JPS5836953B2 - シンキナリパ−ゼノセイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアルカリゲネスに属するリパーゼ生産菌を培養
することによりアルカリ側に至適ｐＨをもち胆汁酸塩に
より活性化される新規なリパーゼを製造する方法に関す
るものである。

微生物、特にバクテリアを用いたリハーゼの製造法とし
ては、シュードモナス属、クロモバクテリア属、アクロ
モバクテリア属、スタフイロコツカス属、プロピオバク
テリウム属、コリネバクテリウム属などに属する菌を利
用する方法が知られている。

しかし、従来アルカリゲネス属に属する微生物がアルカ
リ側に至適ｐＨをもち胆汁酸塩により大巾に賦活される
リパーゼを培地中に生産する事実は未だ見出されていな
い。

本発明者等は、このようなリパーゼ生産菌を見出すべく
広く自然界より微生物を分離した結果、東京都下の土壌
より分離したアルカリゲネス属に属する菌である名糖Ｐ
Ｌ−２６６号がこのような新規なリパーゼを生産するこ
とを発見した。

このリパーゼ生産菌名糖ＰＬ−２６６号は次のような菌
学的性質を有する。

Ａ．形態 ■ 肉汁寒天培地および肉汁液体培地に生育した菌の形
態は桿状であり、０．５〜０．７Ｘ１〜３μの大きさで
、多《の場合単独であるが、まれに２〜４連をなす。

又、時には伸長した細胞も見られる。

■ 細胞の多形性はない。

■ 運動性あり、鞭毛は周毛で１〜１０本。

■ 胞子形成なし。

■ ダラム染色性は陰性。

クリスタルバイオレット寒天培地によく生育し、赤色集
落を形成する。

■ 抗酸性は陰性。

Ｂ．生育状態 ■ 肉汁寒天平板培養 半透明灰白色又は灰黄色で、やや光沢を有する円形のコ
ロニーを生ずる。

表面は生育初期はなめらかで後期にやや粗となる。

周縁は円形で拡散性色素は生産しない。

■ 肉汁寒天斜面培養 絖状又はいぼ状に生育し、生育部分は灰白色又は灰黄色
で、光をあてると半透明、樹脂様色をなす。

■ 肉汁液体培地 生育は良いが、培地はあまり濁ることなく、上層部はほ
とんど透明のまま下層に白色の菌体な沈澱する。

■ 肉汁ゼラチン穿刺培養 縣状に生育し、最初は噴火口状に液化し、後に層状に液
化する。

■ リトマスミルク 培養と共にｐＨはゆっくりアルカリ性となる。

２週間目頃より液化が起り、最後に完全に液化する。

■ ジャガイモ培地 ジャガイモ上によく生育する。

生育と共に汚れた黄白色、灰白色、灰褐色を呈す。

Ｃ．生埋学的性質 ■ 硝酸塩の還元： ■ 脱窒素反応： ■ ＭＲテスト： ■ ｖｐテスト： ■ インドールの生成： ■ 硫化水素の生成：＋（弱い） ■ デンプ／の加水分解： ■ クエン酸の利用：コーザーの培地十 クリステンゼンの培地十 ■ 無機窒素源の利用：硝酸塩十 アンモニウム塩十 ［相］ 色素の生成： キングＡ培地及びキングＢ培地に５すい褐色又はうすい
黄褐色水溶性の色素を生産する。

肉汁寒天、肉汁ゼラチン、ツアベックドックス培地、ポ
テトデキストロース培地では水溶性色素の生成は認めら
れない。

０ ウレアーゼ： ０ オキシダーゼ：＋ ［相］ カタラーゼ：＋ ０ 生育の範囲： ＰＨ５〜９の範囲で生育する。

特にｐＨ６．５ 〜７．５でよ《生育するが、ｐＨ４．
０以下及びｐＨ１０．０以上では生育しない。

生育温度は１５〜３７℃であり、特に２５〜３０℃で最
もよく生育する。

［相］ 好気性及び嫌気性：好気性 ［相］ ＯＦテスト：酸化的でガスの発生はない。

■ 糖の利用： ヒューライフソンの培地を用いて糖の利用を調べた。

いずれの糖でもガスを発生せず、酸の生成は次の通りで
ある。

Ｌ−アラビノース＋ 乳 糖十 Ｄ−キシロース＋ トレハロース＋ Ｄ−グルコース＋ Ｄ−ソルビトール＋Ｄ−マンノ
ース＋ マンニトール十 〇−フラクトース＋ イノシトール＋ Ｄ−ガラクトース＋ グリセリン＋ 麦芽糖＋ 可溶性澱粉一 ショ糖十 Ｄ．その他の性質 ■ リパーゼを菌体外に多量に分泌する。

エステラーゼも分泌する。

■ ３−ケトラクトースの生成： ■ アンモニアの生成：＋（弱い） ■ Ｇ１Ｃ含量：７４．２％ 上記の菌学的性質を有する本菌の分類学上の位置をバー
ジエイのマニュアル・オブ・デイターミナテイブ・バク
テリオロジイ第８版（１９７４年）を参照して検討する
と、本菌はダラム陰性の周毛を有する桿状細菌であるこ
とからコリネバクテリウム属、シュードモナス属ではな
い。

又、３−ケトラクトースを生成せず、アミノ酸、硝酸態
、アンモニア態窒素を利用するのでアグロバクテリウム
属に属さない。

クエン酸を利用するのでリゾビウム属ではない。

更に本菌は好気的に生育し、嫌気的には生育せず、顕著
な色素を生成しないので、フラボバクテリウム、クロモ
バクテリウム属にも属さず、アルカリゲネス属に属する
ものと判定される。

なお本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第３１８７号（ＦＥＲＭ−ＰＡ３１８７）として寄託
されている。

本発明者等は、さらに研究の結果、アルカリゲネス属に
属するリパーゼ生産菌を培養する際、油脂および／また
は非イオン界面活性剤を添加した培地を用いて培養を行
うとリパーゼの生産が一層よくなることを発見した。

本発明はこれらの知見にもとづいて完或されたもので、
本発明はアルカリゲネス属に属するリパーゼ生産菌を培
地に培養し、この培養物からアルカリ側に至適ｐＨをも
ち胆汁酸塩により活性化されるリパーゼを採取すること
を特徴とする新規なリパーゼの製造法であり、また本発
明はアルカリゲネス属に属するリパーゼ生産菌を油脂お
よび／または非イオン界面活性剤を添加した培地に培養
し、この培養物からアルカリ側に至適ｐＨをもち胆汁酸
塩によ゛り活性化されるリパーゼを採取することを特徴
とする新規なリパーゼの製造法である。

本発明における使用菌としては、例えば上記のアルカリ
ゲネス属に属する名糖ＰＬ−２６６号が挙げられるが、
この菌の他にもアルカリゲネス属に属し、この新規なリ
パーゼを生産する菌はすべて本発明において使用するこ
とができる。

本発明方法を実施するにあたっては、アルカリゲネス属
に属するリパーゼ生産菌を培地に培養する。

培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く用い得る。

すなわち炭素源としては、同化可能な炭素化合物であれ
ばよく、例えばブドウ糖、麦芽糖、可溶性澱粉、澱粉、
デキストリン、糖蜜、グリセリン、油脂、小麦ふすま、
，糠などが用いられる。

窒素源としては、同化可能な窒素化合物もしくはこれを
含有するものであればよく、例えば大豆粉、脱脂大豆粉
、綿実粕、ナタネ粕、ペプトン、肉エキス、酵母エキス
、グルーテン、コーンステイープリカー、カザミノ酸、
尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など有機、無機の窒素化
合物またはこれを含有するものが用いられる。

又、無機塩としては、各種リン酸塩、マグネシウム、カ
リウム、ナトリウム、カルシウムなどの塩類が使用され
る。

そしてさらに必要に応じて菌の生育、あるいは酵素生産
に必要な各種の有機物や無機物、例えばシリコン油、消
泡剤、ビタミン類、燐脂質等を培地に添加することがで
きる。

上述の如く、本発明にしたがいアルカリゲネス属に属す
るリパーゼ生産菌を培地に培養して新規なリパーゼを生
産させる場合、培地に油脂および／または非イオン界面
活性剤を添加して培養すると、リパーゼの生産は一層良
くなる。

この培地に添加する油脂としては、例えばオリーブ油、
大豆油、綿実油、ナタネ油などの植物油及び牛脂、豚脂
、魚油などの動物脂が用いられる。

これらの油脂の添加量はその適量を選んで添加されるが
、通常培地に対し約ｏ．ｏｉ〜２％添加するのが好適で
ある。

又、培地に添加する非イオン界面活性剤としては、例え
ばソルビタンアルキルエステル、ポリオキンエチレンソ
ルピタンアルキルエステル、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテ
ル、ポリオキンエチレンアルキルエステル、ポリオキシ
エチレンポリオキシプロピレンポリマー、脂肪酸モノグ
リセライドなどがあげられる。

これらの界面活性剤の添加量はその適当量を選んで培地
に添加されるが、通常培地に対し約０．０１〜２％添加
するのが好適である。

本発明において、培養の形態は液体培養でも固体培養で
もよいが、通常は液体培養が好適であり、工業的には深
部通気攪拌培養を行なうのが有利である。

培養に当っては、本培養に先だって小規模な前培養を行
ない、得られた培養物を本培地に接種して行う方法が望
ましい。

本発明における培養条件は使用する菌株、培地組成等に
より多少異るが、生産の目的物であるリパーゼの生産に
最も有利な条件を適当に選択、調節して行なう。

培養温度は１５〜４０’Ｃの範囲内で適宜変更すること
ができるが、特に好ましいのは２０〜３５℃である。

培養期間は条件によって異るが、１〜４日程度であって
リパーゼが最高蓄積量に達する時期に培養を終了すれば
よい。

培地のｐＨは、培地調整時に弱酸性から弱アルカリ性に
あればよ《、通常の場合特に調節の必要はないが、望ま
しくはｐＨ ６〜１０、特に望ましくはｐＨ７〜１０付
近に調節しておけばリパーゼ生産に好適である。

このようにして得られた培養物からのリパーゼの採取は
、リパーゼを分離、精製する常法に従って実施できる。

すなわち固体培養の場合は公知のように水その他の抽出
剤などで抽出を行って抽出液を得、また液体培養の場合
には例えばＰ過法、遠心分離法などのような公知の適当
な方法により菌体や培地固形物を分離して抽出液、ある
いはｒ液を得ることができる。

これら抽出液あるいはｒ液を濃縮し、または濃縮するこ
となく、このものに可溶性塩類（例えば食塩、硫安、硫
酸ナトリウムなどのような）または親水性有機溶剤（例
えばエタノール、メタノール、アセトンなどのような）
を添加する沈澱法、あるいは安定補助剤（例えばマルト
テキストリン、乳糖、カルボキシメチルセルロース、ホ
リエチレングリコール、スキムミルク、カゼイン、ソル
ビット、食塩などのような）を添加して噴霧乾燥する方
法、あるいは凍結乾燥法、あるいはイオン交換樹脂、リ
ン酸カルシウムゲ″・アノ′ミナ、ベントナイト等によ
る吸着および脱離法、あるいはセファデツクス、セファ
ロース、バイオゲル等を用いる分子ふるい法、あるいは
セルローズ、セファデツクスイオン交換体を用いるクロ
マトグラフイー法、蛋白沈澱剤（例えばタンニン、カル
シウム塩などのような）による沈澱法、等電沈澱法、透
析法、電気泳動法による不純物の分離法などの精製手段
を単独であるいは適宜組合わせて適用することによって
リパーゼカ価を有する任意純度のリパーゼ製品を採取す
ることができる。

本発明で製造されるリパーゼを精製していく途中でセフ
ァロース４Ｂ又はセファデツクスＧ−２００のカラムを
通すと二種類のリパーゼに分けられる事が判明した。

このうち、主体をなスリパーゼをリパーゼ■、少量のリ
パーゼをリパーゼ■とよぶ。

こうして精製されたこの両リパーゼの性質は次の通りで
ある。

■ 作用 リパーゼＩ及び■はいずれも油脂を加水分解し、グリセ
リンと脂肪酸にする酵素であり、デイグリセライド、モ
ノグリセライドを分解中間体として生成する。

■ 基質特異性 油脂及び各種のエステルを基質とした際のリパーゼ■及
び■の活性を、オリーブ油を基質とした際の活性を１０
０％とした相対活性値で示すと、第」表に示す通りであ
る。

第１表より明らかな如く、本リパーゼ■及び■の基質特
異性はよく似ており、天然油脂の如き高級脂肪酸のグリ
セリンエステルのみならず、酪酸メチルやトリアセチン
のような低級脂肪酸のエステルやツウイーン８５のよう
な水溶性エステルにも作用する。

又ｐ−ニトロフエニルアセテートにも作用してこれを分
解スる。

■ 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 リパーゼＩの至適ｐＨは第１図に示す通りでｐＨ８．５
〜９．５付近に最大活性を有し、リバーゼ■の至適ｐＨ
は第２図に示す通りでｐＨ９．５〜１０．５付近に最大
活性を有する。

種々のｐＨの緩衝液中でリハーゼＩ及びリハーゼ■を、
それぞれ５℃、２４時間保持したとき、リパーゼ■の残
存リパーゼ活性は第３図に示す通りであり、またリパー
ゼ■の残存リパーゼ活性は第４図に示す通りであって、
リパーゼＩはｐＨ４．５〜ＩＯの範囲で、リパーゼ■は
ｐＨ５．０〜１０の範囲でほぼ安定である。

■ 作用適温の範囲 リパーゼＩの作用適温は第５図に示す通りであり、リパ
ーゼ■の作用適温は第６図に示す通りであって、リパー
ゼ■は７０〜７５℃付近、リパーゼ■は７０〜８０℃付
近に作用適温がある。

■ ｐＨ、温度などによる失活の条件 リパーゼ■及び■を、それぞれｐｎｓ．ｏの緩衝液に１
０単位／ｍｌの濃度にとかし、５０〜７０℃の温度に保
持し、その活性の経時変化を調べた結果は、リパーゼ■
については第７図に示す通りであり、リパーゼ■につい
ては第８図に示す通りであって、リパーゼＩは５０℃、
３０分の熱処理では９０％の活性が残存するが、７０℃
、３０分の熱処理でほぼ完全に失活し、リハーゼ■は５
０℃、３０分の熱処理で３５％の活性が残存するが、７
０℃、３０分ではほとんど全部失活する。

又、リパーゼ■及びリパーゼ■を、それぞれ※※ ３７℃でｐＨ３．０又はｐＨ １ ２．０に保持すると
、リパーゼ■はｐＨ３．０又はｐＨ １２．０で３０分
でほぼ完全に失活し、リハ− セ［はｐＨ３．０で１０
分、又はｐＨ １２．０で３０分でほぼ完全に失活する
。

■阻害 リパーゼＩ及びリパーゼ■を、それぞれ３７℃で１０分
間、各種の金属塩と接触させた後、リパーゼ活性を測定
して阻害度を調べた。

１０−３モル以下の濃度では殆んど阻害はなかった。

すなわちリパーゼ且がＩＯ−３モルのＣ（１＋十で１０
−真Ｏ％阻害されたが、Ｈｇ＋＋＋＋＋ Ｐｂ＋＋、Ｆｅ ，Ｚｎ＋＋、Ｓｎ ＋＋、ｃｕ＋
＋、Ｎｉ＋＋、Ｍｎ＋＋、ｃｒ＋＋＋などではいずれも
阻害はみられなかった。

又、リハーゼ■はＥＤＴＡ − ４Ｎａ − ２Ｈ２０
により２０〜３０％阻害されるが、ｐ−クロロマーキュ
リーペンゾエイト、フエリシアンカリ、ピロリン酸塩、
ナトリウムアザイド、モノヨード酢酸により阻害されな
い。

又、１０−３モルのＤＢＳ及びＳＬＳにより９０％以上
阻害されるが、１０−４モルの濃度になると殆んど阻害
されない。

■ 活性化 後述のリパーゼ活性測定法において各種胆汁酸成分を加
えてリパーゼ活性を比較すると、第２表に示す通り、リ
パーゼ■及びリパーゼ■は明らかに胆汁酸成分で活性化
された。

■ 力価の測定法 （ａ） 反応液の組成 酵素液 １。

ＯｒｎｌｐＨ８．７、１モルグリシン緩衝液 ２．０
ｄオリーブ油エマルジョン ２．５献蒸留水
０． ５ ｍｌ上記オリ
ーブ油エマルジョンはアラビアガム１０％水溶液１８０
ｒｒＬｌにオリーブ油２０１を加え、５〜１０℃に冷却
しつつ１１０００ｒｐｍで１５分間ホモゲナイズし、ｐ
Ｈ８．７に調節したものである。

（ｂ） 操作 反応液を２５ＴＬｌの共栓試験管に入れ、３７℃にて１
０分間正確に反応させた後、２規定の硫酸ＩＴＬｌを加
えて反応を停止し、ｎ−へブタン：イソプロパノール１
１：４の混合液を１５一加え、３０秒間激しく振盪する
。

３０分以上静置した後、上層を５ＴｆＬｌ採取し、０．
０１規定のエタノール性苛性カリ溶液を用いチモールブ
ルーを指示薬としＮ２ ガ．スを通しながら滴定する。

同じ反応組成で２規定の硫酸溶液を加えた後に酵素液を
加えて上記と同様の処理を行い、得た苛性カリ溶液の滴
定値を差引く。

差引いた残りの滴定値をあらかじめ既知量のパルミチン
酸を加えておいて求めた標準直線から反応液全体で遊離
された脂肪酸量として算出する。

この反応条件で１分間に１マイクロモルの脂肪酸を遊離
させる酵素量を１リパーゼ単位とする。

■ 精製方法 リパーゼＩ及びリパーゼ■の精製方法は塩析、セルロー
スイオン交換クロマトグラフイー、ゲルｐ過などを適宜
組合わせて行われる。

その具体例は実施例６に示す通りである。

［相］ 分子量 ゲルＰ過法により求めた分子量はリパーゼＩでは約１８
００００〜１９００００、リパーゼ■では約３４０００
〜３５０００である。

■ 等電点 結晶構造の解析および元素分析はリパーゼ■及びリパー
ゼ■が結晶化されていないので実施できない。

しかしキャリアーアンホライン（ＬＫＢ社製）を用いた
等電点電気泳動法で等電点を測定すると、リパーゼＩで
は４．１±０．１、リパーゼ■では４．５±０．１であ
る。

＠ リポプロテインリパーゼ活性 リパーゼ■及びリパーゼ■はリパーゼ活性を有すると同
時にリポプロテインリパーゼ活性も有する。

リポプロテインリパーゼ活性の測定は斉木等の方法（
Ａｇｒｉｃ， Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．３ ２巻、１４
５９頁、１９６８年）に従って行なった。

以上のようにリパーゼＩ及びリパーゼ■の性質はその作
用最適ｐＨ （アルカリ側）、胆汁酸塩類による活性化
の点において動物のスイ臓リパーゼによく似ており、こ
のような性質をもったリパーゼがアルカリゲネス属の菌
により生産される事は見出されていない。

このような性質をもった近縁のリパーゼとの比較を第３
表に示した。

この表の中ではクロモバクテリウム・ビスコサム、フコ
マイセス属及ヒムコール・ジャバニクスにより生産され
るリパーゼは胆汁酸による活性化の倍率は似ているが、
作用最適ｐＨが中性付近にあり、本発明により得られる
リパーゼとは異る。

又、シュウドモナス・フラジにより生産されるリパーゼ
は胆汁酸により賦活されない。

シュウドモナス・ステウツエリにより生産されるリパー
ゼは胆汁酸により賦活される倍率が異るし、作用最適ｐ
Ｈの曲線は本リハーゼのもの（第１図）とはかなり異っ
ている。

以上の事から本リパーゼは新規なものと考えられる。

次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に
より制限されるものではない。

実施例 １ 犬豆粉２％、コーンステイープリカ−１％、小麦澱粉１
％、リン酸二カリ０．５％、米ぬ，か０．５％を含む液
体培地のｐＨを７．２に調節し、この５０−スつを５０
０ｒｆＬｌの肩つきフラスコに分注して１２０℃で■５
分間蒸気殺菌を行う。

これに名糖ＰＬ−２６６号（ＦＥＲＭ−Ｐ屋３１８７）
を接種し、３０℃にて４０時間振盪培養した後、培養液
を遠心分離し、その上澄のリパーゼ活性を測定した所、
８５単位／ｒｕｌであった。

この液１００ｍｌに硫安を０．５飽和になるように添加
し、生じた沈澱区分を集めて乾燥すると粗酵素粉末１．
１１が得られ、この粉末のリパーゼ活性は５ ４ ６
０ 単位／ ’ｉｆであった。

実施例 ２ 大豆粉２％、トウモロコシ荒びき粉１％、コ−ンステイ
ープリカ−０．１％、小麦澱粉０．２％、リン酸二力！
７０．２％を含む液体培地を５０ｍｌずつ５００ｒｒＬ
ｌ肩つきフラスコに分注し、１２０℃、１５分間蒸気殺
菌を行う。

これに名糖ＰＬ−２６６号（ ＦＥＲＭ−ＰＡ．３ １
８ ７ ’）を接種し、別に殺菌した苛性ソーダを加
えてｐＨ９．５とし、３０℃にて４０時間振盪培養した
後、培養液にｒ過助剤を加えて戸過する。

この培養Ｐ過液のリパーセ活性は９８単位／ｍｌであっ
た。

このｒ過液５００ｒｒＬｌに冷アセトンを８０％になる
迄徐々に加える。

生じた沈澱を集め、冷アセトンで洗浄後、乾燥して粗酵
素粉末６．４′？を得た。

この粉末のリパーゼ活性は６１００単位／１であった。

実施例 ３ 実施例２に記載の培地にオリーブ油０．４％を添加する
以外は実施例２に記載したと同様に実施すると、リパー
ゼ活性が１８０単位／ｗＬｌの培養Ｐ過液が得られた。

この培養Ｐ過液にアセトンを８０％になる様に添加して
得られた粗酵素粉末のリパーゼ活性は１０２００単位／
クであった。

実施例 ４ 実施例２に記載の培地にポリオキンエチレンソルビタン
トオレイト０．５％を添加する以外は実施例２に記載し
たと同様に実施すると、リパーゼ活性が１６０単位／ｒ
ｕｌの培養Ｐ過液が得られた。

このＦ過液の８０％メタノール沈澱粉末のリパーゼ活性
は４０００単位／♂であった。

実施例 ５ 実施例２に記載の培地１５ｌに大豆油０．４％とホリオ
キンエチレンステアリルエーテル０．２５％を添加し、
３０ｌ容ジャーファーメンターに入れ、消泡剤としてシ
リコン油を５２加えて蒸気殺菌した。

これに名糖ＰＬ−２６６号（ＦＥＲＭ−ＰＡ３１８７）
を接種し、別に殺菌した苛性ソーダ溶液を加えてｐＨ９
．４とした。

３０℃にて２９時間通気攪拌して培養を行った。

この培養液を戸過すると３２０単位／ｒｎｌのＦ過液が
得られ、この液の２８０ｒｒＬμでの吸光度は１２７で
あった。

この沢過液に硫安を４０％飽和になるように添加し、５
℃にて２４時間放置した後、Ｐ過助剤２ｋｇを加えて遠
心分離し、硫安添加によって生じた沈澱をＰ過助剤と共
に集め粗酵素とＰ過助剤の混合物６．５ゆを湿った状態
で得た。

この混合物をよく均質化した後、リハーゼ活性を求める
と３９０単位／ｙであった。

実施例 ６ 実施例５で得られたＰ過助剤と粗酵素の混合物ｌｋｇを
セロファンチューブに入れ、流水中で２日間透析後、更
に０．０ １Ｍ，ｐＨ ８．６のトリス緩衝液を外液と
し５℃にて２４時間透析した後、ｒ過Ｌて３．６Ｊの酵
素液を得た。

この酵素液のリパーゼ活性は９３単位／ｍｌであり、２
８０７７１μの吸光度は４．６４であった。

つぎに０．Ｏ ＬＭ，．ｐＨ ８．６のトリス緩衝液で
充分に平衡化したＤＥＡＥセルロースイオン交換体にこ
の酵素溶液を吸着させ、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液に
溶解した０．５ＭのＮａＣｌ溶液でリパーゼ活性を溶出
させた。

これを透析、濃縮後、上記緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ
セルロースイオン交換体力ラムに通して吸着させ、同緩
衝液で洗浄した後、同緩衝液と０．５モルのＮａＣ］を
溶解した同緩衝液とで濃度勾配を作り、徐々にＮａＣ］
濃度を上げながらリパーゼ活性を溶出させた。

ＮａＣｌ濃度０．１〜０．３モルの範囲でリパーゼ活性
は溶出されるから、活性を測定して活性区分を集めた。

この区分を濃縮した後、セファロース４Ｂを用いてカラ
ムクロマトグラフイーを行うと、リパーゼＩとリパーゼ
■に分げられた。

各活性区分を集め、セファデックスＧ−２００，Ｇ−１
００の順に通してゲルＰ過を行い活性区分を集めた。

このようにして精製したリパーゼＩは３００単位／一で
あり、２８０ｍμの吸光度は０．５５であった。

またリパーゼ■は６０単位／ｒＩＬｌで、２８０ｍμの
吸光度は０．１２であった。

ローリーの方法（ Ｒｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ ．
Ｊ． Ｂｉｏｌ ， Ｃｈｅｍ．１９３ ２６５
１９５１）でアルブミンを標準物質として蛋白量を測定
して重量当りの活性を調べると、リパーゼＩが３０００
単位／■、リバーゼ■が２７４０単位／■であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により製造されるリパーゼ■のｐＨと活
性の変化を示す図であり、第２図は本発明により製造さ
れるリパーゼ■のｐＨと活性の変化を示す図であり、第
３図はリパーゼＩのｐＨ安定曲線であり、第４図はリパ
ーゼ■のｐＨ安定曲線であり、第５図はリパーゼ■の温
度と活性の変化を示す図であり、第６図はリパーゼ■の
温度と活性の変化を示す図であり、第７図はリパーゼ■
の熱耐性曲線であり、第８図はリパーゼ■の熱耐性曲線
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アルカリゲネス属に属するリパーゼ生産菌を培地に
   培養し、この培養物からアルカリ側に至適ｐＨをもち胆
   汁酸塩により活性化されるリパーゼを採取することを特
   徴とする新規なリパーゼの製造法。 ２ アルカリゲネス属に属するリパーゼ生産菌を油脂お
   よび／または非イオン界面活性剤を添加した培地に培養
   し、この培養物からアルカリ側に至適ｐＨをもち胆汁酸
   塩により活性化されるリパーゼを採取することを特徴と
   する新規なリパーゼの製造法。