JPS5828291A - Ｎ，ｎ′−ビスカルバモイル−ｄ−シスチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物の菌体内酵素を利用して、シスチン・
ビスヒダントインを生化学的に加水分解することによシ
、Ｎ、　Ｎ’ビスカルバモイル−Ｄ−シスチンを製造す
る方法に関し、半合成ペニシリン、半合成セファロスポ
リン、或いはルシフニリン類などの合成中間体として有
用なり−システインの前駆物質を工業的に有利に製造す
ることを目的とする。

本発明者らは、先に５−フェニルヒダントインまたはそ
の置換誘導体を製造する方法を特願昭５１−１１５７５
号（特公昭５５−４５１９５）、特願昭５１−１４５７
４８号および特願昭５２−４８７１７号（特公昭５６−
１９１０）として出願し、天然アミノ酸類またはそれら
の置換誘導体に対応する５−置換ヒダントイン類から同
様にしてＮ−カルバモイル−Ｄ−α−アミノ酸類を製造
する方法を特願昭５１−１５７７１３号（特公昭５６−
１９０９）として出願した。本発明は前記技術の発展の
ひとつとして、１分子中に２個のヒダントイン環を有す
るシスチン・ビスヒダントインへの適用を確認したもの
である。

本発明の方法は次式で表わされる。

上記のように、本発明はシスチン・ビスヒダントインに
ヒダントイン環を立体特異的に加水分解シてＮ、　Ｎ’
−ビスカルバモイル−Ｄ−シスチンを生成させる能力を
有する微生物の培養物、菌体または菌体処理物を水性媒
体中で作用させることを特徴とするＮ、　Ｎ’−ビスカ
ルバモイル−Ｄ−シスチンの製造法である。

本発明で使用する微生物酵素は、シスチン・ビスヒダン
トインのそれぞれのヒダントイン環のＤ体のみを選択的
に加水分解しカルバモイル体に変換する。生成したカル
バモイル体は、本機生物変換条件下ではラセミ化するこ
とはないが、一方基質であるシスチン・ビスヒダントイ
ンのそれぞれのヒダントイン環はｐＨ７〜９の水性媒体
中でラセミ化する性質を有している。その為、反応によ
ってＤ体のヒダントイン環が有費されてもＬ体のラセミ
化によシ、反応系には常にＤ一体が補給される。つまシ
反応系においては、酵素的加水分解と基質のラセミ化が
並行的に進行する。従って反応の原料としてはＤＬ、一
体、　Ｔ、一体またはＤ一体のシスチンｅビヌヒダント
インのいずれを用いても実質的には同じであシ、生成物
としては２個のヒダントイン環ともＤ体のカルバモイル
体に変換したＮ、　Ｎ’−ビスカルバモイル−Ｄ−シス
チンを得るこトカできる。

シスチン及びシスティンの化学的合成においては、メル
カプト基の高い反応性と不安定性の為、工程が複雑とな
シ工業的に有効な方法は少なく、従ってこれらを光学分
割してＬ″！たはＤ−シスチン或いはシスティンを得る
実用的な方法はみあたらない。従来、Ｄ−システィンを
製造する方法としては、アミラーゼの作用を用いる方法
があるが、例えば入手の容易なＬ−シスチンをジアセチ
ル誘導体とした後、無水酢酸でラセミ化させ、これにア
ミラーゼを作用させて酵素作用を受けないビスアセチル
−Ｄ−シスチンを分離し、これを酸加水分解後、還元す
る方法（ジャーナル・オブ・アメリカン−ケミカル・ソ
サエティー７９巻、４５！１８〜４５４５頁）が知られ
ているが、理論的にも不斉中心を２個有するシスチンの
ような化合物においては、ラセミ化合物中Ｄ−シヌチン
は２５％しか存在せず、収率が低く実用的ではない。ま
た最近メルカプトメチルヒダントインの微生物分解によ
ル、Ｄ−システイン及びＤ−シスチンが生成蓄積すると
の報告があるが（特開昭５４．−　’２．’５．９８、
同５４−５２７９１、同５４−８９．０８８、同５５−
１１５６９、同５５−１０４８９０、同５５−１１４２
９１　など、）、メルカプト基の高い反応性々どの為、
基質の分解などの副反応も多く収量が低く実用性に乏し
い。

しかるに本発明の方法を利用すれば、安価な微生物酵素
を用いて、基質として比較的安定性に富んだシスチンー
ビスヒダントインを用いることができ、しかもＤＬ体の
みならずＬ体基質を用いても高収率でＤ体のＮ、　Ｎ’
−ビスカルバモイル−シスチンに変換させることが可能
である。

Ｎ、　Ｎ’−ビヌカルバモイルーＤ−シスチンは、例え
ば亜硝酸との反応によって容易にＤ−シスチンに変換さ
れるので、本発明はＤ−シスチン及びＤ−シスナインの
工業的製法として極めて有利な手段を提供するものであ
る。以下に本発明を更に詳細に調明する。

本発明で原料として用いられるシスチン・ビスヒダント
インは前にも述べたように、ＤＬ一体、Ｄ体またはＤ一
体のいずれでもよく、例えば入手の容易なＬ−シスチン
を用いてシアン酸アルカリ金属塩と反応後、酸性条件下
で環化することによシ得られるＬ−シスチン・ビスヒダ
ントインも良好な基質となる。

本発明で使用される微生物は、シスチン・ビスヒダント
インのヒダントイン環を立体特異的に加水分解して、Ｎ
、Ｎ’−ビヌヵルパモイルー＆Ｄ−シスチンを生成させ
る能力を有するもので、自然界に存在する野生株、公的
な微生物保存機関に保存されている菌株、あるいはそれ
らから人工的に変異誘導した微生物などから、前記能力
の有無を調べることによって選択されるものである。こ
の能力の検定方法としては、例えば次のような方法が用
いられる。

まず、微生物の培養物２　ｇ／を遠心分離して菌体を集
め、生理的食塩水で洗浄後、再び遠心分離して集菌する
。この分離した菌体（湿重量４０〜２００ｍ９）を濃度
０５〜２．０％のＬ−シスチン・ビスヒダントインを含
む緩衝液（ｐＨ７〜９）２ゴに加えて、゛温度３０〜５
０℃の条件下で、１０〜４０時間ゆるやかに振盪しつつ
反応させる。

反応後、反応液の一部を用いて沖紙上でスポットテスト
（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドの濃塩酸溶液の
噴霧てよシ発色）を行ない黄色に発色したものにつき、
高速液体カラムクロマトクラフィー分析を行ない、Ｎ、
Ｎ’−ビスカルバモイル・シスチンの生成量を求める。

このようにして、−比較的高い変換率を示した菌株に一
ついては、実験規模を大きくして再度シスチン・ビスヒ
ダントインの加水分解反応を行ない、反応３液を遠心分
離し、その上清を凍結乾燥後、残香を用いてシリカゲル
カラムクロマトグラフィー（展開溶媒ｎ−プロパツール
：水＝ａ：２）にてＮ、　Ｎ’ビスカルバモイル−シス
チンを単離し、それがＤ体であると認められた菌株を本
発明に使用する微生物として採用する。

本発明で使用する微生物は、細菌、放線菌にみいだされ
、細菌に属するものとしては、バチルヌ属、シュードモ
ナス属、コリネバクテリウム属などに、また放線菌に属
するものとしては、ノカルディア属、ミコバクテリウム
属などの中にみいだされている。

本発明の微生物は具体的には以下のものがある。

コリネバクテリウム・セベドニカム　ＩＦＯ３３０６（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｅｐｅｄｏｎｉｃ
ｕｍ　）ノカルディア・コラリーナ　エＦＯ５３３Ｂ（
Ｎｏｃａｒｄｊ−ａ　　ｃｏｒａｌ、１ｉｎａ　）ミコ
バクテリウム・スメグマテイス　ＡＴＯＣ６０７（Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ　）バチ
ルス・スピーシズＫＮＫ　　１０Ｂの菌学的諸性質は以
下の通シである。

実験方法はＭａｎｕａｌ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ　（Ｍ、　Ｊ、Ｐｅ１ｃｚａ
ｖ　）に準じた。

（Ｉ）形態 （１）　　細胞の形および大きさ：桿菌、２〜６μｍＸ
０．８μｍ（２）細胞の多形性の有無：なし く３）　　運動性の有無、鞭毛の着生状態：なしく４）
　　胞子の有無、形状、大きさ：　０Ｖａｌ　１．０μ
ｍＸ０，８＃ｍ（５）ダラム染色性：陽性 （９）　各培地における生育状態 （１）　　肉汁寒天平板培養：適度の生育、不規則状、
扁平状、裂片状、半透明 （２）　　肉汁寒天斜面培養：適度の生育、糸状〜拡布
状、可溶性色素を生成しない。

（３）肉汁液体培養：適度の生育　沈渣（４）　　肉汁
ゼラチン穿刺培養：液化する（層状）［相］　生理学的
性質 （１）硝酸塩の還元　：　陰性 （２）ＭＦＩテスト　：　陰性 （３）ｖｐテスト　：　陰性 （４）　　インドールの生成　：　陰　性（５）　　デ
ンプンの加水分解　：　　陰　性（６）°クエン酸の利
用　：　陽性 （７）色素の生成　：　生成しない （８）ウレアーゼ　：　陽性 （９）カタラーゼ　：　陽性 ＯＱ　　生育の範囲　　：　温度　３７″Ｃで生育する
が４１℃で生育しない。

ｐＨ６〜９５ （ロ）　酸素に対する態度：　好気性 （２）糖から酸の生成の有無（ペプトン培地）Ｌ−アラ
ビノーセ　：　陰　性 Ｄ−キシロース　：　陰性 Ｄ−グルコース　：　陰性 Ｄ−マンノース　：　陰性 トレハロース　：陰性 α匂　フェニルアラニンのデアミナーゼ反応：陰性α→
　カゼインの分解性　：　陽性 （ロ）耐　塩　性　：　食塩７％で生育するα６）　ジ
ヒドロキシアセトンの生成　：　陰　性本発明の方法は
、微生物の菌体またはその処理物の形態で菌庄内酵素の
作用を利用するものであるが、この酵素は有機栄養源を
含有する通常の培地で微生物を培養することによって菌
体内に生成蓄積させることができる。培養培地には通常
、資化しうる炭素源、窒素源および各微生物の生育に必
要な無機塩ならびに栄養素とを含有させるが、更に各種
のピリミジン系核酸塩基類またはそれらの誘導体、或い
は各種のヒダントイン類を００５〜０．３％添加して、
所望の酵素を適応的に増強させることが望ましい。酵素
誘導効果の高いピリミジン系核酸塩基類としてはウラシ
ル、シトシンおよびチミンがあシ、それらの誘導体とし
てはジヒドロウラシル、ジヒドロチミンなどがある。ま
たヒダントイン類の中ではヒダントイン、ＤＬ−５−メ
チルヒダントインなどが比較的好ましい。しかし多くの
微生物に共通して実用的に最も好ましい酵素誘導基質は
ウラシルである。

培養条□件は、使用する、微生物の至適生育条件に応じ
て温度２０〜８５ａＣ５ｐＨ４〜１１の範囲が用いられ
るが、一般的には温度２０〜４０で、ｐＨ５〜９におい
て培養する。培養中には通気、攪拌を行なって微生物の
生育を促進させることもできる。

シスチン−ビスヒダントインの加水分解反応には、前記
のようにして培養した微生物を培養物、菌体または菌体
処理物の形態で使用する。

通常微生物の培養物をそのまま反応に使用することがで
きるが、培養物中の成分が障害になる場合や酵素量を多
く用いたい場合には、培養物から分離した菌体を使用す
ればよい。菌体は生菌体のままで充分に使用目的を達す
るが、貯蔵あるいは取扱いの便宜から、凍結乾燥菌体や
ア七トン乾燥菌体のような乾燥菌体として用いることも
できる。また菌体そのものでなく、菌体破砕物や菌体抽
出物のような菌体処理物の状態で使用す□ることも可能
である。更に上記の菌体または菌体処理物を公知の方法
で固定化したものも使用することができる。

シスチン・ビスヒダントインに微生物の培養物、菌体ま
たは菌体処理物を作用させるには、通常水性媒体中で両
者を混合する方法が用いられる。反応液中での基質濃度
については特に制限はないが、１％以上のような高濃度
では基質は完全には溶解しないことが多いが、反応の進
行に伴って逐次溶解していくので何ら支障にはならない
。

本発明において用いられる微生物酵素の真の基質はＤ体
であシ、Ｄ体のみが選択的に加水分解されてカルバミル
体に変換される。しかし反応系中にラセミ平衡が存在す
るため、加水分解されないＬ体はＤ体の消費に伴ってラ
セミ化し、反応系には常にＤ体が供給される。このよう
にラセミ化反応が酵素反応と並行して進むということか
ら、Ｌ体も間接的な基質とみなすことができる。従って
原料のシフチン・ビスヒダントインはＤＬ体、Ｌ体、Ｄ
体のいずれであっても実際的な効果には殆んど差がない
ことになる。

水性媒体中でシスチン・ビスヒダントインの加水分解反
応を行なう際に、実用上好ましいｐ　Ｈの範囲は７〜９
であル、特に好ましくは７５〜８．５である。ｐＥＴ　
７未満では反応速度は極めて小さく、ｐＨ９を超えると
好ましくない副反応を生じるのでいずれも実用性に乏し
い。ｐＨ７〜９が好ましい理由としては、本発明で利用
される微生物酵素の至適ｐＨが８附近にあること、ｐＨ
が高くなるにつれて基質の溶解度が増すこと、ならびに
ヒダントイン環のラセミ化反応がアルカリ性において効
果的に促進されることなどによって、結果的にシスチン
・ビスヒダントインからＮ、　Ｎ’−ビスカルバモイル
−Ｄ−シスチンへの変換速度が増大することにある。反
応の進行に伴って媒体のｐＨが低下するので５反応中、
継続的に中和剤を添加し至適ｐＨに保持することが望ま
しい。中和剤としてはアンモニア、苛性ソーダ、苛性カ
リ、炭酸ソーダなどが適当である。その他、目的に応じ
て水性媒体に有機溶媒、又は界面活性剤などを添加して
反応を行なわせることもできる。反応温度は使用する微
生物に適した温度が採用されるが、通常２５〜５５℃の
範囲内である。

加水分解反応によ１つて生成したＮ、　Ｎ’−ビヌカル
バモイルーＤ−シスチンは通常単離しないでＤ−シスチ
ンに変換する反応に使用し得る。しかし単離することを
望むならば、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、或
いは陰イオン交換樹脂を利用するなど通常の方法を適用
すればよい。

本発明の方法によって得られるＮ、　Ｎ’−ビスカルバ
モイル−Ｄ−シスチンは、例えば亜硝酸と反応させるこ
とによシ容易にＤ−シスチンに変換させうろことから、
本発明の方法によシ医薬の合成中間体として有用なり一
シスチン或いはそれから容易に誘導されるＤ−システィ
ンの製造を工業的に有利に行なうことができるのである
。

以下実施例によシ本発明を具体的に説明するが、本発明
はこれらの例のみに限定されるものではない。

実施例１ 下記組成からなる栄養液体培地を調製し、５００−容肩
付振盪フラスコに、その１００１１／を加え、１２０で
で２５分間蒸気殺菌を行なった。

肉エキス　５ｆ／β、　酵母エキス　５ｆｌ／ｌ。

ポリペブト：／　　１０ｆ／ｌ、　　　Ｎａ１ｌ　　　
　　　”ｓｆ／ｌ。

ウラシル　１　ｆ／ｌ　、　　　ＭｎＣｌ！　・４Ｈ２
０２０１１１９／Ｊ？（ｐ　Ｈ７，０） これに、同一組成寒天培地で３３″Ｃにて２４時間培養
した、表工に示す微生物を１白金耳接種し、３３″Ｃに
て１８時間振盪下に培養を行なった。この培養液から菌
体を遠心分離し、培養液とほぼ同量の生理食塩水で１回
洗浄した後、再び遠心分離して集菌した。

この菌体を、ＤＬ−シスチン・ビスヒダントイン１ｇ／
ｄ：Ｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）５０
露ｌに全量添加し、３６℃に２０時時間中かな振盪下に
保持、反応させた。反応後、反応液の遠心分離によシ、
その上清を得て、生成Ｎ、　Ｎ’−力ルバモイルーシス
チン量を高速液体クロマトグラフィーによシ分離定量し
たＣカラム：日立陰イオン交換樹脂÷２６３２　、２．
６Ｘ５００關、１　ｍＭ　Ｎａ１ｌを含む０．０　Ｉ　
Ｎ−ＨＣｌ　：メタノール＝：　３　：　１　ｓ検出２
５４ｎｍ）。

更に、この上清を３Ｎ−ＨＣｌによりｐ、　Ｈ５，Ｏに
調整後、凍結乾燥を行ない、その残香全量を用いてシリ
カゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ｎ−プロパ
ツール：水＝ｓ　：　２　）を行なった。その有効液を
減圧濃縮しＮ、　Ｎ’−ビスカルバモイル−シスチンを
結晶状に単離し、その比旋光度を測定した。以上の結果
を各使用微生物ごとに表工に示す。

表　　工 未測定条件　ｃ＝０．１０．０１５Ｎ−ＮＨ，ＯＨ中実
施例２ ３０１容ジャーファーメンタ−に、下記組成よりなる培
地１８ｊ７を調製し１２０″Ｃにて２５分間蒸気殺菌を
行なった。

肉エキス　　５０Ｆ！／ｌ、　　　グルコ−ｙ、　　　
１０ｆ／ｌ。

食　　塩　”ｄｌｌ、　　　　ウラシル　１ダ／ｌ　。

ＭｎＣｌ２−４Ｈ２ｏ　２０”’ｉ／　ｌ　　　（、ｐ
　Ｈ７，０）コレニ、２１容肩付振盪フラヌ−にて、同
一組成培地２５０　ｍｌで３３でで、２４時間培養した
バシルス・スピーシズＫＮＫ１０Ｂを全量接種し、３６
″Ｃにて２Ｎ［／ｍｉｎ　、　２５０　ｒｐｍの通気攪
拌条件下で１８時間培養を行ない培養液を調製した。

この培養液１５１に、Ｌ−シスチン・ビスヒダントイン
３００１ｔ’を加え窒素通気攪拌条件下、２、５　Ｎ　
−ＮａＯＨにてｐ　Ｈ７，８に保持しつつ、３７℃にて
２４時間反応を行なった。反応後、本反応液の高速液体
クロマＩ・グラフィー分析の結果、生成Ｎ、　Ｎ’−ビ
スカルバモイル−シスチン量は１８１ｆであシ、変換率
は５４％であった。

更に、この反応液を冷却、攪拌しつつ、濃塩酸１７５０
ｇ／を加え５″Ｃ前後に保持しつつ、亜硝酸ソーダ７６
．６１を含む水溶液４００　ｍｌを定量ポンプによ９２
時間かがって添加し、更に３時間反応した。この脱カル
バモイル反応液ヲ遠心分離し、不溶物を除却した後、Ｉ
Ｒ−１２０Ｂ陽イオン交換樹脂（Ｎａ型）をつめたカラ
ム（８，５Ｘ　７０備）に通し、イオン交換水６ｅで水
洗した。溶出は５％アンモニア水で行ない、有効液２．
５１を減圧下３００　ｘｌに濃縮した液を６　Ｎ　−Ｈ
Ｃｌを用いてｐＨ４，８に調整してＤ−シスチンの粗結
晶を８　！１．５　ｆを得た。この粗結晶を中和晶析に
て再結晶を行ない精製Ｄ−シスチン６９５ｆを得た（〔
α］　Ｄ’　＝＋　２１２　ｃ＝０．Ｉ　Ｎ−ＨＣＩＩ
　）。

特許出願人　鐘淵化学工業株式会社 代理人弁理士浅野真− 自発手続補正書 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 １、事件の表示　　特願昭５６−１２５６８８２、発明
０名称　　Ｎ、Ｎ−ビスカルバモイル−Ｄ−シスチンの
製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大阪市北区中之島三丁目２番４号 （０９４）鐘淵化学工業株式会社 代表者　　高　１）　敞 ４代理人 大阪市西区京町堀１丁目１３番２号 藤原ビル５階 ６　補正の内容 〃 （１）　　明細書第２頁１８行　Ｎ、Ｎビスカルバモイ
ルを　Ｎ、Ｎ−ビスカルバモイル　に訂正する。

（２）同第５頁１９行　アミラーゼ　をアシラーゼ　に
訂正する。

（３）同第６頁２行　アミラーゼ　を　アシラーゼ　に
訂正する。

（４）同第６頁９行　２５多しか存在せず　を　少量し
か存在せず　に訂正する。

（５）同第１４頁１７行　カルバミル体　をカルバモイ
ル体に訂正する。

以上 自発手続補正書 昭和５６年９月ｌＳ日 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 １、事件の表示　　特願昭５６−１２５６８８２、発明
の名称　　Ｎ、Ｎ−ビスカルバモイル−Ｄ−シスチンの
製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 大阪市北区中之島三丁目２番４号 （０９４）鐘淵化学工業株式会社 代表者　　高　１）　敞 ４、代理人 む、儒止の河原　　明細書の発明の詳細な説明の欄６　
補正の内容 （１）　　８Ａ細誓書第５７行目 一体、Ｌ一体またはＤ一体の　を 一体（光学的不活性体を表わし、ＤＬ−およびメグ一体
を意味する）、Ｌ一体まだはＤ一体の　に訂正する。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　シスチン・ビスヒダントインに、ヒダントイン環
   を立体特異的に加水分解してＮ、　Ｎ’−ビスカルバモ
   イル−Ｄ−シスチンを生成させる能力を有するパシルヌ
   属、コリネバクテリウム属、ミコバクテリウム属、ノカ
   ルディア属、シュードモナヌ属の微生物の培養物、菌体
   または菌体処理物を、水性媒体中で作用させることを特
   徴とするＮ、　Ｎ’−ビスカルバモイル−Ｄ−シスチン
   の製造方法。 ２、　シスチン・ビスヒダントインがＤＬ体またはＬ体
   である特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ５、　水性媒体のｐＨが７〜９である特許請求の範囲第
   １項記載の製造方法。 ４、　微生物の菌体として生菌体または乾燥菌体を使用
   する特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ５、　微生物の菌体処理物として菌体破砕物または菌体
   抽出物を使用する特許請求の範囲第１項記載の製造方法
   。 ６　微生物の菌体または菌体処理物を使用する形態とし
   て、菌体または菌体処理物の固定化物を用いる特許請求
   の範囲第１項、第４項または第５項記載の製造方法。 Ｚ　培地に、ピリミジン系核酸塩基類またはそれらの誘
   導体を添加し、ヒダントイン環を立体特異的に加水分解
   する能力を増強させた微生物を使用する特許請求の範囲
   第１項、第４項、第５項または第６項記載の製造方法。