JP3467264B2 - 微生物の培養法 - Google Patents

微生物の培養法

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、ニトリルヒドラターゼ酵素活性の高い培養
菌体を短時間で且つ高収量で生産する方法に関する。
背景技術 近年、省エネルギーの観点から、微生物またはその酵
素を生体触媒として物質生産に利用しようとする試みが
再び盛んになってきている。ニトリルヒドラターゼはニ
トリル類を水和して対応するアミドを生成させる酵素と
して知られており、特にアクリロニトリルからアクリル
アミドを製造する触媒として有用である。
ニトリルヒドラターゼ産生能を有する微生物として
は、例えば、ノカルジア(Nocardia)属〔特開昭54-12919
0号公報参照〕、ロドコッカス属(Rhodococcus)〔特開平
2-470号公報参照〕、リゾビウム属(Rhizobium)〔特開平
5-236977号公報参照〕、クレブシエラ属(Klebsiera)
〔特開平5-30982号公報参照〕、エアロモナス属(Aeromo
nas)〔特開平5-30983号公報参照〕、アグロバクテリウ
ム属(Agrobacterium)〔特開平8-154691号公報参
照〕、バチルス属(Bacillus)〔特開平8-187092号公報
参照〕、シュードノカルディア属(Pseudonocardia)
〔特開平8-56684〕等に属する細菌が知られている。前
記何れの公報にも、ニトリルヒドラターゼ活性を産生す
る微生物の培養方法が記載されている。
また、培養時の炭素源の利用については、Applied Mi
crobiology and Biotechnology (1991)34:783-788の「E
ffect of carbon sources」の項において、「R.rhodoch
rous J1を用いたニトリルヒドラターゼの生産におい
て、最も適した炭素源は2%グルコースである。」と記
載されている。
発明の開示 前記公報に記載されている培養方法は、いずれも工業
的に短時間で高収量のニトリルヒドラターゼ酵素活性を
有する培養菌体を得る方法としては実用的ではない。
酵素誘導の目的で、特開平2-470号公報記載の方法で
は、コバルトイオンを培養液中に添加しているが、その
コバルトイオン濃度では、常に安定して短時間で高収量
のニトリルヒドラターゼ酵素活性を有する培養菌体を得
ることは難しい。また、大量のコバルトイオンを培地に
添加すると生育阻害が著しくなり、かえって短時間で高
収量のニトリルヒドラターゼ活性を有する培養菌体を得
ることができない。
また、短時間で高収量のニトリルヒドラターゼ活性を
有する培養菌体を得るには、炭素源としては、グルコー
スやスクロースが好適と考えられ、フルクトース等のケ
ト糖やマンニトール等の糖アルコールを用いることは、
従来、学術的にも不可能であると考えられてきた。
本発明は、前記問題点を解決した短時間で高収量のニ
トリルヒドラターゼ活性を有する培養菌体を得る方法を
提供することにある。
本発明者らは、工業的に短時間で高収量のニトリルヒ
ドラターゼ活性を有する菌体を得る培養条件について鋭
意検討を行った結果、フルクトース等のケト糖及び/又
はマンニトール等の糖アルコールを培養液中に存在させ
ることにより、培養液中に大量のコバルトイオンを存在
させても生育阻害が軽減でき、高活性な菌体を得ること
が可能となることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。
すなわち、本発明は、ニトリルヒドラターゼ産生能を
有する微生物を、糖アルコール及び/又はケト糖、並び
にコバルトイオンを含む培地基材で培養する方法であ
る。ここで、コバルトイオンの濃度は、好ましくはCo
Cl2換算で15mg/L以上である。また、前記糖ア
ルコールは、好ましくは一般式(I)で示されるもので
ある。
さらに、前記ケト糖は、一般式(II)で示されるもの
である。
本発明において、糖アルコール及び/又はケト糖を炭
素源として使用するが、これら糖化合物を培養液中に存
在させることで、コバルトイオンによる生育阻害を軽減
できることは、従来知られていなかったことである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の対象となる微生物は、ニトリルヒドラターゼ
産生能を有する微生物であれば特に制限はされない。具
体的には、例えば、特公昭56-17918号記載のノカルジア
(Nocardia)sp.N-775、特公平06-55148号記載のロドコッ
カスロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous )J-1、特
開平05-30982号記載のクレブシエラ(Klebsiella)sp.MCI
2609、特開平05-30983号記載のエアロモナス(Aeromona
s)sp.MCI2614、特開平05-30984号記載のシトロバクター
フロンディ(Citrobacter freundii)MCI2615、特開平0
5-103681号記載のアグロバクテリウム リゾゲネス(Agr
obacterium rhizogenes)IAM13570およびアグロバクテリ
ウム トウメファシエンス(Agrobacteriumfaciens)、特
開平05−161495号記載のキサントバクター フ
ラブス(Xanthobacter flavas)JCM1204、エルウィニア
ニグリフルエンス(Erwinia nigrifluens)MAFF03-0143
5、特開平05-236975号記載のエンテロバクター(Enterob
acter)sp.MCI2707、特開平05-236976号記載のストレプ
トマイセス(Streptomyces)sp.MCI2691、特開平05-23697
7号記載のリゾビウム(Rhizobium)sp.MCI2610、リゾビウ
ムsp.MCI2643、リゾビウム ロティ(Rhizobium loti)IA
M13588、リゾビウム レグミノサーラム(Rhizobium leg
minosarum)IAM12609およびリゾビウム メリオティ(Rhi
zobium merioti)IAM12611、特開平05-15384号記載のキ
ャンディダ グイリエモンディ(Candida guilliermondi
i)NH-2、パントエア アグロメランス(Pantoea agglome
rans)NH-3およびクレブシエラ ニュウモニアエ スブ
スピーシス ニュウモニアエ(Klebsiella pneumoniae s
ubsp. pneumoniae)NH-26T2、特開平06-14786号記載のア
グロバクテリウム ラジオバクター(Agrobacterium rad
iobacter)SC-C15-1、特開平07-25494号記載のバチルス
スミシー(Bacillus smithii)SC-J05-1、特開平08-566
84号記載のシュードノカルディア サーモフィラ(Pseud
onocardia thermophila)ATCC19285、特開平09-275978号
記載のシュードノカルディア サーモフィラ(Pseudonoc
ardia thermophila)JCM3095の微生物を好適な例として
挙げることができる。
また、前記微生物よりクローニングしたニトリルヒド
ラターゼ遺伝子を、任意の宿主で発現させた形質転換体
も本発明の対象となる。
例えば、宿主の代表例として大腸菌(Escherichia col
i)を用いたUSP 5,807,730号記載のMT-10822株(FERM BP-
5785)の細菌も好適な例として挙げることができる。
培養基材として、炭素源は、一般式(I)で示される
糖アルコール及び/又は一般式(II)で示されるケト糖
が挙げられる。具体的には、フルクトース、マンニトー
ル、ソルビトールが好ましい。これら炭素源は適宜組み
合わせて使用することも可能である。
コバルトイオンの供給源としては、2価又は3価のコ
バルト塩であればいずれでも構わない。例えば、塩化コ
バルト、硫酸コバルト、酢酸コバルト、臭化コバルト、
硼酸コバルトを例示することができる。また、ビタミン
12等もコバルト源として挙げられる。また、コバルト
イオン濃度は、CoCl2換算で15mg/L以上、好ましくは15
〜300mg/Lが良い。
窒素源は、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等、有機栄養源
は、例えば、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプ
トン、味液等、無機塩は、例えば、燐酸塩、マグネシウ
ム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、鉄塩、コバルト塩、
その他微量金属塩等を選択し培地を調製する。必要に応
じて、酵素誘導剤として、例えば、尿素又は尿素誘導体
等を添加しても構わない。
また、適宜、炭素源、コバルトイオン等を培養中に分
割添加しても構わない。
培養中、pHは通常5〜10、好ましくは7〜9に維持す
る。培養温度は、通常25〜50℃、好ましくは30〜40℃に
維持し、好気的に1〜3日間培養する。
発明を実施するための最良の形態 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、
本発明はこれらの例のみに限定されるものではない。
〔実施例1〕 (1) 菌の培養 前培養条件: (培地組成) フルクトース 2%(w/v)、ポリペプトン 5%(w/v)(日本
製薬株式会社)、酵母エキス 0.3%(w/v)(オリエンタ
ル酵母工業株式会社製)、KH2PO4 0.1%(w/v)、K2HPO4
0.1%(w/v)、MgSO4 7H2O 0.1%(w/v)、pH 7。
(培養方法) 500ml容三角フラスコに培地を100ml分注して綿栓を
し、121℃、20分間オートクレーブで滅菌した。ロドコ
ッカス ロドクロウスJ-1株(FERM BP-1478)を接種し
て30℃で48時間振とう培養した。
本培養条件 (培地組成) 初期培地:酵母エキス 0.2%(w/v)、KH2PO4 0.1%(w/
v)、K2HPO4 0.1%(w/v)、MgSO4・7H2O 0.1%(w/v)、CoCl2
・6H2O 0.002%(w/v)、硫安 0.025%(w/v)、フルクトース
2%(w/v)、尿素 2%(w/v)、エタノール 0.4%(v/v)、
プルロニックL61 0.1%(w/v)(旭電化工業株式会
社)、pH7。
後添加培地:フルクトース 20%(w/v)、エタノール
5%(v/v)、硫安 6%(w/v)、pH6.5。
(培養方法) 3リッター容ミニジャーファーメンター(高杉製作所
社製)に初期培地2リッター分注し、121℃、20分間オ
ートクレーブで滅菌した。但し、フルクトース、エタノ
ールおよび尿素は、別途、無菌的に濾過して(アドバン
テック東洋株式会社社製0.45ミクロンの濾紙を使
用)に培地に加えた。前記前培養終了後の培養液を20ml
植菌し、槽内圧力0.098MPa、攪拌数600rpm、通気量1vv
m、pH7、温度30℃で44時間培養した。
尚、培養20時間目から、後添加培地を20ml/hrの流
速で培養終了まで添加した。
(2)ニトリルヒドラターゼ活性の測定 培養液0.1mlと1/20Mリン酸緩衝液(pH7.7)4.90mlと
を混合し、これにさらに5.0%(w/v)のアクリロニトリル
を含む1/20Mリン酸緩衝液(pH7.7)5mlを加えて、10℃
で10分間反応させた。反応終了後、菌体を遠心分離によ
り濾別してから、上清のアクリルアミドの量を、ガスク
ロマトグラフィー(GC-14B 島津製作所社製)で定量し
た。分析条件はポラパックPS(ウォーターズ社製カラ
ム充填剤)を充填した1mガラスカラムを用い、カラム温
度230℃、検出器は250℃のFIDで実施した。
以下、酵素活性の単位(ユニット)は、上記活性測定
において、1分間に1μmolのアクリロニトリルをアク
リルアミドに変換する活性を1ユニットと定めた。 活
性は、培養液あたりの活性及び菌体あたりの活性につい
て調べた。結果を表1に示した。CoCl2・6H2Oを0.002%(w
/v)存在させて培養したときの値を100とし、他の培養条
件時の活性値を相対活性(%)で示した。
〔実施例2〜5〕 本培養のCoCl2・6H2Oの濃度を0.002%(w/v)添加した培
地の代わりに、CoCl2・6H2Oの濃度を0.005%(w/v)添加し
た培地(実施例2)、0.01%(w/v)添加した培地(実施例
3)0.02%(w/v)添加した培地(実施例4)、0.03%(w/v)
添加した培地(実施例5)を用いること以外は、実施例
1と同様な方法によって実施した。結果を表1に示し
た。
〔実施例6、7〕 前培養および本培養でフルクトースの代わりにマンニ
トールを添加した培地(実施例6)、ソルビトールを添
加した培地(実施例7)を用いること以外は実施例3と
同様な方法によって実施した。結果を表1に示した。
〔比較例1〕 前培養および培養でフルクトースを添加した培地の代
わりに、グルコースを添加した培地を用いること以外は
実施例1と同様な方法によって実施した。結果を表1に
示した。
〔比較例2〜5〕 本培養のCoCl2・6H2Oの濃度を0.002%(w/v)添加した培
地の代わりに、CoCl2・6H2Oを0.005%(w/v)添加した培地
(比較例2)、0.01%(w/v)添加した培地(比較例3)、
0.02%(w/v)添加した培地(比較例4)、0.03%(w/v)添加
した培地(比較例5)を用いること以外は比較例1と同
様な方法によって実施した。結果を表1に示した。
〔実施例8〕 ロドコッカス ロドクロウスJ-1株の代わりにノカル
ジアsp. N-775株(N-755菌株として寄託。受託番号FERM
BP-961)を用いること以外は実施例1と同様な方法によ
って実施した。結果を表2に示した。
〔実施例9〕 本培養のCoCl2・6H2Oの濃度を0.002%(w/v)添加した培
地の代わりに、CoCl2・6H2Oの濃度を0.01%(w/v)添加した
培地を用いること以外は実施例8と同様な方法によって
実施した。結果を表2に示した。
〔実施例10、11〕 前培養および本培養でフルクトースを添加した培地の
代わりに、マンニトールを添加した培地(実施例1
0)、ソルビトールを添加した培地(実施例11)を用
いること以外は実施例9と同様な方法によって実施し
た。結果を表2に示した。
〔比較例6〕 前培養および本培養でフルクトースを添加した培地の
代わりに、グルコースを添加した培地を用いること以外
は実施例8と同様な方法によって実施した。結果を表2
に示した。
〔比較例7〕 本培養のCoCl2・6H2Oの濃度を0.002%(w/v)添加した培
地の代わりに、CoCl2・6H2Oの濃度を0.01%(w/v)添加した
培地を用いること以外は比較例6と同様な方法によって
実施した。結果を表2に示した。
〔実施例12〕 (1)菌の培養 前培養条件 (培地組成) ポリペプトン1%(w/v)、酵母エキス0.5%(w/v)、NaCl
0.5%(w/v)、アンピシリン・Na 100μg/ml、pH7(L
B培地)。
(培養方法) 500ml容三角フラスコに培地を100ml分注して綿栓を
し、121℃、20分間オートクレーブで滅菌した。MT-1082
2株(FERM BP-5785)を接種して37℃で6時間振とう培養
した。
本培養条件 (培地組成) 酵母エキス 0.5%(w/v)、ポリペプトン 2%(w/v)、NaC
l 0.06%(w/v)、KCl 0.02%(w/v)、MgCl2・6H2O 0.2%(w/
v)、CoCl2・6H2O 0.002%(w/v)、MgCl4・7H2O 0.243%(w/
v)、フルクトース 4%(w/v)、プルロニックL61 0.02%(w
/v)、pH7。
(培養方法) 3リッター容ミニジャーファーメンターに初期培地2
リッター分注し、121℃、20分間オートクレーブで
滅菌した。但し、フルフトースおよびMgSO・7H
Oは、別途、無菌的に濾過して(アドバンテック東洋
株式会社製0.45ミクロンの濾紙を使用)培地に加え
た。前記前培養終了後の培養液を20ml植菌し、槽内圧力
0.025MPa、攪拌数800rpm、通気量1vv
m、pH7、温度37℃で12時間培養した。
(2)ニトリルヒドラターゼ活性の測定 実施例1(2)と同様な方法によって実施した。活性
は、培養液あたりの活性及び菌体あたりの活性について
調べた。結果を表3に示した。CoCl2・6H2Oを0.002%(w/
v)存在させて培養したときの値を100として、他の培養
条件時の活性値を相対活性(%)で示した。
〔実施例13〕 本培養のCoCl2・6H2Oの濃度を0.002%(w/v)添加した培
地の代わりに、CoCl2・6H2Oの濃度を0.01%(w/v)添加した
培地を用いること以外は実施例12と同様な方法によって
実施した。結果を表3に示す。
〔実施例14、15〕 本培養でフルクトースを添加した培地の代わりに、マ
ンニトールを添加した培地(実施例14)、ソルビトー
ルを添加した培地(実施例15)を用いること以外は実
施例13と同様な方法によって実施した。結果を表3に
示した。
〔比較例8〕 本培養でフルクトースを添加した培地の代わりに、グ
ルコースを添加した培地を用いること以外は実施例12
と同様な方法によって実施した。結果を表3に示した。
〔比較例9〕 本培養のCoCl・6HOの濃度を0.002%
(w/v)添加した培地の代わりに、CoCl・6H
Oの濃度を0.01%(w/v)添加した培地を用い
ること以外は比較例8と同様な方法によって実施した。
結果を表3に示した。
産業上の利用可能性 フルクトース等のケト糖、マンニトール等の糖アルコ
ールは、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の培
養に際して、コバルトイオンによる生育阻害を軽減する
ことができるので、結果として、短時間で高収量のニト
リルヒドラターゼ酵素活性を有する菌体を得ることがで
きる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平8−112089(JP,A) 特開 平2−470(JP,A) 特開 平2−100674(JP,A) 特開 昭64−74996(JP,A) 特開 平8−38163(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 1/20 BIOSIS/WPI(DIALOG)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ニトリルヒドラターゼ産生能を有する微
    生物を、一般式(I )で示される糖アルコール(但し、
    イノシトールを除く)及び/又は一般式(II)で示され
    るケト糖、並びにコバルトイオンを含む培地基材で培養
    する方法。 【化1】 【化2】
  2. 【請求項2】 コバルトイオンの濃度がCoCl2換算
    で15mg/L以上である請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項3】 コバルトイオンの濃度がCoCl2換算
    で20mg/L以上である請求項1に記載の方法。
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