JPS6356278A - シユウドモナス属ｎｓ２１４菌及びｄ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、５−置換ヒダントインから微生物酵素系を利
用して医薬、農薬などの原料として工業的に重要な物質
であるＤ−アミノ酸を製造する方法に関するものである
。

〔従来技術及び問題点〕

従来、５−ｆｆｌ！ヒダントインにシュードモナス属菌
を作用させてＤ−アミノ酸を得る方法として特公昭５４
−８９０８８号公報記載の方法がある。

しかし、これらの方法は反応効率が充分で実用的な方法
とはいいがたい。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は５−置換ヒダントインからＤ−アミノ酸を
生成する方法について種々検討した結果、５−置換ヒダ
ントインをラセミ化する能力を有し、かつｎ−５−Ｗｔ
ＡヒダントインがらＤ−アミノ酸を生成する能力を有す
る微生物を分離することに成功し、さらに検討を重ねて
本発明を完成した。

即ち、本発明は上記微生物またはその処理物と５−置換
ヒダントインを接触反応させ、生成するＤ−アミノ酸を
採取するＤ−アミノ酸の製造法である。

ここで５−置換ヒダントインとは対応するアミノ酸から
一〇　〇　ＣＯＯＨを除いたバ基、例えばメＮＨ。

チオニン、アラニン、フェニルグリシン、ロイシンでは
それぞれＣＨｓＳＣＨｚＣＨｉ−１ＣＩ！３−、フェニ
ル、ＣＨｓＣＨｘＣＨｔＣＩ（ｚ−等のπ換基をヒダン
トイン環の５位に有する化合物を言う０本発明により製
造されるアミノ酸としては上記アミノ酸の他にバリン（
Ｃ）（３ＣＨＣＨＣＯＯＨ）、Ｉ ＣＩ（３Ｎ　Ｈｚ 等の種々のアミノ酸が挙げられる。

本発明により製造されるアミノ酸としては、メチオニン
、アラニン、バリン、フェニルグリシン等、種々のアミ
ノ酸が挙げられる。

本発明に用いられる微生物はシュードモナス属ＮＳ２１
４菌（工業技術院微生物工業技術研究所　微工研閏寄第
８８７７号）であり本発明者等が新たに分離した新菌種
である。ＮＳ２１４菌の菌学的諸性質は以下の通りであ
る。

ｆａ）　　形態 ＩＨＥＩ胞の形および大きさ＝０．７〜０．９　Ｘ　１
．３〜２，０８勝 楳菌 ２）細胞の分形成の有無　二なし ３）運動性の有無、　　　　：あり 鞭毛の着生状態　　　：極鞭毛 ４）胞子の有無　　　　　：なし ５）ダラム染色性　　　　：陰性 ６）抗酸性　　　　　　　；なし ＋ｂ＋　　各培地における成育状態 １）肉汁寒天平板培養　　：良好な生育、円形、凸円状
、金縁、 金縁、不透明、 円滑、白色 ２）肉汁寒天斜面培養　　：良好な生育、糸状可溶性色
素を生成 しない ３）肉汁液体培養　　　　：良好な生育、膜状４）肉汁
ゼラチン穿刺培養：乳化しない５）リドマス　ミルク　
　：変化しないｆｃｌ　　生理学的性質 １）硝酸塩の還元　　　　　　　　　　　　＋２）脱窒
素反応　　　　　　　　　　　　　＋３）　ＭＲテスト
　　　　　　　　　　　　　　　　−４）ＶＰテスト　
　　　　　　　　　　　　　　　　−５）インド−ルの
生成　　゛　　　　　　　　−６）硫化水素の生成　　
　　　　　　　　　−７）デンプンの加水分解　二　　
　　　　　−シモンズ培地　　：　＋ コーザー培地　　：　＋ （Ｋｏｓｅｒ） ９）無機窒素源の利用；硝酸塩　　　　二　十アンモニ
ウム塩　　　　　　　：　　　＋１０）色素の生成　　
　　　　　　　　生成しない１１）ウレアーゼ　　　　
　　　　　　　　　　＋１２）オキシダーゼ　　　　　
　　　　　　　＋１３）タカラーゼ　　　　　　　　　
　　　　　＋１４）生育の範囲　　　：温度　３８℃で
生育するが４２℃で生育しない ｐＨ６〜　９ １５）酸素に対する態度：　　　　好気性１６）　Ｏ−
Ｆテスト　　　　　　　酸化１７）糖類から酸およびガ
スの生成の有無酸の生成　ガスの生成 ｆｌ）　Ｌ−７ラビノース　　十　　　　　−（２）Ｄ
−キシロース　　　＋（微弱）　−（３）Ｄ−グルコー
ス　　　十　　　　　−（４）Ｄ−マンノース　　　＋
　　　　　−（５）Ｄ−フラクトース　　十　　　　　
−（６）Ｄ−ガラクトース　　＋　　　　　−（７）　
　　マルトース　　　＋　　　　　−（８）シヨを唐＋
− （９）　　　ラクトース　　　＋（微弱）　−〇〇　　
トレハロース　　＋　　　　　　−Ｄ−ツルピント　　
　＋　　　　　− Ｄ−マンニント　　　＋　　　　　− イノジット　　　↓　　　　　− グリセロール　　＋　　　　　− でん粉　　　　　−− １８）グルコン酸の酸化　　　　　　　　　−リジン　
　　　　　　　　　　− オルニチン　　　　　　　　　− アルギニン　　　　　　　　　＋ ２０）　Ｄ　Ｎ　Ａの分解性　　　　　　　　　　−２
１）ポリーβ−七Ｆｕキシ酢酸の蓄積の有無：　　　あ
り２２）栄養要求性　　　　　　　　　　　　なし２３
）炭素化″合物の資化性（Ｓｔａｒｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ
の方法）１）Ｌ−アラビノース　　　　　　　　＋２）
Ｄ−キシロース　　　　　　　　　＋３）Ｄ−グルコー
ス　　　　　　　　　　＋４）Ｄ−フルクトース　　　
　　　　　　＋５）シａｍ　　　　　　　　　　　　　
　＋６）トレハロース　　　　　　　　　　　＋７）Ｄ
−リボース　　　　　　　　　　＋８）Ｌ−ラムノース
　　　　　　　　　　＋９）アトニット　　　　　　　
　　　　　＋１０）エリスリトール　　　　　　　　　
　−１１）ソルビトール １２）エタノール　　　　　　　　　　　　＋１３）β
−アラニン　　　　　　　　　　−１４）Ｌ−アＪレギ
ニン　　　　　　　　　＋１５）Ｌ−バリン　　　　　
　　　　　ー１６）酪酸　　　　　　　　　　　　　　
−１７）　Ｄ　Ｌ−乳酸　　　　　　　　　　　　＋１
８）プロピオン酸　　　　　　　　　　　本１９）メソ
酒石酸　　　　　　　　　　　　−２０）Ｄ（−）酒石
酸　　　　　　　　　　−２１）　ｍ−ヒドロキシ安息
酸　　　　　　−２２）ｐ−ヒドロキシ安息酸　　　　
　　＋２３）グリコール酸　　　　　　　　　　〜２４
）マロン酸　　　　　　　　　　　　　−２５）　Ｄ　
Ｌ−β−ヒドロキシ酪酸　　　　十２６）レブリン酸　
　　　　　　　　　　　　〜２７）シトラコン酸　　　
　　　　　　　−２８）メサコン酸　　　　　　　　　
　　　　−２９）トリプタミン　　　　　　　　　　　
　ー３０）プロピレングリコール　　　　　　＋３１）
２．３−フ゛チレングリコール　　　　　＋３２）ｎ−
アミルアミン　　　　　　　　　ー３３）ベタイン　　
　　　　　　　　　　　中以上の菌学的性質を、バージ
エイ式分類（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏ
ｆ　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉ
−ｏｌｏｇｙ，　８ｔｈ　ｅｄ）に基づいて検索すると
、上記ＮＳ２１４菌はシュウトモナス属に属する。

さらに種について検索すると、デカルボキシラーゼ反応
の有無、炭水化合物の資化性などの性質において、既知
菌のいずれとも一致しないことから、新菌種であると判
断した。

上記微生物の培養は、通常、振とう培養あるいは通気、
攪拌深部培養などの好気的条件で行なう。

培養温度は、１０〜３５℃、培養ｐｔ＋は６〜９で、１
〜３日間培養する．培地には使用菌が資化しうる炭素源
、窒素源無機塩及び微量有機栄養源が含まれる．即ち、
炭素源としては、グルコース、フラグ−　ドース、デン
プン加水分解液、糖蜜などの炭水化物や、更にエタノー
ルなども使用できる．窒素源としては、アンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの各種の無機お
よび有機のアンモニウム塩類、または肉エキス、酵母エ
キス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物
などの天然有機窒素源も使用可能である。無機塩として
は、マグネシウム、秩、マンガン、カリウム、ナトリウ
ムなどの塩が適宜用いられる。

反応に使用する５−置換ヒダントインの４度に特に制限
はないが、通常１−１０％濃度が用いられ、反応温度は
１０〜５０℃好ましくは３０〜４５℃、反応ｐＨは３〜
１０，好ましくは６〜９の範囲で１〜３日間反応する。

反応液からＤ−アミノ酸を分離するには、例えば濃縮、
等電点沈澱などによる直接晶析方や、イオン交換樹脂処
理などの公知の方法により行なうことができる。

生成したアミノ酸は高速液体クロマトグラフィー　（Ｈ
ＰＬＣ）で測定することにより定量することができる．
また光学異性体は、旋光度分析、光学異性体分離カラム
（キラルバック：ダイセル化学工業製）を用いることに
より判別することができる〔実施例〕 実施例１ グルコース０．５χ、酵母エキス０．５χ、ポリペプト
ン０．５χ１食塩０．５χを含む栄養培地（ＩＨ７）を
３１容フラスコに１１入れ１２０℃で１５分間滅菌した
。これに上記培地において３０℃で１５時間振とう培養
したシュウトモナスｒ％ＮＳ２１４菌の前培養液２１を
植菌して、３０℃で２４時間振とう培養した。培養終了
後、遠心により集菌し、０．１Ｍ濃度のリン酸緩衝Ｗ＜
ｐＨ７）ｔｏｏ　ｍｌを加えて再び遠心集菌した。この
洗浄菌体（湿重量３．２ｇ）を、ＤＬ−メチオニンヒダ
ントイン２ｇを含む０．１Ｍ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ
７）２００　ｍｌ中に分散させ、４２℃で２５時間静置
反応させた０反応終了後、遠心除菌し上清に活性炭を０
．２χになるように添加して１時間攪拌した。アミコン
フィルター（ＰＭＩＯ）を用いて限外濾過し濾液を４０
ｍ　ｌまで減圧ｔ３縮した。このｆｉ４ｍ液をａｌｌ５
．７に調整し、５℃にて１５時間放置した。析出した結
晶を１１取することによりＤ−メチオニン１．２ｇを得
た。

〔α〕、′・−−２３，１’　（ｃ＝１．５Ｎ　Ｈｅ１
）実施例２ 実施例１と同様にして培養したシ１ウドモナス属ＮＳ２
１４菌の前培養液１０園１を５１容ミニジ中−ファーメ
ンタ−に入っている栄養培地２Ｉｌに植菌して、３０℃
で、攪拌５００ｒｐｍ　、通気１１／ｗｉｎの条件で、
２４時間培養した。培養終了後、遠心集菌し、２００−
１の０．１Ｍ濃度のリンＭ緩ｉＪｉ液（ｐＨ７）を加え
た後再び遠心集菌（温重１６．９ｇ）　Ｌ、この菌体を
リン酸緩衝液１００１に懸濁した。この菌体懸濁液を１
０分間超音波処理した後、遠心除菌し上清１００　＋＊
Ｉを、５８のＤＬ−メチオニンヒダントインを含む０．
１Ｍ濃度のリン酸Ｉｌ街液（ｐＨ７）４００１　に加え
て４２℃で３０時間反応させた０反応終了後、反応液を
活性炭処理、限外濾過し濾液を１００　ｍｌまで減圧濃
縮した。この濃縮液を実施例１と同様に等電点沈澱処理
し、Ｄ−メチオニン２．７ｇを得た。〔α）　、ｔｏ、
−−２３，１’　　（Ｃ旗０．９４．５１１：ＨＣＩ）
実施例３ 実施例１と同様にして培養して得た培養液５ｍｌを遠心
集菌し、０．１Ｍ濃度のりん酸緩衝液（ａｌｌ　７）１
ｍｌを加えて再び遠心集菌した。この洗浄菌体を、Ｄ、
Ｌ−フェニルグリジンビダントイン１０ｗを含む０．１
Ｍ？５度のリン酸緩衝液（ｐＨ７）　１　ｍｌ中に分散
させ、４２℃で２４時間静置反応させた０反応終了後、
遠心除菌して得た上清をキラルパソクおよびキラルプレ
ートにより分析した結果、生成したフェニルグリシンは
Ｄ一体であることを確認した。またＤ−フェニルグリシ
ンをＨＰＬＣを用いて定量した結果、この反応液の変換
率は８３．７モル％であった。

実施例４ 実施例１と同様にして培養して得た培養液５１を遠心集
菌し、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）　１　ｍｌを
加えて再び遠心集菌した。この洗浄菌体を、ＤＬ−バリ
ンヒダントインｌＯ■を含む０．１　Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ７）　１　ｍｌ中に分散させ、４２℃で７２時間
静置反応させた０反応終了後、遠心除菌して得た上清を
キラルパソクおよびキラルプレートにより分析した結果
、生成したバリンはＤ一体であるこ・　　とを確認した
。またＤ−バリンをＨＰＬＣを用いて定量した結果、こ
の反応液の変換率は７１．３モル％でであった。

実施例５ 実施例１と同様にして培養して得た培養液５ｍｌを遠心
集菌し、０．ＩＭ濃度のリン酸！ｉ街液（ｐＨ７）１ｍ
’ｌを加えて再び遠心集菌した。この洗浄菌体を、ＤＬ
−フェニルアラニンヒダントインｌＯ■ヲ含ム０．１　
Ｍ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ７）　１ｍｌ中に分散させ
、４２℃で７２時間静置反応させた０反応終了後、遠心
除菌して得た上清をキラルパックおよびキラルプレート
により分析した結果、生成したフェニルアラニンは、Ｄ
一体であることを確認した。またＤ−フェニルアラニン
をＨＰＬＣを用いて定量した結果、この反応液の変換率
は７５．９モル％であった。

〔発明の効果〕

本発明に使用されるＮＳ２１４菌は種々の５−ｒＩＬｔ
ｌｋヒダントインからＤ−アミノ酸を生成する能力を有
し、しかも高濃度でも反応することから反応効率にすぐ
れ、さらに実施例においてＤ−アミノ酸の生成率が５０
％を越えることからも明らかなように５−置換ヒダント
インをラセミ化する能力をも有していることから、ＮＳ
２１４菌を使用することにより、高純度のＤ−アミノ酸
が収率よく取得することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）５−置換ヒダントインをＤ−アミノ酸に返還する
   能力を有するシュウドモナス属ＮＳ２１４菌（２）５−
   置換ヒダントインをＤ−アミノ酸に返還する能力を有す
   るシュウドモナス属ＮＳ２１４菌の菌体または菌体処理
   物を、５−置換ヒダントインに作用させてＤ−アミノ酸
   に変換させ、これを採取することを特徴とするＤ−アミ
   ノ酸の製造法。