SE448883B - Forfarande for framstellning av d-alfa-aminosyror - Google Patents

Description

448 885 2 Efter H8 timmars inkubering: större kolonier (diameter ca 1-1,5 mm), vilka har tydliga kanter och är halvgenomskinliga.

Efter H dygns inkubering: ännu större kolonier (diameter ca H mm), vilka är ogenomskinliga och slemmiga. (b) Näringsbuljong vid BOOC.

I provröv (10 x 160 mm) innehållande 5 cmš medium kan en ut- veckling iakttagas efter ZÄ timmar, men utvecklingen är ganska obe- tydlig. Utvecklingen ökar under de följande dygnen. Härvid bildas en likformig grumling och ett sediment, vilket häftar ganska kraftigt vid rörens botten. Koldioxidgas (10%) ökar icke utvecklingen. (c) Olika fasta medier.

På näringsagar och på "Brain Heart Infusion Agar" sker samma utveckling och erhålles kulturer med samma utseende som ovan har angivits för odlingen på tryptikas-soja-agar-medium. (d) Olika Flytande medier.

På "Brain Heart Infusion Agar", vatten försatt med pepton, vatten försatt med trypton, näringsbuljong med jästextrakt sker samma utveckling och erhålles kulturer med samma utseende som ovan har angivits för odlingen i näringsbuljong. På tryptikas-soja- buljong och på vatten försett med pepton och glukos (O,2%) är ut- vecklingen något svagare. (2) Morfologi. (a) Mikroskopisk undersökning utan färgning.

Efter 2Ä timmars odling i flytande medium vid 37°C erhålles spolformade baciller med en längd av 0,5-5 pm. Bacillen är rörlig, och rörligheten är kraftigast när inkubering genomföras vid 2Ä-3000. (b) Mikroskopisk undersökning efter färgning.

Mikroorganismen är gram-negativ. Den centrala delen av bak- teriekroppen är ofta svagast färgad. (3) Optimal utvecklíngstemperatur: ZHUC; god utveckling 3006: mycket god utveckling 37°C: medelmåttlig utveckling H2°C; svag utveckling.

(H) Odlingsegenskaper och biokemiska egenskaper. (a) Andningstyp: sträng aerob. (b) Oxidas: positiv. (c) Katalas: positiv. (d) "Mac Conkey Agar": riklig kultur. (e) (f) (a) (h) (1) (J) (k) (1) (m) (n) (0) (p) (q) (r) (S) (t) (u) (v) (w) (x) (v) När 448 883 3 "Salmonella Shigella Agar": foga riklig kultur.

"Cetrimide Agar“: ingen utveckling.

Ureas (i Ferguson-medium): positiv.

Produktion av indol: negativ.

Prov med metylrött: negativt.

Voges-Proskauer-prov: negativt.

Utnyttjande av citrater (Simmons): psotivt under H8 timmar; alkalinisering.

Smältning av gelatin: negativ.

Oxidations-jäsningsprov (Hugh och Leifson): oxiderande.

Bildning av syror utgående från kolhydrater: glukos: positiv laktos: positiv arabinos: positiv maltos: positiv mannitol: positiv sackaros: positiv xylos: positiv.

Reduktion av nitrater: positiv.

Reduktion av nitriter: negativ.

Denitrifiering: negativ.

Bildning av pigment: negativ.

Bildning av H28: på mediet "Triple Sugar Iron Agar": mycket svagt positiv. papper med basiskt blyacetat: spår av H28.

Hemolys (hästblod): negativ.

Lwflmmsmjölk: ingen modifiering. ß-galaktosidas: positiv.

Arginin-dihydrolas: negativ.

Lysin-dekarboxylas: negativ.

Ornitin-dekarboxylas: negativ. man odlar stammen Pseudomonas sp. HM-H0 i klassiska od- lingsmedier, bildas det enzym som kan omvandla hydantoiner till mot- svarande D-0(-aminosyror huvudsakligen i mikroorganismens celler och endast till en mindre del i odlingsmediet.

Odlingsmediet bör huvudsakligen innehålla källor för assimi- lerbart kol och källor för assimilerbart kväve samt andra närings- äinxnf-rl nom ih' Iníñflvšímulïgfgx För llt-vouklírniçcsrx av :zmmlrrxc-rx llM-(IO, :xšïzzoïrx oorganiska nultvrn Produktionun av cnzym kan förbättras, om man till odlingsmediet sätter en hydantoin substituerad i 5-ställning 448 885 H såsom kvävekälla. För detta ändamål använder man vanligen den hydan- toin som motsvarar metionin, men även andra hydantoiner kan med för- del användas, såsom den hydantoin som motsvarar valin, den hydantoin som motsvarar leucin, den hydantoin som motsvarar isoleucin och 5- cyanopropylhydantoin.

Såsom källor för assimilerbart kol kan man använda kolhydra- ter, såsom glukos, sackaros, laktos eller maltos, antingen i ren form eller i form av komplexa material, såsom melass och laktoserum.

Man kan även använda alkoholer eller organiska syror. Vissa anima- liska eller vegetabiliska oljor, såsom späckolja eller sojaolja, kan ersätta dessa olika kolkällor eller användas såsom tillsats till dem.

De lämpliga källorna för assimilerbart kväve är ytterst va- rierande. De kan vara mycket enkla kemiska föreningar, såsom oorga- niska eller organiska ammoniumsalter eller karbamid.. De kan också utgöras av komplexa substanser, som huvudsakligen innehåller kväve i proteinform. Bland de tillsatta oorganiska ämnena kan vissa ha en buffrande eller neutraliserande verkan, såsom alkalimetall- eller jordalkalimetallfosfater eller kalcium- eller magnesiumkarbonater.

Andra oorganiska ämnen ger den nödvändiga jonjämvikten för utveckling- en av stammen HM-HO, såsom klorider och sulfater av alkalimetaller och alkaliska jordartsmetaller samt salter av zink, kobolt, järn, koppar och mangan. pH-värdet i jäsningsmediet bör vid odlingens början vara mel- lan U och 9, företrädesvis mellan 6 och 8. Den för jäsningen opti- mala temperaturen är mellan 25 och 3500, men en tillfredsställande produktion erhålles vid temperaturer mellan 20 och 3700.

Lufttillförseln vid jäsningen kan variera inom ganska vida gränser. Man har emellertid funnit, att en lufttillförsel av 0,3- 3 liter per liter odlingsbuljong och minut är särskilt lämplig.

Det maximala utbytet erhålles efter 10-72 timmars odling, varvid den optimala tiden huvudsakligen beror på det använda mediet.

Eftersom enzymet huvudsakligen produceras i cellerna, kan omvandlingen av hydantoin substituterad i 5-ställning till D-0(-ami- nosyra genomföras med användning av odlingsmediet innehållande cel- lerna, eller man kan använda celler isolerade från odlingsbuljongen genom centrifugering. Dessa celler kan användas såsom sådana, ef- ter utfällning med aceton eller lyofilisering. Man kan även använda cellerna i form av ett cellulärt extrakt erhållet genom malning el- ler behandling med ultraljud. 9 448 883 Omvandlingen av den i 5-ställningen substituerade hydantoinen till motsvarande D-K-eminosyra genomförs vanligen i vattenhaltigt medium vid ett pH-värde av mellan 6 och 9, företrädesvis nära pH 7,8. pH-värdet hålles eventuellt nära detta värde genom tillsättning av en alkalisk vattenlösning, särskilt natriumhydroxidlösning.

Omvandlingsreaktionen genomföras vanligen vid en temperatur mellan 20 och 5500, företrädesvis vid en temperatur nära 3700.

Koncentrationen av hydantoin i reaktionsmediet är en funktion av lösligheten. Hydantoinkoncentrationen är vanligen nära 5 g per 100 ml lösning, men koncentrationen kan även vara högre än 10 g/100 ml lösning.

Reaktionsmediet kan innehålla ytaktiva ämnen, antioxidanter och koenzymer, vilka kan främja bildningen av D-N'-aminosyran och sålunda möjliggöra en förbättring av utbytet.

N Reaktionstiden är vanligen mellan 2 timmar och Ä dygn. Reak- tionen får i själva verket fortgå ända till dess att det icke längre sker någon omvandling av hydantoin till D-Of-aminosyra.

Under omvandlingen av hydantoin till D~ såsom mellanprodukt bildas en D-hydantoinsyra, vilken under inverkan av det enzymatiska systemet omvandlas till D~d-eminosyra. Förfaran- det enligt uppfinningen kan alltså genomföras antingen med en hydan~ toin eller med en hydantoinsyra eller med en blandning av hydantoin och hydantoinsyra. gfl Stammen HM-40 racemiserar alltså L-hydantoin in situ.

På grund härav kan racemisk hydantoin använd såsom utgängsmaterial omvandlas fullständigt till D-d -aminosyra Den genom förfarandet enligt uppfinningen erhållna D-$K~amino~ syran kan isoleras från reaktionsmediet enligt vanliga metoder för separation av aminosyror, vanligen efter klarning av reaktionsmediet genom centrifugering och filtrering genom jonbytare. Vanligen ge- nomför men en utfällning av aminosyran vid dess isoelektriska punkt.

Uppfinningen illustreras genom följande, icke begränsande exem- pel.

Exempel 1. (a) Framställning av en enzymatisk komposition.

Man framställer ett odlingsmedium med följande sammansättning: glukos 20 g/l; monokaliumfosfat 3 g/l; dikaliumfosfat 7g/1; magne- siumsulfat 0,7 g/l; mangansulfat 0,02 g/l; järn(II)sulfat 0,02 g/1; natriumklorid lg/1; hydantoin motsvarande D,L-metionin 3 g/1. 448 883 2 6 Odlingsmediet fördelas i 250 cmz kolvar i en mängd av 50 cm; per kolv, varefter man steriliserar vid 12000 under 15 minuter. Ef- ter ympning med stammen Pseudomonas sp., HM-40 odlad på selektivt agarmedium omskakas kolvarna (250 varv/minut) under Ä8 timmar vid 3o°c.

Man genomför produktionsodlingen i en 2-liters jäsningsbehål- lare innehållande 1 liter av det ovan angivna odlingsmediet och 1 cm3 skumdämpare. Man ympar med innehållet i en av de ovan beskrivna kol- varna. Kulturen får utvecklas vid 3000 under 48 timmar, varvid man omrör med en omrörare som roterar med 500 varv/minut och luftar med 1 liter steril luft/minut.

Efter avslutad odling avskiljes cellerna genom centrifugering, varefter cellerna suspenderas i 50 cmš destillerat vatten. Den er- hållna suspensionen innehåller 7,6 g torrt cellextrakt per 100 cmš, (b) Hydrolys av hydantoin motsvarande D,L-fenylalanin.

Till 200 cmš destillerat vatten sätter man 5 g hydantoin mot- svarande D,L-fenylalanin. Efter upphettning för partiell upplösning av hydantoinen kyles reaktionsmediet till 3700. Man inställer pH- värdet på 7,8 genom tillsättning av en N natriumhydroxidlösning.

Man tillsätter därefter 25 cm3 av den ovan framställda suspensionen av celler. Reaktionsblandningens volym inställes på 250 cmš, och pH-värdet inställes på 7,8. _ Reaktionsblandningen placeras i kvävgasatmosfär vid en tempera- tur av 3700. pH-värdet hålles på 7,8 genom successiv tillsättning av en N natriumhydroxidlösning. Efter 24 timmars måttlig omrörning har hela mängden hydantoin löst sig.

Reaktionshlandningen klargöres genom centrifugering, varefter den ledes genom en katjonbytare (Dowex 50 i H+-form). Man eluerar med en 2N ammoniaklösning. De alkaliska fraktionerna koncentreras till torrhet. Man erhåller härvid 3,98 g D-fenylalanin (utbyte 92,5%). Produkten har följande egenskaper: mi? N% 8,63 (teoretiskt 8,U8) Potentiometrisk titer: 93,3%.

Den optiska renheten hos den erhållna D-fenylalaninen är hög- re än 93%.

Exempel 2. Till 150 cm3 destillerat vatten sätter man Ä g 3 av en collsuspennion innehållande 0,6 g torrsubstans (framställd på samma sätt som be- skrives i exempel 1). 29,20 3 20 (c = 1;vatten) hydantoin motsvarande D,L-metionin och 8 cm .li .\\ 448 883 7 pH-värdet ínntälles pâ 7,8 genom tíllsättning av en N nat- riumhydroxjdlöuning. Huuktionnblnndníngvnu volym instüilos på P00 cmj genom tillsättning av destillerat vatten. Reaktionen får äga rum under QU timmar vid 3700, varvid man håller pH-värdet vid 7,8 genom uuoccnuiv tiilsättning av en N natriumhydroxldlösning.

Koncentrationen av bildad D-metionin bestämmes i reaktions- mediet enligt Stein och Moores metod. Man erhåller en koncentra- tion av 17 g/liter, vilket motsvarar en omvandlingsgrad av 100%, räknat på den använda hydantoínen motsvarande D,L-metionin.

Reaktionsblandningen klargöres genom centrifugering och le- des därefter genom en katjonbytare (Dowex 50 i H+-form). Man er- håller härvid 2,7 g D-metionin (utbyte 80% räknat på den analytiskt bestämda mängden D-metionin). Produkten har följande egenskaper: [åšíåo -19,3° (c = 1; 5N H01) N% 9,36 - 9,Ä2 (teoretiskt 9,39) Den erhållna D-metioninen har en optisk renhet av nära 90%.

Exempo__ä. (a) Framställning av en enzymatisk komposition.

Man framställer ett odlingsmedium med följande sammansätt- ning: glukos 20g/l; jästextrakt (DIFCO) 10 g/l: bakto-pepton (DIFCO) 10 g/1.

Detta medium fördelas i 250 cmj kolvar i en mängd av 50 cmš per kolv, varefter man steriliserar vid 12000 under 15 minuter.

Efter ympning med stammen Pseudomonas sp., HM-40 omskakas kolvarna (250 varv/minut) under 2ü timmar vid 3000.

Innehållet i en kolv användes för ympning av en 2 liters jäsningsbehållare innehållande 1 liter av det ovan angivna mediet.

Kulturen får utvecklas under ZÄ timmar vid 30°C, varvid man omrör med en omrörare som roterar med 500 varv/minut och luftar med 1 liter steril luft/minut.

Efter avslutad odling avskiljes bakteriecellerna genom cent- rifugering, varpå cellerna suspenderas i 100 cm3 destillerat vatten.

Den erhållna suspensionen innehåller 8,9 g torrt cellextrakt. (b) Enzymatisk hydrolys av hydantoin motsvarande metionin.

Man löser 5 g hydantoin motsvarande D,L-metionin i 200 cmj destillerat vatten. Man inställer pH-värdet på 7,5 genom tillsätt- ning av en O,1N natriumhydroxidlösning, varefter man tillsätter HU umš nv don ovan framställda oulinuuponnïonvn. Voiymvn inutüllun på 250 cmj, och roaktionsblandningen placeras i kvävgasatmosfär vid en temperatur av 3700. 448 883 8 Efter en reaktionstid av 5 timmar bestämmes halten metionin i reaktionsmediet på kromatografisk väg enligt Stein och Moores me- tod. Man beräknar cellsuspensionens hydantoinasaktivitet, dvs. antalet¿¿mol bildad metionin per mg torrt cellextrakt och per timme enzymatisk reaktionstid. Denna aktivitet är 4,5.

Efter 22 timmars reaktionstid klargöres reaktionsblandningen genom centrifugering. Den bildade metioninen isoleras genom att reaktionsblandningen ledes genom en katjonbytare (Dowex 50 i H+- form), varvid man eluerar med en 2N ammoniaklösning.

Efter indunstning av eluatet till torrhet och torkning er- håller man 3,9 g D-metionin (utbyte 91%). Produkten har följande egenskaper: N% = 9,Ä (teoretiskt 9,39) Iøtjšo = -23° (c ='1; SN Hcl) Potentiometrisk titer: 98%.< Exempel H. Enzymatisk hydrolys av hydantoin motsvarande para-hydroxifenylglycin.

På samma sätt som beskrives i exempel 3(a) framställer man 100 cm; av en suspension innehållande 8,9 g torrt cellextrakt.

Man löser 5 g hydantoin motsvarande p-hydroxifenylglycin i 250 cmš destillerat vatten. Man inställer pH-värdet på 7,5 genom tillsättning av en 0,1N natriumhydroxidlösning, varefter man till- 3 av cellsuspensionen. Volymen inställes på 250 cm3, sätter 20 cm och reaktionsblandningen placeras i kvävgasatmosfär vid en tempera- tur av 37°C.

Efter en reaktionstid av 5 timmar bestämmes halten p-hydroxi- fenylglycin. Hydantoinasaktiviteten är 1,8¿gmol bildad aminosyra per mg torrt cellextrakt och per timme reaktionstid.

Efter en reaktionstid av 22 timmar isoleras p~hydroxifenyl- glycinen genom att reaktionsblandningen ledes genom en katjonbytare (Dowex 50 i H+-form). Man erhåller härvid 3,78 g D-p~hydroxifenyl- glycin (utbyte 87%) i form av en kromatografiskt homogen produkt med följande egenskaper: N% = 7,6 (teoretiskt 8,H) [gjâo = -155° (c = 1; 5N Hcl) Potentiometrink Liter: 110%.

Exempel 5. Man odlar stammen Pseudomonas sp. HM-H0 l ett odlingsmedium med följande sammansättning: glukos 20 g/1; dikalium- fosfat 7 g/1; monokaliumfosfat 3 g/1; maßncsiumsulfat 0,7 g/l; ...,-._.._.__.._...,.,. ....._ _. _, _....._....._,_,_,_ m; 448 883 9 mangansulfat 0,02 g/l; järn(II)sulfat 0,0? g/1; natriumklorid 1 g/1; hydantoin motsvarande D,L-metionin Bg/l; jästextrakt 2 g/l.

Man genomför en första förodling under 2U timmar i en 250 cmš kolv innehållande 50 cmš odlingsmedium. En andra förodling genom- föres under 2H timmar i en 2 liters jäsningsbehållare innehållande 1 liter odlingsmedium, varvid man ympar med innehållet i den kolv, vari den första förodlingen har genomförts.

Innehållet i jäsningsbehållaren med volymen 2 liter användes för ympning av en 7,5 liters jäsningsbehållare innehållande 5 liter odlingsmedium. Man genomför produktionsodling i den sistnämnda jäs- ningsbehållaren, varvid kulturen får utvecklas under 2H timmar vid 3700. Man luftar med 5 liter steril luft per minut och omrör med en omrörare roterande med 500 varm/minut.

Den under dessa betingelser erhållna biomassan utgör 3,8 g torrt material per liter odlingsmedium.

Efter avslutad odling isoleras bakteriecellerna från odlings- medíet genom centrifugering, varefter cellerna suspenderas i 250 cm3 destillerut vatten. 10 g hydantoin motsvarande D,L-fenylglycin suspenderas i 400 cmš destillerat vatten, varpå pH-värdet inställes på 7,5 genom tillsättning av en 0,1N natriumhydroxidlösning. Man tillsätter 50 cmš av den ovan framställda cellsuspensionen, och reaktionsbland- ningens volym inställes på 500 cmš genom tíllsättning av vatten.

Den enzymatiska reaktionen får äga rum i kvävgasatmosfär vid 3700, varvid pH-värdet hâlles på 7,5 under hela reaktionstiden om 17 tim- mar.

Efter 17 timmars reaktionstid klargöres reaktionsblandningen genom centrifugering, varpå den indunstas till en femtedel av sin ursprungliga volym och surgöres till pH 1 genom tillsättning av koncentrerad saltsyra.

Den bildade fällningen avskiljes genom filtrering och torkas.

En kromatografisk analys visar, att fällningen utgöres av den hydan- toinsyra som motsvarar fenylglycin. Denna syra har följande egen- skaper: N% = 13,9% (teoretiskt 1H,4%) [qjšo = -137° (c = 1; ammoniak 17.) Utbytet av D-hydantoinsyra är 6,3%, räknat på tillförd mängd hydantoin.

Moderlutarna koncentreras ytterligare, varefter pH-värdet ínställes på 5 genom tillsättning av natriumhydroxid. Den bildade 448 883 10 i -- fällningen av D-fenylglycin avskiljes genom filtrering, tvättas med vatten och med etylalkohol och torkas. Man erhåller härvid 7,6 g D-fenylglycin (utbyte 88%) med följande egenskaper: N% = 9,2 (teoretiskt 9,3) [qjšo = -1M8° (c = 1; 5N H01) Exempel 6. Man odlar Pseudomonas HM-H0 under samma betingel- ser som anges i exempel 5. Efter centrifugering suspenderas de av- skilda bakteriecellerna i en O,1M fosfatbuffert (pH 7,8). Den er- hållna suspensionen användes såsom katalysator för hydrolys av oli- ka hydantoiner. Följande hydrolysbetingelser användes. Den ur- sprungliga hydantoinkoncentrationen är 20 g/1 i en 0,1N fosfatbuf- fert (pH 7,8). Man använder 6,5 g biomassa (räknat såsom torrsub~ stans) per liter reaktionsblandning. Reaktionstemperaturen är 37°C, och reaktionstiden är 5 timmar.

Den bildade aminosyran analyseras i reaktionsblandningen, och med hjälp av den bestämda halten beräknas cellextraktets enzyma- tiska aktivitet.

De erhållna resultaten är sammanställda i nedanstående tabell, där de angivna aktivitetsvärdena är uttryckta i nmol bildad amino- syra per mg torrt enzymatiskt extrakt och per timme reaktionstid.

H* 448 883 11' Akt ivitet Substrat Formel “HA@5qfl ' co -- nu Hydantoin motsva- ~“' rande DL-metionin CH3-S-cH2_CH3_cH'“*'NH ._ go 2'# Hydantoín motsva- co--NH rande DL-fenyl- / \ CE _03 f' | 2 0 a-lanin __ 2 . ___ ' H dantoin motsva- CE C0-NH rånde DL-leucin 3\\ 'I | /cx-cxa-cfl \ 1 , 6 CH; NH -CO Hydantoin motsva- ,,C0'*"NF _ - CH -CH -CE -CH 1 0 rande DL valln 3 2 2 \NH___Co 1 Hydantoin motsva- ,/C0"'NE rande DL-trypto- 032-03-\ 1 0,7 fan I MH - co NH ' Hydantoin motsva~ _CH/'C°'“_TE 0 6 rande DL-fenyl- -NB___Co ' glycin Hydantoin møtsva- /,C°'__?H rande DL-para- H0 CH 0 5 hydrçxifenyl- “\NE __g0 ' glycln _ Rabemisk cyano- C0"NH propylhydantoln CN_cH2_CE2_cH2_cH 1 3w5 NE-CO Hydantoin motsva~ 0' CO--NH rande DL-meta- CH¿/ i O 7 hydroxlfenyl- > -\NH___C° 1 glycin 448 ass 12 Exempel 7.* En cellsuspension av Pseudomonas HM-H0 i fosfat- buffert framställes på samma sätt som beskrivas i exempel 6. Denna suspension innehåller 6,5 g torra celler per 100 cmš. Före använd- ningen krossas cellerna med hjälp av ultraljud under följande be- tingelser. Man använder en Pons-apparat försedd med en sond TCNC.

Ultraljudfrekvensen är 20 kHz. Den behandlade volymen är 15 cmš, temperaturen hâlles nära 000, och behandlingstiden är 10 minuter.- Den sålunda behandlade suspensionen användes såsom katalysa- tor för hydrolys av de hydantoiner som motsvarar metionin, fenyl- alanin respektive fenylglycin, varvid hydrolysen genomföres under samma betingelser som anges i exempel 6. I nedanstående tabell an- ges de uppmätta aktiviteterna i pmol bildad aminosyra per mg enzy- matiskt extrakt och per timme reaktionstid.

Substrat I Aktivitet lpM/(mg-h) Hydantoin motsvarande DL-metionin . I 1,7 Hydantoin motsvarande DL-fenylalanín 1,0 Hydantoin motsvarande DL-fenylglycin 0,8 Exempel 8. En cellsuspension av Pseudomonas sp. HM-H0 i vat- ten framställes pâ samma sätt som beskrives i exempel 5. Den fram- ställda suspensionen innehåller 7,3 g torra celler per 100 cmš.

Suspensionen lyofiliseras före användning under följande betingelser. 120 cm5 suspension fördelas i fyra kolvar med volymen 500 cmš.

Innehållet i kolvarna fryses och hålles under förminskat tryck (0,5 X 1o'2 serat enzymatiskt pulver, vilket användes för hydrolys under samma mm Hg) under 16 timmar. Man erhåller härvid 8,8 g lyofili- betingelser som anges i exempel 6. I nedanstående tabell anges de uppmätta aktiviteterna i pmol bildad aminosyra per mg torrt extrakt och per timme reaktionstid. 13 448 885 Uubuhrut Aki/Ä Vlßüí, pM/(mg-h) Hyduntuín mmLuvuvundc Uh~mnLínnln 2,5 Hydantoín motsvarande DL~fenylg1ycín 0,14 Hydantoin motsvarande DL-fenylalanin 1,5

Claims (8)

P a t e n t k r a v

1. Förfarande för framställning av D-a-aminosyror, k ä n - n e t e c k n a t a v att en i S-ställning substituerad L-hydantoin racemiseras i närvaro av ett enzymatiskt system producerat av míkroorganismen Pseudomonas sp, HM-40 (CBS 259.79), att den härvid erhållna D,L-hydantoinen hydrolyseras med hjälp av samma enzymatiska system, och att den bildade D-u-aminosyran isoleras.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att det enzymatiska systemet har erhållits genom odling av mikroorganismen Pseudomonas sp, HM-40 i ett medium innehållande minst en källa för assimilerbart kol och minst en källa för assimilerbart kväve.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att den i 5-ställning substituerade L-hydantoinen och den därav bildade DL-hydantoinen bringas i kontakt med det enzymatiska systemet i det medium vari mikroorganismen odlas.

4. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att den i 5-ställning substituerade L-hydantoinen och den därav bildade DL-hydantoinen bríngas i kontakt med en enzymatisk komposition producerad av Pseudomonas sp, HM-40.

5. Förfarande enligt något av kraven 1-4, k ä n n e - t e c k n a t a v att den framställda aminosyran är D-fenyl-' alanin.

6. Förfarande enligt något av kraven 1-4, k ä n n e - t e c k n a t a v att den framställda aminosyran är D-metio- nin.

7. Förfarande enligt något av kraven 1-4, k ä n n e - t e c k n a t a v att den framställda aminosyran är D-fenyl- glycin.

8. Förfarande enligt något av kraven 1-4, k ä n n e - t e c k n a t a v att den framställda aminosyran är D-p- -hydroxifenylglycin. m.