CH643299A5 - Procede de preparation de d-alpha-amino-acides. - Google Patents
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Description
La présente invention concerne un procédé de préparation de D-a-amino-acides par voie enzymatique.
Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé qui consiste à hydrolyser des hydantoïnes substituées en position — 5 directement en D-a-amino-acides.
De préférence, les D-a-amino-acides obtenus selon le procédé de la présente invention sont la D-phénylalanine, la D-méthionine, la D-phénylglycine ou la D-p-hydroxyphényl-glycine qui sont particulièrement utiles comme médicaments ou comme intermédiaires dans la préparation de produits utilisables eux-mêmes dans les domaines pharmaceutique ou agricole, mais de nombreux D-aminoacides, tel que la D-leu-cine, la D-valine, le D-tryptophane peuvent être obtenus par la mise en œuvre du procédé.
Selon le procédé de la présente invention, un D-a-amino-acide est préparé en mettant en contact une hydantoïne convenablement substituée en position — 5 avec une enzyme capable de transformer cette hydantoïne en D-a-amino-acide correspondant.
L'enzyme utilisée dans le procédé selon la présente invention est obtenue par culture d'un micro-organisme, identifié plus complètement ci-après, dans un milieu convenable.
Le micro-organisme dont la culture dans des conditions appropriées fournit l'enzyme utilisée pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention, doit être considéré comme une espèce nouvelle qui appartient au genre Pseudomonas.
Il a été isolé à partir d'un échantillon de boue prélevée à Commentry (France) selon les méthodes habituelles d'isolement des microorganismes. Un échantillon de cette souche a été déposé au Centraalbureau voor Schimmelcultures à Baarn
(Pays-Bas) où il a été enregistré le 11 mai 1979 sous le numéro CBS 259.79. Ce laboratoire est autorisé à distribuer la souche du microorganisme à toute personne ayant licitement connaissance du présent document.
s Le micro-organisme HM-40 est un Pseudomonas dont certains caractères ne correspondent pas à ceux des espèces décrites dans «Bergey's Manual of Determinative Bacterio-logy, 8ème édition». Il est désigné sous le nom Pseudomonas sp. HM-40.
io Les caractères culturaux et morphologiques de Pseudomonas sp. HM-40 sont les suivants:
1) Aspect des cultures sur différents milieux a) Milieu «Trypticase soy agar» à 30 °C
- Après 24 heures d'incubation: très petites colonies i5 - Après 48 heures d'incubation: colonies plus grosses ( 1 à 1,5 mm de diamètres environ) à bords nets et semi-transparentes
-Après 4 jours d'incubation: colonies plus grosses (4 mm de diamètres environ) opaques, mucoïdes.
20 b) Bouillon nutritif à 30 °C
Dans des tubes à essais (16 x 160 mm) contenant 5 cm3 de milieu, le développement est apparent en 24 heures mais il est peu abondant. Le développement augmente les jours suivants. Formation d'un trouble uniforme avec sédiment assez 25 adhérent au fond des tubes. Le gaz carbonique (10%) n'augmente pas le développement.
c) Milieux solides divers
Sur gélose nutritive et sur «Brain Heart Infusion Agar» le développement et l'aspect des cultures sont identiques à ceux 30 qui ont été décrits pour le milieu «Trypticase soy agar».
d) Milieux liquides divers
Sur «Brain Heart Infusion Agar», eau peptonée, eau tryptonée, bouillon nutritif avec extrait de levure, le développement et l'aspect des cultures sont identiques à ceux qui ont 35 été décrits pour le bouillon nutritif. Sur «Trypticase Soy Broth» et sur eau peptonée glucosée à 0,2%, le développement est un peu plus faible.
2) Morphologie a) Examen microscopique sans coloration:
40 Après 24 heures de culture en milieu liquide à 37 °C: bacilles de 0,5 à 5 (i de long, en navettes.
Le germe est mobile et la mobilité est plus marquée lorsque l'incubation est effectuée de 24 à 30 °C.
b) Examen microscopique après coloration:
45 Le germe est gram négatif; fréquemment la partie centrale du corps bactérien est plus faiblement colorée.
3) Température optimale de développement:
24 °C: bon développement so 30 °C: très bon développement 37 °C: développement médiocre 42 °C: développement faible
4) Caractères culturaux et biochimiques:
a) Type respiratoire: aérobie strict
55 b) Oxydase: positive c) Catalase: positive d) «Mac Conkey Agar»: culture abondante e) «Salmonella Shigella Agar»: culture peu abondante f) «Cetrimide Agar»: pas de développement 60 g) Uréase (en milieu de Ferguson): positive h) Production d'indole: négative i) Test au rouge de méthyle: négatif j) Test de Voges-Proskauer: négatif k) Utilisation des citrates (Simmons): positive en 48 heu-65 res; alcalinisation
1) Liquéfaction de la gélatine: négative m) Test oxydation-fermentation (Hugh et Leifson): oxydant
3
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n) Formation d'acides à partir des hydrates de carbone: .
- glucose: positive
- lactose: positive
- arabinose: positive -maltose: positive
- mannite: positive
- saccharose: positive
- xylose: positive o) Réduction des nitrates: positive p) Réduction des nitrites: négative q) Dénitrification: négative r) Formation de pigment: négative s) Formation de H2S:
- sur milieu «Triple Sugar Iron Agar»: très légèrement positive
- papier au sous-acétate de plomb: traces de H2S t) Hémolyse (sang de cheval): négative u) Lait tournesolé: pas de modification v) ß-galactosidase: positive w) Arginine dihydrolase: négative x) Lysine décarboxylase: négative y) Ornithine décarboxylase: négative Lorsque l'on cultive la souche Pseudomonas sp. HM-40 dans des milieux de cultures classiques, l'enzyme, qui peut transformer les hydantoïnes en D-a-amino-acides correspondants, se forme essentiellement dans les cellules du micro-organisme et plus faiblement dans le milieu de culture.
Le milieu de culture doit contenir essentiellement des sources de carbone et d'azote assimilables et d'autres éléments nutritifs nécessaires au développement de la souche HM-40, tels que des sels minéraux. La production d'enzyme peut être améliorée si on ajoute au milieu de culture une hydantoïne substituée en position — 5 comme source d'azote. Généralement on utilise à cet effet l'hydantoïne de la méthionine mais d'autres hydantoïnes telles que l'hydantoïne de la valine, l'hydantoïne de la leucine, l'hydantoïne de l'isoleucine ou la cyanopropyl-5 hydantoïne peuvent être avantageusement utilisées.
Comme sources de carbone assimilable on peut utiliser des hydrates de carbone tels que le glucose, le saccharose, le lactose ou le maltose sous forme pure ou apportés sous forme de résidus complexes tels que les mélasses et le lacotserum; on peut également utiliser des alcools ou des acides organiques. Certaines huiles animales ou végétales comme l'huile de lard ou l'huile de soja peuvent remplacer ces différentes sources carbonées ou leur être adjointes.
Les sources convenables d'azote assimilable sont extrêmement variées. Elles peuvent être des substances chimiques très simples comme les sels minéraux ou organiques d'ammonium ou l'urée. Elles peuvent être aussi apportées par des substances complexes contenant principalement l'azote sous forme protidique.
Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peuvent avoir un effet tampon ou neutralisant comme les phosphates alcalins ou alcalino-terreux ou les carbonates de calcium ou de magnésium. D'autres apportent l'équilibre ionique nécessaire au développement de la souche HM-40, comme les chlorures et sulfates de métaux alcalins et alcalino-terreux ou les sels de zinc, de cobalt, de fer, de cuivre, de manganèse.
Le pH du milieu de fermentation au départ de la culture doit être compris entre 4 et 9 et de préférence entre 6 et 8. La température optimale pour la fermentation est comprise entre 25 et 35 "C mais une production satisfaisante est encore obtenue pour des températures comprises entre 20 et 37 °C.
L'aération de la fermentation peut varier entre des valeurs assez larges. On a cependant.trouvé que des aérations de 0,3 à 3 litres d'air par litre de bouillon et par minute conviennent particulièrement bien. Le rendement maximal est obtenu après 10 à 72 heures de culture, ce temps dépendant essentiellement du milieu utilisé.
L'enzyme étant produite principalement dans les cellules, la transformation de l'hydantoïnase substituée en position 5 - 5 en D-a-amino-acide pourra être effectuée en utilisant le milieu de culture contenant les cellules ou les cellules isolées de ce bouillon par centrifugation; ces cellules peuvent être utilisées telles quelles, après précipitation par l'acétone ou lyophilisation; on peut également les utiliser sous forme d'extrait io cellulaire obtenu par broyage ou traitement aux ultra-sons.
La transformation de l'hydantoïne substituée en position - 5 en D-a-amino-acide correspondant est généralement effectuée en milieu aqueux à un pH compris entre 6 et 9 et de préférence voisin de 7,8. Le pH est éventuellement maintenu i5 au voisinage de cette valeur par addition d'une solution aqueuse alcaline, notamment de soude.
La température de la réaction de transformation est généralement comprise entre 20 et 55 °C et de préférence voisine de 37 °C.
20 La concentration en hydantoïne dans le milieu réactionnel est fonction de la solubilité. Elle est généralement voisine de 5% (p/v) mais elle peut être supérieure à 10% (p/v).
Le milieu réactionnel peut contenir des agents tensio-ac-tifs, des anti-oxydants, des coenzymes qui peuvent favoriser la 25 formation du D-a-amino-acide et permettre ainsi une amélioration du rendement.
Généralement la durée de la réaction est comprise entre 2 heures et 4 jours. La réaction est, en fait, poursuivie jusqu'à ce qu'il n'y ait plus d'hydantoïne transformée en D-a-ami-30 noacide.
Lors de la transformation de l'hydantoïne en D-a-amino-acide, il peut se former intermédiairement un acide D-hydan-toïque qui, sous l'action du système enzymatique, est transformé en D-a-amino-acide. Le procédé selon l'invention peut 35 donc être mis en œuvre soit sur une hydantoïne, soit sur un acide hydantoïque, soit sur leur mélange.
Par ailleurs, la souche HM-40 favorise la racémisation in situ de la L-hydantoïne qui se forme à côté du D-a-amino-aci-de dé siré. De ce fait, l'hydantoïne racémique mise en œuvre 40 peut être transformée dans sa totalité en D-a-amino-acide.
Le D-a-amino-acide obtenu selon le procédé de la présente invention peut être isolé du milieu réactionnel selon les méthodes habituelles de séparation des amino-acides, généralement après clarification du milieu réactionnel par centrifu-45 gation et filtration sur une résine échangeuse d'ions. Généralement on effectue une précipitation de l'amino-acide à son point isoélectrique.
Les exemples suivants, donnés à titre non limitatif, mon-50 trent comment l'invention peut être mise en pratique.
Exemple 1
a) Préparation de la composition enzymatique
On prépare un milieu de culture ayant la composition 55 suivante:
- glucose: 20 g/1
- phosphate monopotassique: 3 g/1
- phosphate dipotassique: 7 g/1
- sulfate de magnésium: 0,7 g/1 60 - sulfate de manganèse: 0,02 g/1
- sulfate ferreux: 0,02 g/1
- chlorure de sodium: 1 g/1
- hydantoïne de la D,L-méthionine: 3 g/1
Le milieu est réparti en fioles de 250 cm3 à raison de
65 50 cm3 par fiole et stérilisé pendant 15 minutes à 120 °C.
Après ensemencement par la souche Pseudomonas sp, HM-40 entretenue sur milieu sélectif gélosé, les fioles sont agitées (250 tours/minute) pendant 48 heures à 30 °C.
643 299
On effectue la culture productrice dans un fermenteur de 2 litres contenant 1 litre du milieu de culture précédent et 1 cm3 d'agent anti-mousse. On ensemence avec le contenu d'une fiole préparé comme indiqué ci-dessus. La culture est développée, à 30 °C, pendant 48 heures en agitant avec une turbine tournant à 500 tours/minute et en aérant avec de l'air stérile au débit de 1 litre/minute.
A la fin de la culture, les corps cellulaires sont séparés par centrifugation et mis en suspension dans 50 cm3 d'eau distillée. Cette suspension contient 7,6 g d'extrait sec pour 100 cm3.
b) Hydrolyse de l'hydantoïne de la D,L-phénylalanine
A 200 cm3 d'eau distillée on ajoute 5 g d'hydantoïne de la D,L-phénylalanine. Après chauffage pour dissoudre partiellement l'hydantoïne, le milieu est refroidi à 37 °C. On ajuste le pH à 7,8 par addition d'une solution normale de soude. On ajoute alors 25 cm3 de la suspension de cellules obtenue précédemment. Le volume du mélange réactionnel est ajusté à 250 cm3 et le pH à 7,8.
Le mélange réactionnel est placé sous atmosphère d'azote; sa température est de 37 °C. Le pH est maintenu à 7,8 par addition progressive d'une solution normale de soude.
Après 24 heures d'agitation modérée, la totalité de l'hydantoïne est solubilisée.
Le mélange réactionnel est clarifié par centrifugation puis passé à travers une résine échangeuse d'ions (résine Dowex 50 forme H+) en éluant avec une solution d'ammoniaque 2N. Les fractions alcalines sont concentrées à sec. On obtient ainsi 3,98 g de D-phénylalanine (rendement 92,5%) dont les caractéristiques sont les suivantes:
20
[a] ^ = 29,2° ± 2° (c = 1, eau)
N % = 8,63 (théorie 8,48)
Titre potentiométrique : 93,3%.
La pureté optique de la D-phénylalanine obtenue est supérieure à 93%.
Exemple 2
A150 cm3 d'eau distillée, on ajoute 4 g d'hydantoïne de D,L-méthionine et 8 cm3 d'une suspension cellulaire contenant 0,6 g d'extrait sec (préparée dans les conditions décrites dans l'exemple 1).
Le pH est ajusté à 7,8 par addition d'une solution normale de soude. Le volume du mélange réactionnel est ajusté à 200 cm3 par addition d'eau distillée. La réaction est poursuivie pendant 24 heures à 37 °C en maintenant le pH à 7,8 par addition progressive d'une solution normale de soude.
La D-méthionine est dosée dans le mélange réactionnel selon la méthode de Stein et Moore: sa concentration est de 17 g/litre, ce qui correspond à un taux de transformation de 100% par rapport à l'hydantoïne de la D,L-méthionine mise en œuvre.
Le mélange réactionnel est clarifié par centrifugation puis passé à travers une résine échangeuse d'ions (résine Dowex 50, forme H+). On obtient ainsi 2,7 g de D-méthionine (rendement de 80% par rapport àia D-méthionine dosée) dont les caractéristiques sont les suivantes:
20
[a] ^ = -19,3° (c = 1; acide chlorhydrique 5 N)
N % = 9,36 - 9,42 (théorie: 9,39)
La pureté de la D-méthionine obtenue est voisine de 90%.
Exemple 3
a) préparation de la composition enzymatique
On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante:
5 - Glucose 20 g/1
- Extrait de levure (DIFCO) 10 g/1
- Bacto peptone (DIFCO) 10 g/1
Le milieu est réparti en fiole de 250 cm3 à raison de 50 cm3
par fiole et stérélisé pendant 15 minutes à 120 °C. Après ense-10mencement par la souche Pseudomonas sp., HM-40, les fioles sont agitées (250 tours/minute) pendant 24 heures à 30 °C.
Le contenu d'une fiole est utilisé pour ensemencer un fer-menteur de deux litres contenant 1 litre du milieu précédent. La culture est développée pendant 24 heures à 30 °C en agi-15 tant avec une turbine tournant à 500 tours/minute et en aérant avec de l'air stérile au débit de 1 litre/minute.
A la fin de la culture, les corps microbiens sont séparés par centrifugation et mis en suspension dans 100 cm3 d'eau distillée; cette suspension contient 8,9 g d'extrait cellulaire sec. 2ob) Hydrolyse enzymatique d'hydantoïne de méthionine
On dissout 5 g d'hydantoïne de DL-méthionine dans 200 cm3 d'eau distillée. On ajuste le pH à 7,5 par addition d'une solution décinormale de soude puis on ajoute 20 cm3 de la suspension cellulaire obtenue précédemment. Le volume est 25 ajusté à 250 cm3; le mélange réactionnel est placé sous atmosphère d'azote, sa température est de 37 °C.
Après 5 heures de réaction, on dose la méthionine présente dans le milieu par Chromatographie selon la méthode de Stein et Moor. L'activité hydantoïnasique de la suspension aocellulaire (nombre de jimoles de méthionine produite par mg d'extrait sec cellulaire et par heure de réaction enzymatique) est calculée; elle est de 4,5.
Après 22 heures de réaction, le mélange réactionnel est clarifié par centrifugation. La méthionine formée est isolée 35 par passage à travers une résine échangeuse d'ions (DOWEX 50, forme H+) en éluant avec une solution d'ammoniaque 2 N.
Après évaporation à sec de l'éluat et séchage, on obtient 3,9 g de D-méthionine (rendement: 91%) ayant les caractéris-40 tiques suivantes:
- N % = 9,4 (théorie : 9,39)
20
- [a] = — 23° (C = 1; acide cdhlorhydrique 5 N)
45 U
- Titre potentiométrique : 98%
Exemple 4
Hydrolyse enzymatique d'hydantoïne depara-hydroxy-phènyl-50 glycine
On prépare 100 cm3 d'une suspension contenant 8,9 g d'extrait cellulaire sec en opérant dans les conditions décrites à l'exemple 3 a).
On dissout 5 g d'hydantoïne de p-hydroxyphénylglycine 55 dans 250 cm3 d'eau distillée. On ajuste le pH à 7,5 par addition d'une solution décinormale de soude et on ajoute 20 cm3 de la suspension cellulaire. Le volume est ajusté à 250 cm3; le mélange réactionnel est placé sous atmosphère d'azote; sa température est de 37 °C.
60 Après 5 heures de réaction, on dose la p-hydroxy-phényl-glycine. L'activité hydantoïnasique est de 1,8 ^iM d'acide aminé formé par mg d'extrait sec cellulaire par heure de réaction.
Après 22 heures de réaction, la p-hydroxyphénylglycine es est isolée par passage à travers une résine échangeuse d'ions (DOWEX 50, forme H+). On obtient ainsi 3,78 g de D-p-hydroxyphénylglycine (rendement 87%), homogène en Chromatographie, ayant les caractéristiques suivantes:
- N % = 7,6 (théorie : 8,4)
20
- [a] ^ = —135° (C= 1; acide chlorhydrique 5 N)
- Titre potentiométrique : 110%
Exemple 5
On cultive la souche de Pseudomonas sp., Hm.40 dans les conditions suivantes:
- Composition du milieu de culture
- Glucose 20 g/1
- Phosphate dipotassique 7 g/1
- Phosphate monopotassique 3 g/1
- Sulfate de magnésium 0,7 g/1
- Sulfate de manganèse 0,02 g/1
- Sulfate ferreux 0,02 g/1
- Chlorure de sodium 1 g/1
- Hydantoïne de DL-méthionine 3 g/1
- Extrait de levure 2 g/1
Précultures
Une première préculture est faite en fiole de 250 cm3 contenant 50 cm3 de milieu, pendant 24 heures. Une seconde préculture, ensemencée par la fiole précédente est effectuée pendant également 24 heures dans un fermenteur de 2 litres contenant 1 litre de milieu de culture.
Culture productrice
Le contenu du fermenteur de 2 litres est utilisé pour ensemencer un fermenteur de 7,5 litres contenant 5 litres de milieu. La culture est développée pendant 24 heures à 37 °C en aérant avec de l'air stérile au débit de 5 litres par minute et en agitant avec une turbine tournant à 500 tours/minute.
La biomasse obtenue dans ces conditions est de 3,8 g d'extrait sec par litre de milieu de culture.
Réaction enzymatique
En fin de culture, les corps microbiens sont isolés du milieu par centrifugation et mis en suspension dans 250 cm3 d'eau distillée.
On met 10 g d'hydantoïne de DL-phénylglycineen suspension dans 400 cm3 d'eau distillée et on ajuste le pH à 7,5 par addition d'une solution décinormale de soude. On ajoute
5 643 299
50 cm3 de la suspension cellulaire précédemment décrite et le volume réactionnel est complété à 500 cm3 par addition d'eau. On laisse alors sous atmosphère d'azote à 37 °C, en maintenant le pH à 7,5 pendant 17 heures.
Après 17 heures de réaction, le mélange réactionnel est clarifié par centrifugation, concentré par évaporation au '/sème de son volume et acidifié à pH 1 par addition d'acide chlorhydrique concentré.
Le précipité formé est séparé par filtration et séché. L'ana-1Qlyse chromatographique montre qu'il s'agit d'acide hydantoï-que de phénylglycine dont les caractéristiques sont les suivantes:
- N% = 13,9% (théorie: 14,4%)
15 20
-[a]^ = -137° (c = 1; ammoniaque 1%)
- Rendement en acide D-hydantoïque obtenu: 6,3% par rapport! l'hydantoïne mise en œuvre.
Les eaux-mères sont à nouveau concentrées puis amenées à pH 5 par addition de soude; le précipité de D-phénylglycine est séparé par filtration lavé par de l'eau et par l'alcool éthyli-que, puis séché. On obtient ainsi 7,6 g de D-phénylglycine (rendement: 88%) ayant les caractéristiques suivantes:
- N% = 9,2(théorie:9,3)
20
- [a] ^ = —148° (C = 1; acide chlorhydrique 5 N) Exemple 6
La culture de Pseudomonas HM. 40 est effectuée dans les conditions de l'exemple 5. Après centrifugation, les corps microbiens sont mis en suspension dans le tampon phosphate 35 0,1 M, à pH 7,8; cette suspension«st utilisée comme catalyseur d'hydrolyse de diverses hydantoïnes; les conditions de réaction sont les suivantes:
- la concentration initiale en hydantoïne est de 20 g/1 dans le tampon phosphate 0,1 M, à pH 7,8.
40 - la biomasse mise en œuvre est de 6,5 g (comptée en extrait sec), par litre de mélange réactionnel.
- la température de réaction est de 37 °C.
- la durée de la réaction est de 5 heures.
L'acide aminé formé est alors dosé dans le mélange réac-45 tionnel, et on en déduit l'activité enzymatique de l'extrait cellulaire.
Les activités ainsi mesurées sont exprimées dans le tableau suivant en |xM d'acide aminé formé par mg d'extrait enzymatique sec et par heure de réaction so Les résultats sont rassemblés dans le tableau suivant:
30
643 299
NATURE Dû SUBSTRAT
FORMULE
ACTIVITE TiM/mg/h
Hydantoïne de DL-méthionine
CO NH
CH -S-CE -CH,-CH |
* " NH CO
2,^
Hydantoïne de DL-phénylalanine
/ \ / CO NH
fi VcH -CE 1 \=J NH — CO
2,0
Hydantoïne de >. DL-leucine
CH
3\ /CO—NH XH-CH--CH f CH^ NH — CO
1,6
Hydantoïne de DL-valine
/CO—NS CH,-CH«-CH--CH [ ^ * ~~~NE—CO
1,0
Hydantoïne de DL-tryptophane
[
^CQ NH j ï
'"•T? t J
frO n"uh2"oa^ ' [0,7
v JL 3 KE —co ■
NH j '
Hydantoïne de DL-phény1gly c ine
/—V . CO — NH
(O)-CH^ t
\ / NH — CO
i
0,6
Hydantoïne de
DL-para-hydroxy-
pbénylglycine
CO—NH
ho -/oYchC 1
N f 7JH — CO
•
0,6
Cyanopropyl-Hydantoïne racèmique
CO — NH / »
CN-CH_-CH_-CH_—CH 1 2 2 2 \ t
NE CO
3,5
Hydantoïne de
DL-méta-hydroxy-
phénylglycine
• °*ì^ CO — NH
<ÖV°< !
\ / NH— CO
0*7
i
1
7
643 299
Exemple 7
Une suspension cellulaire de Pseudomonas HM. 40 dans le tampon phosphate a été obtenue comme il est décrit dans l'exemple 6. Cette suspension contient 6,5 g d'extrait sec dans 100 cm3; avant utilisation, les cellules sont broyées par ultrasons dans le conditions suivantes:
- appareil: PONS équipé d'une sonde TC4C
- fréquence des ultra-sons: 20 kHz
- volume traité: 15 cm3
- température maintenue au voisinage de 0 °C
- durée du broyage: 10 minutes
La suspension ainsi traitée est utilisée pour catalyser l'hydrolyse des hydantoïnes de méthionine, phénylalanine et phénylglycine dans les conditions expérimentales décrites dans l'exemple 6. Les activités mesurées sont alors les suivantes:
SUBSTRAT ACTIVITE
(|iM d'acide aminé
Exemple 8
Une suspension cellulaire de Pseudomonas sp., HM. 40 dans l'eau obtenue comme décrit dans l'exemple 5 et contenant 7,3 g d'extrait sec dans 100 cm3 a été lyophilisée avant 5 utilisation dans les conditions suivantes:
120 cm3 de suspension sont répartis dans 4 ballons de 500 en3, coNgelés et mis sous pression réduite (0,5 10-2 mm io de mercure) pendant 16 heures. On obtient 8,8 g de poudre enzymatique lyophilisée qui est utilisée dans le conditions décrites à l'exemple 6.
i: Les activités mesurées sont les suivantes:
SUBSTRAT ACTIVITE
UM d'acide aminé formé/heure/mg d'extrait sec formé/heure/mg 2(
d'extrait enzymatique
Hydantoïne de DL-Méthionine 1,7 Hydantoïne de DL-Phénylalanine 1,0 Hydantoïne de DL-Phénylglycine 0,8
Hydantoïne de DL-Méthionine 2,4 Hydantoïne de DL-Phénylglycine 0,4 Hydantoïne de DL-Phénylalanine 1,5
C
Claims (11)
1. Procédé de préparation de D-a-amino-acides caractérisé en ce que l'on hydrolyse une hydantoïne substituée en po-sition-5 en présence d'une enzyme obtenue par culture d'un microorganisme désigné par l'appellation Pseudomonas sp, HM-40 (CBS 259.79) puis isole le D-a-amino-acide obtenu.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'enzyme est obtenue par culture du microorganisme Pseudomonas sp, HM-40 dans un milieu contenant au moins une source de carbone et une source d'azote assimilables.
2
REVENDICATIONS
3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le milieu contient en outre une hydantoïne racémique.
4. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'hydantoïne substituée en — 5 est mise en contact avec l'enzyme dans le milieu de culture du microorganisme.
5. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'hydantoïne substituée en — 5 est mise en contact avec une composition enzymatique.
6. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la L-hydantoïne restant dans le milieu est racémisée en D,L-hydantoïne sous l'action du microorganisme Pseudomonas sp, HM-40.
7. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'enzyme hydrolyse également l'acide hydantoïque qui se forme intermédiairement au cours de l'hydrolyse de l'hydantoïne substituée en position — 5 en D-a-amino-acide correspondant.
8. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'amino-acide obtenu est la D-phénylalanine.
9. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'amino-acide obtenu est la D-méthionine.
10. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'amino-acide obtenu est la D-phénylglycine.
11. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'amino-acide obtenu est la D-p.hydroxyphénylglycine.
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