NL8002627A - Werkwijze voor het bereiden van d-alfa-aminozuren langs enzymatische weg. - Google Patents

Description

l λ ί VO 363

Werkwijze voor het bereiden van D-oc -aminozuren langs enzymatische weg.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van 0-oc-aminozuren langs enzymatische weg.

Neer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze bestaande in het hydrolyseren van op de 5-plaats gesub-5 stitueerde hydantoïnen rechtstreeks tot D-<*>aminozuren.

Bij voorkeur zijn de 0-o<-aminozuren verkregen volgens de uitvinding het D-fenylalanine, O-methionine, O-fenylglycine of het D-p-hydroxyfenylglycine, die bijzonder geschikt zijn als geneesmiddel of als tussenverbinding voor de bereiding van produkten die IQ zelf bruikbaar zijn op farmaceutisch of landbouwgebied, maar talrij ke O-aminozuren, zoals D-leucine, D-valine en D-tryptofaan kunnen worden verkregen door uitvoering van de werkwijze.

Volgens de uitvinding wordt een D-c<-aminozuur bereid door een geschikt op de 5-plaats gesubstitueerd hydantoïne in aanraking 15 te brengen met een enzyme dat in staat is dit hydantoïne in het overeenkomstige Ώ-°ί-aminozuur om te zetten.

Het bij de werkwijze toegepaste enzyme wordt verkregen door kweken van een microorganisms, dat hierna vollediger zal worden ge-identificeerc_in een geschikt milieu.

20 Het microorganisms waarvan het kweken onder geschikte omstan digheden het voor de werkwijze volgens de uitvinding bruikbare enzyme levert dient te worden beschouwd als een nieuwe soort behorend tot het genus Pseudomonas.

Het is geïsoleerd uit een modderig monster getrokken te 25 Commentry (Frankrijk] volgens de gebruikelijke methodai voor hst iso leren van microörganismen. Een monster van deze stam is gedeponeerd op het Centraal Bureau voer Schimmelcultures te Baarn (Nederland] geregistreerd onder het nummer CBS 259.73. Dit laboratorium is gemachtigd de spam van het microorganisms af te geven aan iedereen 8 0 0 2 6 27 - 2 - die op legale wijze Kennis van de onderhavige uitvinding heeft genomen .

Het mieroörganisme HM-40 is een Pseudomonas waarvan bepaalde Kenmerken niet overeenkomen met die van de soorten beschreven in 5 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8e druk. Het wordt aangegeven onder de naam Pseudomonas sp. HM-40.

De kweek- en morfologische eigenschappen van Pseudomonas sp. HM-40 zijn de volgende: 1] Uiterlijk van de cultures op verschillende milieus: 10 a] !jilieu_"Trygticase_<soja-agar’’_bijj_30°C: - Na 24 uren bebroeden: zeer kleine kolonies - Na 48 uren bebroeden: grotere kolonies (ongeveer 1 - 1,5 mm diameter] met duidelijke en halftransparante randen.

- Na 4 dagen bebroeden: grotere kolonies (ongeveer 4 mm dia- 15 meter] opaak, slijmachtig.

b] V9§dingsbouillon_bij_3C°C: 3

In proefbuisjes (16 x 150 mm] bevattend 5 cm medium, is ontwikkeling duidelijk bij 24 uren maar weinig overvloedig. De ontwikkeling neemt de volgende dagen toe. Vorming van een ge-20 lijkmatige troebeling met afzetting die tamelijk aan de bodem van de buizen hecht. Koolzuurgas C10%] vermeerdert de ontwikkeling niet.

c] Verschillende_yasts_media:

Qp voedingsagar en op "Brain Heart Infusie-agar” zijn de ont-25 wikkeling en het uiterlijk van de kweken identiek aan die be schreven voor het medium "Trypticase soja-agar”.

d] Verschillende_yloeibare_milieus:

Op "Brain Heart Infusie-agar", peptonwater, tryptonwater, voe-dingsbouillon met gistextract, zijn ce ontwikkeling en het 30 uiterlijk van de kweker, identiek aan die welke zijn beschre ven voor de voedingsbouillon. Op "Trypticase 3oy-Broth" en op glucosepeptonwater van 0,2% is de ontwikkeling een weinig zwakker.

2] Morfologie: 35 a] Microscogisch_onderzoek zonder kleuring:

Na 24 uren kweken in vloeibaar milieu bij 37°C: bacillen van 800 2 6 27 ¢-- i - 3 - 0,5 - 5 lj lengte, "en navettes".

De kiem is beweeglijk en de beweeglijkheid is sterker als de bebroeding wordt uitgevoerd bij 24 - 30°C.

b] Microscogischjjnderzoek_na_kleuren: 5 De kiem is gramnegatief; vaak is het centrale deel van het bacterielichaam zwakker gekleurd.

3] Optimale ontwikkslingstemperatuur: 24°C: goede ontwikkeling 30°C: zeer goede ontwikkeling 10 37°C; matige ontwikkeling 42°C: zwakke ontwikkeling.

4) Kweek- en biochemische eigenschappen: a) Ademhalingstype: strikt aëroob.

b] Oxydase: positief.

15 c] Katalase: positief.

d] "Mac Conkey Agar": overvloedige cultuur.

e] "Salmonella Shigella Agar": weinig overvloedige cultuur f] "Cetrimide Agar": geen ontwikkeling.

g] Urease (in Ferguson-medium): positief.

20 h] Indol-produktie: negatief.

i] Methylrood-proef: negatief.

j] Voges-Proskauer-proef: negatief.

kj Gebruik van citraten (Simmons]: positief in 43 uren: alka- \ linisering.

25 1] Vervloeiing van gelatine: negatief.

m3 Oxydatie-fermentatie-proef (Hugh en Leifson): oxycerend. n3 Vorming van zuren uit koolhydraten: - glucose: positief - lactose: positief 30 - arabinose: positief - maltose: positief - mannier: positief - saccharose: positief - xylose: positief.

35 o] Reductie van nitraten: positief.

800 26 27 - 4 - pj Reductie van nitrieten: negatief.

q) Denitrificatie: negatief.

r) pigmentvorming: negatief.

s) ^S-vorming: 5 - op "Triple Sugar Iron Agar” medium: zeer licht positief

- papier met lood onder acetaat: sporen H^S

t) Hemolyse (paardebloed]: negatief.

u) PapavermelR: geen wijziging.

v) β -galactosidase: positief.

10 w) Arginine-dihydrolase: negatief.

x) Lysine-decarboxylase: negatief.

yj Ornithine-decarboxylase: negatief.

Als men de stam Pseudomonas sp. HM-40 kweekt in klassieke kweekmilieus vormt het enzyme, dat de hydantoïnen in de overeenkom-15 stige 0-oc-aminozuren kan omzetten zich hoofdzakelijk in de cellen van het microorganisme en in mindere mate in het kweekmilieu.

Het kweekmedium moet in hoofdzaak bronnen van koolstof en assimileerbare stikstof en andere voor de ontwikkeling van de stam HM-40 noodzakelijke voedingselementen bevatten zoals minerale zou-20 ten. Oe produktie van het enzyme kan worden verbeterd als men aan het kweekmedium een op de 5-plaats gesubstitueerd hydantoïne als stikstofbron toevoegt. In het algemeen gebruikt men hiertoe het hydantoïne van methionine maar andere hydantoïnen zoals het hydantoïne van valine, van leucine, van isoleucine cf 5-cyanopropyl-25 hydantoïne kunnen met voordeel worden toegepast.

Als bronnen van asamileerbare koolstof kan men koolhydraten toepassen zoals glucose, saccharose, lactose of maltose in zuivere vorm of in de vorm van complexe residu's zoals melasse en melkwei: men kan eveneens alcoholen of organische zuren gebruiken. Eepaalde 30 dierlijke of plantaardige oliën zoals spekolie of sojaolie kunnen deze verschillende koolstofbrcnnen vervangen of er aan worden toege-voegd.

De geschikte bronnen van assimileerbare stikstof zijn bijzonder gevarieerd. Het kunnen zeer eenvoudige chemische stoffen 35 zijn zoals organische of anorganische ammcniumzouten of ureum. Zij 800 2 6 27 # - 5 - kunnen echter ook bestaan uit complexe stoffen die in hoofdzaak stikstof in protidische vorm bevatten.

Onder de toegevoegde minerale elementen kunnen bepaalde een bufferend of neutraliserend effect hebben zoals de alkali- of aard-5 alkalifosfaten of calcium- of magnesiumcarbonaat. Andere leveren het noodzakelijke ionische evenwicht bij de ontwikkeling van de stam HM-40 zoals de alkali- en aardalkalichloriden en -sulfaten of de zouten van zink, kobalt, ijzer, koper of mangaan.

De pH van het fermentatiemedium bij het begin van het kweken 10 ligt tussen 4 en 9 en bij voorkeur tussen S en 3. De optimale tempe ratuur voor het fermenteren ligt tussen 25 en 35°C maar een bevredigende produktie wordt nog verkregen bij temperaturen tussen 20 en 37°C.

De beluchting van de fermentatie kan tussen ruime waarden 15 variëren. Men heeft echter gevonden dat beluchtingen van 0,3-3 3 3 dm lucht per dm bouillon en per minuut bijzonder geschikt zijn.

Het maximale rendement wordt verkregen na 10 - 72 uren kweken, welke tijd in hoofdzaak van het toegepaste medium afhangt.

Daar het enzyme in hoofdzaak in de cellen wordt geproduceerd 20 kan de omzetting van de op de 5-plaats gesubstitueerde hydantolnase in D- oc-aminozuur geschieden cnder toepassing van het kweekmedium dat de cellen bevat of de cellen geïsoleerd uit deze bouillon door centrifugeren,- deze cellen kunnen als zodanig worden toegepast door neerslaan met acetcn of lyofiliserenj men kan hen eveneens toepas-25 sen in de vorm van een celextract verkregen door malen of behandelen met ultrasonische trillingen.

De omzetting van het op de 5-plaats gesubstitueerde hydanto-ine in het overeenkomstige 0-<K-aminozuur geschiedt in het algemeen in waterig medium bij een pH tussen S en 9 en bij voorkeur van 7,8.

30 Oe pH wordt eventueel in de buurt van deze waarde gehandhaafd door toevoeging van een waterige alkalische oplossing met name natronloog.

De temperatuur van de omzettingsreactie ligt in het algemeen o o tussen 20 en 55 C en bij voorkeur in de buurt van 37 C.

35 De concentratie aan hydantcïne in het reactismilieu is een 800 2 6 27 - B - functie van de oplosbaarheid. Zij ligt in het algemeen in de buurt van 5% Cp/v) maar zij Kan groter zijn dan 10% (p/v3.

Het reactiemedium kan bevatten oppervlakteactieve stoffen, antioxydanten, coënzymen die de vorming van het D-^-aminozuur kun-5 nen bevorderen en aldus een beter rendement kunnen leveren.

In het algemeen bedraagt de reactieduur tussen 2 uren en 4 dagen. De reactie wordt feitelijk voortgezet tot er geen hydantolne omgezet in D-oc-aminozuur meer is.

Bij de omzetting van het hydantolne in D-ot· -aminozuur kan 10 zich tussentijds een D-hydantoïnezuur vormen dat onder werking van het enzymestelsel wordt omgezet in D-flC-aminozuur. De werkwijze volgens de uitvinding kan dus worden uitgevoerd met een hydantolne hetzij met een hydantoïnezuur hetzij met een mengsel van beide.

Voorts bevordert de stam HM-40 de in situ racemisering van 15 het L-hydantoïne, dat zich naast het gewenste D-°^-aminozuur vormt.

Vanwege dit feit kan toegepast racemisch hydantolne geheel worden omgezet in D-od-aminozuur.

Het volgens de uitvinding verkregen D-<X-aminozuur kan uit het reactiemilieu worden geïsoleerd volgens de gebruikelijke schei-20 dingsmethoden van aminozuren, in het algemeen na klaren van het reactiemilieu door centrifugeren en filtreren op een ionuitwissel-hars. In het algemeen slaat men het aminozuur neer bij zijn iso-elektrische punt.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van onder-25 staande voorbeelden.

Voorbeeld I

Men bereidt een kweekmedium met onderstaande samenstelling: 3 - glucose 20 g/dm 3 30 - monokaliumfosfaat 3 g/dm 3 - dikaliumfosfaat 7 g/dm 3 - magnesiumsulfaat 0,7 g/dm

- mangaansulfaat 0,02 g/dmJ

3 - ijzerCH]sulfaat 0,02 g/dm 35 - natriumchloride 1 g/dm" 3 - hydantolne van D.L-metnionine 3 g/dm 800 2 6 27 «. i.

- 7 - 3 3

Het medium wordt verdeeld in flesjes van 253 cm met 50 cm per flesje en gesteriliseerd gedurende 15 minuten bij 120°C. Na enten met de stam Pseudomonas sp. HM-4Q vanaf een uitgekozen agar-milieu worden de flesjes geschud C25Q omw./minuut) gedurende 48 uren 5 bij 30°C.

3

Men voert de produktie uit in een fermentator van 2 dm be- 3 3 vattend 1 dm van het voorgaande kweekmedium en 1 cm antischuim- middel. Men ent met de inhoud van een flesje bereid als boven. Het kweken wordt ontwikkeld bij 30°C gedurende 48 uren onder roeren met 10 een turbine met 500 omw./minuut en onder beluchting met steriele 3 lucht met een debiet van 1 dm /minuut.

Aan het eind van het kweken worden de cellichamen afgeschei- 3 den door centrifugeren en gesuspendeerd in 50 cm gedestilleerd 3 water. Deze suspensie bevat 7,8 g droog extract op 100 cm .

15 b) Hydrolyse_van de" hydantoïne^o^D^L-fenylalanine:

Aan 200 cm gedestilleerd water voegt men toe 5 g hydantoine van D.L-fenylalanine. Na verwarmen voor het ten dele oplossen van de hydantoïne wordt het milieu afgekoeld tot 37°C. Men stelt de pH in op 7,8 door toevoeging van een 1 N oplossing van natronloog.

3 20 Vervolgens voegt men toe 25 cm van de eerder verkregen celsuspen- 3 sie. Het volume van het reactiemengsel wordt ingesteld op 250 cm en de pH op 7,8.

Het reactiemengsel wordt onder een stikstofatmosfeer geplaatst; zijn temperatuur bedraagt 37°C. 0e pH wordt gehandhaafd op 25 7,8 door een geleidelijke toevoeging van een 1 N loogoplossing.

Na 24 uren matig roeren is alle hydantoïne opgelost.

Het reactiemengsel wordt geklaard door centrifugeren en vervolgens geleid door een ionuitwisselhars (Cowex 50 Vorm H ) onder elueren met een 2 N ammoniakCDlossing. 2e alkalische fracties worden 30 tot droog geconcentreerd. Men verkrijgt aldus 3,98 g D-fenylelsnine

Crendement 92,5%) waarvan de kenmerken de volgende zijn: = 23,2° + 2° Cc = 1, water) N % = 8,63 [theorie S,45)

Potenticmetrische titer: 33,3% 35 Ce optische zuiverheid van het verkregen D-fsnylalanine is groter dan 33%.

ΟΠΛ 997 3 - 8 -

Voorbeeld II

Aan 150 cm gedestilleerd water voegt men toe 4 g hydantoïne 3 van D.L-methionine en 8 cm van een celsuspensie bevattende 0,6 g droog extract [bereid onder de omstandigheden beschreven in voor-5 beeld I).

De pH wordt ingesteld op 7,8 door toevoeging van een 1 N natronloogoplossing. Het volume van het reactiemengsel wordt inge- 3 steld op 200 cm door toevoeging van gedestilleerd water. De reactie wordt 24 uren bij 37°C voortgezet onder handhaving van de pH op 10 7,8 door geleidelijke toevoeging van een 1 N natronloogoplossing.

Het D-methionine wordt in het reactiemengsel bepaald volgens 3 de methode van Stein en Moore: zijn concentratie bedraagt 17g/dm , corresponderend met een omzettingsgraad van 100% betrokken op het toegepaste hydantoïne van het D.L-methionine.

15 Het reactiemengsel wordt geklaard door centrifugeren en ver- volgens geleid door een ionuitwisselhars [Dowex 50, vorm H ]. Men verkrijgt aldus 2,7 g D-methionine (rendement 90% betrokken op het bepaalde D-methionine] waarvan de kenmerken de volgends zijn: = -19,3° (c = Ij chloorwaterstofzuur 5 N] 20 N % = 9,36 - 9,42 (theorie: 9,39]

De optische zuiverheid van het verkregen D-methionine bedraagt ongeveer 90%.

Voorbeeld III

a] Oe_bereiding_yan_het_enzymmengsel: 25 Men bereidt een kweekmedium met de volgende samenstelling: 3 - glucose 20 g/dm 3 - gistextract (DIFCO] 10 g/dm 3 - Bacte pepton CDIFC03 10 g/dm

Het mengsel wordt verdeeld ever flesjes van 250 cm3 met 50 3 o 30 cm per flesje en gesteriliseerd gedurende 15 minuten bij 120 C.

Na enten met de stam Pseudomonas sp. HM-40 worden de flesjes geroerd (250 omw./minuut] gedurende 24 uren bij 30°C.

De inhoud van één flesje wordt gebruikt voer het enten van 3 3 een fermentator van 2 dm bevattend 1 dm van net voorafgaande me-35 dium. De kweek wordt ontwikkeld gedurende 24 uren bij 30°C onder 800 2 6 27 - 9 - rosren met een turbine met 500 omw./minuut en onder beluchting met 3 steriele lucht met een debiet van 1 dm /minuut.

Aan het eind van het kweken worden de microbiële lichamen 3 afgescheiden door centrifugeren en gesuspendeerd in 100 cm gedes-5 tilleerd water; deze suspensie bevat 8,9 g droog celextract.

b) Enzymatische_hydrolyse_van_het_hydantoïne_van_>methionine: 3

Men lost 5 g hydantoïne van D.L-methionine op in 200 cm gedestilleerd water. Men stelt de pH in op 7,5 door toevoeging van 3 een 0,1 N natronloogoplossing en voegt vervolgens toe 20 cm van 10 de boven verkregen celsuspensie. Het volume wordt ingesteld op 3 250 cm ; het reactiemengsel wordt onder een stikstofatmosfeer geplaatst; de temperatuur bedraagt 37°C.

Na 5 uren reactie analyseert men de methionine aanwezig in het medium chromatografisch volgens de methode van Stein en Moore. 15 Üe hydantoïnische activiteit van de celsuspensie [aantal ymol me thionine geproduceerd per mg droog celextract en per uur enzymatische reactie] wordt berekend; zij bedraagt 4,5.

Na 22 uren reactie wordt het reactiemengsel geklaard door centrifugeren. Het gevormde methionine wordt geïsoleerd door leiden 20 door een ionuitwisselhars [Dowex 50, vorm H+] onder elueren met een 2 N ammoniakoplossing.

Na verdampen tot droog van hst eluaat en drogen verkrijgt men 3,9 g D-methionine [rendement 91%) met de volgende eigenschappen: ' 25 - N % = 9,4 [theorie: 3,39] 20 - = “23° Cc = 1; chloorwaterstofzuur 5 N] -potentiometrische titer: 96%.

Voorbeeld IV

Enzymatische_hydrolyse_yan_het hydantoïne_van para-hydroxyfenyl-30 3

Men bereidt 100 cm van een suspensie bevattende 8,9 g droog celextract door te werken onder de omstandigheden beschreven in voorbeeld III a].

Men lost 5 g hydantoïne van p-hydroxyfenylglycine op in 250 3 35 cm gedestilleerd water. Men stelt de pH in op 7,5 door toevoeging 800 2 6 27 3 - 10 - van een 0,1 N natronloogoplossing en voegt toe 20 cm van de cel- 3 suspensie. Het volume wordt ingesteld op 250 cm ; het reactiemeng-sel wordt onder een stikstofatmosfeer geplaatst; de temperatuur bedraagt 37°C.

5 Na 5 uren reactie bepaalt men het p-hydroxyfenylglycine. De hydantoïnische activiteit bedraagt 1,8 ylM aminozuur gevormd per mg droog celextract per uur reactie.

Na 22 uren reactie wordt het para-hydroxyfenylglycine geïsoleerd door leiden door een ionuitwisselhars (Dowex 50, vorm H+).

10 Hen verkrijgt aldus 3,78 g D-p-hydroxyfenylglycine (rendement 87%), homogeen in de chromatografie met de volgende eigenschappen: - N % = 7,6 (theorie: 8,4) - = -135° (c = 1. chloorwaterstofzuur 5 N) - potentiometrische titer: 110%.

15 Voorbeeld V

Men kweekt de stam Pseudomonas sp. HM-40 onder de volgende omstandigheden: - Samenstelling van het kweekmedium: 3 . glucose 20 g/dm 3 20 . dikaliumfosfaat 7 g/dm 3 . monokaliumfosfaat 3 g/dm 3 . magnesiumsulfaat 0 ,7 g/dm 3 . mangaansulfaat 0,02 g/dm . ijzer(II)sulfaat 0,02 g/dm3 25 . natriumchloride 1 g/dmw 3 . hydantoïne van D.L-methionine 3 g/dm 3 . gistextract 2 g/dm - Voorcultures: 3

Een eerste voorculture geschiedt in een flesje van 250 cm p 30 bevattend 50 cm"' medium gedurende 24 uren. Een tweede voorculture geënt met het voorafgaande flesje geschiedt eveneens gedurende 24 3 3 uren in een fermentator van 2 dm bevattende 1 dm van het kweekmedium.

- ProduKtieculture: 3 35 Ce inhoud van de fermentator van 2 dm wordt toegepast voor 800 2 6 27 Τ' - 11 - 3 3 het enten van een fermentator van 7,5 dm bevattende 5 dm medium.

Het Kweken geschiedt gedurende 24 uren bij 37°C onder beluchten 3 met steriele lucht met een debiet van 5 dm per minuut en onder roeren met een turbine roterend met 500 omw./minuut.

5 De onder deze omstandigheden verkregen levende celmassa 3 bedraagt 3,8 g droog extract per dm kweekmedium.

- Enzymreactie: »

Aan het eind van het kweken worden de microbiële lichamen geïsoleerd uit het medium door centrifugeren en gesuspendeerd in 250 3 10 cm gedestilleerd water.

Men suspendeert 10 g hydantoïne van D.L-fenylglycine in 40Q

3 cm gedestilleerd water en stelt de pH in op 7,5 door toevoeging 3 van een 0,1 N natronloogoplossing. Men voegt toe 50 cm van de voorgaande celsuspensie en het reactievolume wordt aangevuld tot 3 15 500 cm onder toevoeging van water. Men laat dan onder een stikstof- atmosfeer bij 37°C onder handhaven van de pH op 7,5 gedurende 17 uren.

IMa 17 uren reactie wordt het reactismengsel geklaard door centrifugeren, geconcentreerd door verdampen tot 1/5 van zijn volu-20 me en aangezuurd tot pH 1 door toevoeging van geconcentreerd chloor- waterstofzuur.

Het gevormde neerslag wordt afgescheiden door filtratie en gedroogd. Uit chromatografische analyse blijkt dat het om het hy-dantoïnezuur van fenylglycine gaat waarvan de eigenschappen de 25 volgende zijn: - N % = 13,9% (theorie: 14,4%] - = -137° (c = lj ammoniak 1%) - Rendement aan verkregen Q-hydantoïnezuur: 6,3% betrokken op het toegepaste hydantoïne.

30 De moederlogen worden opnieuw geconcentreerd en vervolgens gebracht op pH 5 door toevoeging van natronloog,· het neerslag van D-fenylglycine wordt afgescheiden door filtratie, gewassen met water en ethanol en vervolgens gedroogd. Men verkrijgt aldus 7,5 g D-fenylglycine (rendement 88%) met de volgende eigenschappen: 35 - N % = 9,2 (tneorie: 9,3) 20 p - = 145’' (c = 1; chlocrwaterstcfzuur 5 N).

fiOfl 2 θ 27 - 12 -

Voorbeeld VI

Het Kweken van Pseudomonas sp. HM-40 geschiedt onder de omstandigheden van voorbeeld V. Na centrifugeren worden de microbiële lichamen gesuspendeerd in de 0,1 M fosfaatbuffer bij pH 7,8* deze 5 suspensie wordt toegepast als hydrolysekatalysator voor verschil lende hydantoïnen; de reactieomstandigheden zijn de volgende: 3 - de beginooncentratie aan hydantoïne bedraagt 20 g/dm in de 0,1 M fosfaatbuffer bij pH 7,8* - de levende celmassa bedraagt 6,5 g tberekend als droog 3 10 extract) per dm reactiemengsel* - de temperatuur van de reactie bedraagt 37°C* - de duur van de reactie bedraagt 5 uren.

Het gevormde aminozuur wordt vervolgens geanalyseerd in het reactiemengsel en men leidt er de enzymatische activiteit van het 15 celextract uit af.

De aldus bepaalde activiteiten zijn vermeld in de volgende tabel in yM gevormd aminozuur per mg droog enzymextract per uur reactie.

De resultaten zijn verenigd in de volgende tabel: 20 Substraat Formule Activiteit yM/mg/ii hydantoïne van D.L-methionine 1 2,4 hydantoïne van D.L-fenylalanine 2 2,0 hydantoïne van D.L-ieucine 3 1,6 25 hydantoïne van D.L-valine 4 1,0 hydantoïne van D.L-tryptofaan 5 0,7 hydantoïne van D.L-fenylglycine 6 0,6 hydantoïne van D.L-para-hydroxy- fenylglycine 7 0,5 30 racsmisch cyanopropyl-hydantoïne 8 3,5 hydantoïne van O.L-meta-hydroxy- fenylglycine 3 0>7

Voorbeeld VII

Een celsuspensie van Pseudomonas sp. HM-4G in de fosfaatbuf-35 fsr werd verkregen op de wijze zoals beschreven in voorbeeld Vi. De- 800 2 6 27 3 V f - 13 - ze suspensie bevatte S,5 g droog extract in IOC cm ; voor gebruik zijn de cellen gemalen door ultrasonische trillingen onder de volgende omstandigheden: - toestel: PONS voorzien van sonde TC^C.

5 - ultrasonische frequentie: 20 kHz 3 - behandeld volume: 15 cm

- temperatuur in de buurt van 0°C

- maalduur: 10 minuten.

De aldus behandelde suspensie wordt toegepast voor het kata-10 lyseren van de hydrolyse van de hydantoïnen van methionine, fenyl- alanine en fenylglycine onder de experimentele omstandigheden beschreven in voorbeeld VI. De bepaalde activiteiten zijn dan de volgende :

Substraat Activiteit

CyM gevormd aminozuur/ji/mg droog extract) hydantoïne van D.L-methionine 1,7 hydantoïne van D.L-fenylalanine 1,0 hydantoïne van D.L-fenylglycine 0,8

20 Voorbeeld VIII

Een celsuspensie van Pseudomonas sp. Hfl-40 in water verkre- 3 gen als in voorbeeld V en bevattend 7,3 g droog extract in 100 cm werd gelyofiliseerd vóór georuik onder de volgende omstandigheden: 3 120 cm van de suspensie werden verdeeld in vier kolven van q -2 25 500 cm“, bevroren en onder verlaagde druk gesteld [0,5 x 10 mm 'kwik) gedurende 16 uren. Men verkrijgt 3,8 g gelyofiliseerd enzym- poeder, dat wordt toegepast onder de omstandigheden beschreven in voorbeeld VI.

De bepaalde activiteiten zijn ds volgende: 30 Substraat Activiteit [yiM gevormd aminozuur/Ji/mg droog extract) hydantoïne van D.L-methionine 2,4 hydantoïne van D.L-fenylglycine 0,4 35 hydantoïne van D.L-fenylalanine 1,5 800 2 6 27

Claims (11)

1. Werkwijze voor het bereiden van D-^-aminozuren, met het kenmerk, dat men een op de 5-plaats gesubstitueerd hydantoïne hydroly-seert bij aanwezigheid van een enzym verkregen door het kweken van een microörganisme aangeduid met de naam Pseudomonas sp. HI4-40 5 (CBS 259.79] en vervolgens het verkregen D-<=>4-aminozuur isoleert.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het enzym wordt verkregen door kweken van het microörganisme Pseudomonas sp. ΗΓ1-40 in een medium dat tenminste één assimileerbare koolstof-en één assimileerbare stikstofbron bevat.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het mi lieu bovendien een racemisch hydantoïne bevat.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het op de 5-plaats gesubstitueerde hydantoïne in aanraking wordt gebracht met het enzyme in het kweekmilieu van het microörganisme.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het op de 5-plaats gesubstitueerde hydantoïne in aanraking wordt gebracht met een enzymmengsel.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het in het medium overblijvende L-hydantoïne wordt geracemiseerd tot D.ΙΣΟ hydantoïne onder invloed van het microörganisme Pseudomonas sp. HM- 40.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het enzyme eveneens het hydantoïnezuur, dat zich intermediair vGrmt in de loop van de hydrolyse van het op de 5-plaats gesubstitueerde 25 hydantoïne tot het overeenkomstige D-öC-aminozuur hydrolysssrt.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het verkregen aminozuur D-fenylalanine is.

9. Werkwijze volgens conclusie 1, met het Kenmerk, dat het verkregen aminozuur D-methionine is.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het ver kregen aminozuur D-fenylglycine is.

11. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het verkregen aminozuur D-p-hydroxyfenylglycine is. 800 2 6 27