JP2002159290A - 新規リパーゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、様々な分野における種々の用途にお
いて有用な、耐熱性および耐酸性を有する新規リパー
ゼ、その製造方法ならびに該リパーゼを産生する能力を
有する新規酵母を提供することを目的とする。 【解決手段】次の性質を有するリパーゼ：（Ａ）作用お
よび基質特異性：グリセロールエステルのエステル結合
を加水分解し、脂肪酸を遊離する；（Ｂ）至適ｐＨ範
囲：３７℃において至適ｐＨは２．９〜５．５である；
（Ｃ）安定ｐＨ範囲：４℃または２５℃、２４時間の保
持条件でｐＨ２．３〜７．１で安定である；（Ｄ）分子
量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約４７ｋＤａである、前記リパ
ーゼを産生する能力を有するクルツマノミセス属に属す
る酵母を培養し、培養物より該リパーゼを採取する工程
を含むリパーゼの製造方法、ならびに前記リパーゼを産
生する能力を有するクルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１１
株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２６）。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規リパーゼおよ
びその製造方法に関し、さらに詳細にはクルツマノミセ
ス（Kurtzmanomyces）属に属する酵母が産生し得る新規
リパーゼおよびその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】リパーゼはグリセロールエステルを加水
分解する酵素の総称であり、従来、動物臓器、微生物等
から抽出、製造されている。リパーゼは、乳製品のフレ
ーバー形成のための食品加工用酵素、消化剤としての医
療用酵素、血中脂質測定のための診断用酵素、油脂の加
水分解や改質のための工業用酵素等として広範囲に使用
されている。それぞれの用途に応じてリパーゼに要求さ
れる特性は多岐に渡っている。

【０００３】たとえば、耐熱性を有するリパーゼの応用
範囲は広く、様々な用途で求められている。たとえば、
食品加工においては、食品衛生上の観点から、雑菌汚染
の危険性の少ない高温での酵素反応が望まれる。また、
油脂分解においても耐熱性を有するリパーゼは有用であ
る。油脂分解とは油脂を加水分解することであるが、洗
剤、化粧品、界面活性剤等の油脂化学工業製品の原料で
ある脂肪酸およびグリセリンを提供する重要なプロセス
である。かかるプロセスにおいてリパーゼによる加水分
解の試みがなされている。その際、問題となるのは、多
くの油脂を構成するステアリン酸、パルミチン酸は常温
で固体であるという点である。このため反応時に油脂を
融点以上の温度に維持して反応させなければならない。
それゆえ、かかる油脂分解に使用されるリパーゼは、熱
安定性が高く、しかも高温下での反応性が高いものでな
ければならない。

【０００４】一方、医療分野においては、耐酸性を有す
るリパーゼに対する高い需要が存在する。たとえば、リ
パーゼは食餌脂肪の分解を促進するための消化剤として
用いられているが、そのようなリパーゼの至適ｐＨ領域
は中性〜アルカリ性に近いものが多いため、経口投与の
際には胃での失活の問題がある。

【０００５】このように、リパーゼは前記するような様
々な分野において利用されるが、それらにおける種々の
用途に対して広範囲に使用可能な、充分な耐熱性と耐酸
性を有する高機能リパーゼは、これまでには知られてい
ない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記のよう
な様々な分野における種々の用途において有用な、耐熱
性および耐酸性を有する新規リパーゼ、その製造方法な
らびに該リパーゼを産生する能力を有する新規酵母を提
供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、 （１） 次の性質を有するリパーゼ：（Ａ）作用および
基質特異性：グリセロールエステルのエステル結合を加
水分解し、脂肪酸を遊離する、（Ｂ）至適ｐＨ範囲：３
７℃において至適ｐＨは２．９〜５．５である、（Ｃ）
安定ｐＨ範囲：４℃または２５℃、２４時間の保持条件
でｐＨ２．３〜７．１で安定である、（Ｄ）分子量：Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで約４７ｋＤａである、（２） 前記
（１）記載のリパーゼを産生する能力を有するクルツマ
ノミセス属に属する酵母を培養し、培養物より該リパー
ゼを採取する工程を含むリパーゼの製造方法、（３）
クルツマノミセス属に属する酵母がクルツマノミセス
ｓｐ．Ｉ−１１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２６）である
前記（２）記載のリパーゼの製造方法、ならびに（４）
前記（１）記載のリパーゼを産生する能力を有するク
ルツマノミセスｓｐ．Ｉ−１１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８
１２６）、に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明のリパーゼは、耐熱性およ
び耐酸性の両方の性質を有する新規な酵素であり、たと
えば、クルツマノミセス属の酵母、好ましくはクルツマ
ノミセス ｓｐ．Ｉ−１１株の培養により得ることがで
きる。前記クルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１１株は本発
明者らにより単離された新規酵母であり、国内寄託機関
である通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に
２０００年１１月２０日に寄託（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１
２６）されている。当該酵母は、本発明に包含される。

【０００９】なお、本明細書において、「培養物」と
は、微生物培養後の微生物を含む培地をいい、「培養
液」とは、微生物培養前の培地そのもの、または微生物
培養後に菌体を除去して得た培地をいう。

【００１０】以下、クルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１１
株について説明する。 菌学的性質 本発明の酵母の菌学的性質を表１〜３に示す。

【００１１】

【表１】

【００１２】

【表２】

【００１３】

【表３】

【００１４】酵母であるとの同定は、飯塚広、後藤昭
二：酵母の分類同定法（第２版）、１、東京大学出版会
（１９７３）および長谷川武治 編：＜改訂版＞微生物
の分類と同定（上）、１７９、（株）学会出版センター
（１９８４）に記載の方法に従って行う。すなわち、栄
養細胞の形態及び、偽菌糸、真菌糸の形成はするが、ク
ランプコネクション、子実体を形成しないという観点か
ら、当該微生物は酵母であると同定される。さらに、表
１〜３に示す菌学的性質を、ジェイ．エイ．バーネット
（J.A.Barnett）、アール．ダブリュ．ペイン（R.W.Pay
ne）、ディー．ヤロー（D.Yarrow）：イースツ キャラ
クタリスティクス アンド アインデンティフィケーシ
ョン（Yeasts Characteristics and identificatio
n）、５０、ケンブリッジ ユニバーシティー プレス
（CAMBRIDGE UNIVERSITY PRESS）（１９９０）およびシ
イ．ピイ．クルツマン（C.P.Kurzman）、ジェイ．ダブ
リュ．フェル（J.W.Fell）：ジ イースツ，ア タキソ
ノミック スタディー 第４版（The Yeasts, A Taxono
mic Study 4th edition）、エルシバー サイエンス
ビイ．ブイ．（Elsevier Science B.V.）（１９９８）
と照合し、増殖形式が、母細胞から生じる小柄先端に娘
細胞を形成するという形式であり、細胞壁中にキシロー
スが存在せず、キノン系がＱ−１０であるという観点か
ら、当該酵母はクルツマノミセス属の酵母であると同定
される。クルツマノミセス属の酵母は担子菌酵母の不完
全世代の一属で、形態的に母細胞から生じる小柄先端に
娘細胞を形成するのが特徴であるステリグマトミセス
（Sterigmatomyces）属から、細胞壁中のキシロースの
有無及びキノン系の違いによって新たに分離、独立が提
唱された属である。すなわち、当該酵母では、細胞壁中
にキシロースが存在せず、キノン系がＱ−１０である。
本発明の酵母の特徴は、このクルツマノミセス属酵母の
特徴と一致する。

【００１５】また、クルツマノミセス属酵母には、クル
ツマノミセス ネクタイレ（Kurtzmanomyces nectaire
i）とクルツマノミセス タルドゥス（Kurtzmanomyces
tardus）の２種の酵母の存在が知られているが、イノシ
トールの資化性、グルクロン酸塩の資化性がこれら酵母
と異なるという観点から、本発明の酵母はクルツマノミ
セス属に属するものであるが、前記クルツマノミセス属
のいずれかの種に分類することは適当ではないと考えら
れ、クルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１１株と命名されて
いる。

【００１６】培養条件 前記酵母の培地は、酵母に対して一般に用いられる培
地、たとえば、ＹＰＤ培地 (イーストイクストラクト
１０ｇ、ポリペプトン ２０ｇ、グルコース ２０ｇ）
を使用することができる。また、最適生育ｐＨは５．６
であり、生育可能なｐＨ範囲は２．１〜６．６である。
最適生育温度は２８℃であり、生育可能な温度範囲は２
４〜３６℃である。

【００１７】本発明の酵母は、様々な分野において種々
の用途に広範囲に使用することができる、本発明の耐熱
性および耐酸性を有する高機能リパーゼを産生し得るの
で、非常に有用である。

【００１８】次に、本発明のリパーゼについて説明す
る。 リパーゼの性質 本発明のリパーゼの理化学的性質を以下に示す。

【００１９】（１）作用および基質特異性 本発明のリパーゼは、グリセロールエステルのエステル
結合を加水分解し、脂肪酸を遊離させる。かかる本発明
のリパーゼの作用および基質特異性は、後述のリパーゼ
活性の測定方法ＩおよびＩＩに準じて酵素反応を行うこ
とで調べることができる。

【００２０】（ｉ）リパーゼ活性の測定方法Ｉに準ずる
反応 基質として表４に示す各脂肪酸とｐ−ニトロフェノール
（以下、ｐＮＰという）とのエステルを用いて酵素反応
（リパーゼ：約０．０１ｕ）を行い、各基質に対する酵
素活性を、基質としてｐ−ニトロフェニルラウレートを
用いる場合の結果を１００％とし、相対活性（％）とし
て求める。その結果を、図１に示す。

【００２１】

【表４】

【００２２】ところで、リパーゼ（EC3.1.1.3)の定義で
は、脂肪酸トリグリセリドのエステル結合を加水分解
（水解）する酵素であるとされている。一方、エステル
結合を水解する酵素としてエステラーゼがあるが、その
反応機構から２つに分類される。一つは脂肪酸モノエス
テルをアルコールと脂肪酸に分解するカルボキシルエス
テラーゼ（carboxylesterase） (EC3.1.1.1)であり、も
う一つはフェニルエステルをフェノールと脂肪酸に分解
するアリールエステラーゼ（arylesterase） (EC3.1.1.
2)である。リパーゼは広い意味ではエステラーゼに属す
る酵素であるが、基質として水に不溶のグリセロールエ
ステルを水解する活性（リパーゼ活性）を示す点で、エ
ステラーゼについて定義される酵素活性と異なる。すな
わち、前記定義に従うリパーゼは、リパーゼ活性を少な
くとも有し、さらに場合によりエステラーゼ活性をも有
するものであるということができる。しかしながら、か
かるエステラーゼ活性は、リパーゼが基質として水に不
溶のグリセロールエステルを水解する活性を示すもので
あることから、その作用様式はエステラーゼとは異なる
と考えられ、また、リパーゼ活性と別個にエステラーゼ
活性を有するのではなく、基本的にはリパーゼ活性に付
随して発揮され得るものであると考えられるため、かか
るエステラーゼ活性に基づく理化学的性質は、当該リパ
ーゼのリパーゼ活性に基づく理化学的性質と同様に扱う
ことができると考えられる。本発明のリパーゼは、前記
リパーゼの定義に従うものであって、エステラーゼ活性
をも示し得るものである。

【００２３】さて、本測定方法では、基質としてｐＮＰ
とのエステルを用いている。その理由としては、かかる
エステルを用いる測定方法は比色法であるため酵素活性
の評価がしやすく、また、酵素の量が少量で良いという
メリットがあり、一方、トリグリセリドを基質として用
いる測定方法は、リパーゼ活性の測定方法としては直接
的ではあるが、大量の酵素を必要とし、反応系が二層系
であるため操作が煩雑であるということが挙げられる。

【００２４】また、以上のような種々の理由から、本発
明のリパーゼの理化学的性質等の評価においては、トリ
グリセリド等のグリセロールエステルを基質として用い
ると共に、各種脂肪酸とｐＮＰとのエステルおよび各種
脂肪酸のエチルエステルを基質として用いる。

【００２５】図１から、本発明のリパーゼが有するアリ
ールエステラーゼ活性は、ｐ−ニトロフェニルラウレー
トよりも長い脂肪酸側鎖を持つｐＮＰエステルに対して
強い活性を示すということが分かる。この活性はｐ−ニ
トロフェニルカプレートのような中鎖化合物では低くな
るが、ｐ−ニトロフェニルラクテートよりも短い脂肪酸
側鎖を持つｐＮＰエステルに対しては再び活性を示すこ
とが分かる。

【００２６】（ｉｉ）リパーゼ活性の測定方法ＩＩに準
ずる反応 基質として、それぞれ、表５に示す各脂肪酸とのエチル
エステル、ならびに該脂肪酸とグリセロールとのエステ
ルである、１−モノグリセリド（以下、１−ＭＧと略
す）、２−モノグリセリド（以下、２−ＭＧと略す）お
よびトリグリセリド（以下、ＴＧと略す）を用いて酵素
反応（リパーゼ：約２．５ｕ）を行う。

【００２７】

【表５】

【００２８】１−ＭＧ、２−ＭＧ、ＴＧ、およびエチル
エステルのそれぞれについては、酵素反応で遊離する脂
肪酸をＮＥＦＡ−Ｃテストワコー〔和光純薬工業（株）
製〕にて定量し、それらの基質に対する酵素活性を求
め、基質として１−モノオレオイルグリセロールを用い
る場合の結果を１００％として相対活性（％）で表わ
す。それらの結果を図２〜４に示す。

【００２９】図２〜４に示すように、本発明のリパーゼ
は、用いる基質のタイプによって、各脂肪酸エステルに
対する作用に若干の違いが認められる。モノアシルグリ
セロールを基質に用いた場合（図２）、ステアリン酸や
オレイン酸のような長い側鎖を持つ基質よりも、カプリ
ン酸やラウリン酸のような中鎖脂肪酸を側鎖に持つ基質
に対する分解活性の方が強いことが分かる。また、１−
モノオレオイルグリセロールと２−モノオレオイルグリ
セロールの分解活性がほぼ同等であることから、グリセ
ロールの１位、２位をほぼ同程度に分解できるというこ
とが分かる。一方、トリアシルグリセロールを基質に用
いた場合（図３）、トリステアロイルグリセロールに対
する分解活性が最も強いことが分かる。これらの結果か
ら、本発明のリパーゼは、特に一般の油脂に多く存在す
る鎖長（炭素数：１６〜２０）の脂肪酸のグリセロール
とのいずれのエステルにも作用し得、特に飽和脂肪酸の
エステルに対して優れた作用を示すといえる。

【００３０】また、エチルエステルを基質に用いた場合
（図４）、ステアリン酸のような長い側鎖を持つエステ
ルよりもカプリン酸のような短い側鎖を持つエステルを
分解するということが分かる。しかしながら、１−モノ
オレオイルグリセロールと比較すると、その相対活性は
６％以下であり、かなり低いということが分かる。この
ことから、本発明のリパーゼは、カルボキシルエステラ
ーゼ活性は非常に弱いということが分かる。

【００３１】このように、本発明のリパーゼはｐＮＰエ
ステルを加水分解できることから、アリールエステラー
ゼ活性があることが分かる。また、エチルエステルを加
水分解できることから、カルボキシルエステラーゼ活性
があることが分かる。しかしながら、エチルエステルの
加水分解活性はかなり低く、カルボキシルエステラーゼ
活性は非常に弱いということがいえる。

【００３２】また、本発明のリパーゼは、トリグリセリ
ドリパーゼ活性およびモノグリセリドリパーゼ活性を有
することが分かる。以上から、エステラーゼ活性を示す
ものの、水に不溶のエステルを加水分解できるという点
から判断して、本発明のリパーゼは、水に可溶のエステ
ルのみを水解するエステラーゼとは異なり、前記定義に
従うリパーゼであると判断できる。その作用及び基質特
異性は前記のとおりである。

【００３３】（２）至適ｐＨ範囲および安定ｐＨ範囲 本発明のリパーゼの至適ｐＨ範囲は、３７℃において
２．９〜５．５である。かかる本発明のリパーゼの至適
ｐＨ範囲は、ｐＨ１．５〜９の緩衝液中で後述のリパー
ゼ活性の測定方法ＩＩに準じて酵素反応を行うことで調
べることができる。かかる酵素反応はｐＨで０．５刻み
で行う。なお、使用する緩衝液は、ｐＨ２〜３の範囲で
は５０ｍＭ グリシン−塩酸緩衝液、ｐＨ４〜５の範囲
では５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６〜７の範
囲では５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８〜９
の範囲では５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液である。その
結果を、図５に示す。結果は、各ｐＨにおける反応にお
いて、反応液１０００μＬに対し本発明のリパーゼを約
５ｕ添加し、３０分間反応を行い、次いで遊離してきた
グリセロールの測定を行い、リパーゼ活性（ｕ／ｍＬ反
応液）に換算する。

【００３４】本発明のリパーゼの安定ｐＨ範囲は、４℃
または２５℃、２４時間の保持条件で２．３〜７．１で
ある。かかる本発明のリパーゼの安定ｐＨ範囲は、前記
と同様の緩衝液中にリパーゼを溶解し、４℃または２５
℃で２４時間保持した後、後述のリパーゼ活性の測定方
法ＩＩに準じて酵素反応〔リパーゼ：０．０１ｍｇ／ｍ
Ｌ（約１ｕ）〕を行うことで調べることができる。その
結果を、図６に示す。結果は、実験開始時０分の酵素活
性を１００％として、それに対する残存活性（％）で表
す。図６から、本発明のリパーゼは耐酸性に優れたもの
であることが分かる。また、本発明のリパーゼは、図６
から、４℃または２５℃においてｐＨ９．６以上、２４
時間で失活することが分かる。

【００３５】（３）分子量 本発明のリパーゼの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約４
７ｋＤａである（図１５参照）。また、図１５から、該
リパーゼはモノマータンパク質であることが分かる。さ
らに、該リパーゼタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にニ
トロセルロース膜に移し、常法に従って糖染色を行う
と、糖の存在は認められない。

【００３６】（４）至適温度範囲 本発明のリパーゼの至適温度範囲は、ｐＨ５．６におい
て７０〜８０℃である。かかる本発明のリパーゼの至適
温度範囲は、１０〜９０℃の温度範囲で後述のリパーゼ
活性の測定方法Ｉに準じて酵素反応（リパーゼ：約０．
０３ｕ）を行うことで調べることができる。かかる測定
は５℃刻みで行う。その結果を、図７に示す。結果は、
３７℃におけるリパーゼ活性を１００％として相対活性
（％）で表す。

【００３７】（５）熱安定性 本発明のリパーゼの熱安定性は、ｐＨ５．６、１２０分
間の条件で７０℃まで安定であるが、７５℃においても
６０％の残存活性を示すというものである。かかる本発
明のリパーゼの熱安定性は、６５〜８５℃の範囲で１２
０分間まで保持し、保持の途中におけるリパーゼ活性を
後述のリパーゼ活性の測定方法Ｉに準じて酵素反応〔リ
パーゼ：０．０１ｍｇ／ｍＬ（約１ｕ）〕を行うことで
調べることができる。かかる測定は５℃刻みで行う。そ
の結果を、図８に示す。結果は、３７℃におけるリパー
ゼ活性を１００％として残存活性（％）で表す。図８か
ら、本発明のリパーゼは耐熱性に優れたものであること
が分かる。

【００３８】（６）金属イオン等の影響 本発明のリパーゼの金属イオン等の影響は、表６に示す
金属イオン等を持つ各種物質の存在下、後述のリパーゼ
活性の測定方法Ｉに準じて酵素反応（リパーゼ：約２．
５ｕ）を行うことで調べることができる。その結果を、
図９に示す。結果は、いずれの物質も存在させない場合
（対照）の結果を１００％として相対活性（％）で表
す。図９から、本発明のリパーゼは、Ｆｅ^{3 +} 、Ｆｅ
^{2 +} 、Ａｌ³⁺等、特にＦｅ^{3 +} で活性が若干阻害される
ものの、表６に示す金属イオンにより格別著しい阻害は
受けず、一方、ＰＭＳＦや、Ｍｇ等のアルカリ土類金
属、Ｎａ、Ｋ等のアルカリ金属等で活性が若干安定化さ
れることが分かる。

【００３９】

【表６】

【００４０】（７）有機溶媒の影響 本発明のリパーゼに対する有機溶媒の影響は、各種有機
溶媒の存在下で一定時間酵素を保存し、後述のリパーゼ
活性の測定方法Ｉに準じて酵素反応（リパーゼ：約０．
０１ｕ）を行い、リパーゼの残存活性を測定することに
より調べることができる。具体的には、有機溶媒として
は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、１−ブ
タノール、イソブタノール、イソプロパノール、クロロ
ホルム、キシレン、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、Ｄ
ＭＳＯ、酢酸エチルおよびアセトンを用い、それらを酵
素液中に２０、４０、６０及び８０重量％の濃度でそれ
ぞれ存在させ、３０℃、１時間保存した後の残存活性を
測定する。リパーゼ活性は、有機溶媒の非存在下で保存
した場合（対照）の結果を１００％として相対活性
（％）で表す。結果を、図１０に示す。図１０から、い
ずれの有機溶媒も酵素液中の濃度が６０重量％までは顕
著に活性阻害を示さず、また、イソブタノール、キシレ
ン、ヘキサン、ベンゼン、酢酸エチル等では、リパーゼ
活性の安定化効果または増強効果があることが分かる。
なお、図中、各有機溶媒の濃度は簡単に「％」と表示す
る。

【００４１】リパーゼは、本来のエステル加水分解反応
以外に、微水系においてはエステル合成反応やエステル
転移反応を行う。それゆえ、本発明のリパーゼを用い、
好ましくは前記リパーゼ活性の安定化効果または増強効
果を有する有機溶媒の存在下に、高効率なランダムエス
テル交換反応等を行い得る。

【００４２】活性測定方法 本発明のリパーゼの活性は以下に示す２つの方法により
測定することができる。なお、本明細書中、特に記載が
ない限り、リパーゼの単位（ｕ）数は以下のリパーゼ活
性の測定方法Ｉに従って得られた値を示す。

【００４３】〔リパーゼ活性の測定方法Ｉ〕本方法は、
ウインクラー，ユウ．ケイ．（Winkler,U.K.）とエム．
スタックマン（M.Stuckmann）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１３８，６６３頁（１９７９年）に記載の方法に基
づくものである。

【００４４】（ａ）基質の調製 ｐ−ニトロフェニルラウレート（東京化成製）１６．１
ｍｇを量り、４重量％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液
を１０ｍＬ加えて５５〜６０℃の水浴中で攪拌溶解す
る。２分後に１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）を１ｍＬ
添加し、さらに５分間攪拌後、精製水８ｍＬを加えて混
和し、室温に放置する。得られた溶液を基質液とする。

【００４５】（ｂ）活性測定の方法 試験管に基質液０．９５ｍＬをとり、３７℃で５分間予
熱し、リパーゼを１０重量％エチレングリコールと０．
０５重量％Ｂｒｉｊ３５を含む１０ｍＭ 酢酸緩衝液
（ｐＨ５．６）に溶解して調製したリパーゼ溶液０．０
５ｍＬを加えて混合し、１５分間反応後、アセトン２ｍ
Ｌを加えて反応を停止させ、加水分解反応により遊離し
たｐＮＰを定量してリパーゼの力価を求める。具体的に
は、反応停止後、速やかに４１０ｎｍにおける吸光度を
測定して、得られる吸光度をＯＤ_{te st}とし、一方、ブラ
ンクとして、前記リパーゼ溶液の代わりに、その溶媒の
みを用いて同様の操作を行った後に吸光度を測定し、得
られる吸光度をＯＤ_blankとし、以下に示す計算式によ
ってリパーゼの力価を算出する。

【００４６】（ｃ）力価算出法 リパーゼの１単位（ｕ）は、上記の条件下で、１分間に
１μｍｏｌのｐＮＰを生成するのに要する酵素量とす
る。リパーゼの力価は、以下の計算式により求める。 力価（ｕ／ｍｇタンパク質）＝２．２４×（ＯＤ_test−
ＯＤ_blank）×（希釈倍率）

【００４７】〔リパーゼ活性の測定方法ＩＩ〕本方法
は、ティー．マセ（T.Mase）、ワイ．マツミヤ（T.Mats
umiya）、とティー．アキバ（T.Akiba）、Ｂｉｏｓｃ
ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９（９），
１７７１頁（１９９５年）に記載の方法に基づくもので
ある。

【００４８】（ａ）基質の調製 ０．１ｇの１−モノオレオイルグリセロール（東京化成
製）をｎ−ヘキサン１０ｍＬに溶解する。得られた溶液
を基質液とする。

【００４９】（ｂ）活性測定の方法 試験管に基質液２００μＬ、０．１Ｍ トリス緩衝液
（ｐＨ７）８００μＬ、前記リパーゼ溶液１００μＬを
入れ、３分間ごとに攪拌しながら、３７℃で３０分間反
応させる。反応は、クロロホルムを１ｍＬ添加して停止
する。次いで反応液の水層を回収し、加水分解反応で遊
離したグリセロールを定量してリパーゼの力価を求め
る。具体的には、グリセロールの定量をトリグリセライ
ドＧ−テストワコー〔和光純薬工業（株）製〕を用いて
行い、その際に得られる吸光度をＯＤ _testとし、一方、
ブランクとして、前記リパーゼ溶液の代わりに、その溶
媒のみを用いて同様の操作を行い、得られる吸光度をＯ
Ｄ_blankとし、以下に示す計算式によってリパーゼの力
価を算出する。

【００５０】（ｃ）力価算出法 リパーゼの１単位（ｕ）は、上記の条件下で、１分間に
１μｍｏｌのグリセロールを生成するのに要する酵素量
とする。リパーゼの力価は、以下の計算式により求め
る。 力価（ｕ／ｍｇタンパク質）＝４４．１９×（ＯＤ_test
−ＯＤ_blank）

【００５１】本発明のリパーゼは、例えば、工業的にも
大変よく利用されている（イ）キャンディダ アンター
クティカ（Candida Antarctica）由来のリパーゼ〔日本
醗酵工学会誌 第６６巻 第５号 ｐ４０８−４１０
（１９８８）；以下、（イ）リパーゼという〕と種々の
点で異なる。たとえば、本発明のリパーゼの至適温度は
７０〜８０℃であり、これは（イ）リパーゼの場合の６
５℃に比べはるかに高い。（イ）リパーゼの場合、至適
ｐＨは７．５〜８．０であり、ｐＨ５．５〜１０．５の
範囲では最高値の５０％までその活性が減少する。しか
し、本発明のリパーゼは至適ｐＨがｐＨ２．９〜５．５
であり、はるかに酸性領域の活性が強い。一方、（ロ）
キャンディダ シリンドラセ（Candida cylindracea）
の生産するリパーゼ〔Agr. Biol. Chem., Vol.30, No.
6, p.576-584, (1966) ；以下、（ロ）リパーゼとい
う〕はｐＨ５〜８における５℃、１２時間経過後の残存
活性が１００％と、酸性領域にも安定な酵素として知ら
れているが、至適ｐＨは７．２であり、本発明のリパー
ゼはｐＨ２．９〜５．５であるので、本発明のリパーゼ
の方がより酸性側で優れた活性を示す。また、（ロ）リ
パーゼは４５℃、ｐＨ７で１０分間保持すると約９０％
が失活するのに対し、本発明のリパーゼは７０℃でｐＨ
５．６で１２０分間保持しても安定であり、高温側にお
いて高い安定性を有する。このように、本発明のリパー
ゼは、優れた耐熱性と耐酸性を有する。

【００５２】本発明のリパーゼのように、耐熱性および
耐酸性の両方の性質に優れるリパーゼはこれまでに報告
がなく、従って、本発明のリパーゼは全く新規なリパー
ゼであるといえる。本発明のリパーゼは、かかる性質に
より、高温での脂質が関与する反応、たとえば、加水分
解反応、エステル交換反応等において充分にその活性を
発揮することができ、工業的にきわめて有用な用途を提
供し得、一方、医薬の分野において、たとえば、消化剤
の有効成分としても使用することができる。従って、本
発明のリパーゼは、医薬、食品加工、化粧品製造、汚水
処理、油脂分解等に広く利用され得る。

【００５３】次に、本発明のリパーゼの製造方法につい
て説明する。本発明のリパーゼは、クルツマノミセス属
に属する酵母により産生され得るものである。かかる事
実は、後述する耐熱性および耐酸性に優れるリパーゼを
産生する能力を有する微生物を対象にしたスクリーニン
グを行った結果、本発明者らが初めて明らかにしたこと
である。

【００５４】本発明のリパーゼの製造方法は、本発明の
リパーゼを産生する能力を有するクルツマノミセス属に
属する酵母を培養し、培養物より該リパーゼを採取する
工程を含む。かかる製造方法において好適には、前記ク
ルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１１株が用いられる。

【００５５】培養条件 本発明の酵母の培養のための培地は、前記するような一
般の酵母について公知である培地を用いることができ
る。リパーゼの産生を有意に促進する観点からは、好ま
しくは、特に炭素源として、大豆油などの植物性油脂
等、また、後述するようにリパーゼの採取、たとえば、
培養物からの精製を容易にする観点からは、パルミチン
酸のような高級脂肪酸等を用い、公知の培地を一部改変
したものを用いてもよい。たとえば、後述する表７に示
す培地が好適に用いられる。

【００５６】培養ｐＨは、好ましくは５〜５．８、より
好ましくは５．６、培養温度は、好ましくは２８〜３２
℃、より好ましくは３０℃であり、約７２〜９６時間、
好気的に攪拌（たとえば、ジャーファーメンターを用い
る場合、１，０００ｒｐｍ）または振盪（１２０ｒｐ
ｍ）しながら培養を行う。かかる培養条件下に、クルツ
マノミセス属の酵母、好ましくは本発明の酵母を培養す
ると、かかる酵母は主としてリパーゼを菌体外に分泌す
る。たとえば、ジャーファーメンターを用い、後述の表
７に示す液体培地ＩＩにおいて３０℃にて本発明の酵母
を培養した場合、図１１に示すように、経時的に培養物
中のリパーゼ活性が増加し、約７５時間後のリパーゼ産
生量は約１．８ｕ／ｍＬ培養物となる。なお、リパーゼ
活性は前述のリパーゼ活性の測定方法Ｉにより測定す
る。

【００５７】リパーゼの採取方法 前記のように、リパーゼを産生する能力を有するクルツ
マノミセス属の酵母、好ましくは本発明の酵母を培養し
て該リパーゼの生産を行い、次いで、たとえば、（ａ）
培養物から菌体を除去して該リパーゼを含む培養液を得
る、または、（ｂ）培養物中の酵母を公知の方法に従っ
て破砕し、次いで該培養物を適宜遠心分離にかけて菌体
沈殿物を除去し、菌体抽出物を含む培養液を得る。以下
においては、より一般的な方法である前記（ａ）の態様
について説明する。

【００５８】リパーゼの採取は培養液を得た時点で終了
してもよいが、通常、以下に説明するようにして、さら
に精製を行うのが好ましい。得られた培養液からの本発
明のリパーゼの精製は、基本的には公知の操作を組み合
わせることにより行うことができる。しかしながら、酸
性領域において安定であるという本発明のリパーゼに特
有の性質より、以下に示す方法においては、全ての工程
において、酢酸緩衝液のような溶液のｐＨが酸性となる
ような緩衝液を用いるのが好ましい。かかる態様によれ
ば、本発明のリパーゼをより効率的に採取することがで
きる。

【００５９】かかる採取方法の一例の概要は以下の通り
である。すなわち、培養物を濾過または遠心分離にかけ
て菌体を除去し、さらに所望により濃縮する。続いて、
硫安による塩析等を行った後、限外濾過および／または
透析にかける。さらに、陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマ
トグラフィー等で精製を行う。より具体的には以下の通
りである。

【００６０】たとえば、後述の表７に示す液体培地ＩＩ
１．５Ｌに本発明の酵母を接種し、２８〜３２℃にて
７２〜９６時間、１，０００ｒｐｍ（たとえば、ジャー
ファーメンターを用いる場合）にて振盪培養する。かか
る培養は、所望の酵母の充分な増殖が得られるまで、た
とえば、培地の量を段階的に増やし数回に分けて行って
もよい。次いで、得られた培養物から遠心分離により菌
体を除去し、上清を得る。所望により濃縮し、上清を硫
酸アンモニウム（飽和度８０％）による塩析に供し、遠
心分離を行って沈澱したタンパク質を回収する。さら
に、該タンパク質を８０％エタノールに懸濁後、遠心分
離を行って沈澱したタンパク質を回収する。次いで、該
タンパク質を、例えば、少量の５０ｍＭ 酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５）に溶解し、例えば、５０ｍＭ 酢酸緩衝
液（ｐＨ５．５）に対し透析を行う。次いで、順次、以
下に示す種々のクロマトグラフィーにかけ、さらにリパ
ーゼの精製を行う。

【００６１】透析後のタンパク質溶液を、例えば担体と
してＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｄｅｘＡ−２５を用いる陰イ
オン交換クロマトグラフィーにかけ、非吸着画分を回収
する。得られた画分を、例えば、限外濾過膜（分画分子
量：１００００Ｄａ）を用いて濃縮すると共に、溶媒
を、例えば、５０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）
に置換する。得られた濃縮物を、例えば、担体としてＳ
Ｐ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−５０を用いる陽イオン交換ク
ロマトグラフィーにかけ、非吸着画分を回収する。得ら
れた画分について、例えば、１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．６）を用いて前記と同様に濃縮ならびに緩衝液の
置換を行う。最後に、得られた濃縮物を、たとえば、担
体としてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００を用いるゲル濾
過クロマトグラフィーにかけ、リパーゼ活性のピークに
相当する溶出画分を回収し、前記同様に濃縮して精製リ
パーゼを得る。

【００６２】なお、リパーゼの採取方法の前記の例で
は、大豆油を唯一の炭素源として培養を行う態様を示し
たが、かかる場合、精製初期の工程における遠心分離で
該油を完全には除去できず、油分が残存して塩析やその
後の透析操作等に影響し、精製効率が低下する場合があ
る。それゆえ、脂肪酸、たとえば、パルミチン酸を基質
として培養を行ってもよい。それにより、残存油の問題
を解消でき、より少ない工程で良好な精製を行うことが
できる。

【００６３】次に、耐熱性および耐酸性に優れるリパー
ゼを産生する能力を有する微生物を対象にしたスクリー
ニング方法について説明する。本発明のリパーゼは、ク
ルツマノミセス属に属する酵母により産生され得るもの
であるが、かかる酵母は以下のスクリーニング方法に従
って得られ得る。

【００６４】微生物のスクリーニング方法 微生物の採取に好適な、たとえば、植物の葉、花、茎、
木の樹液、土壌、ため池の水、工場排水、昆虫等に由来
する種々のサンプルを採取する。得られたサンプルを、
たとえば、生理的食塩水等に懸濁し、懸濁液上清を得
る。得られた上清を、概してリパーゼ産生菌のみが生育
可能なように、たとえば、炭素源を大豆油のみとした表
７に示す寒天培地にストリークし、上清に含まれる微生
物を静置培養する。なお、かかる培地としては、たとえ
ば、北本ら（北本 大：油化学、４１、８３９頁、１９
９２年）が使用した培地を改変して使用するのが好まし
い。本スクリーニング方法において好適に用いられる培
地の組成を表７に示す。

【００６５】

【表７】

【００６６】静置培養後、寒天培地上に生育したコロニ
ーを釣菌し、再び同様の寒天培地にストリークし、同条
件にて静置培養を行う。生育したコロニーを顕微鏡観察
し、コンタミネーションが確認できなくなるまで、かか
る工程を繰り返す。次いで、分離された微生物を液体培
地ＩＩ（所望によりｐＨ調整を行う）において、２８〜
３２℃において４〜７日間培養する。かかる条件下に活
発に増殖する微生物はリパーゼを産生している可能性が
示唆される。

【００６７】さらにリパーゼ活性の存在について詳細に
調べるため、培養液を成分分析に供する。分析の結果、
培養液中にグリセロールおよび脂肪酸が検出された場
合、それは培地に基質として含まれていた大豆油が分解
されたことを示す。すなわち、培養液におけるリパーゼ
活性の存在を示している。

【００６８】かかる成分分析により培養液中にリパーゼ
活性の存在が認められた微生物について、さらに、それ
らが産生するリパーゼの活性について、たとえば、前記
のリパーゼ活性の測定方法Ｉに準じて培養液１ｍＬ当た
りのリパーゼの単位（ｕ）数を求め、リパーゼ活性を比
較する。

【００６９】本発明の酵母は、以上のスクリーニングを
行った結果、分離された微生物の内、最も優れた耐熱性
および耐酸性を有するリパーゼを産生する微生物として
単離されたものである。

【００７０】

【実施例】本発明を以下の実施例により詳細に説明する
が、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではな
い。

【００７１】実施例１ 本発明の酵母、クルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１１株
は、前記微生物のスクリーニング方法に従って、植物の
葉から単離された。

【００７２】すなわち、東北地方を除く日本全域におい
て植物の葉、花、茎、木の樹液、土壌、ため池の水、工
場排水、昆虫等、自然界から様々なサンプルを採取して
微生物のスクリーニングを行った。その際、前記表７に
示す培地を使用した。

【００７３】採取した新鮮なサンプルを、φ１８ｍｍの
試験管に適当量投入した。その後、その試験管を２８〜
３２℃において４〜７日間振盪培養を行い、培養物を一
白金耳採り、表７に示す寒天培地にストリークし、２８
℃で４日間程度、静置培養した。静置培養後、寒天培地
上に生育したコロニーを釣菌し、再び同様の寒天培地に
ストリークし、同条件にて静置培養を行った。生育した
コロニーを顕微鏡観察し、コンタミネーションが確認で
きなくなるまで、寒天培地を用いた分離操作を繰り返し
た。次いで、コンタミネーションがなくなったと確認さ
れた菌株を、ジャーファーメンターを用い、液体培地Ｉ
Ｉ（ｐＨ５．６）において、３０℃、４日間、さらに培
養した。

【００７４】培養後、菌体を除去して得た培養液を成分
分析に供し、リパーゼ活性の存在について調べた。成分
分析は、培養液を、該培養液と当量の酢酸エチルを用い
た油分の抽出に供し、イアトロスキャン（島津製作所
製）にて残存大豆油、遊離脂肪酸量等の測定を行うこと
により行った。

【００７５】かかる成分分析により培養液中にリパーゼ
活性の存在が認められた微生物について、さらに、それ
らが産生するリパーゼの活性について調べた。すなわ
ち、ｐ−ニトロフェニルラウレートを基質として用い、
前述のリパーゼ活性の測定方法Ｉに準じて培養液１ｍＬ
当たりのリパーゼの単位数を求め、比較した。

【００７６】以上のスクリーニングに基づき、分離され
た微生物の内、最も優れたリパーゼ活性の産生を示した
微生物を単離した。該微生物について、前記する菌学的
性質を調べたところ、クルツマノミセス属の酵母である
ことが判明し、クルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１１株と
命名した。

【００７７】実施例２ 本発明のリパーゼを製造し、基質として１−モノオレオ
イルグリセロールを用いて酵素反応を行った。

【００７８】（Ａ）クルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１１
株の培養 大豆油８重量％、ＮＨ₄ ＮＯ₃ ０．１重量％、ＫＨ₂
ＰＯ₄ ０．０５重量％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．
０５重量％、イーストイクストラクト ０．１重量％を
含有する培地（前記表７の液体培地ＩＩ）を用い、クル
ツマノミセスｓｐ．Ｉ−１１株の培養を行った。培養は
３０℃で約７２時間、３Ｌ容ジャーファーメンター〔三
ツワ理化学工業（株）製〕により行った。

【００７９】（Ｂ）リパーゼの精製 工程（１）：得られた培養物１．５Ｌを４℃にて１０，
０００×ｇで１０分間、遠心分離して菌体を除去し、上
清を得た。

【００８０】工程（２）：硫酸アンモニウムで塩析を行
った（飽和度８０％）。次いで、遠心分離を行って沈澱
したタンパク質を回収した。

【００８１】工程（３）：該タンパク質を８０％エタノ
ールに懸濁し、沈澱したタンパク質を遠心分離を行って
回収した。

【００８２】工程（４）：回収されたタンパク質を、約
１０ｍＬの５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解
し、１０Ｌの５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に対
し４℃にて１日間透析を行った。透析後、得られたタン
パク質溶液を、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５
クロマトグラフィー〔カラム：直径３×５０ｃｍ：アマ
シャムファルマシア（株）製〕にかけ、前記５０ｍＭ
酢酸緩衝液により溶出を行った。その結果を図１２に示
す。図１２に示すように、前半のタンパク質のピークと
リパーゼ活性のピークは一致し、かかる溶出画分を回収
した。

【００８３】工程（５）：次いで、得られた溶出画分を
限外濾過膜〔マクロセップ（分画分子量：１０００
０）：ゲルマンサイエンスジャパン（株）製〕を用いて
濃縮すると共に、溶媒を、５０ｍＭ クエン酸緩衝液
（ｐＨ３．９）に置換した。得られた濃縮物を、ＳＰ−
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−５０クロマトグラフィー〔カラ
ム：直径３×５０ｃｍ：アマシャムファルマシア（株）
製〕にかけ、前記５０ｍＭ クエン酸緩衝液により溶出
を行った。その結果を図１３に示す。図１３に示すよう
に、リパーゼ活性のピークは溶出画分の前半において１
つだけ現れ、かかるピークに相当する溶出画分を回収し
た。

【００８４】工程（６）：回収した溶出画分を、１０ｍ
Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）を用いて前記工程（５）
と同様にして濃縮した。得られた濃縮物を、担体として
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００を用いるゲル濾過クロマ
トグラフィー〔カラム：直径３×１００ｃｍ：アマシャ
ムファルマシア（株）製〕にかけた。かかるクロマトグ
ラフィーの結果を図１４に示す。リパーゼ活性のピーク
は溶出画分の前半において１つだけ現れたので、かかる
ピークに相当する溶出画分を回収し、精製リパーゼを得
た。

【００８５】以上の方法で精製した場合の各工程におけ
るリパーゼの精製度を調べた。各工程において得られた
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、その結果を図１
５に、また、かかるタンパク質のリパーゼ活性を前記リ
パーゼ活性の測定方法Ｉに準じて測定し、その結果を表
８に示す。

【００８６】

【表８】

【００８７】図１５に示すように、最終段階のゲル濾過
クロマトグラフィー〔工程（６）〕を終えた精製物では
シングルバンドを得ており、リパーゼが高度に精製され
たことが分かる。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、リパ
ーゼの分子量は約４７ｋＤａで、モノマータンパク質で
あることが分かる。

【００８８】表８の工程（１）の値は、培養物を遠心分
離し、菌体を除去した後の培養上清を試料としたときの
値である。最終的に、工程（６）では６２６．８ｕ／ｍ
ｇタンパク質〔工程（２）、（３）に比較して１７９．
０９倍に精製される〕の精製リパーゼが得られたことが
分かる。

【００８９】（Ｃ）エステル加水分解反応 得られたリパーゼを用いて、１−モノオレオイルグリセ
ロールを基質として、前記リパーゼ活性の測定方法ＩＩ
に準じて酵素反応を行った。基質の終濃度は５ｍｍｏｌ
／Ｌとなるように調整し、リパーゼを５ｕ使用し、反応
液量は５５０μＬとした。３０分反応後に２．３ｍｍｏ
ｌ／Ｌの脂肪酸が遊離した。

【００９０】（Ｄ）リパーゼの理化学的性質 得られたリパーゼを用いて、（１）作用および基質特異
性、（２）至適ｐＨ範囲および安定ｐＨ範囲、（３）分
子量、（４）至適温度範囲、（５）熱安定性、（６）金
属イオン等の影響、ならびに（７）有機溶媒の影響につ
いて試験を行ったところ、図１〜１０のデータが得ら
れ、それぞれ前記したような結果となった。

【００９１】

【発明の効果】本発明によれば、クルツマノミセス ｓ
ｐ．Ｉ−１１株の培養により、優れた耐熱性と耐酸性を
有する新規リパーゼが得られる。かかるリパーゼは、高
温での脂質が関与する反応、たとえば、加水分解反応、
エステル交換反応等において充分にその活性を発揮する
ことができ、工業的にきわめて有用な用途を提供し得、
一方、医薬の分野において、たとえば、消化剤の有効成
分としても使用することができるので、医薬、食品加
工、化粧品製造、汚水処理、油脂分解等に広く利用され
得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、各種脂肪酸とｐＮＰとのエステルを基
質とした場合のリパーゼの作用性を示すグラフである。

【図２】図２は、各種１−ＭＧまたは２−ＭＧを基質と
した場合のリパーゼの作用性を示すグラフである。

【図３】図３は、各種ＴＧを基質とした場合のリパーゼ
の作用性を示すグラフである。

【図４】図４は、各種脂肪酸のエチルエステルを基質と
した場合のリパーゼの作用性を示すグラフである。

【図５】図５は、リパーゼの至適ｐＨ範囲を示すグラフ
である。

【図６】図６は、リパーゼの安定ｐＨ範囲を示すグラフ
である。

【図７】図７は、リパーゼの至適温度範囲を示すグラフ
である。

【図８】図８は、リパーゼの安定温度範囲を示すグラフ
である。

【図９】図９は、リパーゼ活性に対する各種物質の影響
を示すグラフである。

【図１０】図１０は、リパーゼ活性に対する各種有機溶
媒の影響を示すグラフである。

【図１１】図１１は、クルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１
１株培養時の培養物中における経時的なリパーゼ活性の
増加を示すグラフである。

【図１２】図１２は、クルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１
１株の培養物からのリパーゼの精製過程における陰イオ
ン交換クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。

【図１３】図１３は、クルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１
１株の培養物からのリパーゼの精製過程における陽イオ
ン交換クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。

【図１４】図１４は、クルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１
１株の培養物からのリパーゼの精製過程におけるゲル濾
過クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。

【図１５】図１５は、クルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１
１株の培養物からのリパーゼの精製過程における各工程
でのリパーゼの精製度を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 玉井 正弘 広島県広島市南区比治山本町12番70号 広 島県立食品工業技術センター内 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD04 EE03 FF03E FF04E FF12E LL05 4B065 AA72X AC12 AC14 BA22

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の性質を有するリパーゼ。 （Ａ）作用および基質特異性：グリセロールエステルの
   エステル結合を加水分解し、脂肪酸を遊離する。 （Ｂ）至適ｐＨ範囲：３７℃において至適ｐＨは２．９
   〜５．５である。 （Ｃ）安定ｐＨ範囲：４℃または２５℃、２４時間の保
   持条件でｐＨ２．３〜７．１で安定である。 （Ｄ）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約４７ｋＤａであ
   る。
2. 【請求項２】 請求項１記載のリパーゼを産生する能力
   を有するクルツマノミセス属に属する酵母を培養し、培
   養物より該リパーゼを採取する工程を含むリパーゼの製
   造方法。
3. 【請求項３】 クルツマノミセス属に属する酵母がクル
   ツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８
   １２６）である請求項２記載のリパーゼの製造方法。
4. 【請求項４】 請求項１記載のリパーゼを産生する能力
   を有するクルツマノミセス ｓｐ．Ｉ−１１株（ＦＥＲ
   Ｍ Ｐ−１８１２６）。