'acide sulfurique et d'hydroxyde de sodium.

Après 36 heures d'incubation, la préculture est transférée dans un fermenteur de 100 litres (volume de travail 70 1). La composition du milieu, de même que la préparation e.t la stérilisation, 20 sont identiques à ce qui est indiqué pour la préculture.

La fermentation est conduite à 30°C, 1 vvm, 300 tpm et un pH de 3,0 à 4,5.

On règle le développement de mousses par addition 25 d'un agent anti-moussant à base de silicones. Après 48 h d'incubation, on arrête la fermentation; toutes les sources de carbone disponibles ont été métabolisées. Le milieu- de fermentation est filtré et lavé à l'aide d'eau déminéralisée. La biomasse (1,125 kg de masse 30 cellulaire séchée) est stockée à -18°C. L'activité g intracellulaire totale était de 1,125.10 unités. L'activité extracellulaire était d'environ 1,5.10° ou 12 % de l'activité volumétrique totale.

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Tableau I (Exemple 2)

Agar + extrait de malt 30°C, 3 jours v 5 Aspergillus tamarii CBS 10413 spores

Y

solution de sel physiologique (0,75 % NaCl) suspension de spore 10 ^ milieu de fermination (suspension de 5 % spores) v

Préculture - 10 1 v

Fermenteur - 100 1 il

Filtration

Filtrat v 2o Biomasse - tannase.

Claims (12)

1. Procédé pour la préparation de tannase caractérisé en ce qu'on utilise pour la production le genre

2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la tannase est obtenue par fermentation d1 Aspergillus tamarii dans un milieu contenant des tannins destinés à induire la synthèse de la tannase, 10 le mycélium fongique pouvant être séparé du milieu de fermentation et utilisé de manière répétée, sous forme d’un système enzymatique de tannase immobilisé sur un support, in situ, pour la bioconversion de tannins et la biomasse pouvant être recyclée et réuti-

15 Usée sans addition d'agent nutritif particulier.

3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'on ajoute des tannins à la préculture de même que dans le milieu de germination pour obtenir des phases ultérieures rapides de croissance et de produc- 20 tion.

4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que la concentration en tannins dans le liquide de fermentation est comprise entre 1 et 30 % (poids/ volume) tandis que les milieux de germination et de 25 préculture ne contiennent que des niveaux faibles de tannins (1 à 5 % - poids/volume) pour l'induction.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'opération de fermentation est accélérée par l'addition de sucres 30 aux milieux de fermentation.

5 Aspergillus tamarii, en particulier la souche CBS 10413.

6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'on ajoute du saccharose, du glucose, du fructose ou leurs sources industrielles, à savoir les mélasses et les sirops de glucose et de fructose, à 35 des concentrations de l'ordre de 2 à 4 % (poids/volume) en fonction du niveau d'azote alimenté. 10 ‘ ' f «

7. Procédé selon la revendication 4 ou 5 caractérisé en ce qu'un rapport C/N élevé (de l'ordre de 10 à 15) est réalisé pour favoriser la production d'une biomasse fortement active.

8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'azote est alimenté sous forme de sels inorganiques d'ammonium et nitrate tels que : (NH4)2S04, (NH4)2C03, (NH4)2HP04> NH4C1, NH4N03, KN03 et NaN03.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendica-10 tions 2 à 8 caractérisé en ce que des minéraux K, Mg, Zn, P et S sont ajoutés au milieu de culture sous forme de sels de sulfate ou de phosphate inorganique.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9 caractérisé en ce que de l'acide folique 15 et l'acide pantothénique sont ajoutés en tant qu'agents de croissance complémentaires .

11. Tannase obtenu par le procédé d'une quelconque des revendications 1 à 10.

12. Utilisation de la tannase selon la revendica-20 tion 11 pour la production d'acide gallique.