KR100507248B1

KR100507248B1 - 미생물 배양 방법

Info

Publication number: KR100507248B1
Application number: KR10-2002-7012430A
Authority: KR
Inventors: 고이찌로 류노; 에쯔꼬 고바야시
Original assignee: 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤
Priority date: 2000-03-21
Filing date: 2001-03-21
Publication date: 2005-08-10
Also published as: WO2001070936A1; EP1283256A1; CN1419596A; EP1283256A4; US20030068789A1; DE60129547T2; JP3467264B2; EP1283256B1; DE60129547D1; KR20020086667A; BR0109480A; US6955911B2; CN1316009C; BR0109480B1

Abstract

본 발명은 니트릴 히드라타제 생산능을 갖는 미생물을 배양할 때, 배양액 중에 과당 등의 케토당 및 만니톨 등의 당알콜 중 1종 이상을 존재시킴으로써 코발트 이온에 의한 생육 저해를 회피하고, 고농도 및 고활성 배양을 달성할 수 있다.

Description

미생물 배양 방법 {Method of Culturing Microorganism}

본 발명은 니트릴 히드라타제 효소 활성이 높은 배양 균체를 단시간에 높은 수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근 에너지 절약면에서 미생물 또는 그의 효소를 생체 촉매로서 물질 생산에 이용하고자 하는 시도가 다시 활발해지고 있다. 니트릴 히드라타제는 니트릴류를 수화하여 대응하는 아미드를 생성시키는 효소로서 알려져 있으며, 특히 아크릴로니트릴로부터 아크릴아미드를 제조하는 촉매로서 유용하다.

니트릴 히드라타제 생산능을 갖는 미생물로서는, 예를 들면 노카르디아속 (Nocardia) [일본 특허 공개 (소)54-129190호 공보 참조], 로도코커스속 (Rhodococcus) [일본 특허 공개 (평)2-470호 공보 참조], 리조븀속(Rhizobium) [일본 특허 공개 (평)5-236977호 공보 참조], 클렙시엘라속(Klebsiella) [일본 특허 공개 (평)5-30982호 공보 참조], 에로모나스속(Aeromonas) [일본 특허 공개 (평)5-30983호 공보 참조], 아그로박테리움속(Agrobacterium) [일본 특허 공개 (평)8-154691호 공보 참조], 바실루스속(Bacillus) [일본 특허 공개 (평)8-187092호 공보 참조], 슈도노카르디아속(Pseudonocardia) [일본 특허 공개 (평)8-56684] 등에 속하는 세균이 알려져 있다. 상기 모든 공보에 있어서도 니트릴 히드라타제 활성을 생산하는 미생물의 배양 방법이 기재되어 있다.

또한, 배양시의 탄소원의 이용에 대해서는 문헌 (Applied Microbiology and Biotechnology (1991)34: 783-788의 "Effect of carbon sources")의 항에서 "R.rhodochrous J1을 이용한 니트릴 히드라타제의 생산에 있어서, 가장 적합한 탄소원은 2 ％ 글루코스이다"라고 기재되어 있다.

상기 공보에 기재되어 있는 배양 방법은 모두 공업적으로 단시간에 높은 수율의 니트릴 히드라타제 효소 활성을 갖는 배양 균체를 얻는 방법으로서는 실용적이지 못하였다.

효소 유도의 목적으로, 일본 특허 공개 (평)2-470호 공보에 기재된 방법에서는 코발트 이온을 배양액 중에 첨가하고 있지만, 그 코발트 이온 농도로는 항상 안정하게 단시간 동안 높은 수율의 니트릴 히드라타제 효소 활성을 갖는 배양 균체를 얻는 것은 곤란하였다. 또한, 다량의 코발트 이온을 배지에 첨가하면, 생육 저해가 현저해져 오히려 단시간에 높은 수율의 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 배양 균체를 얻는 것은 불가능하였다.

또한, 단시간에 높은 수율의 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 배양 균체를 얻기 위해서는 탄소원으로서 글루코스 및 수크로스가 바람직하다고 여겨지고 있으며, 과당 등의 케토당 및 만니톨 등의 당알콜을 사용하는 것은 종래 학술적으로도 불가능하다고 여겨져 왔다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결한 것으로, 단시간에 높은 수율의 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 배양 균체를 얻는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 공업적으로 단시간에 높은 수율의 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 균체를 얻는 배양 조건에 대하여 예의 검토한 결과, 과당 등의 케토당 및(또는) 만니톨 등의 당알콜을 배양액 중에 존재시킴으로써, 배양액 중에 다량의 코발트 이온을 존재시켜도 생육 저해를 감소시킬 수 있으며, 고활성의 균체를 얻을 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 니트릴 히드라타제 생산능을 갖는 미생물을 당알콜 및(또는) 케토당, 및 코발트 이온을 포함하는 배지 기재에서 배양하는 방법에 관한 것이다. 여기에서, 코발트 이온의 농도는 바람직하게는 CoCl₂환산으로 15 mg/ℓ 이상이다. 또한, 상기 당알콜은 바람직하게는 하기 화학식 I로 표시되는 것이다.

식 중, n은 2 내지 4의 정수를 나타낸다.

또한, 상기 케토당은 하기 화학식 II로 표시되는 것이다.

식 중, n은 3을 나타낸다.

본 발명에서는, 당알콜 및(또는) 케토당을 탄소원으로서 사용하고 있지만, 이들 당 화합물을 배양액 중에 존재시킴으로써 코발트 이온에 의한 생육 저해를 감소시킬 수 있다는 것은 종래 알려져 있지 않은 사실이었다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 대상이 되는 미생물은 니트릴 히드라타제 생산능을 갖는 미생물이라면 특별히 제한되지는 않는다. 구체적으로는, 예를 들면 일본 특허 공고 (소)56-17918호에 기재된 노카르디아종 N-775, 일본 특허 공고 (평)06-55148호에 기재된 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J-1, 일본 특허 공개 (평)05-30982호에 기재된 클렙시엘라종 MCI2609, 일본 특허 공개 (평)05-30983호에 기재된 에로모나스종 MCI2614, 일본 특허 공개 (평)05-30984호에 기재된 시트로박터 프론디(Citrobacter freundii) MCI2615, 일본 특허 공개 (평)05-103681호에 기재된 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) IAM13570 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 일본 특허 공개 (평)05-161495호에 기재된 크산토박터 플라바스(Xanthobacter flavas) JCM1204, 에르위니아 니그리플루엔스(Erwinia nigrifluens) MAFF03-01435, 일본 특허 공개 (평)05-236975호에 기재된 엔테로박터종(Enterobacter) MCI2707, 일본 특허 공개 (평)05-236976호에 기재된 스트렙토마이세스종(Streptomyces) MCI2691, 일본 특허 공개 (평)05-236977호에 기재된 리조븀종 MCI2610, 리조븀종 MCI2643, 리조븀 로티(Rhizobium loti) IAM13588, 리조븀 레그미노사럼 (Rhizobium legminosarum) IAM12609 및 리조븀 메리오티(Rhizobium merioti) IAM12611, 일본 특허 공개 (평)05-15384호에 기재된 칸디다 길리에르몬디(Candida guilliermondii) NH-2, 판토에아 아글로메란스 (Pantoea agglomerans) NH-3 및 클렙시엘라 뉴모니아에 아종 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae) NH-26T2, 일본 특허 공개 (평)06-14786호에 기재된 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) SC-C15-1, 일본 특허 공개 (평)07-25494호에 기재된 바실루스 스미시(Bacillus smithii) SC-J05-1, 일본 특허 공개 (평)08-56684호에 기재된 슈도노카르디아 서모필라 (Pseudonocardia thermophila) ATCC19285, 일본 특허 공개 (평)09-275978호에 기재된 슈도노카르디아 서모필라 JCM3095의 미생물을 바람직한 예로서 들 수 있다.

또한, 상기 미생물로부터 클로닝한 니트릴 히드라타제 유전자를 임의의 숙주에서 발현시킨 형질 전환체도 본 발명의 대상이 된다.

예를 들면, 숙주의 대표예로서 대장균(Escherichia coli)을 사용한 USP 5,807,730호에 기재된 MT-10822주 (FERM BP-5785)의 세균도 바람직한 예로서 들 수 있다.

배양 기재로서 탄소원은 하기 화학식 I로 표시되는 당알콜 및(또는) 하기 화학식 II로 표시되는 케토당을 들 수 있다. 구체적으로는 과당, 만니톨, 소르비톨이 바람직하다. 이들 탄소원은 적절하게 조합하여 사용하는 것도 가능하다.

<화학식 I>

식 중, n은 2 내지 4의 정수를 나타낸다.

<화학식 II>

식 중, n은 3을 나타낸다.

코발트 이온의 공급원으로서는 2가 또는 3가의 코발트염이라면 어떠한 것이든 상관없다. 예를 들면, 염화 코발트, 황산 코발트, 아세트산 코발트, 브롬화 코발트, 붕산 코발트를 예시할 수 있다. 또한, 비타민 B₁₂ 등도 코발트원으로서 들 수 있다. 또한, 코발트 이온의 농도는 CoCl₂환산으로 15 mg/ℓ 이상, 바람직하게는 15 내지 300 mg/ℓ가 바람직하다.

질소원으로서는 예를 들면 암모니아, 황산 암모늄, 염화 암모늄, 질산 암모늄 등을, 유기 영양원으로서는 예를 들면 효모 추출물, 육즙 추출물, 맥아 추출물, 펩톤, 미액(味液) 등을, 무기염으로서는 예를 들면 인산염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 철염, 코발트염, 기타 미량 금속염 등을 선택하여 배지를 제조한다. 필요에 따라 효소 유도제로서 예를 들면 요소 또는 요소 유도체 등을 첨가할 수도 있다.

또한, 적절하게 탄소원, 코발트 이온 등을 배양 중에 분할 첨가할 수도 있다.

배양 중 pH는 통상 5 내지 10, 바람직하게는 7 내지 9로 유지된다. 배양 온도는 통상 25 내지 50 ℃, 바람직하게는 30 내지 40 ℃로 유지되며, 호기적으로 1 내지 3일간 배양한다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

(1) 균의 배양

① 전배양 조건:

(배지 조성)

과당 2 ％(w/v), 폴리펩톤 5 ％(w/v) (닛본 세야꾸 가부시끼 가이샤), 효모 추출물 0.3 ％(w/v) (오리엔탈 고우모 고교 가부시끼 가이샤 제조), KH₂PO₄0.1 ％(w/v), K₂HPO₄0.1 ％(w/v), MgSO_4ㆍ7H₂O 0.1 ％(w/v), pH 7.

(배양 방법)

500 ㎖ 용량의 삼각 플라스크에 배지를 100 ㎖ 분주하고 솜으로 마개를 하여 121 ℃에서 20분간 오토클레이브에서 멸균하였다. 로도코커스 로도크로우스 J-1주 (FERM BP-1478)를 접종하여 30 ℃에서 48시간 진탕 배양하였다.

② 본배양 조건

(배지 조성)

초기 배지: 효모 추출물 0.2 ％(w/v), KH₂PO₄0.1 ％(w/v), K₂HPO₄0.1 ％(w/v), MgSO₄ㆍ7H₂O 0.1 ％(w/v), CoCl₂ㆍ6H₂O 0.002 ％(w/v), 황산암모늄 0.025 ％(w/v), 과당 2 ％(w/v), 요소 2 ％(w/v), 에탄올 0.4 ％(v/v), 플루로닉 L61 0.1 ％(w/v) (아사히 덴까 고교 가부시끼 가이샤), pH 7.

후첨가 배지: 과당 20 ％(w/v), 에탄올 5 ％(v/v), 황산암모늄 6 ％(w/v), pH 6.5.

(배양 방법)

3 ℓ 용량의 소형 단지 발효기 (다까스기 세이사꾸쇼 제조)에 초기 배지 2 ℓ를 분주하고, 121 ℃에서 20분간 오토클레이브에서 멸균하였다. 단, 과당, 에탄올 및 요소는 별도로 무균적으로 여과하여 (어드벤텍 도요 가부시끼 가이샤 제조의 0.45 마이크론의 여과지를 사용) 배지에 첨가하였다. 상기 전배양 종료 후의 배양액을 20 ㎖ 식균하고, 조 내의 압력 0.098 MPa, 교반수 600 rpm, 통기량 1 vvm, pH 7, 온도 30 ℃에서 44시간 배양하였다.

또한, 배양 20시간째부터 후첨가 배지를 20 ㎖/hr의 유속으로 배양 종료까지 첨가하였다.

(2) 니트릴 히드라타제 활성의 측정

배양액 0.1 ㎖와 1/20 M 인산 완충액 (pH 7.7) 4.90 ㎖를 혼합하고, 여기에 다시 5.0 ％(w/v)의 아크릴로니트릴을 포함하는 1/20 M 인산 완충액 (pH 7.7) 5 ㎖를 첨가하여 10 ℃에서 10분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 균체를 원심 분리에 의해 여과 분리하고 나서 상청의 아크릴아미드의 양을 가스 크로마토그래피 (GC-14 B, 시마즈 세이사꾸쇼 제조)로 정량하였다. 분석 조건은 포라팩 PS (워터즈사 제조의 칼럼 충전제)를 충전한 1 m 유리 칼럼을 사용하여 칼럼 온도 230 ℃, 검출기 250 ℃의 FID에서 실시하였다.

이하, 효소 활성의 단위(유닛)는 상기 활성 측정에 있어서 1분 동안 1 μmol의 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 변환하는 활성을 1 유닛이라고 정하였다. 활성은 배양액당 활성 및 균체당 활성에 대하여 조사하였다. 결과를 표 1에 나타내었다. CoCl₂ㆍ6H₂O를 0.002 ％(w/v) 존재시켜 배양했을 때의 값을 100으로 하여, 다른 배양 조건시의 활성치를 상대 활성(％)으로 나타내었다.

<실시예 2 내지 5>

본배양의 CoCl₂ㆍ6H₂O의 농도를 0.002 ％(w/v) 첨가한 배지 대신에 CoCl₂ㆍ6 H₂O의 농도를 0.005 ％(w/v) 첨가한 배지 (실시예 2), 0.01 ％(w/v) 첨가한 배지 (실시예 3), 0.02 ％(w/v) 첨가한 배지 (실시예 4), 0.03 ％(w/v) 첨가한 배지 (실시예 5)를 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

<실시예 6, 7>

전배양 및 본배양에서 과당 대신에 만니톨을 첨가한 배지 (실시예 6), 소르비톨을 첨가한 배지 (실시예 7)를 사용한 것 이외에는, 실시예 3과 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

<비교예 1>

전배양 및 본배양에서 과당을 첨가한 배지 대신에 글루코스를 첨가한 배지를 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

<비교예 2 내지 5>

본배양의 CoCl₂ㆍ6H₂O의 농도를 0.002 ％(w/v) 첨가한 배지 대신에 CoCl₂ㆍ 6H₂O를 0.005 ％(w/v) 첨가한 배지 (비교예 2), 0.01 ％(w/v) 첨가한 배지 (비교예 3), 0.02 ％(w/v) 첨가한 배지 (비교예 4), 0.03 ％(w/v) 첨가한 배지 (비교예 5)를 사용한 것 이외에는, 비교예 1과 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

<실시예 8>

로도코커스 로도크로우스 J-1주 대신에 노카르디아종 N-775주 (N-755 균주로서 기탁. 수탁 번호 FERM BP-961)를 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

<실시예 9>

본배양의 CoCl₂ㆍ6H₂O의 농도를 0.002 ％(w/v) 첨가한 배지 대신에 CoCl₂ㆍ 6H₂O의 농도를 0.01 ％(w/v) 첨가한 배지를 사용한 것 이외에는, 실시예 8과 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

<실시예 10, 11>

전배양 및 본배양에서 과당을 첨가한 배지 대신에 만니톨을 첨가한 배지 (실시예 10), 소르비톨을 첨가한 배지 (실시예 11)를 사용한 것 이외에는, 실시예 9와 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

<비교예 6>

전배양 및 본배양에서 과당을 첨가한 배지 대신에 글루코스를 첨가한 배지를 사용한 것 이외에는, 실시예 8과 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

<비교예 7>

본배양의 CoCl₂ㆍ6H₂O의 농도를 0.002 ％(w/v) 첨가한 배지 대신에 CoCl₂ㆍ 6H₂O의 농도를 0.01 ％(w/v) 첨가한 배지를 사용한 것 이외에는, 비교예 6과 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

	당	CoCl₂ 농도	균체당 활성	배양액당 활성
실시예 1	과당	0.002	100	100
실시예 2	과당	0.005	215	195
실시예 3	과당	0.01	252	229
실시예 4	과당	0.02	259	230
실시예 5	과당	0.03	259	231
실시예 6	만니톨	0.01	250	252
실시예 7	소르비톨	0.01	259	247
비교예 1	글루코스	0.002	100	18
비교예 2	글루코스	0.005	100	16
비교예 3	글루코스	0.01	48	6
비교예 4	글루코스	0.02	37	3
비교예 5	글루코스	0.03	7	0.2

	당	CoCl₂ 농도	균체당 활성	배양액당 활성
실시예 8	과당	0.002	100	100
실시예 9	과당	0.01	207	188
실시예 10	만니톨	0.01	217	197
실시예 11	소르비톨	0.01	230	209
비교예 6	글루코스	0.002	83	15
비교예 7	글루코스	0.01	55	10

<실시예 12>

(1) 균의 배양

① 전배양 조건

(배지 조성)

폴리펩톤 1 ％(w/v), 효모 추출물 0.5 ％(w/v), NaCl 0.5 ％(w/v), 암피실린ㆍNa 100 ㎍/㎖, pH 7 (LB 배지).

(배양 방법)

500 ㎖ 용량의 삼각 플라스크에 배지를 100 ㎖ 분주하고 솜으로 마개를 하여 121 ℃에서 20분간 오토클레이브에서 멸균하였다. MT-10822주 (FERM BP-5785)를 접종하여 37 ℃에서 6시간 진탕 배양하였다.

② 본배양 조건

(배지 조성)

효모 추출물 0.5 ％(w/v), 폴리펩톤 2 ％(w/v), NaCl 0.06 ％(w/v), KCl 0.02 ％(w/v), MgCl₂ㆍ6H₂O 0.2 ％(w/v), CoCl₂ㆍ6H₂O 0.002 ％(w/v), MgSO₄ㆍ7H₂O 0.243 ％(w/v), 과당 4 ％(w/v), 플루로닉 L61 0.02 ％(w/v), pH 7.

(배양 방법)

3 ℓ 용량의 소형 단지 발효기에 초기 배지 2 ℓ를 분주하고, 121 ℃에서 20분간 오토클레이브에서 멸균하였다. 단, 과당 및 MgSO₄ㆍ7H₂O는 별도로 무균적으로 여과하여 (어드벤텍 도요 가부시끼 가이샤 제조의 0.45 마이크론의 여과지를 사용) 배지에 첨가하였다. 상기 전배양 종료 후의 배양액을 20 ㎖ 식균하고, 조 내의 압력 0.025 MPa, 교반수 800 rpm, 통기량 1 vvm, pH 7, 온도 37 ℃에서 12시간 배양하였다.

(2) 니트릴 히드라타제 활성의 측정

실시예 1(2)와 동일한 방법에 의해 실시하였다. 활성은 배양액당 활성 및 균체당 활성에 대하여 조사하였다. 결과를 표 3에 나타내었다. CoCl₂ㆍ6H₂O를 0.002 ％(w/v) 존재시켜 배양했을 때의 값을 100으로 하여, 다른 배양 조건시의 활성치를 상대 활성(％)으로 나타내었다.

<실시예 13>

본배양의 CoCl₂ㆍ6H₂O의 농도를 0.002 ％(w/v) 첨가한 배지 대신에 CoCl₂ㆍ 6H₂O의 농도를 0.01 ％(w/v) 첨가한 배지를 사용한 것 이외에는, 실시예 12와 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.

<실시예 14, 15>

본배양에서 과당을 첨가한 배지 대신에 만니톨을 첨가한 배지 (실시예 14), 소르비톨을 첨가한 배지 (실시예 15)를 사용한 것 이외에는, 실시예 13과 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.

<비교예 8>

본배양에서 과당을 첨가한 배지 대신에 글루코스를 첨가한 배지를 사용한 것 이외에는, 실시예 12와 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.

<비교예 9>

본배양의 CoCl₂ㆍ6H₂O의 농도를 0.002 ％(w/v) 첨가한 배지 대신에 CoCl₂ㆍ 6H₂O의 농도를 0.01 ％(w/v) 첨가한 배지를 사용한 것 이외에는, 비교예 8과 동일한 방법에 의해 실시하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.

	당	CoCl₂ 농도	균체당 활성	배양액당 활성
실시예 12	과당	0.002	100	100
실시예 13	과당	0.01	342	363
실시예 14	만니톨	0.01	528	113
실시예 15	소르비톨	0.01	436	363
비교예 8	글루코스	0.002	87	87
비교예 9	글루코스	0.01	38	35

과당 등의 케토당, 만니톨 등의 당알콜은 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 미생물 배양시 코발트 이온에 의한 생육 저해를 감소시킬 수 있기 때문에, 결과적으로 단시간에 높은 수율의 니트릴 히드라타제 효소 활성을 갖는 균체를 얻을 수 있다.

Claims

니트릴 히드라타제 생산능을 갖는 미생물을 하기 화학식 I로 표시되는 당알콜 및(또는) 케토당, 및 코발트 이온을 포함하는 배지 기재에서 배양하는 방법.

<화학식 I>

식 중, n은 2 내지 4의 정수를 나타낸다.
삭제
제1항에 있어서, 케토당이 하기 화학식 II로 표시되는 것인 방법.

<화학식 II>

식 중, n은 3을 나타낸다.
제1항 또는 제3항에 있어서, 코발트 이온의 농도가 CoCl₂환산으로 15 mg/ℓ 내지 300 mg/ℓ인 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 코발트 이온의 농도가 CoCl₂환산으로 20 mg/ℓ 내지 300 mg/ℓ인 방법.