JP3467264B2 - 微生物の培養法 - Google Patents
微生物の培養法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ニトリルヒドラターゼ酵素活性の高い培養
菌体を短時間で且つ高収量で生産する方法に関する。
菌体を短時間で且つ高収量で生産する方法に関する。
背景技術
近年、省エネルギーの観点から、微生物またはその酵
素を生体触媒として物質生産に利用しようとする試みが
再び盛んになってきている。ニトリルヒドラターゼはニ
トリル類を水和して対応するアミドを生成させる酵素と
して知られており、特にアクリロニトリルからアクリル
アミドを製造する触媒として有用である。
素を生体触媒として物質生産に利用しようとする試みが
再び盛んになってきている。ニトリルヒドラターゼはニ
トリル類を水和して対応するアミドを生成させる酵素と
して知られており、特にアクリロニトリルからアクリル
アミドを製造する触媒として有用である。
ニトリルヒドラターゼ産生能を有する微生物として
は、例えば、ノカルジア(Nocardia)属〔特開昭54-12919
0号公報参照〕、ロドコッカス属(Rhodococcus)〔特開平
2-470号公報参照〕、リゾビウム属(Rhizobium)〔特開平
5-236977号公報参照〕、クレブシエラ属(Klebsiera)
〔特開平5-30982号公報参照〕、エアロモナス属(Aeromo
nas)〔特開平5-30983号公報参照〕、アグロバクテリウ
ム属（Agrobacterium）〔特開平8-154691号公報参
照〕、バチルス属（Bacillus）〔特開平8-187092号公報
参照〕、シュードノカルディア属（Pseudonocardia）
〔特開平8-56684〕等に属する細菌が知られている。前
記何れの公報にも、ニトリルヒドラターゼ活性を産生す
る微生物の培養方法が記載されている。
は、例えば、ノカルジア(Nocardia)属〔特開昭54-12919
0号公報参照〕、ロドコッカス属(Rhodococcus)〔特開平
2-470号公報参照〕、リゾビウム属(Rhizobium)〔特開平
5-236977号公報参照〕、クレブシエラ属(Klebsiera)
〔特開平5-30982号公報参照〕、エアロモナス属(Aeromo
nas)〔特開平5-30983号公報参照〕、アグロバクテリウ
ム属（Agrobacterium）〔特開平8-154691号公報参
照〕、バチルス属（Bacillus）〔特開平8-187092号公報
参照〕、シュードノカルディア属（Pseudonocardia）
〔特開平8-56684〕等に属する細菌が知られている。前
記何れの公報にも、ニトリルヒドラターゼ活性を産生す
る微生物の培養方法が記載されている。
また、培養時の炭素源の利用については、Applied Mi
crobiology and Biotechnology (1991)34:783-788の「E
ffect of carbon sources」の項において、「R.rhodoch
rous J1を用いたニトリルヒドラターゼの生産におい
て、最も適した炭素源は２％グルコースである。」と記
載されている。
crobiology and Biotechnology (1991)34:783-788の「E
ffect of carbon sources」の項において、「R.rhodoch
rous J1を用いたニトリルヒドラターゼの生産におい
て、最も適した炭素源は２％グルコースである。」と記
載されている。
発明の開示
前記公報に記載されている培養方法は、いずれも工業
的に短時間で高収量のニトリルヒドラターゼ酵素活性を
有する培養菌体を得る方法としては実用的ではない。
的に短時間で高収量のニトリルヒドラターゼ酵素活性を
有する培養菌体を得る方法としては実用的ではない。
酵素誘導の目的で、特開平2-470号公報記載の方法で
は、コバルトイオンを培養液中に添加しているが、その
コバルトイオン濃度では、常に安定して短時間で高収量
のニトリルヒドラターゼ酵素活性を有する培養菌体を得
ることは難しい。また、大量のコバルトイオンを培地に
添加すると生育阻害が著しくなり、かえって短時間で高
収量のニトリルヒドラターゼ活性を有する培養菌体を得
ることができない。
は、コバルトイオンを培養液中に添加しているが、その
コバルトイオン濃度では、常に安定して短時間で高収量
のニトリルヒドラターゼ酵素活性を有する培養菌体を得
ることは難しい。また、大量のコバルトイオンを培地に
添加すると生育阻害が著しくなり、かえって短時間で高
収量のニトリルヒドラターゼ活性を有する培養菌体を得
ることができない。
また、短時間で高収量のニトリルヒドラターゼ活性を
有する培養菌体を得るには、炭素源としては、グルコー
スやスクロースが好適と考えられ、フルクトース等のケ
ト糖やマンニトール等の糖アルコールを用いることは、
従来、学術的にも不可能であると考えられてきた。
有する培養菌体を得るには、炭素源としては、グルコー
スやスクロースが好適と考えられ、フルクトース等のケ
ト糖やマンニトール等の糖アルコールを用いることは、
従来、学術的にも不可能であると考えられてきた。
本発明は、前記問題点を解決した短時間で高収量のニ
トリルヒドラターゼ活性を有する培養菌体を得る方法を
提供することにある。
トリルヒドラターゼ活性を有する培養菌体を得る方法を
提供することにある。
本発明者らは、工業的に短時間で高収量のニトリルヒ
ドラターゼ活性を有する菌体を得る培養条件について鋭
意検討を行った結果、フルクトース等のケト糖及び／又
はマンニトール等の糖アルコールを培養液中に存在させ
ることにより、培養液中に大量のコバルトイオンを存在
させても生育阻害が軽減でき、高活性な菌体を得ること
が可能となることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
ドラターゼ活性を有する菌体を得る培養条件について鋭
意検討を行った結果、フルクトース等のケト糖及び／又
はマンニトール等の糖アルコールを培養液中に存在させ
ることにより、培養液中に大量のコバルトイオンを存在
させても生育阻害が軽減でき、高活性な菌体を得ること
が可能となることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
すなわち、本発明は、ニトリルヒドラターゼ産生能を
有する微生物を、糖アルコール及び／又はケト糖、並び
にコバルトイオンを含む培地基材で培養する方法であ
る。ここで、コバルトイオンの濃度は、好ましくはＣｏ
Ｃｌ2換算で１５ｍｇ／Ｌ以上である。また、前記糖ア
ルコールは、好ましくは一般式（Ｉ）で示されるもので
ある。
有する微生物を、糖アルコール及び／又はケト糖、並び
にコバルトイオンを含む培地基材で培養する方法であ
る。ここで、コバルトイオンの濃度は、好ましくはＣｏ
Ｃｌ2換算で１５ｍｇ／Ｌ以上である。また、前記糖ア
ルコールは、好ましくは一般式（Ｉ）で示されるもので
ある。
さらに、前記ケト糖は、一般式（II）で示されるもの
である。
である。
本発明において、糖アルコール及び／又はケト糖を炭
素源として使用するが、これら糖化合物を培養液中に存
在させることで、コバルトイオンによる生育阻害を軽減
できることは、従来知られていなかったことである。
素源として使用するが、これら糖化合物を培養液中に存
在させることで、コバルトイオンによる生育阻害を軽減
できることは、従来知られていなかったことである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の対象となる微生物は、ニトリルヒドラターゼ
産生能を有する微生物であれば特に制限はされない。具
体的には、例えば、特公昭56-17918号記載のノカルジア
(Nocardia)sp.N-775、特公平06-55148号記載のロドコッ
カスロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous )J-1、特
開平05-30982号記載のクレブシエラ(Klebsiella)sp.MCI
2609、特開平05-30983号記載のエアロモナス(Aeromona
s)sp.MCI2614、特開平05-30984号記載のシトロバクター
フロンディ(Citrobacter freundii)MCI2615、特開平0
5-103681号記載のアグロバクテリウム リゾゲネス(Agr
obacterium rhizogenes)IAM13570およびアグロバクテリ
ウム トウメファシエンス(Agrobacteriumfaciens)、特
開平０５−１６１４９５号記載のキサントバクター フ
ラブス(Xanthobacter flavas)JCM1204、エルウィニア
ニグリフルエンス(Erwinia nigrifluens)MAFF03-0143
5、特開平05-236975号記載のエンテロバクター(Enterob
acter)sp.MCI2707、特開平05-236976号記載のストレプ
トマイセス(Streptomyces)sp.MCI2691、特開平05-23697
7号記載のリゾビウム(Rhizobium)sp.MCI2610、リゾビウ
ムsp.MCI2643、リゾビウム ロティ(Rhizobium loti)IA
M13588、リゾビウム レグミノサーラム(Rhizobium leg
minosarum)IAM12609およびリゾビウム メリオティ(Rhi
zobium merioti)IAM12611、特開平05-15384号記載のキ
ャンディダ グイリエモンディ(Candida guilliermondi
i)NH-2、パントエア アグロメランス(Pantoea agglome
rans)NH-3およびクレブシエラ ニュウモニアエ スブ
スピーシス ニュウモニアエ(Klebsiella pneumoniae s
ubsp. pneumoniae)NH-26T2、特開平06-14786号記載のア
グロバクテリウム ラジオバクター(Agrobacterium rad
iobacter)SC-C15-1、特開平07-25494号記載のバチルス
スミシー(Bacillus smithii)SC-J05-1、特開平08-566
84号記載のシュードノカルディア サーモフィラ(Pseud
onocardia thermophila)ATCC19285、特開平09-275978号
記載のシュードノカルディア サーモフィラ(Pseudonoc
ardia thermophila)JCM3095の微生物を好適な例として
挙げることができる。
産生能を有する微生物であれば特に制限はされない。具
体的には、例えば、特公昭56-17918号記載のノカルジア
(Nocardia)sp.N-775、特公平06-55148号記載のロドコッ
カスロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous )J-1、特
開平05-30982号記載のクレブシエラ(Klebsiella)sp.MCI
2609、特開平05-30983号記載のエアロモナス(Aeromona
s)sp.MCI2614、特開平05-30984号記載のシトロバクター
フロンディ(Citrobacter freundii)MCI2615、特開平0
5-103681号記載のアグロバクテリウム リゾゲネス(Agr
obacterium rhizogenes)IAM13570およびアグロバクテリ
ウム トウメファシエンス(Agrobacteriumfaciens)、特
開平０５−１６１４９５号記載のキサントバクター フ
ラブス(Xanthobacter flavas)JCM1204、エルウィニア
ニグリフルエンス(Erwinia nigrifluens)MAFF03-0143
5、特開平05-236975号記載のエンテロバクター(Enterob
acter)sp.MCI2707、特開平05-236976号記載のストレプ
トマイセス(Streptomyces)sp.MCI2691、特開平05-23697
7号記載のリゾビウム(Rhizobium)sp.MCI2610、リゾビウ
ムsp.MCI2643、リゾビウム ロティ(Rhizobium loti)IA
M13588、リゾビウム レグミノサーラム(Rhizobium leg
minosarum)IAM12609およびリゾビウム メリオティ(Rhi
zobium merioti)IAM12611、特開平05-15384号記載のキ
ャンディダ グイリエモンディ(Candida guilliermondi
i)NH-2、パントエア アグロメランス(Pantoea agglome
rans)NH-3およびクレブシエラ ニュウモニアエ スブ
スピーシス ニュウモニアエ(Klebsiella pneumoniae s
ubsp. pneumoniae)NH-26T2、特開平06-14786号記載のア
グロバクテリウム ラジオバクター(Agrobacterium rad
iobacter)SC-C15-1、特開平07-25494号記載のバチルス
スミシー(Bacillus smithii)SC-J05-1、特開平08-566
84号記載のシュードノカルディア サーモフィラ(Pseud
onocardia thermophila)ATCC19285、特開平09-275978号
記載のシュードノカルディア サーモフィラ(Pseudonoc
ardia thermophila)JCM3095の微生物を好適な例として
挙げることができる。
また、前記微生物よりクローニングしたニトリルヒド
ラターゼ遺伝子を、任意の宿主で発現させた形質転換体
も本発明の対象となる。
ラターゼ遺伝子を、任意の宿主で発現させた形質転換体
も本発明の対象となる。
例えば、宿主の代表例として大腸菌(Escherichia col
i)を用いたUSP 5,807,730号記載のMT-10822株(FERM BP-
5785)の細菌も好適な例として挙げることができる。
i)を用いたUSP 5,807,730号記載のMT-10822株(FERM BP-
5785)の細菌も好適な例として挙げることができる。
培養基材として、炭素源は、一般式（Ｉ）で示される
糖アルコール及び／又は一般式（II）で示されるケト糖
が挙げられる。具体的には、フルクトース、マンニトー
ル、ソルビトールが好ましい。これら炭素源は適宜組み
合わせて使用することも可能である。
糖アルコール及び／又は一般式（II）で示されるケト糖
が挙げられる。具体的には、フルクトース、マンニトー
ル、ソルビトールが好ましい。これら炭素源は適宜組み
合わせて使用することも可能である。
コバルトイオンの供給源としては、２価又は３価のコ
バルト塩であればいずれでも構わない。例えば、塩化コ
バルト、硫酸コバルト、酢酸コバルト、臭化コバルト、
硼酸コバルトを例示することができる。また、ビタミン
Ｂ12等もコバルト源として挙げられる。また、コバルト
イオン濃度は、CoCl2換算で15mg/L以上、好ましくは15
〜300mg/Lが良い。
バルト塩であればいずれでも構わない。例えば、塩化コ
バルト、硫酸コバルト、酢酸コバルト、臭化コバルト、
硼酸コバルトを例示することができる。また、ビタミン
Ｂ12等もコバルト源として挙げられる。また、コバルト
イオン濃度は、CoCl2換算で15mg/L以上、好ましくは15
〜300mg/Lが良い。
窒素源は、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等、有機栄養源
は、例えば、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプ
トン、味液等、無機塩は、例えば、燐酸塩、マグネシウ
ム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、鉄塩、コバルト塩、
その他微量金属塩等を選択し培地を調製する。必要に応
じて、酵素誘導剤として、例えば、尿素又は尿素誘導体
等を添加しても構わない。
塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等、有機栄養源
は、例えば、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプ
トン、味液等、無機塩は、例えば、燐酸塩、マグネシウ
ム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、鉄塩、コバルト塩、
その他微量金属塩等を選択し培地を調製する。必要に応
じて、酵素誘導剤として、例えば、尿素又は尿素誘導体
等を添加しても構わない。
また、適宜、炭素源、コバルトイオン等を培養中に分
割添加しても構わない。
割添加しても構わない。
培養中、ｐＨは通常5〜10、好ましくは7〜9に維持す
る。培養温度は、通常25〜50℃、好ましくは30〜40℃に
維持し、好気的に1〜3日間培養する。
る。培養温度は、通常25〜50℃、好ましくは30〜40℃に
維持し、好気的に1〜3日間培養する。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、
本発明はこれらの例のみに限定されるものではない。
本発明はこれらの例のみに限定されるものではない。
〔実施例１〕
(1) 菌の培養
前培養条件：
（培地組成）
フルクトース 2%(w/v)、ポリペプトン 5%(w/v)（日本
製薬株式会社）、酵母エキス 0.3%(w/v)（オリエンタ
ル酵母工業株式会社製）、KH2PO4 0.1%(w/v)、K2HPO4
0.1%(w/v)、MgSO4 7H2O 0.1%(w/v)、pH 7。
製薬株式会社）、酵母エキス 0.3%(w/v)（オリエンタ
ル酵母工業株式会社製）、KH2PO4 0.1%(w/v)、K2HPO4
0.1%(w/v)、MgSO4 7H2O 0.1%(w/v)、pH 7。
（培養方法）
500ml容三角フラスコに培地を100ml分注して綿栓を
し、121℃、20分間オートクレーブで滅菌した。ロドコ
ッカス ロドクロウスJ-1株（FERM BP-1478）を接種し
て30℃で48時間振とう培養した。
し、121℃、20分間オートクレーブで滅菌した。ロドコ
ッカス ロドクロウスJ-1株（FERM BP-1478）を接種し
て30℃で48時間振とう培養した。
本培養条件
（培地組成）
初期培地：酵母エキス 0.2%(w/v)、KH2PO4 0.1%(w/
v)、Ｋ2HPO4 0.1%(w/v)、MgSO4・7H2O 0.1%(w/v)、CoCl2
・6H2O 0.002%(w/v)、硫安 0.025%(w/v)、フルクトース
2%(w/v)、尿素 2%(w/v)、エタノール 0.4%(v/v)、
プルロニックＬ６１ 0.1%(w/v)（旭電化工業株式会
社）、pH7。
v)、Ｋ2HPO4 0.1%(w/v)、MgSO4・7H2O 0.1%(w/v)、CoCl2
・6H2O 0.002%(w/v)、硫安 0.025%(w/v)、フルクトース
2%(w/v)、尿素 2%(w/v)、エタノール 0.4%(v/v)、
プルロニックＬ６１ 0.1%(w/v)（旭電化工業株式会
社）、pH7。
後添加培地：フルクトース 20%(w/v)、エタノール
5%(v/v)、硫安 6%(w/v)、pH6.5。
5%(v/v)、硫安 6%(w/v)、pH6.5。
（培養方法）
３リッター容ミニジャーファーメンター（高杉製作所
社製）に初期培地２リッター分注し、121℃、20分間オ
ートクレーブで滅菌した。但し、フルクトース、エタノ
ールおよび尿素は、別途、無菌的に濾過して（アドバン
テック東洋株式会社社製０．４５ミクロンの濾紙を使
用）に培地に加えた。前記前培養終了後の培養液を20ml
植菌し、槽内圧力0.098MPa、攪拌数600rpm、通気量1vv
m、pH7、温度３０℃で４４時間培養した。
社製）に初期培地２リッター分注し、121℃、20分間オ
ートクレーブで滅菌した。但し、フルクトース、エタノ
ールおよび尿素は、別途、無菌的に濾過して（アドバン
テック東洋株式会社社製０．４５ミクロンの濾紙を使
用）に培地に加えた。前記前培養終了後の培養液を20ml
植菌し、槽内圧力0.098MPa、攪拌数600rpm、通気量1vv
m、pH7、温度３０℃で４４時間培養した。
尚、培養２０時間目から、後添加培地を20ml/hrの流
速で培養終了まで添加した。
速で培養終了まで添加した。
（２）ニトリルヒドラターゼ活性の測定
培養液0.1mlと1/20Mリン酸緩衝液（pH7.7）4.90mlと
を混合し、これにさらに5.0%(w/v)のアクリロニトリル
を含む1/20Mリン酸緩衝液（pH7.7）5mlを加えて、10℃
で10分間反応させた。反応終了後、菌体を遠心分離によ
り濾別してから、上清のアクリルアミドの量を、ガスク
ロマトグラフィー（GC-14B 島津製作所社製）で定量し
た。分析条件はポラパックＰＳ（ウォーターズ社製カラ
ム充填剤）を充填した1mガラスカラムを用い、カラム温
度230℃、検出器は250℃のFIDで実施した。
を混合し、これにさらに5.0%(w/v)のアクリロニトリル
を含む1/20Mリン酸緩衝液（pH7.7）5mlを加えて、10℃
で10分間反応させた。反応終了後、菌体を遠心分離によ
り濾別してから、上清のアクリルアミドの量を、ガスク
ロマトグラフィー（GC-14B 島津製作所社製）で定量し
た。分析条件はポラパックＰＳ（ウォーターズ社製カラ
ム充填剤）を充填した1mガラスカラムを用い、カラム温
度230℃、検出器は250℃のFIDで実施した。
以下、酵素活性の単位（ユニット）は、上記活性測定
において、１分間に１μmolのアクリロニトリルをアク
リルアミドに変換する活性を１ユニットと定めた。 活
性は、培養液あたりの活性及び菌体あたりの活性につい
て調べた。結果を表１に示した。CoCl2・6H2Oを0.002%(w
/v)存在させて培養したときの値を100とし、他の培養条
件時の活性値を相対活性（％）で示した。
において、１分間に１μmolのアクリロニトリルをアク
リルアミドに変換する活性を１ユニットと定めた。 活
性は、培養液あたりの活性及び菌体あたりの活性につい
て調べた。結果を表１に示した。CoCl2・6H2Oを0.002%(w
/v)存在させて培養したときの値を100とし、他の培養条
件時の活性値を相対活性（％）で示した。
〔実施例２〜５〕
本培養のCoCl2・6H2Oの濃度を0.002%(w/v)添加した培
地の代わりに、CoCl2・6H2Oの濃度を0.005%(w/v)添加し
た培地（実施例２）、0.01%(w/v)添加した培地（実施例
３）0.02%(w/v)添加した培地（実施例４）、0.03%(w/v)
添加した培地（実施例５）を用いること以外は、実施例
１と同様な方法によって実施した。結果を表１に示し
た。
地の代わりに、CoCl2・6H2Oの濃度を0.005%(w/v)添加し
た培地（実施例２）、0.01%(w/v)添加した培地（実施例
３）0.02%(w/v)添加した培地（実施例４）、0.03%(w/v)
添加した培地（実施例５）を用いること以外は、実施例
１と同様な方法によって実施した。結果を表１に示し
た。
〔実施例６、７〕
前培養および本培養でフルクトースの代わりにマンニ
トールを添加した培地（実施例６）、ソルビトールを添
加した培地（実施例７）を用いること以外は実施例３と
同様な方法によって実施した。結果を表１に示した。
トールを添加した培地（実施例６）、ソルビトールを添
加した培地（実施例７）を用いること以外は実施例３と
同様な方法によって実施した。結果を表１に示した。
〔比較例１〕
前培養および培養でフルクトースを添加した培地の代
わりに、グルコースを添加した培地を用いること以外は
実施例１と同様な方法によって実施した。結果を表１に
示した。
わりに、グルコースを添加した培地を用いること以外は
実施例１と同様な方法によって実施した。結果を表１に
示した。
〔比較例２〜５〕
本培養のCoCl2・6H2Oの濃度を0.002%(w/v)添加した培
地の代わりに、CoCl2・6H2Oを0.005%(w/v)添加した培地
（比較例２）、0.01%(w/v)添加した培地（比較例３）、
0.02%(w/v)添加した培地（比較例４）、0.03%(w/v)添加
した培地（比較例５）を用いること以外は比較例１と同
様な方法によって実施した。結果を表１に示した。
地の代わりに、CoCl2・6H2Oを0.005%(w/v)添加した培地
（比較例２）、0.01%(w/v)添加した培地（比較例３）、
0.02%(w/v)添加した培地（比較例４）、0.03%(w/v)添加
した培地（比較例５）を用いること以外は比較例１と同
様な方法によって実施した。結果を表１に示した。
〔実施例８〕
ロドコッカス ロドクロウスJ-1株の代わりにノカル
ジアsp. N-775株(N-755菌株として寄託。受託番号FERM
BP-961)を用いること以外は実施例１と同様な方法によ
って実施した。結果を表２に示した。
ジアsp. N-775株(N-755菌株として寄託。受託番号FERM
BP-961)を用いること以外は実施例１と同様な方法によ
って実施した。結果を表２に示した。
〔実施例９〕
本培養のCoCl2・6H2Oの濃度を0.002%(w/v)添加した培
地の代わりに、CoCl2・6H2Oの濃度を0.01%(w/v)添加した
培地を用いること以外は実施例８と同様な方法によって
実施した。結果を表２に示した。
地の代わりに、CoCl2・6H2Oの濃度を0.01%(w/v)添加した
培地を用いること以外は実施例８と同様な方法によって
実施した。結果を表２に示した。
〔実施例１０、１１〕
前培養および本培養でフルクトースを添加した培地の
代わりに、マンニトールを添加した培地（実施例１
０）、ソルビトールを添加した培地（実施例１１）を用
いること以外は実施例９と同様な方法によって実施し
た。結果を表２に示した。
代わりに、マンニトールを添加した培地（実施例１
０）、ソルビトールを添加した培地（実施例１１）を用
いること以外は実施例９と同様な方法によって実施し
た。結果を表２に示した。
〔比較例６〕
前培養および本培養でフルクトースを添加した培地の
代わりに、グルコースを添加した培地を用いること以外
は実施例８と同様な方法によって実施した。結果を表２
に示した。
代わりに、グルコースを添加した培地を用いること以外
は実施例８と同様な方法によって実施した。結果を表２
に示した。
〔比較例７〕
本培養のCoCl2・6H2Oの濃度を0.002%(w/v)添加した培
地の代わりに、CoCl2・6H2Oの濃度を0.01%(w/v)添加した
培地を用いること以外は比較例６と同様な方法によって
実施した。結果を表２に示した。
地の代わりに、CoCl2・6H2Oの濃度を0.01%(w/v)添加した
培地を用いること以外は比較例６と同様な方法によって
実施した。結果を表２に示した。
〔実施例１２〕
（１）菌の培養
前培養条件
（培地組成）
ポリペプトン1%(w/v)、酵母エキス0.5%(w/v)、NaCl
0.5%(w/v)、アンピシリン・Na 100μg/ml、ｐＨ７（Ｌ
Ｂ培地）。
0.5%(w/v)、アンピシリン・Na 100μg/ml、ｐＨ７（Ｌ
Ｂ培地）。
（培養方法）
500ml容三角フラスコに培地を100ml分注して綿栓を
し、121℃、20分間オートクレーブで滅菌した。MT-1082
2株（FERM BP-5785）を接種して37℃で6時間振とう培養
した。
し、121℃、20分間オートクレーブで滅菌した。MT-1082
2株（FERM BP-5785）を接種して37℃で6時間振とう培養
した。
本培養条件
（培地組成）
酵母エキス 0.5%(w/v)、ポリペプトン 2%(w/v)、NaC
l 0.06%(w/v)、KCl 0.02%(w/v)、MgCl2・6H2O 0.2%(w/
v)、CoCl2・6H2O 0.002%(w/v)、MgCl4・7H2O 0.243%(w/
v)、フルクトース 4%(w/v)、プルロニックL61 0.02%(w
/v)、pH7。
l 0.06%(w/v)、KCl 0.02%(w/v)、MgCl2・6H2O 0.2%(w/
v)、CoCl2・6H2O 0.002%(w/v)、MgCl4・7H2O 0.243%(w/
v)、フルクトース 4%(w/v)、プルロニックL61 0.02%(w
/v)、pH7。
（培養方法）
３リッター容ミニジャーファーメンターに初期培地２
リッター分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブで
滅菌した。但し、フルフトースおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ
２Ｏは、別途、無菌的に濾過して（アドバンテック東洋
株式会社製０．４５ミクロンの濾紙を使用）培地に加え
た。前記前培養終了後の培養液を20ml植菌し、槽内圧力
０．０２５ＭＰａ、攪拌数８００ｒｐｍ、通気量１ｖｖ
ｍ、ｐＨ７、温度３７℃で１２時間培養した。
リッター分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブで
滅菌した。但し、フルフトースおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ
２Ｏは、別途、無菌的に濾過して（アドバンテック東洋
株式会社製０．４５ミクロンの濾紙を使用）培地に加え
た。前記前培養終了後の培養液を20ml植菌し、槽内圧力
０．０２５ＭＰａ、攪拌数８００ｒｐｍ、通気量１ｖｖ
ｍ、ｐＨ７、温度３７℃で１２時間培養した。
（２）ニトリルヒドラターゼ活性の測定
実施例１（２）と同様な方法によって実施した。活性
は、培養液あたりの活性及び菌体あたりの活性について
調べた。結果を表３に示した。CoCl2・6H2Oを0.002%(w/
v)存在させて培養したときの値を100として、他の培養
条件時の活性値を相対活性（％）で示した。
は、培養液あたりの活性及び菌体あたりの活性について
調べた。結果を表３に示した。CoCl2・6H2Oを0.002%(w/
v)存在させて培養したときの値を100として、他の培養
条件時の活性値を相対活性（％）で示した。
〔実施例13〕
本培養のCoCl2・6H2Oの濃度を0.002%(w/v)添加した培
地の代わりに、CoCl2・6H2Oの濃度を0.01%(w/v)添加した
培地を用いること以外は実施例12と同様な方法によって
実施した。結果を表３に示す。
地の代わりに、CoCl2・6H2Oの濃度を0.01%(w/v)添加した
培地を用いること以外は実施例12と同様な方法によって
実施した。結果を表３に示す。
〔実施例14、15〕
本培養でフルクトースを添加した培地の代わりに、マ
ンニトールを添加した培地（実施例１４）、ソルビトー
ルを添加した培地（実施例１５）を用いること以外は実
施例１３と同様な方法によって実施した。結果を表３に
示した。
ンニトールを添加した培地（実施例１４）、ソルビトー
ルを添加した培地（実施例１５）を用いること以外は実
施例１３と同様な方法によって実施した。結果を表３に
示した。
〔比較例８〕
本培養でフルクトースを添加した培地の代わりに、グ
ルコースを添加した培地を用いること以外は実施例１２
と同様な方法によって実施した。結果を表３に示した。
ルコースを添加した培地を用いること以外は実施例１２
と同様な方法によって実施した。結果を表３に示した。
〔比較例９〕
本培養のＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏの濃度を０．００２％
（ｗ／ｖ）添加した培地の代わりに、ＣｏＣｌ２・６Ｈ
２Ｏの濃度を０．０１％（ｗ／ｖ）添加した培地を用い
ること以外は比較例８と同様な方法によって実施した。
結果を表３に示した。
（ｗ／ｖ）添加した培地の代わりに、ＣｏＣｌ２・６Ｈ
２Ｏの濃度を０．０１％（ｗ／ｖ）添加した培地を用い
ること以外は比較例８と同様な方法によって実施した。
結果を表３に示した。
産業上の利用可能性
フルクトース等のケト糖、マンニトール等の糖アルコ
ールは、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の培
養に際して、コバルトイオンによる生育阻害を軽減する
ことができるので、結果として、短時間で高収量のニト
リルヒドラターゼ酵素活性を有する菌体を得ることがで
きる。
ールは、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の培
養に際して、コバルトイオンによる生育阻害を軽減する
ことができるので、結果として、短時間で高収量のニト
リルヒドラターゼ酵素活性を有する菌体を得ることがで
きる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平８−112089（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−470（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−100674（ＪＰ，Ａ)
特開 昭64−74996（ＪＰ，Ａ)
特開 平８−38163（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 1/20
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 ニトリルヒドラターゼ産生能を有する微
生物を、一般式（I ）で示される糖アルコール（但し、
イノシトールを除く）及び／又は一般式（II）で示され
るケト糖、並びにコバルトイオンを含む培地基材で培養
する方法。 【化１】 【化２】 - 【請求項２】 コバルトイオンの濃度がＣｏＣｌ2換算
で１５ｍｇ／Ｌ以上である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 コバルトイオンの濃度がＣｏＣｌ2換算
で２０ｍｇ／Ｌ以上である請求項１に記載の方法。
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| JP2000-78484 | 2000-03-21 | ||
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- 2001-03-21 CN CNB018070728A patent/CN1316009C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-21 DE DE60129547T patent/DE60129547T2/de not_active Expired - Lifetime
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