JP2005160403A - ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の改変方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】改変の対象となる領域をニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列中のアミノ酸に置換・挿入・削除等の変更を加える事によってニトリルヒドラターゼを改変し、該変更によって得られた改変酵素遺伝子を含むプラスミド、形質転換された細胞株を作製し、該細胞株を用いた該酵素の産生や該細胞株を培養して得られる培養液・細胞・細胞処理物を用いたニトリル化合物からの対応アミド化合物の製造方法。
【選択図】図2
Description
〔1〕 ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Vmax・Km・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(a)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列及び配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
(b)アラインメント結果から、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列中の36番目スレオニンより48番目アスパラギンに至る領域、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列中の31番目リジンより51番目フェニルアラニンに至る領域、及び112番目リジンより127番目ロイシンに至る領域に相当するアミノ酸残基を特定する、
(c)特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔2〕 ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Vmax・Km・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(d)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列及び配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
(e)アラインメント結果から、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列中の36・48・71・148・188・204番目に相当するアミノ酸残基、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列中の10・32・33・37・40・41・46・48・51・61・72・112・118・127・146・150・160・168・171・176・186・217・218番目に相当するアミノ酸残基を特定する、
(f)特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔3〕 ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Vmax・Km・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(g)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、PDB(Protein Data Bank)番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づ
いたアラインメントを行う事により推定する、
(h)推定された立体構造に基づき、PDB番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のA鎖(Chain 1IRE:A)におけるN末から数えて2番目のヘリックス、及びB鎖(Chain 1IRE:B)におけるN末から数えて1番目のヘリックス、2番目のヘリックス、及びそれらにはさまれたループ部分とC末から数えて3番目のヘリックスに相当する領域のアミノ酸残基を特定する、
(i)特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔4〕 ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Vmax・Km・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(j)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、PDB番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
(k)推定された立体構造に基づき、PDB番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のA鎖におけるN末から89番目のアミノ酸残基であるグルタミン、165番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸に相当するアミノ酸残基、及びB鎖のN末から37番目のアミノ酸残基であるフェニルアラニン、48番目のアミノ酸であるロイシンに相当する4つのアミノ酸残基を特定する、
(l)特定された4つのアミノ酸残基の側鎖先端重原子を各々中心点とした立体構造上半径5Å内の範囲に側鎖先端重原子が含まれるアミノ酸残基を特定する、
(m)上記lで特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔5〕 ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Vmax・Km・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(n)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、PDB番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
(o)推定された立体構造に基づき、基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域を特定する、
(p)特定された領域を構成するアミノ酸残基の内、それを変更する事が空洞の大きさを変化させ、延いては基質/生成物の通過し易さ/し難さを制御するアミノ酸残基を特定する、
(q)上記pで特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔6〕 ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Vmax・Km・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(r)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、PDB番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
(s)推定された立体構造に基づき、PDB番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のA鎖におけるN末から89番目のアミノ酸であるグルタミン(A89Q)、165番目のアミノ酸であるグルタミン酸(A165E)に相当するアミノ酸残基、及びB鎖のN末から37番目のアミノ酸であるフェニルアラニン(B37F)、48番目のアミノ酸であるロイシン(B48L)に相当するアミノ酸残基の4つのアミノ酸残基を特定する、
(t)A165Eに相当するアミノ酸残基とB48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd1、A89Qに相当するアミノ酸残基とB48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd2、B37Fに相当するアミノ酸残基とB48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd3と規定し、d1から3の1つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する、
(u)特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔7〕 (t)の工程が以下の(t’)のとおりである〔6〕に記載の改変方法、
(t’)A165Eに相当するアミノ酸残基とB48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd1、A89Qに相当するアミノ酸残基とB48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd2、B37Fに相当するアミノ酸残基とB48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd3、A165Eに相当するアミノ酸残基とB37Fに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd4、A89Qに相当するアミノ酸残基とB37Fに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd5と規定し、d1から5の1つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する、
〔8〕 改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素が下記の[A]と[B]の2種類のポリペプチドを含む事を特徴とする〔1〕から〔7〕の何れか一項記載の改変方法、
[A]配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列と40%以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、
[B]配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列と25%以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、
〔9〕 [A]のポリペプチドが下記[C]のポリペプチドであり、[B]のポリペプチドが下記[D]ポリペプチドである事を特徴とする〔8〕記載の改変方法、
[C]配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列の少なくとも1箇所に関して置換、挿入又は削除を行ったアミノ酸配列、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列の6・19・38・77・90・102・106・126・130・142・146・187・194・203番目のアミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列、の何れかのアミノ酸配列から成るポリペプチド、
[D]配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列の少なくとも1箇所に関して置換、挿入又は削除を行ったアミノ酸配列、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列の20・21・108・200・212番目のアミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列、の何れかのアミノ酸配列から成るポリペプチド、
〔10〕 [A]のポリペプチドが下記[E]のポリペプチドであり、[B]のポリペプチドが下記[F]のポリペプチドである事を特徴とする〔8〕記載の改変方法、
[E]配列表の配列番号7記載の塩基配列の704番目から1315番目によって成るORF(オープンリーディングフレーム)がコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
[F]配列表の配列番号7記載の塩基配列の1番目から680番目によって成るORFがコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
〔11〕 改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素が構成要素として含む2種のポリペプチドの内、1つが〔10〕記載の[E]のポリペプチドであり、もう1つのロリペプチドが〔10〕記載の[F]のポリペプチドである事を特徴とし、且つ以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行うことにより、該酵素の活性、基質特異性、Vmax、Km、熱安定性、基質に対する安定性、生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(d’)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
(e’)アラインメント結果から、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列中の48・51番目に相当するアミノ酸残基を特定する、
(f’)特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う、
〔12〕 [A]のポリペプチドが下記[G]のポリペプチドである事を特徴とする〔8〕記載の改変方法、
[G]アミノ酸配列X1CXLC1SC2X2X3X4X5で表される領域を含むポリペプチド
(ここにおいて、Cはシステインを、Xはセリン又はスレオニンを、Lはロイシンを、C1はシステインスルフィン酸(CYSTEINE SULFINIC ACID・3-SULFINOALANINE)を、Sはセリンを、C2はシステインスルフェン酸(CYSTEINE SULFENIC ACID・S-HYDROXY-CYSTEINE)を、X1・X2・X3・X4・X5は任意のアミノ酸を示す。)、
〔13〕 X1がバリン、X4がトリプトファン、X5がプロリンである事を特徴とする〔12〕記載の改変方法、
〔14〕 X2がチロシン、X3がプロリンである事を特徴とする〔13〕記載の改変方法、
〔15〕 X1CXLC1SC2X2X3X4X5で表される領域を介して金属原子と結合している事を特徴とする〔12〕から〔14〕の何れか一項記載の改変方法、
〔16〕 金属原子がコバルト原子である事を特徴とする〔15〕記載の改変方法、
〔17〕 〔1〕から〔16〕の何れか一項記載の改変方法により得られる事を特徴とする改変酵素、
〔18〕 〔17〕記載の改変酵素をコードする遺伝子、
〔19〕 〔18〕記載の遺伝子を含む事を特徴とするプラスミド、
〔20〕 微生物を〔18〕記載の遺伝子又は〔19〕記載のプラスミドを用いる形質転換をすることにより得られる事を特徴とする形質転換体、
〔21〕 〔20〕記載の形質転換体を培養して得られる培養液、細胞、又はそれらの処理物から改変酵素を回収する工程を含む事を特徴とする改変酵素の調製方法、
〔22〕 〔20〕記載の形質転換体を培養して得られる培養液、細胞、又はそれらの処理物、又は〔21〕記載の調製方法により得られる改変酵素をニトリル化合物と溶媒中で接触させる事により該ニトリル化合物を対応するアミド化合物へと転化させる工程を含む事を特徴とするアミド化合物製造方法、
本発明において、ニトリルヒドラターゼ活性とは、ニトリル化合物を対応するアミド化合物に水和する活性を言う。該活性を有する酵素とは、一般的にはαサブユニット、βサブユニットと称される2種のポリペプチド鎖を構成要素とする事を特徴とし、ニトリルヒドラターゼ遺伝子とは、これら2種のポリペプチド鎖を形成する事を特徴とする2つのアミノ酸配列乃至それらをコードする事を特徴とする2つのORF(オープンリーディングフレーム)を成す塩基配列を指す。
1)相対的に、より嵩高いニトリル化合物を基質とし易くなる。
2)相対的に、より嵩の小さいニトリル化合物を基質とし易くなる。
3)任意のニトリル化合物を基質とする場合のVmaxが向上する。
4)任意のニトリル化合物を基質とする場合のKmが低減する。
5)酵素を任意の熱量に暴露した場合の不可逆的失活率が軽減する。
6)酵素を任意濃度の基質に暴露した場合の不可逆的失活率が軽減する。
7)反応中に任意濃度の生成物が存在する事による反応阻害率が軽減する。
8)酵素を任意濃度の生成物に暴露した場合の不可逆的失活率が軽減する。
等を挙げる事が出来る。
500mlのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地100mlを調製し、121℃・20分間のオートクレーブにより滅菌した。
培地組成;
グルコース:10.0g/L、リン酸二水素一カリウム:0.5g/L、リン酸一水素二カリウム:0.5g/L、硫酸マグネシウム・七水和物:0.5g/L、酵母エキストラクト:1.0g/L、ペプトン:7.5g/L、尿素:7.5g/L、塩化コバルト・六水和物:10.0mg/L、pH7.2
この培地に特許文献1記載のロドコッカス・ロドクロウスJ−1株(FERM BP−1478として、前記の寄託機関に特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されており、万人に対し請求により分譲される)を一白菌耳植菌し、30℃・130rpmにて72時間培養した。遠心分離(15000G×15分間)により菌体のみを培養液より分離し、続いて、50mlの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
特許文献2及び非特許文献1において明らかになっているニトリルヒドラターゼ遺伝子の塩基配列に基づいて、配列表の配列番号8及び9記載のプライマーを合成した。実施例1にて調製した部分切断された染色体DNA3μgを鋳型としてPCRを行った。PCR反応では、各プライマーを各々200ngとKODポリメラーゼ(東洋紡績社製)を1Uを含む全量50μlの系で、熱変性(98℃)15秒・アニーリング(58℃)15秒・伸長反応(68℃)2分間のサイクルを40回繰り返した。PCR反応の終了液をアガロース電気泳動(シグマ社製タイプVII低融点アガロース使用;アガロース濃度0.8重量%)によりDNA増幅産物の分析を行ったところ、約1.3kbpの増幅DNA産物の存在が確認できた。
500mlのバッフル付三角フラスコに下記の組成の40μg/mLの硫酸第二鉄・七水和物及び10μg/mLの塩化コバルト・六水和物を含むLB液体培地を100ml調製し、121℃・20分間のオートクレーブにより滅菌した。
培地組成;
酵母エキストラクト:5.0g/L、ポリペプトン:10.0g/L、NaCl:5.0g/L、塩化コバルト・六水和物:10.0mg/L、硫酸第二鉄・七水和物:40.0mg/L、pH7.5
この培地に終濃度が100μg/mlとなるようにアンピシリンを添加した後、特許文献3記載のMT10822(FERM BP−5785)を一白菌耳植菌し、37℃・130rpmにて16時間培養した。遠心分離(15000G×15分間)により菌体のみを培養液より分離し、続いて、50mlの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。該湿菌体よりアルカリSDS抽出法によりpPT−DB1(図1)のプラスミドを調製し、RNaseAを30μg加えて37℃で1時間保温した後、フェノール抽出/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によって該DNAを精製し、最終的に1.0μg/μlとなるようにTE溶液に溶解させた。
実施例2にて調製したEcoRI及びScaIにより切断された約1.3kbpのDNA断片と実施例3にて調製したEcoRI及びEco47IIIにより切断された約3.3kbpのDNA断片とを混合し、DNA連結反応に供した。反応産物により大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体No.200を得た。
改変方法の対象として、ロドコッカス ロドクロウス J−1株由来のニトリルヒドラターゼを例として用いた。請求項1から7に記載された変異導入の標的となるアミノ酸残基を特定する方法を例として用いて、標的の抽出を行った。請求項1・2記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントには、日立ソフト社製のDNASISを用いた。請求項3から7記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントに基づく立体構造のモデリングには、アクセルリス社製のモデラー乃至ホモロジーを用いた。
改変方法の対象として、シュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼを例として用いた。請求項1から7に記載された変異導入の標的となるアミノ酸残基を特定する方法を例として用いて、標的の抽出を行った。請求項1・2記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントには、日立ソフト社製のDNASISを用いた。請求項3から7記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントに基づく立体構造のモデリングには、アクセルリス社製のモデラー乃至ホモロジーを用いた。
改変方法の対象として、シュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼを例として用いた。請求項1から7に記載された変異導入の標的となるアミノ酸残基を特定する方法を例として用いて、標的の抽出を行った。請求項1・2記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントには、日立ソフト社製のDNASISを用いた。請求項3から7記載の特定方法におけるアミノ酸配列のアラインメントに基づく立体構造のモデリングには、アクセルリス社製のモデラー乃至ホモロジーを用いた。
ニトリルヒドラターゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に変異を導入する為に、宝酒造社製の「LA PCR in vitro mutagenesis Kit」を用いた部位特異的な変異導入を行った。以後、「LA PCR in vitro mutagenesis Kit」を単にキットと呼ぶ。以下の実施例では、基本的にキットの原理及び操作方法に従った。
下記の(表1)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるαサブユニットのアミノ酸配列中の36番目のThrを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表2)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるαサブユニットのアミノ酸配列中の48番目のAsnを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表3)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるαサブユニットのアミノ酸配列中の71番目のArgを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表4)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるαサブユニットのアミノ酸配列中の148番目のGlyを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表5)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるαサブユニットのアミノ酸配列中の188番目のThrを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表6)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるαサブユニットのアミノ酸配列中の204番目のValを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表7)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の10番目のThrを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表8)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の32番目のValを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表9)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の33番目のAlaを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表10)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の37番目のPheを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表11)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の40番目のThrを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表12)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の41番目のPheを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表13)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の46番目のMetを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表14)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の48番目のLeuを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表15)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の51番目のPheを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表16)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の61番目のAlaを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表17)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の72番目のTrpを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表18)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の112番目のLysを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表19)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の118番目のPheを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表20)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の127番目のLeuを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表21)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の146番目のArgを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の150番目のAlaを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表23)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の160番目のArgを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表24)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の168番目のThrを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表25)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の171番目のLysを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表26)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の176番目のTyrを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表27)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の186番目のLeuを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表28)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の217番目のAspを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表29)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
実施例3にてMT10822より調製したシュードノカルディア サーモフィラ JCM3095由来のニトリルヒドラターゼをコードするORFを含むプラスミド:pPT−DB1に、実施例6又は7にて抽出した変異導入標的であるβサブユニットのアミノ酸配列中の218番目のCysを他のアミノ酸に変換する為の変異導入を施した。
下記の(表30)に、得られた形質転換体の番号と変異箇所・アミノ酸配列の変化・塩基配列の変化との対応を示す。
500mLのバッフル付三角フラスコに40μg/mLの硫酸第二鉄・七水和物及び10μg/mLの塩化コバルト・六水和物を含む100mLのLB液体培地を5つ調製し、121℃・20分間のオートクレーブにより滅菌した。各々の培地に終濃度が100μg/mLとなるようにアンピシリンを添加した。
500mLのバッフル付三角フラスコに40μg/mLの硫酸第二鉄・七水和物及び10μg/mLの塩化コバルト・六水和物を含む100mLのLB液体培地を57つ調製し、121℃・20分間のオートクレーブにより滅菌した。各々の培地に終濃度が100μg/mLとなるようにアンピシリンを添加した。
が100μg/mLとなるようにアンピシリンを添加した。
ColE1-ori:ColE1系の複製開始部位を示す。
lacZ:pUC18由来のラクトースオペロンのプロモーターおよびオペレーター領域を示す。
NHα:シュードノカルディア サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードするORFを示す。
NHβ:シュードノカルディア サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードするORFを示す。
P16:シュードノカルディア サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化に関与する事を特徴とする蛋白質をコードするORFを示す。
nhhA:ロドコッカス ロドクロウス J−1株由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードするORFを示す。
nhhB:ロドコッカス ロドクロウス J−1株由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードするORFを示す。
Claims (22)
- ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Vmax・Km・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(a)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列及び配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
(b)アラインメント結果から、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列中の36番目スレオニンより48番目アスパラギンに至る領域、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列中の31番目リジンより51番目フェニルアラニンに至る領域、及び112番目リジンより127番目ロイシンに至る領域に相当するアミノ酸残基を特定する、
(c)特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。 - ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Vmax・Km・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(d)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列及び配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
(e)アラインメント結果から、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列中の36・48・71・148・188・204番目に相当するアミノ酸残基、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列中の10・32・33・37・40・41・46・48・51・61・72・112・118・127・146・150・160・168・171・176・186・217・218番目に相当するアミノ酸残基を特定する、
(f)特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。 - ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Vmax・Km・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(g)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、PDB(Protein Data Bank)番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
(h)推定された立体構造に基づき、PDB番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のA鎖(Chain 1IRE:A)におけるN末から数えて2番目のヘリックス、及びB鎖(Chain 1IRE:B)におけるN末から数えて1番目のヘリックス、2番目のヘリックス、及びそれらにはさまれたループ部分とC末から数えて3番目のヘリックスに相当する領域のアミノ酸残基を特定する、
(i)特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。 - ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Vmax・Km・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(j)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、PDB番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
(k)推定された立体構造に基づき、PDB番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のA鎖におけるN末から89番目のアミノ酸残基であるグルタミン、165番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸に相当するアミノ酸残基、及びB鎖のN末から37番目のアミノ酸残基であるフェニルアラニン、48番目のアミノ酸であるロイシンに相当する4つのアミノ酸残基を特定する、
(l)特定された4つのアミノ酸残基の側鎖先端重原子を各々中心点とした立体構造上半径5Å内の範囲に側鎖先端重原子が含まれるアミノ酸残基を特定する、
(m)上記lで特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。 - ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Vmax・Km・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(n)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、PDB番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
(o)推定された立体構造に基づき、基質が酵素外部から活性中心に向かう際や生成物が活性中心から酵素外部に向かう際に通過する空洞を形成する領域を特定する、
(p)特定された領域を構成するアミノ酸残基の内、それを変更する事が空洞の大きさを変化させ、延いては基質/生成物の通過し易さ/し難さを制御するアミノ酸残基を特定する、
(q)上記pで特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。 - ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素において、以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除することにより、該酵素の活性・基質特異性・Vmax・Km・熱安定性・基質に対する安定性・生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、
(r)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素の立体構造を、PDB番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造と、アミノ酸配列に基づいたアラインメントを行う事により推定する、
(s)推定された立体構造に基づき、PDB番号1IRE記載のニトリルヒドラターゼ立体構造中のA鎖におけるN末から89番目のアミノ酸であるグルタミン(A89Q)、165番目のアミノ酸であるグルタミン酸(A165E)に相当するアミノ酸残基、及びB鎖のN末から37番目のアミノ酸であるフェニルアラニン(B37F)、48番目のアミノ酸であるロイシン(B48L)に相当するアミノ酸残基の4つのアミノ酸残基を特定する、
(t)A165Eに相当するアミノ酸残基とB48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd1、A89Qに相当するアミノ酸残基とB48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd2、B37Fに相当するアミノ酸残基とB48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd3と規定し、d1から3の1つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する、
(u)特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。 - (t)の工程が以下の(t’)のとおりである請求項6に記載の改変方法、
(t’)A165Eに相当するアミノ酸残基とB48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd1、A89Qに相当するアミノ酸残基とB48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd2、B37Fに相当するアミノ酸残基とB48Lに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd3、A165Eに相当するアミノ酸残基とB37Fに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd4、A89Qに相当するアミノ酸残基とB37Fに相当するアミノ酸残基との最短重原子間距離をd5と規定し、d1から5の1つ以上を変化させるアミノ酸残基を特定する。 - 改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素が下記の[A]と[B]の2種類のポリペプチドを含む事を特徴とする請求項1から7の何れか一項記載の改変方法、
[A]配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列と40%以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、
[B]配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列と25%以上の相同性を示すアミノ酸配列から成るポリペプチド。 - [A]のポリペプチドが下記[C]のポリペプチドであり、[B]のポリペプチドが下記[D]ポリペプチドである事を特徴とする請求項8記載の改変方法、
[C]配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列の少なくとも1箇所に関して置換、挿入又は削除を行ったアミノ酸配列、配列表の配列番号1記載のアミノ酸配列の6・19・38・77・90・102・106・126・130・142・146・187・194・203番目のアミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列、の何れかのアミノ酸配列から成るポリペプチド、
[D]配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列の少なくとも1箇所に関して置換、挿入又は削除を行ったアミノ酸配列、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列の20・21・108・200・212番目のアミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列、の何れかのアミノ酸配列から成るポリペプチド。 - [A]のポリペプチドが下記[E]のポリペプチドであり、[B]のポリペプチドが下記[F]のポリペプチドである事を特徴とする請求項8記載の改変方法、
[E]配列表の配列番号7記載の塩基配列の704番目から1315番目によって成るORF(オープンリーディングフレーム)がコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
[F]配列表の配列番号7記載の塩基配列の1番目から680番目によって成るORFがコードするアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列から成るポリペプチド。 - 改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素が構成要素として含む2種のポリペプチドの内、1つが請求項10記載の[E]のポリペプチドであり、もう1つのロリペプチドが請求項10記載の[F]のポリペプチドである事を特徴とし、且つ以下の工程により特定のアミノ酸残基を特定し、特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行うことにより、該酵素の活性、基質特異性、Vmax、Km、熱安定性、基質に対する安定性、生成物に対する安定性の何れか1つ以上の性質を変化させる改変方法、(d’)改変前のニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列を、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列とアラインメントする、
(e’)アラインメント結果から、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列中の48・51番目に相当するアミノ酸残基を特定する、
(f’)特定されたアミノ酸残基の内の1箇所以上に置換、挿入又は削除を行う。 - [A]のポリペプチドが下記[G]のポリペプチドである事を特徴とする請求項8記載の改変方法、
[G]アミノ酸配列X1CXLC1SC2X2X3X4X5で表される領域を含むポリペプチド
(ここにおいて、Cはシステインを、Xはセリン又はスレオニンを、Lはロイシンを、C1はシステインスルフィン酸(CYSTEINE SULFINIC ACID・3-SULFINOALANINE)を、Sはセリンを、C2はシステインスルフェン酸(CYSTEINE SULFENIC ACID・S-HYDROXY-CYSTEINE)を、X1・X2・X3・X4・X5は任意のアミノ酸を示す。)。 - X1がバリン、X4がトリプトファン、X5がプロリンである事を特徴とする請求項12記載の改変方法。
- X2がチロシン、X3がプロリンである事を特徴とする請求項13記載の改変方法。
- X1CXLC1SC2X2X3X4X5で表される領域を介して金属原子と結合している事を特徴とする請求項12から14の何れか一項記載の改変方法。
- 金属原子がコバルト原子である事を特徴とする請求項15記載の改変方法。
- 請求項1から16の何れか一項記載の改変方法により得られる事を特徴とする改変酵素。
- 請求項17記載の改変酵素をコードする遺伝子。
- 請求項18記載の遺伝子を含む事を特徴とするプラスミド。
- 微生物を請求項18記載の遺伝子又は請求項19記載のプラスミドを用いる形質転換をすることにより得られる事を特徴とする形質転換体。
- 請求項20記載の形質転換体を培養して得られる培養液、細胞、又はそれらの処理物から改変酵素を回収する工程を含む事を特徴とする改変酵素の調製方法。
- 請求項20記載の形質転換体を培養して得られる培養液、細胞、又はそれらの処理物、又は請求項21記載の調製方法により得られる改変酵素をニトリル化合物と溶媒中で接触させる事により該ニトリル化合物を対応するアミド化合物へと転化させる工程を含む事を特徴とするアミド化合物製造方法。
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