JP4652426B2 - ニトリルヒドラターゼを含有する菌体溶液熱処理物の製造方法 - Google Patents
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Description
に関する。
らpHを制御することにより行なうと、極めて効率的に活性の保持をなしうるものである
ことを見出した。すなわち本発明は、下記のとおりである。
を6〜8に調整しながら通気および攪拌して保存した後に加熱殺菌処理する加熱処理物の製造方法。
(2)前記加熱殺菌処理を、50〜121℃、3〜20分で実施することを特徴とする前記(1)に記載の加熱処理物の製造方法。
(3)前記(1)または前記(2)に記載の加熱処理物を用いて、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
(4)前記ニトリル化合物が、アクリロニトリルであることを特徴とする前記(3)に記載のニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
(5)加熱殺菌処理に供する微生物の菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法
であって、液体のpHを6〜8に調整しながら通気および攪拌することを特徴とする菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法 。
(7)攪拌所要動力数が、0.5W/m3から1800W/m3である前記(5)〜(6)のいずれかに
記載の保存方法 。
(8)無機酸を用いてPHを調整することを特徴とする前記(5)〜(7)のいずれかに記載の保存方法 。
(9)無機酸が、硫酸、硝酸、塩酸から選ばれる少なくとも1つであることを特徴とする前記(8)に記載の保存方法 。
(10)微生物がニトリルヒドラターゼを含有する微生物であることを特徴とする前記(5)〜(9)のいずれか1項に記載の保存方法 。
ターゼ とは、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力をも
つ酵素をいうものである。ここで、ニトリルヒドラターゼ を含有する微生物としては、
ニトリルヒドラターゼ を産生し、かつ50重量%のアクリルアミド水溶液中でニトリル
ヒドラターゼ の活性を保持している微生物が好ましい。
バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロ
コッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム( Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物を好適な例として挙げることができる。
現させた形質転換体も本発明でいう微生物に含まれる。なお、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。その様なものの例として、MT−10822(本菌株は、1996年2月7日に茨城県つくば市東1丁目1番3号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP−5785として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。)が挙げられる。また、組換えDNA技術を用いて該酵素の構成アミノ酸の1個または2個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アミド化合物耐性やニトリル化合物耐性、温度耐性を更に向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も、本発明でいう微生物に含まれる。
(単位vvm、1分間に液体1Lに気体1Lを流した量が1vvm(volum/volum・分)となる)が好ましいが、空気の分散や発泡を考えると、0.2〜0.6であることがより望ましい。本発明
の攪拌所要動力数は、0.5W/m3から1800W/m3が好ましいが、菌体の沈降や発泡を考えると
、100W/m3から800W/m3がより望ましい。液体のpHは通常6〜8、望ましくは7〜7.5に調整する。PHの調整は、無機酸、有機酸などを使用できる。無機酸としては、硫酸、硝酸、塩酸などを挙げることができる。有機酸としては、アクリル酸、酢酸、メタクリル酸などを挙げることができる。なかでも無機酸を使用するのが好ましい。保存温度は短期間保存の場合は室温でもよいが、低温、例えば0℃〜20℃で保存するのが好ましい。保存期間も任意であるが、3日以内の範囲が好ましい。
実施例1(培養)500mlのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地100mlを調製し、121℃・20分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が50μg/mlとなるようにアンピシリンを添加した後、MT−10822株(FERM
BP−5785)を一白菌耳植菌し、37℃・130rpmにて20時間培養した。
なった。なお、pHの調整には硫酸を使用した。
トリルの菌体懸濁液への添加にて開始し、20℃、15分の攪拌ののち、燐酸液を加えて反応を停止し、稀釈後、高速液体クロマトクラフィーで分析した。以下、すべてのデータで0日の活性を1とする。
o mutagenesis Kit」を用いた部位特異的な変異導入を行った。以後、「LA PCR in vitro mutagenesis Kit」を単にキットと呼ぶ。
キットに記載の条件による)で、熱変性(98℃)15秒、アニーリング(55℃)30秒、伸長反応(72℃)120秒の条件を25サイクル繰り返すことにより行った。PCR反応No.2は、MUT4プライマー(配列表の配列番号3に配列を記載)及びM13プライマーRV(配列表の配列番号4に配列を記載)を各々50pmol含む全量50μlの系(組成はキットに記載の条件による)で、PCR反応No.1と同様の操作により行った。PCR反応No.1およびNo.2の反応終了液各5μlを用いたアガロース電気泳動(アガロース濃度1.0質量%)によりDNA増幅産物の分析を行ったところ、増幅DNA産物の存在が確認できた。
m×5分)により菌体を分離した。
No.1のプラスミドDNAを鋳型として、上述と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。すなわち、30mlの試験管に10mlのLB液体培地を調製し、121℃・20分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が100μg/mlとなるようにアンピシリンを添加した後、得られたクローンNo.1株を一白菌耳植菌し、37℃・300rpmにて約20時間培養した。該培養液1mlを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離(15000rpm×5分)により菌体を分離した。続いてアルカリSDS抽出法により該菌体よりクローンNo.1株のプラスミドDNAを調製した。
Claims (4)
- ニトリルヒドラターゼを含有する微生物を培養した後の菌体を含有する液体のpHを6
〜8に調整しながら通気および攪拌して保存した後に加熱殺菌処理する加熱処理物の製造方法。 - 前記加熱殺菌処理を、50〜121℃、3〜20分で実施することを特徴とする請求項1に記載の加熱処理物の製造方法。
- 請求項1または請求項2に記載の加熱処理物を用いて、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
- 前記ニトリル化合物が、アクリロニトリルであることを特徴とする請求項3に記載のニトリル化合物からアミド化合物を製造する方法。
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