FI87579B - Foerfarande foer framstaellning av amider anvaendande mikroorganismer - Google Patents

Description

1 87579

Menetelmä amidien valmistamiseksi mikro-organismeja käyttäen

Kyseessä oleva keksintö koskee amidien valmistus-5 menetelmää mikro-organismeja käyttämällä. Lähemmin se koskee nitriilien hydratointimenetelmää mikro-organismien toiminnan avulla, vastaavien amidien valmistamiseksi tällä tavoin.

Viime vuosina on lisääntyvästi suoritettu laajoja 10 tutkimuksia mikro-organismien ja entsyymien käyttämisestä kemiallisten aineiden erilaisiin valmistuksiin.

Entsyymi, joka pystyy hydratoimaan nitriilejä vastaavien amidien muodostamiseksi, tunnetaan nitrolaasina tai nitriilihydrataasina. On kuvattu, että bakteereilla, 15 jotka kuuluvat sukuun Bacillus, Pevotin mukaan sukuun

Bacteridium, sukuun Micrococcus sekä sukuun Brevibacterium (japanilainen patenttihakemus (OPI) no 86186/76 (vastaten US-patenttia 4 001 081) (termiä "OPI" tässä yhteydessä käytetään tarkoittamaan "julkaistua, tutkittua japanilais-20 ta patenttihakemusta")), bakteereilla, jotka kuuluvat sukuun Corynebacterium sekä sukuun Nocardia (japanilainen patenttijulkaisu no 17918/81, vastaten US-patenttia 4 248 968) sekä bakteereilla, jotka kuuluvat sukuun Pseudomonas (japanilainen patenttijulkaisu no 37951/84), 25 on nitrilaasi-aktiivisuutta ja ne hydratoivat nitriilejä vastaavien amidien muodostamiseksi, erityisesti asylo-nitriilejä, akryyliamidin muodostamiseksi.

Kyseessä oleva keksintö koskee menetelmää amidi-yhdisteen valmistamiseksi mikro-organismeja käyttämällä, 30 jossa menetelmässä nitriili, jossa on 2-6 hiiliatomia, saatetaan bakteereiden toiminnan kohteeksi, bakteereiden, jotka kuuluvat sukuun Rhodococcus, sukuun Arthrobacter tai sukuun Microbacterium, joilla on aktiivisuutta hydratoida nitriilejä vastaavien amidien muodostamiseksi vettä sisäl-35 tavassa väliaineessa.

Kyseessä oleva menetelmä on erityisen tehokas valmistettaessa akryyliamidia akryylinitriilistä.

2 87579

Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti käytetyt mikro-organismit ovat bakteereita, joilla on nitrilaasi-aktiivisuutta ja jotka kuuluvat sukuun Rhodococcus, sukuun Arthrobacter sekä sukuun Microbacterium. Tyypillisiä esi-5 merkkejä ovat Rhodococcus laji S-6 FERM Bp-687, Rhodococcus erytropolis IFM 155, Rhodococcus rhodochrous IFM 153, Arthrobacter oxydans IFO 12138, Arthrobacter aurescens IAM 12340 sekä Microbacterium flavum IAM 1642.

Bakteerit, joita merkitään symbolein IFM, IFO ja 10 IAM, ovat tunnettuja mikro-organismeja ja ne ovat helposti saatavissa vastaavasti seuraavista laitoksista The Japanese Federation of Culture Collections of Microorganisms (JFCC) of Research Institute for Chemobiodynamics, Chiba University (IFM); The Institute for Fermentation, Osaka (IFO); 15 ja Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo (IAM). Rhodococcus-laji S-6 on kyseessä olevan keksinnön tekijöiden eristämä kanta, jolla on erityisesti nitrilaa-si-aktiivisuutta, ja joka on tallennettu Japanissa laitokseen, nimeltään Fermentation Research Institute, Agency 20 of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade and Industry, FERM-Bp-numerona 687. Kannan bakteriologiset ominaisuudet esitetään alla.

Rhodococcus sp. S-6 (а) Morfologia 25 (1) Pieni, muodoltaan pyöreä, läpimitta 0,5-0,8 ^um x pituus 1-5yUm (2) Viljelyn alkuvaiheessa solu on muodoltaan pitkänomaisen pyöreä ja havaitaan epäsäännöllisiä haaroja. Myöhemmin se murtuu ja pilkkoutuu pallomaiseksi tai ly- 30 hyeksi, sauvamaiseksi muodoksi (pleomorfismi) (3) Liikkuvuus: liikkumaton (4) Itiöiden muoto: ei itiöitä (5) Gram-värjäys: positiivinen (+) (б) Happovärjäyksen pysyvyys: negatiivinen (-) 35 (b) Kasvun muoto erilaisissa elatusaineissa (30°C) (1) Lihaliemi-agar-levyviljelmä: pesäkkeet ovat pyö- 3 37579 reitä, epäsäännöllisiä, pinnaltaan pehmeitä ja väriltään vaaleanpunaisia (2) Lihaliemi-agar-vinopintaviljelmä: hyvä kasvu, poikkileikkaukseltaan puolisuunnikkaan muotoinen, ei kiil- 5 toa ja jossain määrin vaaleanpunainen (3) Nestemäinen lihaliemiviljelmä: voimakas kasvu, samalla kun soluketto muodostuu, ja neste on läpinäkyvää ja saostuu kasvun myötä (c) Fysiologiset ominaisuudet 10 (1) Nitraatin pelkistyminen: positiivinen (+) (2) Urean hajoaminen: positiivinen (+) (3) Indolin valmistus: negatiivinen (-) (4) Tärkkelyksen hydrolyysi: negatiivinen (-) (5) Gelatiinin hajoaminen: negatiivinen (-) 15 (6) Selluloosan hajoaminen: negatiivinen (-) (7) Oksidaasi: negatiivinen (-) (8) Katalaasi: positiivinen (+) (9) Vapaan hapen tarve: positiivinen (+) (10) Kasvu anaerobisissa olosuhteissa: negatiivi-20 nen (-) (11) O/F-testi: 0 (12) Kasvu 37°C:ssa: positiivinen (+) (13) Vitamiinien tarve: negatiivinen (-) (14) Kaasun muodostuminen glukoosista: negatii- . ‘ 2 5 vinen (-) (15) Hapon muodostuminen glukoosista: positiivinen ( + ) (d) Solujen kemiallinen koostumus (1) Sisältävät meso-diaminopimeliinihappoa, arabi-30 noosia sekä galaktoosia (B. Becker et ai., Applied Microbiology, osa 12, s. 421 (1964), sekä H.A. Lechevalier et ai., The Actinomycetales, s. 311 (1970)) (2) Sisältävät rasvahappoja C^g (n, F^), C^q (F^) sekä dO-CH^) tärkeimpinä rasvahappoina (K. Komagata 35 et ai., International Journals of Systematic Bacteriology, osa 33 (2), s. 188 (1983)) 4 37579 (3) Sisältävät C^2~c4g-mY^°1ihappoja mykolihappo-tyyppinä (M. Goodfellow, Microbiological Classification and Identification, (1980)).

Kirjallisuusviitteiden Bergey's Manual of Deter-5 minative Bacteriology, H. Ans-G. Schlegel, The Prokaryotes, osa II (1981) sekä kohdassa (d) kuvatun kirjallisuuden perusteella, joka koskee mikro-organismien kemiallista luokittelua, kanta S-6 määritellään bacillukseksi, joka on gram-positiivinen, itiöiden muodostumisen suhteen negatii-10 vinen, aerobinen, jolla on polymorfismia ja joka on negatiivinen happovärjäyksen pysyvyyden suhteen. Tämä kanta sisältää meso-diaminopimeliinihappoa, arabinoosia ja galaktoosia, (n, F^)/ (F^) sekä (10-CHg) -rasvahappotyyppejä sekä C32-C46 -mykolihappoja mykoli-15 happotyyppinä.

Yllä esitettyjen bakteriologisten ominaisuuksien perusteella kyseessä oleva kanta identifioidaan bakteeriksi, joka kuuluu sukuun Rhodococcus.

Tässä yhteydessä käytetyssä mikro-organismien vilje-20 lyssä käytetään tavallista viljelyelatusainetta, joka sisältää hiilenlähteen (esimerkiksi glukoosia, glyserolia ja maltoosia), typenlähteen (esim. ammoniumsulfaattia sekä ammoniumkloridia), orgaanisen ravintolähteen (esim. hiiva-uutetta, peptonia, lihauutetta, soijapapuhydrolysaattia 25 sekä maissinliotusvettä (CSL)), sekä epäorgaanisen ravin-·. ’ tolähteen (esim. fosfaattia, magnesiumia, kaliumia, sink kiä, rautaa ja mangaania) jne. Tämä viljely suoritetaan ·; aerobisesti, sekoittaen pH-alueella 6-8 sekä 20-35°C:n lämpötilassa, ja mieluummin 25-30°C:ssa, 1-3 päivän ajan.

30 Kyseessä olevan keksinnön mukaista menetelmää toteutettaessa, yhtä kantaa, joka valittiin yllä mainittujen mikro-organismien joukosta, viljeltiin 2-3 päivän ajan yllä kuvatun menetelmän mukaisesti, ja syntyvät viljelmät tai solut eristettiin viljelmistä tai käsitellyt solut 35 (raa'at entsyymit, liikkumattomat solut, jne.) lietettiin veteen puskuriin tai fysiologiseen keittosuolaliuokseen, ja siihen lisättiin nitriili-yhdiste.

5 87579

Nitriili-yhdiste vaikuttaa soluihin reagoimalla, vettä sisältävän väliaineen sisältäessä yleensä noin 0,01-10 paino-% soluja ja noin 0,1-10 paino-% nitriili-yhdistettä, lämpötilassa, joka on noin väliaineen jääty-5 mispisteestä 30°C:seen ja mieluummin jäätymispisteestä 15°C:seen, pH:ssa 6-10 ja mieluummin 7-9, 0,5-10 tunnin ajan.

Substraattina käytetyt nitriili-yhdisteet ovat biologisesti hyvin toksisia ja ne saavat aikaan vakavia, epä-10 edullisia vaikutuksia kyseisiin entsymaattisiin reaktioihin. Tästä syystä nitriili-yhdisteitä lisätään asteittain, kontrolloidulla tavalla, siten että nitriilien konsentraa-tio systeemissä ei mielellään ole enempää kuin 2 paino-%.

Jos pH-arvo on yllä määritellyn alueen ulkopuolella, 15 muodostunut ja kerääntynyt amidi edelleen hydrolysoituu ja solujen stabiilisuus vähenee. Täten on edullista säätää pH-arvoa asteittain alueen 7-9 sisällä lisäämällä asteittain emäksistä alkalia (esim. NaOH:a ja KOH:a) tai etukäteen lisäämällä järjestelmään puskuria.

20 Jos reaktio-olosuhteet ovat sopivasti säädetyt, ha luttu amidi voi muodostua nitriili-yhdisteestä ja kerääntyä muuntoarvon ollessa lähes 100 % ja siten, että ei juuri muodostu sivutuotteita.

Täten muodostunut amidi voidaan koota reaktioseok-25 sesta yleisesti tunnetuin tekniikoin. Esimerkiksi solut erotetaan reaktioseoksesta sentrifugoinnin avulla, niitä käsitellään aktivoidun hiilen, ioninvaihtohartsin yms. avulla värillisten aineiden, epäpuhtauksien yms. poistamiseksi, ja sitten suoritetaan konsentrointi vähennetyssä 30 paineessa halutun amidin, esimerkiksi akryyliamidin saamiseksi .

Kyseessä olevaa keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin viittaamalla seuraaviin esimerkkeihin. Kaikki osat ja prosentit tarkoittavat painoa.

35 Erilaiset nitriilit ja niitä vastaavat amidit ana lysoitiin kvantitatiivisesti kaasukromatografian avulla ja 6 87579 niitä vastaavat orgaaniset hapot analysoitiin suurpaine-nestekromatografiän avulla.

Esimerkki 1

Kantaa Rhodococcus sp. S-6 viljeltiin aerobisesti 5 elatusaineella, joka sisälsi 1 % glukoosia, 0,5 % pepto-nia, 0,3 % hiivauutetta sekä 0,3 % lihauutetta (pH 7,2), 30°C:ssa, 48 tunnin ajan. Täten muodostuneet solut poistettiin sentrifugoimalla ja niitä pestiin 0,05M fosfaatti-puskurilla (pH 7,7). Tämä menettely toistettiin S-6-kannan 10 pestyjen solujen saamiseksi (vesisisältö: 80 %).

Valmistettiin seos, jossa oli 0,5 osaa pestyjä soluja sekä 84,5 osaa 0,05 M fosfaattipuskuria (pH 8,5), ja sitten lisättiin välittömästi sekoittaen 15 osaa akryylinitriiliä, 0-3°C:ssa, samalla säätäen olosuhteet 15 siten, että akryylinitriilin konsentraatio reaktiojärjestelmässä ei ylitä 2 %, saattaen täten akryylinitriili hydrataatio-reaktion kohteeksi. Akryylinitriilin lisäys päättyi noin 3 tunnissa. Sen varmistamiseksi, että reaktio oli täydellinen, sekoitusta jatkettiin usean tunnin 20 ajan. Sitten solut poistettiin sentrifugoiden kirkkaan liuoksen saamiseksi. Tämä liuos sisälsi 20 % akryyliamidia, ja akryyliamidin saanto oli enemmän kuin 99,9 %. Reagoimatonta akryylinitriiliä ei havaittu ollenkaan, ja sivutuotteena saadun akryylihapon osuus ei ollut enempää kuin 25 0,1 % (akryyliamidin painoon perustuen).

Vesi poistettiin tislaamalla kirkkaasta liuoksesta lämpötilassa, joka ei ollut korkeampi kuin 50°C; kirkas liuos väkevöitiin kiteiden saamiseksi. Nämä kiteet uudel-leenkiteytettiin metanolista, jotta saatiin värittömiä, 30 levymäisiä kiteitä. Tämä yhdiste identifioitiin akryyli-amidiksi sulamispisteen, alkuaineanalyysin ja IR:n perusteella.

Esimerkki 2

Kannan S-6 pestyjä soluja saatiin samalla tavalla 35 kuin esimerkissä 1, ja ne mitattiin reaktiivisuutensa suhteen erilaisiin nitriileihin nähden seuraavissa olosuhteissa .

7 37579 (a) Reaktio-olosuhteet

Nitriiliyhdistettä 2,5 %

Kaliumfosfaattipuskuria pH 7,7/0,05 M

Soluja (kuivina soluina) 5 mg

5 Lämpötila 10°C

Reaktioaika 10 min

Reaktioliuoksen määrä 10 ml (b) Reaktion tulokset

Nitriilityyppi Amideja muodostava aktiivisuus* 10 Asetonitriili 30

Propionitriili 102

Akryylinitriili 100

Metakryylinitriili 123

Butyronitriili 51 15 Valeronitriili 11

Nikotinonitriili 16 ♦Suhteellinen arvo, joka ilmaisee aktiivisuuden akryyli-nitriilin suhteen, merkitään 100:ksi.

Esimerkki 3 20 500 ml:n vetoisessa Erlenmeyer-pullossa valmistet tiin 100 ml elatusainetta, joka käsitti 1 % glyserolia, 0,1 % KH2P04:a, 0,0 5 % MgSC>4 * 7 H20:a, 0,001 % FeSC>4 · 7H2<D: a, 0,5 % soijapapuproteiinihydrolysaattia ja 0,1 % hiiva-uutetta (pH 7,5), joka oli steriloitu ja johon oli lisätty 25 0,5 % steriiliä isobutyronitriiliä. Sitten lisättiin tyyppiviljelmäkannan viljelmää 1 ml, jota oli kasvatettu edellä esitetyllä tavalla 48 tunnin ajan samassa elatus-aineessa kuin esimerkissä 1, ja viljely suoritettiin : täristystä käyttäen 25°C:ssa, 48 tunnin ajan. Sen jälkeen 30 kun viljely oli täydellinen, solut koottiin erottamalla ne sentrifugoiden, ja sitten ne pestiin 0,05 M fosfaatti-puskurilla (pH 7,7). Tämä menettely toistettiin, jotta saatiin pestyjä soluja. Nämä solut mitattiin aktiivisuuden suhteen muodostaa akryyliamidia akryylinitriilistä samalla 35 tavalla kuin esimerkissä 2.

Tulokset esitetään taulukossa 1.

s 87579

Taulukko 1

Akryyliamidia muodostava

Kannan tyyppi aktiivisuus (^uM/mg-h)

Rhodococcus erythropolis IFM 155 3,5 5 Rhodococcus rhodochrous IFM 153 2,5

Arthrobacter oxydans IFO 12138 5,0

Arthrobacter aurescens IAM 12340 2,0

Microbacterium flavum IAM 1642 2,0

Vaikka keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisesti ja 10 viitaten sen spesifisiin patentinsuoritusmuotoihin, on aiheeseen perehtyneelle selvää, että siinä voidaan suorittaa erilaisia muutoksia ja muunnoksia poikkeamatta sen hengestä ja piiristä.

Claims (5)

9 87579 Patentt ivaat imukset

1. Menetelmä amidiyhdisteiden valmistamiseksi mikro-organismin avulla, tunnettu siitä, että 2 -6 5 hiiliatomia sisältävä nitriili kohdistetaan mikro-organismin Rhodococcus sp. S-6 (FERM-BP no 687) toiminnan kohteeksi, jolla on kyky hydratoida mainittuja 2-6 hiili-atomia sisältäviä nitriilejä, vastaavien amidien muodostamiseksi vettä sisältävässä väliaineessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vettä sisältävä väliaine pidetään lämpötilassa, joka on väliaineen jäätymispisteestä 30 °C:seen, edullisesti väliaineen jäätymispisteestä 15 °C:seen.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vettä sisältävä väliaine pidetään pH:ssa 6 - 10, edullisesti pH:ssa 7-9.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nitriiliä lisätään jatkuvasti 20 tai ajoittain vettä sisältävään väliaineeseen siten, että nitriilien konsentraatio ei ylitä 5 paino-%, edullisesti siten, että nitriilien konsentraatio ei ylitä 2 paino-%.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nitriili on alkryylinitriili. ίο 87 579