JPWO2010055666A1 - ニトリルヒドラターゼ変異体 - Google Patents

Abstract

本発明のニトリルヒドラターゼ変異体は、１つのアミノ酸置換により、ニトリルヒトラターゼの２つ以上の性質を改善する少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含む。

Description

本発明は、ニトリルヒドラターゼ変異体、及びそれをコードする遺伝子、該遺伝子を含むＤＮＡ、該遺伝子を含有するプラスミド、該プラスミドによる形質転換体、該形質転換体を用いてニトリルヒドラターゼ変異体を生産する方法に関する。

近年、種々の化合物のニトリル基を水和によりアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素を産生する微生物株が多数開示されている。ニトリルヒドラターゼを用いてニトリル化合物よりアミド化合物を工業的に製造するためには、アミド化合物の製造コストに占める該酵素の製造コストを下げることが重要である。より具体的には、酵素調製物の単位重量あたりの活性値を高くする必要がある。

酵素調製物中の酵素量を増やすことにより活性値を高くする方法として、既に、該酵素をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的手法により該酵素を大量に発現させる試みがなされている。

例えば、シュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）由来のニトリルヒドラターゼを形質転換体内で大量に発現できるプラスミド及び同プラスミドにより形質転換された細胞株が作出されている。加えて、該細胞株による該ニトリルヒドラターゼの生産及び該細胞株若しくはそれより得られる該ニトリルヒドラターゼをニトリル化合物と接触させる事による対応するアミド化合物の製造が可能となっている（特許文献１参照）。

一方、酵素分子そのものの高活性化が実現できれば、酵素調製物の活性値をより高くすることができる。

これまでその活性を損なうことなく、ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基に変異を導入することにより、基質特異性、酵素安定性等が改良されたニトリルヒドラターゼ変異体を探索する試みがなされている（特許文献２〜４参照）。

なお、ロドコッカス・ロドクロウス由来のニトリルヒドラターゼ変異体として、特許文献５、６に記載のものがある。

特開平９−２７５９７８号公報 特開２００４−１９４５８８号公報 特開２００５−１６０４０３号公報 国際公開第２００４／０５６９９０号パンフレット 特開２００７−１４３４０９号公報 特開２００８−２５３１８２号公報

しかしながら、特許文献１記載の野生型ニトリルヒドラターゼと比較し、その反応初速度及び酵素安定性が同時に向上した具体的な変異体は知られていない。反応初速度及び酵素安定性を同時に向上させることでアミド化合物の製造コストを削減できることが期待される。

本発明の目的は、高い反応初速度及び酵素安定性を有するニトリルヒドラターゼを提供することである。

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］３以下１以上のアミノ酸置換により、ニトリルヒドラターゼの２以上の性質を改善する少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体。
［２］［１］に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、改善される前記性質が反応初速度及び熱安定性であることを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体。
［３］［１］又は［２］に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、
配列表の配列番号：１に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：２に示されるβサブユニットとからなり、下記（ａ）〜（ｌ）からなるアミノ酸置換位置より選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体。
（ａ）αサブユニットの９２番目
（ｂ）αサブユニットの９４番目
（ｃ）αサブユニットの１９７番目
（ｄ）βサブユニットの４番目
（ｅ）βサブユニットの２４番目
（ｆ）βサブユニットの７９番目
（ｇ）βサブユニットの９６番目
（ｈ）βサブユニットの１０７番目
（ｉ）βサブユニットの２２６番目
（ｊ）βサブユニットの１１０番目、及び、βサブユニットの２３１番目
（ｋ）βサブユニットの２０６番目、及び、βサブユニットの２３０番目
（ｌ）αサブユニットの１３番目、αサブユニットの２７番目、及び、βサブユニットの１１０番目
［４］［３］に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、さらに下記（ｍ）〜（ｕ）からなるアミノ酸置換位置より選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体。
（ｍ）（ｂ）又は（ｇ）のとき、αサブユニットの１３番目
（ｎ）（ｂ）又は（ｈ）のとき、αサブユニットの２７番目
（ｏ）（ｄ）及び（ｆ）
（ｐ）（ｆ）のとき、βサブユニットの２３０番目
（ｑ）（ａ）及び（ｉ）
（ｒ）（ｉ）のとき、αサブユニットの１３番目、及び、βサブユニットの２０６番目
（ｓ）（ａ）及び（ｄ）のとき、βサブユニットの２０６番目
（ｔ）（ｃ）及び（ｈ）のとき、βサブユニットの２３０番目
（ｕ）（ｆ）のとき、βサブユニットの２３０番目、及び、βサブユニットの２３１番目
［５］［３］に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、（ｅ）のとき、（ａ）、（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）、（ｈ）、βサブユニットの２３０番目、及びβサブユニットの２３１番目からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換をさらに含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体。
［６］［１］〜［５］いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、
αサブユニットの１３番目のアミノ酸が置換されているとき、ＩｌｅがＬｅｕに置換されており、
αサブユニットの２７番目のアミノ酸が置換されているとき、ＭｅｔがＩｌｅに置換されており、
αサブユニットの９２番目のアミノ酸が置換されているとき、ＡｓｐがＧｌｕに置換されており、
αサブユニットの９４番目のアミノ酸が置換されているとき、ＭｅｔがＩｌｅに置換されており、
αサブユニットの１９７番目のアミノ酸が置換されているとき、ＧｌｙがＣｙｓに置換されており、
βサブユニットの４番目のアミノ酸が置換されているとき、ＶａｌがＭｅｔに置換されており、
βサブユニットの２４番目のアミノ酸が置換されているとき、ＶａｌがＩｌｅに置換されており、
βサブユニットの７９番目のアミノ酸が置換されているとき、ＨｉｓがＡｓｎに置換されており、
βサブユニットの９６番目のアミノ酸が置換されているとき、ＧｌｎがＡｒｇに置換されており、
βサブユニットの１０７番目のアミノ酸が置換されているとき、ＰｒｏがＭｅｔに置換されており、
βサブユニットの１１０番目のアミノ酸が置換されているとき、ＧｌｕがＡｓｎに置換されており、
βサブユニットの２０６番目のアミノ酸が置換されているとき、ＰｒｏがＬｅｕに置換されており、
βサブユニットの２２６番目のアミノ酸が置換されているとき、ＶａｌがＩｌｅに置換されており、
βサブユニットの２３０番目のアミノ酸が置換されているとき、ＡｌａがＧｌｕに置換され
βサブユニットの２３１番目のアミノ酸が置換されているとき、ＡｌａがＶａｌに置換されていることを特徴とするニトリルターゼ変異体。
［７］［３］〜［６］いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、更に下記（ａａ）〜（ｂｒ）からなるアミノ酸置換より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体。
（ａａ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ
（ａｂ）αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、及び、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ
（ａｃ）βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ
（ａｄ）βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｅ）βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇ
（ａｆ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ
（ａｇ）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ
（ａｈ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、及び、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ
（ａｉ）βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＡｓｐ、βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｊ）βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＬｅｕ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｋ）βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＶａｌ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｌ）βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＩｌｅ、βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ
（ａｍ）βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＬｙｓ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
（ａｎ）βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＶａｌ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
（ａｏ）βサブユニットの１２７番目のＬｅｕをＳｅｒ、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇ
（ａｐ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＬｙｓ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
（ａｑ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＶａｌ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
（ａｒ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＡｌａ、αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、βサブユニットの１２７番目のＬｅｕをＳｅｒ、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇ
（ａｓ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＡｓｐ、βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｔ）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓ、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＬｅｕ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｕ）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓ、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＶａｌ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｖ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ、βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＩｌｅ、βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ
（ａｗ）αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
（ａｘ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＧｌｙ、及び、αサブユニットの１８８番目のＴｈｒをＧｌｙ
（ａｙ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＡｌａ、及び、αサブユニットの４８番目のＡｓｎをＧｌｎ
（ａｚ）αサブユニットの４８番目のＡｓｎをＧｌｕ、及び、βサブユニットの１４６番目のＡｒｇをＧｌｙ
（ｂａ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＣｙｓ
（ｂｂ）βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＧｌｙ
（ｂｃ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＳｅｒ、及び、βサブユニットの３３番目のＡｌａをＶａｌ
（ｂｄ）βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＡｌａ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＶａｌ
（ｂｅ）βサブユニットの４０番目のＴｈｒをＶａｌ、及び、βサブユニットの２１８番目のＣｙｓをＭｅｔ
（ｂｆ）βサブユニットの３３番目のＡｌａをＭｅｔ、及び、βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＴｈｒ
（ｂｇ）βサブユニットの４０番目のＴｈｒをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＬｅｕ
（ｂｈ）βサブユニットの４０番目のＴｈｒをＩｌｅ、及び、βサブユニットの６１番目のＡｌａをＶａｌ
（ｂｉ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＴｈｒ、及び、βサブユニットの２１８番目のＣｙｓをＳｅｒ
（ｂｊ）βサブユニットの１１２番目のＬｙｓをＶａｌ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＭｅｔ
（ｂｋ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＴｒｐ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＨｉｓ
（ｂｌ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＬｅｕ、及び、βサブユニットの１１２番目のＬｙｓをＩｌｅ
（ｂｍ）βサブユニットの１４６番目のＡｒｇをＧｌｙ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＳｅｒ
（ｂｎ）βサブユニットの１７１番目のＬｙｓをＡｌａ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＴｈｒ
（ｂｏ）βサブユニットの１５０番目のＡｌａをＳｅｒ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＣｙｓ
（ｂｐ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＧｌｙ、及び、βサブユニットの１５０番目のＡｌａをＡｓｎ
（ｂｑ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＳｅｒ、及び、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＭｅｔ
（ｂｒ）βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１６８番目のＴｈｒをＧｌｕ
［８］［１］〜［７］いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子。
［９］配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットをコードする遺伝子と、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットをコードする遺伝子とからなる、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子において、下記（ａ）〜（ｌ）からなる塩基置換位置より選ばれる、少なくとも１つの塩基置換を含むことを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号：３の塩基配列の２７４番目〜２７６番目
（ｂ）配列番号：３の塩基配列の２８０番目〜２８２番目
（ｃ）配列番号：３の塩基配列の５８９番目〜５９１番目
（ｄ）配列番号：４の塩基配列の１０番目〜１２番目
（ｅ）配列番号：４の塩基配列の６９番目〜７１番目
（ｆ）配列番号：４の塩基配列の２３５番目〜２３７番目
（ｇ）配列番号：４の塩基配列の２８６番目〜２８８番目
（ｈ）配列番号：４の塩基配列の３１９番目〜３２１番目
（ｉ）配列番号：４の塩基配列の６７６番目〜６７８番目
（ｊ）配列番号：４の塩基配列の３２８番目〜３３０番目、及び、配列番号：４の６９１番目〜６９３番目
（ｋ）配列番号：４の塩基配列の６１６番目〜６１８番目、及び、配列番号：４の塩基配列の６８８番目〜６９０番目
（ｌ）配列番号：３の塩基配列の３７番目〜３９番目、及び、配列番号：３の塩基配列の７９番目〜８１番目、及び、配列番号：４の塩基配列の３２８番目〜３３０番目
［１０］［９］に記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子において、さらに下記（ｍ）〜（ｕ）からなる塩基置換位置より選ばれる、少なくとも１つの塩基置換を含むことを特徴とする遺伝子。
（ｍ）（ｂ）又は（ｇ）のとき、配列番号：３の塩基配列の３７番目〜３９番目
（ｎ）（ｂ）又は（ｈ）のとき、配列番号：３の塩基配列の７９番目〜８１番目
（ｏ）（ｄ）及び（ｆ）
（ｐ）（ｆ）のとき、配列番号：４の塩基配列の６８８番目〜６９０番目
（ｑ）（ａ）及び（ｉ）
（ｒ）（ｉ）のとき、配列番号：３の塩基配列の３７〜３９番目及び、配列番号：４の塩基配列の６１６番目〜６１８番目
（ｓ）（ａ）及び（ｄ）のとき、配列番号：４の塩基配列の６１６番目〜６１８番目
（ｔ）（ｃ）及び（ｈ）のとき、配列番号：４の塩基配列の６８８番目〜６９０番目
（ｕ）（ｆ）のとき、配列番号：４の塩基配列の６８８番目〜６９０番目、及び、配列番号：４の塩基配列の６９１番目〜６９３番目
［１１］［９］に記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子において、（ｅ）のとき、（ａ）、（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）、（ｈ）、配列番号：４の塩基配列の６８８番目〜６９０番目、及び配列番号：４の塩基配列の６９１番目〜６９３番目からなる塩基置換位置から選択される少なくとも１つの塩基の他の塩基への置換をさらに含むことを特徴とする遺伝子。
［１２］［９］〜［１１］いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子において、
配列番号：３の塩基配列の３７番目〜３９番目が塩基置換されているとき、ＡＴＣがＣＴＣに置換されており、
配列番号：３の塩基配列の７９番目〜８１番目が塩基置換されているとき、ＡＴＧがＡＴＣに置換されており、
配列番号：３の塩基配列の２７４番目〜２７６番目が塩基置換されているとき、ＧＡＣがＧＡＧに置換されており、
配列番号：３の塩基配列の２８０番目〜２８２番目が塩基置換されているとき、ＡＴＧがＡＴＣに置換されており、
配列番号：３の塩基配列の５８９番目〜５９１番目が塩基置換されているとき、ＧＧＣをＴＧＣに置換されており、
配列番号：４の塩基配列の１０番目〜１２番目が塩基置換されているとき、ＧＴＧをＡＴＧに置換されており、
配列番号：４の塩基配列の６９番目〜７１番目が塩基置換されているとき、ＧＴＣがＡＴＣに置換されており、
配列番号：４の塩基配列の２３５番目〜２３７番目が塩基置換されているとき、ＣＡＣがＡＡＣに置換されており、
配列番号：４の塩基配列の２８６番目〜２８８番目が塩基置換されているとき、ＣＡＧがＣＧＴに置換されており、
配列番号：４の塩基配列の３１９番目〜３２１番目が塩基置換されているとき、ＣＣＣがＡＴＧに置換されており、
配列番号：４の塩基配列の３２８番目〜３３０番目が塩基置換されているとき、ＧＡＧがＡＡＣに置換されており、
配列番号：４の塩基配列の６１６番目〜６１８番目が塩基置換されているとき、ＣＣＧがＣＴＧに置換されており、
配列番号：４の塩基配列の６７６番目〜６７８番目が塩基置換されているとき、ＧＴＣがＡＴＣに置換されており、
配列番号：４の塩基配列の６８８番目〜６９０番目が塩基置換されているとき、ＧＣＧがＧＡＧに置換されており、
配列番号：４の塩基配列の６９１番目〜６９３番目が塩基置換されているとき、ＧＣＣがＧＴＣに置換されていることを特徴とする遺伝子。
［１３］［９］〜［１２］いずれかに記載の遺伝子が、下記（ａａ）〜（ｂｒ）からなる塩基置換位置より選ばれる、少なくとも１つの塩基置換を含み、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子。
（ａａ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＡＴＧ、及び、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ
（ａｂ）配列番号：３の塩基配列の４４２番目〜４４４番目のＧＧＣをＧＡＣ、及び、配列番号：３の塩基配列の６１０番目〜６１２番目のＧＴＣをＣＧＣ
（ａｃ）配列番号：４の塩基配列の１５１番目〜１５３番目のＴＴＣをＧＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ
（ａｄ）配列番号：４の塩基配列の３５２番目〜３５４番目のＴＴＣをＧＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
（ａｅ）配列番号：４の塩基配列の４７８番目〜４８０番目のＣＧＧをＴＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の５５６番目〜５５８番目のＣＴＧをＣＧＧ
（ａｆ）配列番号：３の塩基配列の１６番目〜１８番目のＣＴＧをＡＣＧ、配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＡＴＧ、及び、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ
（ａｇ）配列番号：３の塩基配列の５５番目〜５７番目のＧＣＧをＧＴＧ、配列番号：３の塩基配列の２１１番目〜２１３番目のＣＧＴをＣＡＴ、及び、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ
（ａｈ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＡＴＧ、配列番号：３の塩基配列の４４２番目〜４４４番目のＧＧＣをＧＡＣ、及び、配列番号：３の塩基配列の６１０番目〜６１２番目のＧＴＣをＣＧＣ
（ａｉ）配列番号：４の塩基配列の２８番目〜３０番目のＡＣＣをＧＡＣ、配列番号：４の塩基配列の３５２番目〜３５４番目のＴＴＣをＧＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
（ａｊ）配列番号：４の塩基配列の１０９番目〜１１１番目のＴＴＣをＣＴＣ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
（ａｋ）配列番号：４の塩基配列の１０９番目〜１１１番目のＴＴＣをＧＴＣ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
（ａｌ）配列番号：４の塩基配列の１２１番目〜１２３番目のＴＴＣをＡＴＣ、配列番号：４の塩基配列の１５１番目〜１５３番目のＴＴＣをＧＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ
（ａｍ）配列番号：４の塩基配列の１３６番目〜１３８番目のＡＴＧをＡＡＧ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＣＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６３４番目〜６３６番目のＴＣＣをＴＡＣ
（ａｎ）配列番号：４の塩基配列の１４２番目〜１４４番目のＣＴＧをＧＴＧ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＣＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６３４番目〜６３６番目のＴＣＣをＴＡＣ
（ａｏ）配列番号：４の塩基配列の３７９番目〜３８１番目のＣＴＧをＴＣＧ、配列番号：４の塩基配列の４７８番目〜４８０番目のＣＧＧをＴＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の５５６番目〜５５８番目のＣＴＧをＣＧＧ
（ａｐ）配列番号：３の塩基配列の１６番目〜１８番目のＣＴＧをＡＣＧ、配列番号：３の塩基配列の５５番目〜５７番目のＧＣＧをＧＴＧ、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ、配列番号：４の塩基配列の１３６番目〜１３８番目のＡＴＧをＡＡＧ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＣＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６３４番目〜６３６番目のＴＣＣをＴＡＣ
（ａｑ）配列番号：３の塩基配列の１６番目〜１８番目のＣＴＧをＡＣＧ、配列番号：３の塩基配列の５５番目〜５７番目のＧＣＧをＧＴＧ、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ、配列番号：４の塩基配列の１４２番目〜１４４番目のＣＴＧをＧＴＧ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＣＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６３４番目〜６３６番目のＴＣＣをＴＡＣ
（ａｒ）配列番号：３の塩基配列の１６番目〜１８番目のＣＴＧをＧＣＧ、配列番号：３の塩基配列の５５番目〜５７番目のＧＣＧをＧＴＧ、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ、配列番号：４の塩基配列の３７９番目〜３８１番目のＣＴＧをＴＣＧ、配列番号：４の塩基配列の４７８番目〜４８０番目のＣＧＧをＴＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の５５６番目〜５５８番目のＣＴＧをＣＧＧ
（ａｓ）配列番号：３の塩基配列の１６番目〜１８番目のＣＴＧをＡＣＧ、配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＡＴＧ、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ、配列番号：４の塩基配列の２８番目〜３０番目のＡＣＣをＧＡＣ、配列番号：４の塩基配列の３５２番目〜３５４番目のＴＴＣをＧＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
（ａｔ）配列番号：３の塩基配列の５５番目〜５７番目のＧＣＧをＧＴＧ、配列番号：３の塩基配列の２１１番目〜２１３番目のＣＧＴをＣＡＴ、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ、配列番号：４の塩基配列の１０９番目〜１１１番目のＴＴＣをＣＴＣ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
（ａｕ）配列番号：３の塩基配列の５５番目〜５７番目のＧＣＧをＧＴＧ、配列番号：３の塩基配列の２１１番目〜２１３番目のＣＧＴをＣＡＴ、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ、配列番号：４の塩基配列の１０９番目〜１１１番目のＴＴＣをＧＴＣ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
（ａｖ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＡＴＧ、配列番号：３の塩基配列の４４２番目〜４４４番目のＧＧＣをＧＡＣ、配列番号：３の塩基配列の６１０番目〜６１２番目のＧＴＣをＣＧＣ、配列番号：４の塩基配列の１２１番目〜１２３番目のＴＴＣをＡＴＣ、配列番号：４の塩基配列の１５１番目〜１５３番目のＴＴＣをＧＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ
（ａｗ）配列番号：３の塩基配列の４４２番目〜４４４番目のＧＧＣをＧＡＣ、配列番号：３の塩基配列の６１０番目〜６１２番目のＧＴＣをＣＧＣ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
（ａｘ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＧＧＧ、及び、配列番号：３の塩基配列の５６２番目〜５６４番目のＡＣＣをＧＧＣ
（ａｙ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＧＣＧ、及び、配列番号：３の塩基配列の１４２番目〜１４４番目のＡＡＣをＣＡＡ
（ａｚ）配列番号：３の塩基配列の１４２番目〜１４４番目のＡＡＣをＧＡＡ、及び、配列番号：４の塩基配列の４３６番目〜４３８番目のＣＧＧをＧＧＧ
（ｂａ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＴＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の５２６番目〜５２８番目のＴＡＣをＴＧＣ
（ｂｂ）配列番号：４の塩基配列の５２６番目〜５２８番目のＴＡＣをＡＴＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＧＧＣ
（ｂｃ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＴＣＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の９７番目〜９９番目のＧＣＧをＧＴＧ
（ｂｄ）配列番号：４の塩基配列の５２６番目〜５２８番目のＴＡＣをＧＣＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＧＴＣ
（ｂｅ）配列番号：４の塩基配列の１１８番目〜１２０番目のＡＣＧをＧＴＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６５２番目〜６５４番目のＴＧＣをＡＴＧ
（ｂｆ）配列番号：４の塩基配列の９７番目〜９９番目のＧＣＧをＡＴＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の５２６番目〜５２８番目のＴＡＣをＡＣＣ
（ｂｇ）配列番号：４の塩基配列の１１８番目〜１２０番目のＡＣＧをＣＴＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＣＴＣ
（ｂｈ）配列番号：４の塩基配列の１１８番目〜１２０番目のＡＣＧをＡＴＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の１８１番目〜１８３番目のＧＣＣをＧＴＣ
（ｂｉ）配列番号：４の塩基配列の１８１番目〜１８３番目のＧＣＣをＡＣＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６５２番目〜６５４番目のＴＧＣをＴＣＣ
（ｂｊ）配列番号：４の塩基配列の３３４番目〜３３６番目のＡＡＧをＧＴＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＡＴＧ
（ｂｋ）配列番号：４の塩基配列の１８１番目〜１８３番目のＧＣＣをＴＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＣＡＣ
（ｂｌ）配列番号：４の塩基配列の１８１番目〜１８３番目のＧＣＣをＣＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の３３４番目〜３３６番目のＡＡＧをＡＴＴ
（ｂｍ）配列番号：４の塩基配列の４３６番目〜４３８番目のＣＧＧをＧＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＡＧＣ
（ｂｎ）配列番号：４の塩基配列の５１１番目〜５１３番目のＡＡＧをＧＣＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＡＣＣ
（ｂｏ）配列番号：４の塩基配列の４４８番目〜４５０番目のＧＣＧをＴＣＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＴＧＴ
（ｂｐ）配列番号：４の塩基配列の１８１番目〜１８３番目のＧＣＣをＧＧＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の４４８番目〜４５０番目のＧＣＧをＡＡＴ
（ｂｑ）配列番号：４の塩基配列の１８１番目〜１８３番目のＧＣＣをＴＣＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の４７８番目〜４８０番目のＣＧＧをＡＴＧ
（ｂｒ）配列番号：４の塩基配列の４７８番目〜４８０番目のＣＧＧをＴＧＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の５０２番目〜５０４番目のＡＣＧをＧＡＧ
［１４］［９］〜［１３］いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子の５'末端上流に更に、遺伝子の発現に必要とされるプロモーター配列を含むＤＮＡと、該プロモーターの３'末端の下流に、配列番号：７に含まれるリボゾーム結合配列とを含む、連結されたＤＮＡ。
［１５］［１４］に記載のＤＮＡを含む、プラスミド。
［１６］［１５］に記載のプラスミドによって宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
［１７］ニトリルヒドラターゼ変異体の生産方法において、［１６］に記載の形質転換体を培地で培養して、該形質転換体にプラスミドの有するニトリルヒドラターゼ遺伝子に基づくニトリルヒドラターゼ変異体を生産させる工程を含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体の生産方法。

本発明によれば、配列表の配列番号：１に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：２に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼにおいて、上記（ａ）〜（ｌ）からなるアミノ酸置換位置より選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含んでいる。これにより、ニトリルヒドラターゼの反応初速度及び酵素安定性を同時に向上させて、酵素調製物の単位重量あたりの活性値を高くするとともに、工業利用での温度変動等による酵素失活のリスクを低減することができる。したがって、より少ない酵素量でアミド化合物を安定に生産することができアミド化合物の製造コストを低減させることが可能になる。

本発明によれば、野生型ニトリルヒドラターゼよりも反応初速度及び酵素安定性が向上した新規なニトリルヒドラターゼ変異体を提供することができ、アミド化合物の製造コストに占める該酵素の製造コストを下げることができる。

上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態によってさらに明らかになる。以下、本発明について更に詳細に説明する。

本発明のニトリルヒドラターゼ変異体は、３以下１以上のアミノ酸置換により、ニトリルヒドラターゼの２以上の性質を改善する少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含んでいる。

本発明のニトリルヒドラターゼ変異体で改善される性質とは、ニトリル基を水和しアミド基に変換する反応そのものに関わる物性と、酵素安定性とがある。反応そのものに関わる物性とは、酵素の活性、基質特異性、Ｖｍａｘ、Ｋｍ、及び、反応初速度がある。酵素安定性には、熱安定性、基質に対する安定性、生成物に対する安定性が含まれる。

本発明のニトリルヒドラターゼ変異体は、好ましくは、好熱性菌由来のニトリルヒドラターゼの性質を改善する少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むものである。好熱性菌の例としては、シュードノカルディア（Ｐｓｕｅｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属に属するものが好適に使用でき、具体的にはシュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｕｅｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）が挙げられる。

より具体的には、本発明のニトリルヒドラターゼ変異体は、配列表の配列番号：１に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：２に示されるβサブユニットからなるニトリルヒドラターゼにおいて、表Ｉで示すように、（ａ）〜（ｌ）から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換位置が他のアミノ酸に置換されている。こうすることで、本発明のニトリルヒドラターゼ変異体は、特許文献１記載の野生型ニトリルヒドラターゼよりも高い反応初速度及び酵素安定性を備えることができる。

表Ｉで示す（ａ）〜（ｌ）のアミノ酸置換は、複数組合せてもよいし、（ａ）〜（ｌ）以外の異なる位置におけるアミノ酸置換と組み合わせることもできる。たとえば、（ｅ）のとき、（ａ）、（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）、（ｈ）、βサブユニットの２３０番目、及びβサブユニットの２３１番目からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸へ置換されていてもよい。（ａ）〜（ｌ）に組合せることができるアミノ酸置換の例として、たとえば、表ＩＩのものがある。

本発明のニトリルヒドラターゼ変異体は、上記（ａ）〜（ｘ）のいずれかのニトリルヒドラターゼ変異体にさらに表IIIで示すように配列番号１および配列番号２のニトリルヒドラターゼのアミノ酸位置（ａａ）〜（ｂｒ）に変異が含まれていてもよい。

本発明において、「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、種々の化合物のニトリル基を水和によりアミド基に変換するニトリル水和活性を指し、より好ましくは、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性をいう。

本発明において、「ニトリルヒドラターゼ活性を向上させた」とは、反応初速度を向上させることをいう。本発明における「反応初速度」は、次のようにして確認することができる。まず、基質として２．５％（ｖ／ｖ）のアクリロニトリルを含む、５０ｍＭトリス塩酸水溶液（ｐＨ８．０）にニトリルヒドラターゼ標品を加える。ニトリルヒドラターゼ標品に代えて、微生物の菌体及び培養液や、ニトリルヒドラターゼ粗精製物を用いることもできる。ニトリルヒドラターゼの添加後、２０℃で１５分間反応させる。反応液に１Ｍリン酸を加えて反応を停止し、生成したアクリルアミドを定量する。アクリルアミド量はＨＰＬＣによって分析することができる。

本発明における「反応初速度の向上」とは、反応初速度が野生型のニトリルヒドラターゼ、並びに従来公知のニトリルヒドラターゼ変異体と比較し有意に向上したことをいい、具体的には１．２倍以上に向上したことをいう。

本発明において、「酵素安定性を向上させた」とは、ニトリルヒドラターゼの熱安定性を向上させることをいう。熱安定性の向上したニトリルヒドラターゼは、蛋白質の構造安定性が強化されているものと見なされることから、加熱以外のストレス、即ち有機溶媒や、高濃度の基質、生成物に対する安定性も増していることが期待される。

本発明における「酵素の熱安定性」は、次のようにして確認することができる。まずニトリルヒドラターゼ標品を６０℃にて２時間加熱処理した後に２０℃に戻し、基質として２．５％（ｖ／ｖ）のアクリロニトリルを含む、５０ｍＭトリス塩酸水溶液（ｐＨ８．０）を加える。ニトリルヒドラターゼ標品に代えて、微生物の菌体及び培養液や、ニトリルヒドラターゼ粗精製物を用いることもできる。加熱処理した該ニトリルヒドラターゼと基質とを混和後、２０℃で１５分間反応させ、反応初速度を測定する。

本発明における「酵素の熱安定性の向上」とは、加熱処理後の反応初速度が、同様に加熱処理を加えた野生型のニトリルヒドラターゼ、並びに従来公知のニトリルヒドラターゼ変異体と比較し有意に向上したこと、具体的には１．２倍以上に向上したことをいう。

本発明における野生型のニトリルヒドラターゼとしては、特許文献１記載のシュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）由来のニトリルヒドラターゼが好ましく、該野生型ニトリルヒドラターゼを形質転換体内で大量に発現できるプラスミド及び同プラスミドにより形質転換された細胞株として、ＭＴ−１０８２２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として茨城県つくば市東１-１-１ 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成８年２月７日より寄託されている）を上げることができる。本発明における従来公知のニトリルヒドラターゼ変異体とは、特許文献1〜４記載のニトリルヒドラターゼ変異体を上げることができる。

本発明のニトリルヒドラターゼ変異体は、ニトリルヒドラターゼ活性を向上させるほか、次の特性を有する。該酵素は、αサブユニットとβサブユニットが会合した２量体がその基本構造単位となっており、その２量体が更に会合して４量体を形成する。αサブユニットの１１１番目のシステイン残基がシステインスルフィン酸（Ｃｙｓ-ＳＯＯＨ）に、１１３番目のシステイン残基がシステインスルフェン酸（Ｃｙｓ-ＳＯＨ）にそれぞれ翻訳後修飾を受け、この修飾アミノ酸残基を介してαサブユニットのポリペプチド鎖とコバルト原子が結合し、活性中心を形成する。反応は、好ましくは０〜６０℃の範囲で行うことができ、反応時のｐＨは通常、４〜１０、好ましくは６〜９の範囲で選ばれる。

本発明のニトリルヒドラターゼ変異体は、以下のように製造することができる。

まず、ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするＤＮＡを含むプラスミドを用意し、このプラスミドを用いて任意の宿主細胞を形質転換して形質転換体または細胞株を得る。ついで、上記の形質転換体や細胞株を培養してニトリルヒドラターゼ変異体を産生する。

野生型のニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子は、配列表の配列番号：３に示される塩基配列と、配列表の配列番号：４に示される塩基配列とからなる。配列表の配列番号：３に示される塩基配列は、配列表の配列番号：１からなるアミノ酸配列に対応し、配列表の配列番号：４に示される塩基配列は、配列表の配列番号：２からなるアミノ酸配列に対応する。配列番号３および／または配列番号４の塩基配列を塩基置換することでニトリルヒドラターゼ変異体をコードするＤＮＡを得ることができる。具体的には、表Ｉで示す（ａ）〜（l）のアミノ酸置換は、表ＩＶ−１で示すように、塩基置換させることで実現することができる。

また、表ＩＩで示すアミノ酸置換は、表ＩＶ−２で示すように、塩基置換させることで実現することができる。

また、表ＩＩＩで示すアミノ酸置換は、表Ｖで示すように、塩基置換させることで実現することができる。

プラスミドとして、上記のようなニトリルヒドラターゼ変異体のαサブユニットをコードする遺伝子、βサブユニットをコードする遺伝子またはニトリルヒドラターゼ変異体遺伝子に加え、各遺伝子の発現に必要な制御領域及び自律複製に必要な領域などの、任意の宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体や細胞株によるニトリルヒドラターゼの産生を可能せしめる構成を有することができる。ここでいう任意の宿主細胞の一例として大腸菌が挙げられる。

発現に必要な制御領域としては、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む。）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、転写終結配列等を挙げることができる。具体的なプロモーター配列の例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーター等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターやｔｒｃプロモーターのように人為的に設計・改変された配列も利用できる。

リボゾーム結合配列としては、配列番号：７に含まれる、ＴＡＡＧＧＡＧＧＴを有する配列が望ましく、これら制御領域のプラスミド上での配列順序は、プロモーター配列とリボゾーム結合配列はニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子より５'末端側上流に位置する事が望ましく、転写終結配列はニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子より３'末端側下流に位置する事が望ましい。また、その様な制御領域によりニトリルヒドラターゼ変異体のαサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子が各々独立のシストロンとして発現されてもよいし、共通の制御領域によりポリシストロンとして発現されてもよい。

以上の要件を満たしているプラスミドベクターの例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１を挙げる事ができる。

このようなプラスミドベクターに本発明のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子を該ニトリルヒドラターゼ変異体の活性発現に必要な領域と共に挿入して本発明のプラスミドを構築する方法、該プラスミドを所望の宿主細胞に形質転換する方法及び該形質転換体内でニトリルヒドラターゼを産生させる方法には、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）等に記載されている分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法と宿主細胞が利用できる。

上記のプラスミドを所望の宿主細胞に形質転換して得られた形質転換体は、培地で培養することにより、該プラスミドの有するニトリルヒドラターゼ遺伝子に基づくニトリルヒドラターゼ変異体を生産することができる。宿主細胞が大腸菌の場合、該形質転換体を培養する培地としてＬＢ培地やＭ９培地などが一般的に用いられるが、より好ましくはそのような培地成分にＦｅイオン及びＣｏイオンを０．１μｇ／ｍＬ以上存在させるとよく、該形質転換体を植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃）で生育させればよい。

本発明のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子を発現させて所望の酵素活性を有するニトリルヒドラターゼ変異体を生産する場合、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質をコードする遺伝子が必要となる。

このニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質とは、該タンパク質の発現の有無が、ニトリルヒドラターゼの活性化を直接左右する性質を有しているタンパク質の事であり、特開平１１−２５３１６８号公報に記載されるシュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼ活性化に関与するタンパク質（ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質）をその代表例として挙げる事が出来る。該ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質の配列を配列表：５、及び、６に示す。

本発明のニトリルヒドラターゼ変異体を用いて以下のようにアミド化合物を製造することができる。まず、本発明のニトリルヒドラターゼ変異体を産生する形質転換体や細胞株を培養し、得られる培養液、細胞または細胞処理物を媒体中にてニトリル化合物と接触させる。こうすることで、対応するアミド化合物を製造する。

ここでいう細胞処理物とは、該形質転換体からの抽出物や磨砕物、これらの抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離して得られる粗酵素調製物や更に精製して得られる酵素精製物などの後分離物、該形質転換体や該形質転換体の抽出物、磨砕物または後分離物を適当な手段を用いて固定化した固定化物の事を示している。接触させる温度は特に限定されないが、好ましくはニトリルヒドラターゼ変異体が失活しない温度範囲内であり、より好ましくは０℃〜６０℃である。ニトリル化合物としては、本発明のニトリルヒドラターゼ変異体が基質として作用できる化合物であれば特に限定されないが、好ましくはアセトニトリル、プロピオニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、クロトノニトリル、α−ヒドロキシイソブチロニトリル等といった炭素数２〜４のニトリル化合物がその代表例として挙げられる。該ニトリル化合物の水性媒体中での濃度は、特に限定されるものではなく、また、反応温度も特に限定されないが、好ましくは該ニトリルヒドラターゼが失活しない温度範囲内であり、より好ましくは０℃〜６０℃である。なお、より少ない酵素量でアミド化合物を生産するためには、アミド化合物の製造条件下において一定の安定性を有するニトリルヒドラターゼ変異体を用いると好ましい。

つづいて、本発明の作用効果について詳細に説明する。本発明者らは、鋭意精鋭を重ねた結果、３以下１以上のアミノ酸置換により、２以上の性質を改善する少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことで、従来のニトリルヒドラターゼよりも反応そのものに関わる物性と、酵素安定性とをいずれも向上させたニトリルヒドラターゼ変異体を見出した。そして、特に、配列表の配列番号：１に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：２に示されるβサブユニットとからなるニトリルヒドラターゼについて、上記（ａ）〜（ｌ）からなるアミノ酸置換位置より選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させることにより、ニトリルヒドラターゼの反応初速度のみならず、酵素安定性を同時に向上させることができることを見出した。こうすることで、酵素反応の効率化と酵素のハンドリングとの両立を実現することができる。また、反応初速度及び酵素安定性を同時に向上させたニトリルヒドラターゼを用いることで、酵素調製物の単位重量あたりの活性値を高くするとともに、工業利用での温度変動等による酵素失活のリスクを低減することができる。したがって、より少ない酵素量でアミド化合物を安定に生産することができアミド化合物の製造コストを低減させることが可能になる。

以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。

以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定されるものではない。

［実施例１］リボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）の取得
鋳型として特許文献１の実施例３記載のプラスミドｐＰＴ−ＤＢ１、配列表の配列番号：７、及び、８に記載のプライマーを用いたＰＣＲ反応により、約０．７ｋｂｐの遺伝子断片を得た。上記ＰＣＲ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製した。同様に、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩによりｐＰＴ−ＤＢ１を切断、アガロースゲル電気泳動を行い、アガロースゲルから約３．９ｋｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出した。この様にして得られた約０．７ｋｂｐと約３．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させ、上記のリボゾーム結合配列が改変されたニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を作製した。

該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、ｐＰＴ−ＤＢ１に、表１で示される改変されたリボゾーム結合配列を有していることを確認した。

こうして得られた形質転換体（１）、及び、そのベースとなったｐＰＴ−ＤＢ１を含む形質転換体、ＭＴ−１０８２２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として茨城県つくば市東１-１-１ 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成８年２月７日より寄託されている）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度を以下の方法により比較した。

＜反応初速度の比較＞
試験管に４０μｇ／ｍＬの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍＬの塩化コバルト・二水和物を含む５ｍＬのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した後、各形質転換体を一白金耳植菌し、３７℃・２００ｒｐｍにて約２０時間其々培養した。該培養終了液から４０μＬを取り、７４０μＬの５４ｍＭトリス塩酸水溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、これに２０μＬのアクリロニトリルを添加して２０℃で緩やかに攪拌しながら１５分間反応させ、アクリルアミドを生成させた。反応終了後、ＨＰＬＣを用いて反応液中のアクリルアミド含有量の分析を行った。
＜酵素の熱安定性の比較＞
上述の形質転換体の培養終了液から遠心分離（５０００Ｇ、１５分間）により各形質転換体を分離した。
各形質転換体０．１ｇを２０ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸水溶液（ｐＨ８．０）に其々懸濁し、６０℃にて２時間加熱処理した。加熱処理後に２０℃に戻し、基質として０．５ｍｌのアクリロニトリルを添加して、２０℃で１５分間反応させ、反応初速度を測定した。
〈分析条件〉
分析機器： 日本分光ＨＰＬＣ
カラム ： ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ （１５０×６．００ ｍｍ）
分析温度： ４０℃
移動相 ： ３％ アセトニトリル、１０ｍＭ リン酸
反応及び分析は各形質転換体に対し３回以上行い、分注操作等でのデータのばらつきを補正した。

形質転換体（１）とＭＴ−１０８２２の反応初速度及び熱安定性、即ち、上記反応条件で生成したアクリルアミド量の比較の結果、表１で示される改変されたリボゾーム結合配列が新たに追加されたことにより、１．１５倍の反応初速度の向上が見られ、熱安定性は維持された。

［参考例１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２）
表２で示すようにニトリルヒドラターゼを（ａｖ）のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２）を取得するために、特許文献２の実施例７９に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２）を得た。

［参考例２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３）
表２で示すようにニトリルヒドラターゼを（ｂｃ）のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３）を取得するために、宝酒造社製の「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（以後、変異導入キットと呼ぶ）を用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。

ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成は変異導入キットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。

ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：１１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成は変異導入キットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。

ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマー及びｄＮＴＰを除去した後、ＴＥを加えて各々５０μＬの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μＬずつ含む全量４７．５μＬのアニーリング溶液（組成は変異導入キットに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持することによってアニーリング処理を行った。
アニーリング処理液にＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を０．５μＬ加えて７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。

これにＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：１０に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて全量を５０μＬとした後、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反応Ｎｏ．３を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．３の反応終了液５μＬを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約２ｋｂの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。

続いて、アガロースゲルから約２ｋｂのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。精製した約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。

同様に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７ｋｂのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。

この様にして得られた約２ｋｂｐと約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換した。該形質転換体から抽出したプラスミドを鋳型とし、上記の操作を、配列番号：９記載のプライマーに換えて、配列番号：１３記載のプライマーを用いて実施し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３）を得た。

［参考例３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４）
表２で示すようにニトリルヒドラターゼを（ｂｈ）のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号１４、及び、１５に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４）を得た。

［実施例２］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（５）
表３で示すようにニトリルヒドラターゼを（ａ）及び（ａｖ）のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５）を取得するために、前記の参考例１記載の形質転換体（２）より回収したプラスミド（２）を鋳型とし、配列表の配列番号：１６に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１記載のプラスミド（２）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。

こうして得られた形質転換体（５）、及び、そのベースとなった形質転換体（２）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（５）では、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（２）に対し、１．６５倍の反応初速度の向上、及び、１．２５倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例３］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（６）
表３で示すようにニトリルヒドラターゼを（ａ）及び（ｂｃ）のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６）を取得するために、前記の参考例２記載の形質転換体（３）より回収したプラスミド（３）を鋳型とし、配列表の配列番号：１６に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２記載のプラスミド（３）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（６）、及び、そのベースとなった形質転換体（３）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（６）では、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（３）に対し、１．６３倍の反応初速度の向上、及び、１．２３倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例４］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（７）
表３で示すようにニトリルヒドラターゼを（ａ）及び（ｂｈ）のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７）を取得するために、前記の参考例３記載の形質転換体（４）より回収したプラスミド（４）を鋳型とし、配列表の配列番号：１６に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３記載のプラスミド（４）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（７）、及び、そのベースとなった形質転換体（４）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（７）では、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（４）に対し、１．５８倍の反応初速度の向上、及び、１．３０倍の熱安定性の向上の向上が見られた。

［参考例４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８）
表４で示すようにニトリルヒドラターゼを（ａｋ）のアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８）を取得するために、特許文献２の実施例６８に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８）を得た。

［参考例５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９）
表４で示すように（ａｐ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９）を取得するために、特許文献２の実施例７３に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９）を得た。

［参考例６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０）
表４で示すように（ｂｐ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１７、及び、１８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０）を得た。

［実施例５］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１１）
表５で示すように（ｂ）及び（ａｋ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１）を取得するために、前記の参考例４記載の形質転換体（８）より回収したプラスミド（８）を鋳型とし、配列表の配列番号：１９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例４記載のプラスミド（８）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１１）、及び、そのベースとなった形質転換体（８）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１１）では、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（８）に対し、１．４５倍の反応初速度の向上、及び、１．３８倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例６］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１２）
表５で示すように（ｂ）及び（ａｐ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１２）を取得するために、前記の参考例５記載の形質転換体（９）より回収したプラスミド（９）を鋳型とし、配列表の配列番号：１９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例５記載のプラスミド（９）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１２）、及び、そのベースとなった形質転換体（９）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１２）では、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（９）に対し、１．４０倍の反応初速度の向上、及び、１．２５倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例７］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１３）
表５で示すように（ｂ）及び（ｂｐ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１３）を取得するために、前記の参考例６記載の形質転換体（１０）より回収したプラスミド（１０）を鋳型とし、配列表の配列番号：１９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例６記載のプラスミド（１０）に、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１３）、及び、そのベースとなった形質転換体（１０）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１３）では、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１０）に対し、１．３２倍の反応初速度の向上、及び、１．３５倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１４）
表６で示すように（ａｎ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１４）を取得するために、特許文献２の実施例７１に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１４）を得た。

［参考例８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１５）
表６で示すように（ｂｅ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１５）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：２０、及び、２１に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１５）を得た。

［参考例９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１６）
表６で示すように（ｂｒ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１６）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：２２、及び、２３に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１６）を得た。

［実施例８］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１７）
表７で示すように（ｃ）及び（ａｎ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１７）を取得するために、前記の参考例７記載の形質転換体（１４）より回収したプラスミド（１４）を鋳型とし、配列表の配列番号：２４に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例７記載のプラスミド（１４）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１７）、及び、そのベースとなった形質転換体（１４）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１７）では、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１４）に対し、１．８０倍の反応初速度の向上、及び、１．２５倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例９］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１８）
表７で示すように（ｃ）及び（ｂｅ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１８）を取得するために、前記の参考例８記載の形質転換体（１５）より回収したプラスミド（１５）を鋳型とし、配列表の配列番号：２４に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例８記載のプラスミド（１５）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１８）、及び、そのベースとなった形質転換体（１５）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１８）では、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１５）に対し、１．８６倍の反応初速度の向上、及び、１．４０倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例１０］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１９）
表７で示すように（ｃ）及び（ｂｒ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１９）を取得するために、前記の参考例９記載の形質転換体（１６）より回収したプラスミド（１６）を鋳型とし、配列表の配列番号：２４に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例９記載のプラスミド（１６）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１９）、及び、そのベースとなった形質転換体（１６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１９）では、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１６）に対し、１．６８倍の反応初速度の向上、及び、１．２０倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例１０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２０）
表８で示すように（ａｒ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２０）を取得するために、特許文献２の実施例７５に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２０）を得た。

［参考例１１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２１）
表８で示すように（ａｘ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２１）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：２５、及び、２６に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２１）を得た。

［参考例１２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２２）
表８で示すように（ｂｄ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２２）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：２７、及び、２８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２２）を得た。

［実施例１１］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（２３）
表９で示すように（ｄ）及び（ａｒ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２３）を取得するために、前記の参考例１０記載の形質転換体（２０）より回収したプラスミド（２０）を鋳型とし、配列表の配列番号：２９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１０記載のプラスミド（２０）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（２３）、及び、そのベースとなった形質転換体（２０）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（２３）では、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（２０）に対し、１．２５倍の反応初速度の向上、及び、１．３５倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例１２］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（２４）
表９で示すように（ｄ）及び（ａｘ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２４）を取得するために、前記の参考例１１記載の形質転換体（２１）より回収したプラスミド（２１）を鋳型とし、配列表の配列番号：２９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１１記載のプラスミド（２１）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（２４）、及び、そのベースとなった形質転換体（２１）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（２４）では、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（２１）に対し、１．３２倍の反応初速度の向上、及び、１．３９倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例１３］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（２５）
表９で示すように（ｄ）及び（ｂｄ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２５）を取得するために、前記の参考例１２記載の形質転換体（２２）より回収したプラスミド（２２）を鋳型とし、配列表の配列番号：２９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１２記載のプラスミド（２２）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（２５）、及び、そのベースとなった形質転換体（２２）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

形質転換体（２５）と形質転換体（２２）の反応初速度と熱安定性の比較の結果、形質転換体（２５）では、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（２２）に対し、１．２５倍の反応初速度の向上、及び、１．２５倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例１３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２６）
表１０で示すように（ａｏ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異したニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２６）を取得するために、特許文献２の実施例７２に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２６）を得た。

［参考例１４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２７）
表１０で示すように（ａｔ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２７）を取得するために、特許文献２の実施例７７に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２７）を得た。

［比較例１］ニトリルヒドラターゼ活性が向上したアミノ酸置換体の取得（２８）
表１１で示すようにβサブユニットの８番目及び（ａｏ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２８）を取得するために、前記の参考例１３記載の形質転換体（２６）より回収したプラスミド（２６）を鋳型とし、配列表の配列番号：３０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１３記載のプラスミド（２６）に、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（２８）、及び、そのベースとなった形質転換体（２６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その比較の結果、形質転換体（２８）では、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（２６）に対し、１．３５倍の反応初速度の向上、及び、０．６５倍の熱安定性の低下が見られた。

［比較例２］ニトリルヒドラターゼ活性が向上したアミノ酸置換体の取得（２９）
表１１で示すようにβサブユニットの８番目及び（ａｔ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（２９）を取得するために、前記の参考例１４記載の形質転換体（２７）より回収したプラスミド（２７）を鋳型とし、配列表の配列番号：３０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（２９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（２９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１４記載のプラスミド（２７）に、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（２９）、及び、そのベースとなった形質転換体（２７）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（２９）では、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（２７）に対し、１．４０倍の反応初速度の向上、及び、０．３１倍の熱安定性の低下が見られた。

［比較例３］ニトリルヒドラターゼ活性が向上したアミノ酸置換体の取得（３０）
表１１で示すようにβサブユニットの８番目及び（ｂｒ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３０）を取得するために、前記の参考例９記載の形質転換体（１６）より回収したプラスミド（１６）を鋳型とし、配列表の配列番号：３０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例９記載のプラスミド（１６）に、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（３０）、及び、そのベースとなった形質転換体（１６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（３０）では、βサブユニットの８番目のＧｌｙをＡｌａとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１６）に対し、１．３２倍の反応初速度の向上、及び、０．５２倍の熱安定性の低下が見られた。

［参考例１５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３１）
表１２で示すように（ａｕ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３１）を取得するために、特許文献２の実施例７８に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３１）を得た。

［参考例１６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３２）
表１２で示すように（ｂｆ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３２）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：３１、及び、３２に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３２）を得た。

［実施例１４］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（３３）
表１３で示すように（ｆ）及び（ａｕ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３３）を取得するために、前記の参考例１５記載の形質転換体（３１）より回収したプラスミド（３１）を鋳型とし、配列表の配列番号：３３に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１５記載のプラスミド（３１）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（３３）、及び、そのベースとなった形質転換体（３１）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（３３）では、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（３１）に対し、１．２９倍の反応初速度の向上、及び、１．８２倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例１５］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（３４）
表１３で示すように（ｆ）及び（ｂｆ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３４）を取得するために、前記の参考例１６記載の形質転換体（３２）より回収したプラスミド（３２）を鋳型とし、配列表の配列番号：３３に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１６記載のプラスミド（３２）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（３４）、及び、そのベースとなった形質転換体（３２）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（３４）では、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（３２）に対し、１．２５倍の反応初速度の向上、及び、１．７６倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例１６］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（３５）
表１３で示すように（ｆ）及び（ｂｐ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３５）を取得するために、前記の参考例６記載の形質転換体（１０）より回収したプラスミド（１０）を鋳型とし、配列表の配列番号：３３に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例６記載のプラスミド（１０）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（３５）、及び、そのベースとなった形質転換体（１０）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（３５）では、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１０）に対し、１．３０倍の反応初速度の向上、及び、１．７２倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例１７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３６）
表１４で示すように（ａａ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３６）を取得するために、特許文献２の実施例５８に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３６）を得た。

［参考例１８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３７）
表１４で示すように（ａｈ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３７）を取得するために、特許文献２の実施例６５に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３７）を得た。

［参考例１９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３８）
表１４で示すように（ａｑ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３８）を取得するために、特許文献２の実施例７４に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３８）を得た。

［実施例１７］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（３９）
表１５で示すように（ｇ）及び（ａａ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（３９）を取得するために、前記の参考例１７記載の形質転換体（３６）より回収したプラスミド（３６）を鋳型とし、配列表の配列番号：３４に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（３９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（３９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１７記載のプラスミド（３６）に、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（３９）、及び、そのベースとなった形質転換体（３６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（３９）では、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（３６）に対し、１．３３倍の反応初速度の向上、及び、１．２５倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例１８］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（４０）
表１５で示すように（ｇ）及び（ａｈ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４０）を取得するために、前記の参考例１８記載の形質転換体（３７）より回収したプラスミド（３７）を鋳型とし、配列表の配列番号：３４に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１８記載のプラスミド（３７）に、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（４０）、及び、そのベースとなった形質転換体（３７）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（４０）では、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（３７）に対し、１．２５倍の反応初速度の向上、及び、１．３６倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例１９］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（４１）
表１５で示すように（ｇ）及び（ａｑ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４１）を取得するために、前記の参考例１９記載の形質転換体（３８）より回収したプラスミド（３８）を鋳型とし、配列表の配列番号：３４に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１９記載のプラスミド（３８）に、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（４１）、及び、そのベースとなった形質転換体（３８）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（４１）では、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（３８）に対し、１．３５倍の反応初速度の向上、及び、１．４２倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例２０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４２）
表１６で示すように（ａｅ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４２）を取得するために、特許文献２の実施例６２に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４２）を得た。

［参考例２１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４３）
表１６で示すように（ｂｋ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４３）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：３５、及び、３６に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４３）を得た。

［実施例２０］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（４４）
表１７で示すように（ｈ）及び（ａｅ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４４）を取得するために、前記の参考例２０記載の形質転換体（４２）より回収したプラスミド（４２）を鋳型とし、配列表の配列番号：３７に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２０記載のプラスミド（４２）に、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（４４）、及び、そのベースとなった形質転換体（４２）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（４４）では、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（４２）に対し、１．３４倍の反応初速度の向上、及び、２．２５倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例２１］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（４５）
表１７で示すように（ｈ）及び（ａｕ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４５）を取得するために、前記の参考例１５記載の形質転換体（３１）より回収したプラスミド（３１）を鋳型とし、配列表の配列番号:６８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１５記載のプラスミド（３１）に、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（４５）、及び、そのベースとなった形質転換体（３１）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（４５）では、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（３１）に対し、１．４０倍の反応初速度の向上、及び、２．１２倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例２２］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（４６）
表１７で示すように（ｈ）及び（ｂｋ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４６）を取得するために、前記の参考例２１記載の形質転換体（４３）より回収したプラスミド（４３）を鋳型とし、配列表の配列番号：３７に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４６）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２１記載のプラスミド（４３）に、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（４６）、及び、そのベースとなった形質転換体（４３）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（４６）では、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（４３）に対し、１．３２倍の反応初速度の向上、及び、２．４０倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例２３］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（４７）
表１８で示すように（ｉ）及び（ａａ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４７）を取得するために、前記の参考例１７記載の形質転換体（３６）より回収したプラスミド（３６）を鋳型とし、配列表の配列番号：３８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１７記載のプラスミド（３６）に、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（４７）、及び、そのベースとなった形質転換体（３６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（４７）では、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（３６）に対し、１．２６倍の反応初速度の向上、及び、１．２９倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例２４］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（４８）
表１８で示すように（ｉ）及び（ａｋ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４８）を取得するために、前記の参考例４記載の形質転換体（８）より回収したプラスミド（８）を鋳型とし、配列表の配列番号：３８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例４記載のプラスミド（８）に、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（４８）、及び、そのベースとなった形質転換体（８）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（４８）では、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（８）に対し、１．３５倍の反応初速度の向上、及び、１．２７倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例２５］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（４９）
表１８で示すように（ｉ）及び（ｂｅ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異するニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（４９）を取得するために、前記の参考例８記載の形質転換体（１５）より回収したプラスミド（１５）を鋳型とし、配列表の配列番号：３８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の変異導入キットを用いた方法により、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（４９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（４９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例８記載のプラスミド（１５）に、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（４９）、及び、そのベースとなった形質転換体（１５）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（４９）では、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１５）に対し、１．２５倍の反応初速度の向上、及び、１．３０倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例２２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５０）
表１９で示すように（ａｆ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５０）を取得するために、特許文献２の実施例６３に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５０）を得た。

［参考例２３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５１）
表１９で示すように（ｂｑ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミドを取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：３９、及び、４０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５１）を得た。

［参考例２４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５２）
表１９で示すように（ｂｊ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５２）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：４１、及び、４２に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５２）を得た。

［実施例２６］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（５３）
表２０で示すように（ｍ−１）及び（ａｆ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５３）を取得するために、前記の参考例２２記載の形質転換体（５０）より回収したプラスミド（５０）を鋳型とし、配列表の配列番号：４３、及び、１９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２２記載のプラスミド（５０）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（５３）、及び、そのベースとなった形質転換体（５０）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（５３）では、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（５０）に対し、１．６７倍の反応初速度の向上と、１．４５倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例２７］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（５４）
表２０で示すように（ｍ−１）及び（ｂｑ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５４）を取得するために、前記の参考例２３記載の形質転換体（５１）より回収したプラスミド（５１）を鋳型とし、配列表の配列番号：４３、及び、１９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２３記載のプラスミド（５１）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（５４）、及び、そのベースとなった形質転換体（５１）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（５４）では、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（５１）に対し、１．５９倍の反応初速度の向上、及び、１．３２倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例２８］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（５５）
表２０で示すように（ｍ−１）及び（ｂｊ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５５）を取得するために、前記の参考例２４記載の形質転換体（５２）より回収したプラスミド（５２）を鋳型とし、配列表の配列番号：４３、及び、１９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２４記載のプラスミド（５２）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（５５）、及び、そのベースとなった形質転換体（５２）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（５５）では、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（５２）に対し、１．６２倍の反応初速度の向上、及び、１．２６倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例２５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５６）
表２１で示すように（ａｍ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５６）を取得するために、特許文献２の実施例７０に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５６）を得た。

［参考例２６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５７）
表２１で示すように（ａｙ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５７）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：４４、及び、４５に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５７）を得た。

［実施例２９］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（５８）
表２２で示すように（ｍ−２）及び（ａｍ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５８）を取得するために、前記の参考例２５記載の形質転換体（５６）より回収したプラスミド（５６）を鋳型とし、配列表の配列番号：４３、及び、３４に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２５記載のプラスミド（５６）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（５８）、及び、そのベースとなった形質転換体（５６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（５８）では、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（５６）に対し、１．５３倍の反応初速度の向上、及び、１．３２倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例３０］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（５９）
表２２で示すように（ｍ−２）及び（ａｔ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（５９）を取得するために、前記の参考例１４記載の形質転換体（２７）より回収したプラスミド（２７）を鋳型とし、配列表の配列番号：４３、及び、３４に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（５９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（５９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１４記載のプラスミド（２７）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（５９）、及び、そのベースとなった形質転換体（２７）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（５９）では、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（２７）に対し、１．４９倍の反応初速度の向上、及び、１．２８倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例３１］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（６０）
表２２で示すように（ｍ−２）及び（ａｙ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６０）を取得するために、前記の参考例２６記載の形質転換体（５７）より回収したプラスミド（５７）を鋳型とし、配列表の配列番号：４３、及び、３４に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２６記載のプラスミド（５７）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（６０）、及び、そのベースとなった形質転換体（５７）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（６０）では、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの９６番目のＧｌｎをＡｒｇとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（５７）に対し、１．３９倍の反応初速度の向上、及び、１．４５倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例３２］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（６１）
表２３で示すように（ｎ−１）及び（ａｆ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６１）を取得するために、前記の参考例２２記載の形質転換体（５０）より回収したプラスミド（５０）を鋳型とし、配列表の配列番号：４６、及び、１９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２２記載のプラスミド（５０）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（６１）、及び、そのベースとなった形質転換体（５０）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（６１）では、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（５０）に対し、１．６５倍の反応初速度の向上、及び、１．３６倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例３３］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（６２）
表２３で示すように（ｎ−１）及び（ａｏ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異したニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６２）を取得するために、前記の参考例１３記載の形質転換体（２６）より回収したプラスミド（２６）を鋳型とし、配列表の配列番号：４６、及び、１９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１３記載のプラスミド（２６）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（６２）、及び、そのベースとなった形質転換体（２６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（６２）では、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（２６）に対し、１．７２倍の反応初速度の向上、及び、１．４７倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例３４］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（６３）
表２３で示すように（ｎ−１）及び（ａｘ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６３）を取得するために、前記の参考例１１記載の形質転換体（２１）より回収したプラスミド（２１）を鋳型とし、配列表の配列番号：４６、及び、１９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１１記載のプラスミド（２１）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（６３）、及び、そのベースとなった形質転換体（２１）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（６３）では、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、αサブユニットの９４番目のＭｅｔをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（２１）に対し、１．５５倍の反応初速度の向上、及び、１．２７倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例２７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６４）
表２４で示すように（ａｊ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６４）を取得するために、特許文献２の実施例６７に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６４）を得た。

［参考例２８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６５）
表２４で示すように（ａｓ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６５）を取得するために、特許文献２の実施例７６に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６５）を得た。

［参考例２９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６６）
表２４で示すように（ｂｂ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６６）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：４７、及び、４８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６６）を得た。

［実施例３５］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（６７）
表２５で示すように（ｎ−２）及び（ａｊ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６７）を取得するために、前記の参考例２７記載の形質転換体（６４）より回収したプラスミド（６４）を鋳型とし、配列表の配列番号：４６、及び、６８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２７記載のプラスミド（６４）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（６７）、及び、そのベースとなった形質転換体（６４）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（６７）では、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（６４）に対し、１．５３倍の反応初速度の向上、及び、２．２３倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例３６］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（６８）
表２５で示すように（ｎ−２）及び（ａｓ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６８）を取得するために、前記の参考例２８記載の形質転換体（６５）より回収したプラスミド（６５）を鋳型とし、配列表の配列番号：４６、及び、３７に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２８記載のプラスミド（６５）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（６８）、及び、そのベースとなった形質転換体（６５）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（６８）では、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（６５）に対し、１．５５倍の反応初速度の向上、及び、２．１５倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例３７］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（６９）
表２５で示すように（ｎ−２）及び（ｂｂ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（６９）を取得するために、前記の参考例２９記載の形質転換体（６６）より回収したプラスミド（６６）を鋳型とし、配列表の配列番号：４６、及び、３７に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（６９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（６９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２９記載のプラスミド（６６）に、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（６９）、及び、そのベースとなった形質転換体（６６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（６９）では、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（６６）に対し、１．４６倍の反応初速度の向上、及び、１．９２倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例３０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７０）
表２６で示すように（ａｌ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７０）を取得するために、特許文献２の実施例６９に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７０）を得た。

［参考例３１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７１）
表２６で示すように（ａｗ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７１）を取得するために、特許文献２実施例８０に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７１）を得た。

［参考例３２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７２）
表２６で示すように（ｂｌ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７２）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：４９、及び、５０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７２）を得た。

［実施例３８］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（７３）
表２７で示すように（ｑ）及び（ａｌ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７３）を取得するために、前記の参考例３０記載の形質転換体（７０）より回収したプラスミド（７０）を鋳型とし、配列表の配列番号：１６、及び、３８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３０記載のプラスミド（７０）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（７３）、及び、そのベースとなった形質転換体（７０）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（７３）では、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（７０）に対し、２．００倍の反応初速度の向上、及び、１．５２倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例３９］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（７４）
表２７で示すように（ｑ）及び（ａｗ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７４）を取得するために、前記の参考例３１記載の形質転換体（７１）より回収したプラスミド（７１）を鋳型とし、配列表の配列番号：１６、及び、３８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３１記載のプラスミド（７１）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（７４）、及び、そのベースとなった形質転換体（７１）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（７４）では、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（７１）に対し、１．７８倍の反応初速度の向上、及び、１．４４倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例４０］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（７５）
表２７で示すように（ｑ）及び（ｂｌ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７５）を取得するために、前記の参考例３２記載の形質転換体（７２）より回収したプラスミド（７２）を鋳型とし、配列表の配列番号：１６、及び、３８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３２記載のプラスミド（７２）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（７５）、及び、そのベースとなった形質転換体（７２）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（７５）では、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（７２）に対し、１．８５倍の反応初速度の向上、及び、１．３８倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例３３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７６）
表２８で示すように（ｂｉ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７６）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：５１、及び、５２に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７６）を得た。

［参考例３４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７７）
表２８で示すように（ｂｍ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７７）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：５３、及び、５４に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７７）を得た。

［実施例４１］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（７８）
表２９で示すように（ｏ）及び（ａｎ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７８）を取得するために、前記の参考例７記載の形質転換体（１４）より回収したプラスミド（１４）を鋳型とし、配列表の配列番号：２９、及び、３３に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例７記載のプラスミド（１４）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（７８）、及び、そのベースとなった形質転換体（１４）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（７８）では、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１４）に対し、１．６０倍の反応初速度の向上、及び、１．４６倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例４２］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（７９）
表２９で示すように（ｏ）及び（ｂｉ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（７９）を取得するために、前記の参考例３３記載の形質転換体（７６）より回収したプラスミド（７６）を鋳型とし、配列表の配列番号：２９、及び、３３に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（７９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（７９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３３記載のプラスミド（７６）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（７９）、及び、そのベースとなった形質転換体（７６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（７９）では、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（７６）に対し、１．３８倍の反応初速度の向上、及び、１．３５倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例４３］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（８０）
表２９で示すように（ｏ）及び（ｂｍ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８０）を取得するために、前記の参考例３４記載の形質転換体（７７）より回収したプラスミド（７７）を鋳型とし、配列表の配列番号：２９、及び、３３に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３４記載のプラスミド（７７）に、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（８０）、及び、そのベースとなった形質転換体（７７）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（８０）では、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（７７）に対し、１．５２倍の反応初速度の向上、及び、１．２８倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例３５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８１）
表３０で示すように（ａｇ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８１）を取得するために、特許文献２の実施例６４に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８１）を得た。

［参考例３６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８２）
表３０で示すように（ａｉ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８２）を取得するために、特許文献２の実施例６６に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８２）を得た。

［実施例４４］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（８３）
表３１で示すように（ｐ）及び（ａｇ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８３）を取得するために、前記の参考例３５記載の形質転換体（８１）より回収したプラスミド（８１）を鋳型とし、配列表の配列番号：３３、及び、６０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３５記載のプラスミド（８１）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（８３）、及び、そのベースとなった形質転換体（８１）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（８３）では、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（８１）に対し、１．２５倍の反応初速度の向上、及び、２．１６倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例４５］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（８４）
表３１で示すように（ｐ）及び（ａｉ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８４）を取得するために、前記の参考例３６記載の形質転換体（８２）より回収したプラスミド（８２）を鋳型とし、配列表の配列番号：３３、及び、６０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３６記載のプラスミド（８２）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（８４）、及び、そのベースとなった形質転換体（８２）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（８４）では、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（８２）に対し、１．２７倍の反応初速度の向上、及び、２．１０倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例４６］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（８５）
表３１で示すように（ｐ）及び（ａｑ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８５）を取得するために、前記の参考例１９記載の形質転換体（３８）より回収したプラスミド（３８）を鋳型とし、配列表の配列番号：３３、及び、６０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３１記載のプラスミド（３８）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（８５）、及び、そのベースとなった形質転換体（３８）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（８５）では、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（３８）に対し、１．３３倍の反応初速度の向上、及び、２．５２倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例３７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８６）
表３２で示すように（ａｄ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８６）を取得するために、特許文献２の実施例６１に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８６）を得た。

［参考例３８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８７）
表３２で示すように（ｂｇ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８７）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：５５、及び、５６に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８７）を得た。

［実施例４７］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（８８）
表３３で示すように（ｊ）及び（ａｄ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８８）を取得するために、前記の参考例３７記載の形質転換体（８６）より回収したプラスミド（８６）を鋳型とし、配列表の配列番号：５７、及び、５８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３７記載のプラスミド（８６）に、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（８８）、及び、そのベースとなった形質転換体（８６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（８８）では、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（８６）に対し、１．２９倍の反応初速度の向上、及び、１．６２倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例４８］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（８９）
表３３で示すように（ｊ）及び（ａｊ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（８９）を取得するために、前記の参考例２７記載の形質転換体（６４）より回収したプラスミド（６４）を鋳型とし、配列表の配列番号：５７、及び、５８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（８９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（８９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２７記載のプラスミド（６４）に、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（８９）、及び、そのベースとなった形質転換体（６４）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（８９）では、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（６４）に対し、１．３４倍の反応初速度の向上、及び、１．８３倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例４９］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（９０）
表３３で示すように（ｊ）及び（ｂｇ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９０）を取得するために、前記の参考例３８記載の形質転換体（８７）より回収したプラスミド（８７）を鋳型とし、配列表の配列番号：５７、及び、５８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９０）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３８記載のプラスミド（８７）に、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（９０）、及び、そのベースとなった形質転換体（８７）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（９０）では、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（８７）に対し、１．２５倍の反応初速度の向上、及び、１．４６倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例５０］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（９１）
表３４で示すように（ｋ）及び（ａｄ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９１）を取得するために、をコードするプラスミドを取得するため、前記の参考例３７記載の形質転換体（８６）より回収したプラスミド（８６）を鋳型とし、配列表の配列番号：５９、及び、６０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３７記載のプラスミド（８６）に、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（９１）、及び、そのベースとなった形質転換体（８６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（９１）では、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（８６）に対し、１．４４倍の反応初速度の向上、及び、１．４２倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例５１］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（９２）
表３４で示すように（ｋ）及び（ａｓ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９２）を取得するために、前記の参考例２８記載の形質転換体（６５）より回収したプラスミド（６５）を鋳型とし、配列表の配列番号：５９、及び、６０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２８記載のプラスミド（６５）に、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（９２）、及び、そのベースとなった形質転換体（６５）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（９２）では、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（６５）に対し、１．４８倍の反応初速度の向上、及び、１．３９倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例５２］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（９３）
表３４で示すように（ｋ）及び（ａｖ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９３）を取得するために、前記の参考例１記載の形質転換体（２）より回収したプラスミド（２）を鋳型とし、配列表の配列番号：５９、及び、６０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１記載のプラスミド（２）に、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（９３）、及び、そのベースとなった形質転換体（２）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（９３）では、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（２）に対し、１．３６倍の反応初速度の向上、及び、１．５２倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例３９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９４）
表３５で示すように（ｂｏ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９４）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：６１、及び、６２に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９４）を得た。

［実施例５３］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（９５）
表３６で示すように（ｌ）及び（ａｇ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９５）を取得するために、前記の参考例３５記載の形質転換体（８１）より回収したプラスミド（８１）を鋳型とし、配列表の配列番号：４３、４６、及び、５７に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３５記載のプラスミド（８１）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（９５）、及び、そのベースとなった形質転換体（８１）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（９５）では、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（８１）に対し、１．５３倍の反応初速度の向上、及び、１．７６倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例５４］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（９６）
表３６で示すように（ｌ）及び（ａｍ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９６）を取得するために、前記の参考例２５記載の形質転換体（５６）より回収したプラスミド（５６）を鋳型とし、配列表の配列番号：４３、４６、及び、５７に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９６）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例２５記載のプラスミド（５６）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（９６）、及び、そのベースとなった形質転換体（５６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（９６）では、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（５６）に対し、１．４９倍の反応初速度の向上、及び、１．６９倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例５５］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（９７）
表３６で示すように（ｌ）及び（ｂｏ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９７）を取得するために、前記の参考例３９記載の形質転換体（９４）より回収したプラスミド（９４）を鋳型とし、配列表の配列番号：４３、４６、及び、５７に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３９記載のプラスミド（９４）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（９７）、及び、そのベースとなった形質転換体（９４）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（９７）では、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、αサブユニットの２７番目のＭｅｔをＩｌｅ、及び、βサブユニットの１１０番目のＧｌｕをＡｓｎとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（９４）に対し、１．３７倍の反応初速度の向上、及び、１．８３倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例４０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９８）
表３７で示すように（ａｂ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９８）を取得するために、特許文献２の実施例５９に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９８）を得た。

［実施例５６］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（９９）
表３８で示すように（ｒ）及び（ａｂ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（９９）を取得するために、前記の参考例４０記載の形質転換体（９８）より回収したプラスミド（９８）を鋳型とし、配列表の配列番号：４３、５９、及び、３８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（９９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（９９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例４０記載のプラスミド（９８）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（９９）、及び、そのベースとなった形質転換体（９８）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（９９）では、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（９８）に対し、１．８５倍の反応初速度の向上、及び、１．３６倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例５７］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１００）
表３８で示すように（ｒ）及び（ａｉ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１００）を取得するために、前記の参考例３６記載の形質転換体（８２）より回収したプラスミド（８２）を鋳型とし、配列表の配列番号：４３、５９、及び、３８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１００）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１００）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３６記載のプラスミド（８２）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１００）、及び、そのベースとなった形質転換体（８２）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１００）では、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（８２）に対し、１．７２倍の反応初速度の向上、及び、１．４２倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例５８］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１０１）
表３８で示すように（ｒ）及び（ｂｈ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０１）を取得するために、前記の参考例３記載の形質転換体（４）より回収したプラスミド（４）を鋳型とし、配列表の配列番号：４３、５９、及び、３８に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３記載のプラスミド（４）に、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１０１）、及び、そのベースとなった形質転換体（４）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１０１）では、αサブユニットの１３番目のＩｌｅをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（４）に対し、１．６５倍の反応初速度の向上、及び、１．２９倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例４１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０２）
表３９で示すように（ａｃ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０２）を取得するために、特許文献２の実施例６０に記載のプラスミドを鋳型とし、実施例１記載の方法でリボゾーム結合配列を改変し、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０２）を得た。

［実施例５９］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１０３）
表４０で示すように（ｓ）及び（ａｂ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０３）を取得するために、前記の参考例４０記載の形質転換体（９８）より回収したプラスミド（９８）を鋳型とし、配列表の配列番号：１６、２９、及び、５９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例４０記載のプラスミド（９８）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１０３）、及び、そのベースとなった形質転換体（９８）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１０３）では、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（９８）に対し、２．５０倍の反応初速度の向上、及び、１．５７倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例６０］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１０４）
表４０で示すように（ｓ）及び（ａｈ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０４）を取得するために、前記の参考例１８記載の形質転換体（３７）より回収したプラスミド（３７）を鋳型とし、配列表の配列番号：１６、２９、及び、５９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１８記載のプラスミド（３７）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１０４）、及び、そのベースとなった形質転換体（３７）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１０４）では、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（３７）に対し、１．８２倍の反応初速度の向上、及び、１．４１倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例６１］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１０５）
表４０で示すように（ｓ）及び（ａｃ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０５）を取得するために、前記の参考例４１記載の形質転換体（１０２）より回収したプラスミド（１０２）を鋳型とし、配列表の配列番号：１６、２９、及び、５９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例４１記載のプラスミド（１０２）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１０５）、及び、そのベースとなった形質転換体（１０２）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１０５）では、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、及び、βサブユニットの４番目のＶａｌをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２０６番目のＰｒｏをＬｅｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１０２）に対し、１．６７倍の反応初速度の向上、及び、１．６１倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例４２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０６）
表４１で示すように（ａｚ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０６）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：６５、及び、５３に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０６）を得た。

［実施例６２］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１０７）
表４２で示すように（ｔ）及び（ａｃ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０７）を取得するために、前記の参考例４１記載の形質転換体（１０２）より回収したプラスミド（１０２）を鋳型とし、配列表の配列番号：２４、３７、及び、６０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例４１記載のプラスミド（１０２）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１０７）、及び、そのベースとなった形質転換体（１０２）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１０７）では、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１０２）に対し、２．１１倍の反応初速度の向上、及び、１．８８倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例６３］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１０８）
表４２で示すように（ｔ）及び（ａｌ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０８）を取得するために、前記の参考例３０記載の形質転換体（７０）より回収したプラスミド（７０）を鋳型とし、配列表の配列番号：２４、３７、及び、６０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０８）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０８）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３０記載のプラスミド（７０）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１０８）、及び、そのベースとなった形質転換体（７０）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１０８）では、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（７０）に対し、１．９８倍の反応初速度の向上、及び、２．３４倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例６４］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１０９）
表４２で示すように（ｔ）及び（ａｚ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１０９）を取得するために、前記の参考例４２記載の形質転換体（１０６）より回収したプラスミド（１０６）を鋳型とし、配列表の配列番号：２４、３７、及び、６０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１０９）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１０９）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例４３記載のプラスミド（１０６）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１０９）、及び、そのベースとなった形質転換体（１０６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１０９）では、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１０６）に対し、２．０５倍の反応初速度の向上、及び、１．６２倍の熱安定性の向上が見られた。

［参考例４３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１０）
表４３で示すように（ｂａ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１０）を取得するために、上記参考例２記載の変異導入キットを用いた部位特異的な変異導入を行った。実施例１記載のリボゾーム結合配列を改変したニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（１）を鋳型とし、配列表の配列番号：６６、及び、６７に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１０）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１０）を得た。

［実施例６５］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１１１）
表４４で示すように（ｕ）及び（ａｑ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１１）を取得するために、前記の参考例１９記載の形質転換体（３８）より回収したプラスミド（３８）を鋳型とし、配列表の配列番号：３３、及び、６９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１１）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１１）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１９記載のプラスミド（３８）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１１１）、及び、そのベースとなった形質転換体（３８）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１１１）では、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（３８）に対し、１．４６倍の反応初速度の向上、及び、１．４３倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例６６］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１１２）
表４４で示すように（ｕ）及び（ａｐ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１２）を取得するために、前記の参考例５記載の形質転換体（９）より回収したプラスミド（９）を鋳型とし、配列表の配列番号：３３、及び、６９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１２）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１２）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例５記載のプラスミド（９）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１１２）、及び、そのベースとなった形質転換体（９）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１１２）では、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（９）に対し、１．４２倍の反応初速度の向上、及び、１．６６倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例６７］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１１３）
表４４で示すように（ｕ）及び（ｂａ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１３）を取得するために、前記の参考例４３記載の形質転換体（１１０）より回収したプラスミド（１１０）を鋳型とし、配列表の配列番号：３３、及び、６９に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１３）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１３）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例４３記載のプラスミド（１１０）に、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１１３）、及び、そのベースとなった形質転換体（１１０）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１１３）では、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１１０）に対し、１．３９倍の反応初速度の向上、及び、１．３８倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例６８］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１１４）
表４５で示すように（ｖ）及び（ａｌ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１４）を取得するために、前記の参考例３０記載の形質転換体（７０）より回収したプラスミド（７０）を鋳型とし、配列表の配列番号：１６、３８、及び、７０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１４）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１４）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３０記載のプラスミド（７０）に、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、βサブユニットの２４番目のＶａｌをＩｌｅ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１１４）、及び、そのベースとなった形質転換体（７０）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１１４）では、αサブユニットの９２番目のＡｓｐをＧｌｕ、βサブユニットの２４番目のＶａｌをＩｌｅ、及び、βサブユニットの２２６番目のＶａｌをＩｌｅとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（７０）に対し、２．４３倍の反応初速度の向上、及び、１．６３倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例６９］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１１５）
表４６で示すように（ｗ）及び（ａｌ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１５）を取得するために、前記の参考例３０記載の形質転換体（７０）より回収したプラスミド（７０）を鋳型とし、配列表の配列番号：２４、３７、６０及び、７０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１５）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１５）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例３０記載のプラスミド（７０）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、βサブユニットの２４番目のＶａｌをＩｌｅ、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１１５）、及び、そのベースとなった形質転換体（７０）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１１５）では、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、βサブユニットの２４番目のＶａｌをＩｌｅ、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（７０）に対し、２．２３倍の反応初速度の向上、及び、２．５１倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例７０］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１１６）
表４６で示すように（ｗ）及び（ａｚ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１６）を取得するために、前記の参考例４２記載の形質転換体（１０６）より回収したプラスミド（１０６）を鋳型とし、配列表の配列番号：２４、３７、６０、及び、７０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１６）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１６）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例４２記載のプラスミド（１０６）に、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、βサブユニットの２４番目のＶａｌをＩｌｅ、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１１６）、及び、そのベースとなった形質転換体（１０６）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１１６）では、αサブユニットの１９７番目のＧｌｙをＣｙｓ、βサブユニットの２４番目のＶａｌをＩｌｅ、βサブユニットの１０７番目のＰｒｏをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（１０６）に対し、２．３５倍の反応初速度の向上、及び、１．８７倍の熱安定性の向上が見られた。

［実施例７１］ニトリルヒドラターゼ活性及び熱安定性が向上したアミノ酸置換体の取得（１１７）
表４７で示すように（ｘ）及び（ａｑ）のアミノ酸置換位置でニトリルヒドラターゼを変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を発現する形質転換体（１１７）を取得するために、前記の参考例１９記載の形質転換体（３８）より回収したプラスミド（３８）を鋳型とし、配列表の配列番号：３３、６９、及び７０に記載のプライマーを用い、参考例２に記載の方法を変異点毎に繰り返すことにより、上記ニトリルヒドラターゼ変異体をコードするプラスミド（１１７）を作製した。該プラスミドにて大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体（１１７）を得た。また上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定し、参考例１９記載のプラスミド（３８）に、βサブユニットの２４番目のＶａｌをＩｌｅ、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加された目的通りの配列を有していることを確認した。こうして得られた形質転換体（１１７）、及び、そのベースとなった形質転換体（３８）を用いたアミド化合物の製造における反応初速度、並びに熱安定性を実施例１記載の方法と同様の方法により比較した。

その結果、形質転換体（１１７）では、βサブユニットの２４番目のＶａｌをＩｌｅ、βサブユニットの７９番目のＨｉｓをＡｓｎ、βサブユニットの２３０番目のＡｌａをＧｌｕ、及び、βサブユニットの２３１番目のＡｌａをＶａｌとする変異が新たに追加されたことにより、形質転換体（３８）に対し、１．７３倍の反応初速度の向上、及び、１．５０倍の熱安定性の向上が見られた。

Claims (17)

1. ３以下１以上のアミノ酸置換により、ニトリルヒドラターゼの２以上の性質を改善する少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体。
2. 請求項１に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、改善される前記性質が反応初速度及び熱安定性であることを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体。
3. 請求項１又は２に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、
   配列表の配列番号：１に示されるαサブユニットと、配列表の配列番号：２に示されるβサブユニットとからなり、下記（ａ）〜（ｌ）からなるアミノ酸置換位置より選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体。
   （ａ）αサブユニットの９２番目
   （ｂ）αサブユニットの９４番目
   （ｃ）αサブユニットの１９７番目
   （ｄ）βサブユニットの４番目
   （ｅ）βサブユニットの２４番目
   （ｆ）βサブユニットの７９番目
   （ｇ）βサブユニットの９６番目
   （ｈ）βサブユニットの１０７番目
   （ｉ）βサブユニットの２２６番目
   （ｊ）βサブユニットの１１０番目、及び、βサブユニットの２３１番目
   （ｋ）βサブユニットの２０６番目、及び、βサブユニットの２３０番目
   （ｌ）αサブユニットの１３番目、αサブユニットの２７番目、及び、βサブユニットの１１０番目
4. 請求項３に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、さらに下記（ｍ）〜（ｕ）からなるアミノ酸置換位置より選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体。
   （ｍ）（ｂ）又は（ｇ）のとき、αサブユニットの１３番目
   （ｎ）（ｂ）又は（ｈ）のとき、αサブユニットの２７番目
   （ｏ）（ｄ）及び（ｆ）
   （ｐ）（ｆ）のとき、βサブユニットの２３０番目
   （ｑ）（ａ）及び（ｉ）
   （ｒ）（ｉ）のとき、αサブユニットの１３番目、及び、βサブユニットの２０６番目
   （ｓ）（ａ）及び（ｄ）のとき、βサブユニットの２０６番目
   （ｔ）（ｃ）及び（ｈ）のとき、βサブユニットの２３０番目
   （ｕ）（ｆ）のとき、βサブユニットの２３０番目、及び、βサブユニットの２３１番目
5. 請求項３に記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、（ｅ）のとき、（ａ）、（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）、（ｈ）、βサブユニットの２３０番目、及びβサブユニットの２３１番目からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸の他のアミノ酸への置換をさらに含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体。
6. 請求項１乃至５いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、
   αサブユニットの１３番目のアミノ酸が置換されているとき、ＩｌｅがＬｅｕに置換されており、
   αサブユニットの２７番目のアミノ酸が置換されているとき、ＭｅｔがＩｌｅに置換されており、
   αサブユニットの９２番目のアミノ酸が置換されているとき、ＡｓｐがＧｌｕに置換されており、
   αサブユニットの９４番目のアミノ酸が置換されているとき、ＭｅｔがＩｌｅに置換されており、
   αサブユニットの１９７番目のアミノ酸が置換されているとき、ＧｌｙがＣｙｓに置換されており、
   βサブユニットの４番目のアミノ酸が置換されているとき、ＶａｌがＭｅｔに置換されており、
   βサブユニットの２４番目のアミノ酸が置換されているとき、ＶａｌがＩｌｅに置換されており、
   βサブユニットの７９番目のアミノ酸が置換されているとき、ＨｉｓがＡｓｎに置換されており、
   βサブユニットの９６番目のアミノ酸が置換されているとき、ＧｌｎがＡｒｇに置換されており、
   βサブユニットの１０７番目のアミノ酸が置換されているとき、ＰｒｏがＭｅｔに置換されており、
   βサブユニットの１１０番目のアミノ酸が置換されているとき、ＧｌｕがＡｓｎに置換されており、
   βサブユニットの２０６番目のアミノ酸が置換されているとき、ＰｒｏがＬｅｕに置換されており、
   βサブユニットの２２６番目のアミノ酸が置換されているとき、ＶａｌがＩｌｅに置換されており、
   βサブユニットの２３０番目のアミノ酸が置換されているとき、ＡｌａがＧｌｕに置換され
   βサブユニットの２３１番目のアミノ酸が置換されているとき、ＡｌａがＶａｌに置換されていることを特徴とするニトリルターゼ変異体。
7. 請求項３乃至６いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体において、更に下記（ａａ）〜（ｂｒ）からなるアミノ酸置換より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体。
   （ａａ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ
   （ａｂ）αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、及び、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ
   （ａｃ）βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ
   （ａｄ）βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
   （ａｅ）βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇ
   （ａｆ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ
   （ａｇ）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓ、及び、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ
   （ａｈ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、及び、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ
   （ａｉ）βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＡｓｐ、βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
   （ａｊ）βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＬｅｕ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
   （ａｋ）βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＶａｌ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
   （ａｌ）βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＩｌｅ、βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ
   （ａｍ）βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＬｙｓ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
   （ａｎ）βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＶａｌ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
   （ａｏ）βサブユニットの１２７番目のＬｅｕをＳｅｒ、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇ
   （ａｐ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＬｙｓ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
   （ａｑ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＶａｌ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇ、及び、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒ
   （ａｒ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＡｌａ、αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、βサブユニットの１２７番目のＬｅｕをＳｅｒ、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇ
   （ａｓ）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒ、αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＡｓｐ、βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
   （ａｔ）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓ、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＬｅｕ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
   （ａｕ）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌ、αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓ、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒ、βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＶａｌ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
   （ａｖ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔ、αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ、βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＩｌｅ、βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌ、及び、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ
   （ａｗ）αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐ、αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇ、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐ、及び、βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕ
   （ａｘ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＧｌｙ、及び、αサブユニットの１８８番目のＴｈｒをＧｌｙ
   （ａｙ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＡｌａ、及び、αサブユニットの４８番目のＡｓｎをＧｌｎ
   （ａｚ）αサブユニットの４８番目のＡｓｎをＧｌｕ、及び、βサブユニットの１４６番目のＡｒｇをＧｌｙ
   （ｂａ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＴｒｐ、及び、βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＣｙｓ
   （ｂｂ）βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＭｅｔ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＧｌｙ
   （ｂｃ）αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＳｅｒ、及び、βサブユニットの３３番目のＡｌａをＶａｌ
   （ｂｄ）βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＡｌａ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＶａｌ
   （ｂｅ）βサブユニットの４０番目のＴｈｒをＶａｌ、及び、βサブユニットの２１８番目のＣｙｓをＭｅｔ
   （ｂｆ）βサブユニットの３３番目のＡｌａをＭｅｔ、及び、βサブユニットの１７６番目のＴｙｒをＴｈｒ
   （ｂｇ）βサブユニットの４０番目のＴｈｒをＬｅｕ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＬｅｕ
   （ｂｈ）βサブユニットの４０番目のＴｈｒをＩｌｅ、及び、βサブユニットの６１番目のＡｌａをＶａｌ
   （ｂｉ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＴｈｒ、及び、βサブユニットの２１８番目のＣｙｓをＳｅｒ
   （ｂｊ）βサブユニットの１１２番目のＬｙｓをＶａｌ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＭｅｔ
   （ｂｋ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＴｒｐ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＨｉｓ
   （ｂｌ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＬｅｕ、及び、βサブユニットの１１２番目のＬｙｓをＩｌｅ
   （ｂｍ）βサブユニットの１４６番目のＡｒｇをＧｌｙ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＳｅｒ
   （ｂｎ）βサブユニットの１７１番目のＬｙｓをＡｌａ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＴｈｒ
   （ｂｏ）βサブユニットの１５０番目のＡｌａをＳｅｒ、及び、βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＣｙｓ
   （ｂｐ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＧｌｙ、及び、βサブユニットの１５０番目のＡｌａをＡｓｎ
   （ｂｑ）βサブユニットの６１番目のＡｌａをＳｅｒ、及び、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＭｅｔ
   （ｂｒ）βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＣｙｓ、及び、βサブユニットの１６８番目のＴｈｒをＧｌｕ
8. 請求項１乃至７いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子。
9. 配列表の配列番号：３に示されるαサブユニットをコードする遺伝子と、配列表の配列番号：４に示されるβサブユニットをコードする遺伝子とからなる、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子において、下記（ａ）〜（ｌ）からなる塩基置換位置より選ばれる、少なくとも１つの塩基置換を含むことを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子。
   （ａ）配列番号：３の塩基配列の２７４番目〜２７６番目
   （ｂ）配列番号：３の塩基配列の２８０番目〜２８２番目
   （ｃ）配列番号：３の塩基配列の５８９番目〜５９１番目
   （ｄ）配列番号：４の塩基配列の１０番目〜１２番目
   （ｅ）配列番号：４の塩基配列の６９番目〜７１番目
   （ｆ）配列番号：４の塩基配列の２３５番目〜２３７番目
   （ｇ）配列番号：４の塩基配列の２８６番目〜２８８番目
   （ｈ）配列番号：４の塩基配列の３１９番目〜３２１番目
   （ｉ）配列番号：４の塩基配列の６７６番目〜６７８番目
   （ｊ）配列番号：４の塩基配列の３２８番目〜３３０番目、及び、配列番号：４の６９１番目〜６９３番目
   （ｋ）配列番号：４の塩基配列の６１６番目〜６１８番目、及び、配列番号：４の塩基配列の６８８番目〜６９０番目
   （ｌ）配列番号：３の塩基配列の３７番目〜３９番目、及び、配列番号：３の塩基配列の７９番目〜８１番目、及び、配列番号：４の塩基配列の３２８番目〜３３０番目
10. 請求項９に記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子において、さらに下記（ｍ）〜（ｕ）からなる塩基置換位置より選ばれる、少なくとも１つの塩基置換を含むことを特徴とする遺伝子。
    （ｍ）（ｂ）又は（ｇ）のとき、配列番号：３の塩基配列の３７番目〜３９番目
    （ｎ）（ｂ）又は（ｈ）のとき、配列番号：３の塩基配列の７９番目〜８１番目
    （ｏ）（ｄ）及び（ｆ）
    （ｐ）（ｆ）のとき、配列番号：４の塩基配列の６８８番目〜６９０番目
    （ｑ）（ａ）及び（ｉ）
    （ｒ）（ｉ）のとき、配列番号：３の塩基配列の３７〜３９番目及び、配列番号：４の塩基配列の６１６番目〜６１８番目
    （ｓ）（ａ）及び（ｄ）のとき、配列番号：４の塩基配列の６１６番目〜６１８番目
    （ｔ）（ｃ）及び（ｈ）のとき、配列番号：４の塩基配列の６８８番目〜６９０番目
    （ｕ）（ｆ）のとき、配列番号：４の塩基配列の６８８番目〜６９０番目、及び、配列番号：４の塩基配列の６９１番目〜６９３番目
11. 請求項９に記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子において、（ｅ）のとき、（ａ）、（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）、（ｈ）、配列番号：４の塩基配列の６８８番目〜６９０番目、及び配列番号：４の塩基配列の６９１番目〜６９３番目からなる塩基置換位置から選択される少なくとも１つの塩基の他の塩基への置換をさらに含むことを特徴とする遺伝子。
12. 請求項９乃至１１いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子において、
    配列番号：３の塩基配列の３７番目〜３９番目が塩基置換されているとき、ＡＴＣがＣＴＣに置換されており、
    配列番号：３の塩基配列の７９番目〜８１番目が塩基置換されているとき、ＡＴＧがＡＴＣに置換されており、
    配列番号：３の塩基配列の２７４番目〜２７６番目が塩基置換されているとき、ＧＡＣがＧＡＧに置換されており、
    配列番号：３の塩基配列の２８０番目〜２８２番目が塩基置換されているとき、ＡＴＧがＡＴＣに置換されており、
    配列番号：３の塩基配列の５８９番目〜５９１番目が塩基置換されているとき、ＧＧＣをＴＧＣに置換されており、
    配列番号：４の塩基配列の１０番目〜１２番目が塩基置換されているとき、ＧＴＧをＡＴＧに置換されており、
    配列番号：４の塩基配列の６９番目〜７１番目が塩基置換されているとき、ＧＴＣがＡＴＣに置換されており、
    配列番号：４の塩基配列の２３５番目〜２３７番目が塩基置換されているとき、ＣＡＣがＡＡＣに置換されており、
    配列番号：４の塩基配列の２８６番目〜２８８番目が塩基置換されているとき、ＣＡＧがＣＧＴに置換されており、
    配列番号：４の塩基配列の３１９番目〜３２１番目が塩基置換されているとき、ＣＣＣがＡＴＧに置換されており、
    配列番号：４の塩基配列の３２８番目〜３３０番目が塩基置換されているとき、ＧＡＧがＡＡＣに置換されており、
    配列番号：４の塩基配列の６１６番目〜６１８番目が塩基置換されているとき、ＣＣＧがＣＴＧに置換されており、
    配列番号：４の塩基配列の６７６番目〜６７８番目が塩基置換されているとき、ＧＴＣがＡＴＣに置換されており、
    配列番号：４の塩基配列の６８８番目〜６９０番目が塩基置換されているとき、ＧＣＧがＧＡＧに置換されており、
    配列番号：４の塩基配列の６９１番目〜６９３番目が塩基置換されているとき、ＧＣＣがＧＴＣに置換されていることを特徴とする遺伝子。
13. 請求項９乃至１２いずれかに記載の遺伝子が、下記（ａａ）〜（ｂｒ）からなる塩基置換位置より選ばれる、少なくとも１つの塩基置換を含み、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子。
    （ａａ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＡＴＧ、及び、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ
    （ａｂ）配列番号：３の塩基配列の４４２番目〜４４４番目のＧＧＣをＧＡＣ、及び、配列番号：３の塩基配列の６１０番目〜６１２番目のＧＴＣをＣＧＣ
    （ａｃ）配列番号：４の塩基配列の１５１番目〜１５３番目のＴＴＣをＧＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ
    （ａｄ）配列番号：４の塩基配列の３５２番目〜３５４番目のＴＴＣをＧＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
    （ａｅ）配列番号：４の塩基配列の４７８番目〜４８０番目のＣＧＧをＴＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の５５６番目〜５５８番目のＣＴＧをＣＧＧ
    （ａｆ）配列番号：３の塩基配列の１６番目〜１８番目のＣＴＧをＡＣＧ、配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＡＴＧ、及び、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ
    （ａｇ）配列番号：３の塩基配列の５５番目〜５７番目のＧＣＧをＧＴＧ、配列番号：３の塩基配列の２１１番目〜２１３番目のＣＧＴをＣＡＴ、及び、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ
    （ａｈ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＡＴＧ、配列番号：３の塩基配列の４４２番目〜４４４番目のＧＧＣをＧＡＣ、及び、配列番号：３の塩基配列の６１０番目〜６１２番目のＧＴＣをＣＧＣ
    （ａｉ）配列番号：４の塩基配列の２８番目〜３０番目のＡＣＣをＧＡＣ、配列番号：４の塩基配列の３５２番目〜３５４番目のＴＴＣをＧＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
    （ａｊ）配列番号：４の塩基配列の１０９番目〜１１１番目のＴＴＣをＣＴＣ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
    （ａｋ）配列番号：４の塩基配列の１０９番目〜１１１番目のＴＴＣをＧＴＣ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
    （ａｌ）配列番号：４の塩基配列の１２１番目〜１２３番目のＴＴＣをＡＴＣ、配列番号：４の塩基配列の１５１番目〜１５３番目のＴＴＣをＧＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ
    （ａｍ）配列番号：４の塩基配列の１３６番目〜１３８番目のＡＴＧをＡＡＧ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＣＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６３４番目〜６３６番目のＴＣＣをＴＡＣ
    （ａｎ）配列番号：４の塩基配列の１４２番目〜１４４番目のＣＴＧをＧＴＧ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＣＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６３４番目〜６３６番目のＴＣＣをＴＡＣ
    （ａｏ）配列番号：４の塩基配列の３７９番目〜３８１番目のＣＴＧをＴＣＧ、配列番号：４の塩基配列の４７８番目〜４８０番目のＣＧＧをＴＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の５５６番目〜５５８番目のＣＴＧをＣＧＧ
    （ａｐ）配列番号：３の塩基配列の１６番目〜１８番目のＣＴＧをＡＣＧ、配列番号：３の塩基配列の５５番目〜５７番目のＧＣＧをＧＴＧ、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ、配列番号：４の塩基配列の１３６番目〜１３８番目のＡＴＧをＡＡＧ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＣＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６３４番目〜６３６番目のＴＣＣをＴＡＣ
    （ａｑ）配列番号：３の塩基配列の１６番目〜１８番目のＣＴＧをＡＣＧ、配列番号：３の塩基配列の５５番目〜５７番目のＧＣＧをＧＴＧ、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ、配列番号：４の塩基配列の１４２番目〜１４４番目のＣＴＧをＧＴＧ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＣＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６３４番目〜６３６番目のＴＣＣをＴＡＣ
    （ａｒ）配列番号：３の塩基配列の１６番目〜１８番目のＣＴＧをＧＣＧ、配列番号：３の塩基配列の５５番目〜５７番目のＧＣＧをＧＴＧ、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ、配列番号：４の塩基配列の３７９番目〜３８１番目のＣＴＧをＴＣＧ、配列番号：４の塩基配列の４７８番目〜４８０番目のＣＧＧをＴＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の５５６番目〜５５８番目のＣＴＧをＣＧＧ
    （ａｓ）配列番号：３の塩基配列の１６番目〜１８番目のＣＴＧをＡＣＧ、配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＡＴＧ、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ、配列番号：４の塩基配列の２８番目〜３０番目のＡＣＣをＧＡＣ、配列番号：４の塩基配列の３５２番目〜３５４番目のＴＴＣをＧＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
    （ａｔ）配列番号：３の塩基配列の５５番目〜５７番目のＧＣＧをＧＴＧ、配列番号：３の塩基配列の２１１番目〜２１３番目のＣＧＴをＣＡＴ、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ、配列番号：４の塩基配列の１０９番目〜１１１番目のＴＴＣをＣＴＣ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
    （ａｕ）配列番号：３の塩基配列の５５番目〜５７番目のＧＣＧをＧＴＧ、配列番号：３の塩基配列の２１１番目〜２１３番目のＣＧＴをＣＡＴ、配列番号：３の塩基配列の３７６番目〜３７８番目のＴＴＣをＴＡＣ、配列番号：４の塩基配列の１０９番目〜１１１番目のＴＴＣをＧＴＣ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
    （ａｖ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＡＴＧ、配列番号：３の塩基配列の４４２番目〜４４４番目のＧＧＣをＧＡＣ、配列番号：３の塩基配列の６１０番目〜６１２番目のＧＴＣをＣＧＣ、配列番号：４の塩基配列の１２１番目〜１２３番目のＴＴＣをＡＴＣ、配列番号：４の塩基配列の１５１番目〜１５３番目のＴＴＣをＧＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ
    （ａｗ）配列番号：３の塩基配列の４４２番目〜４４４番目のＧＧＣをＧＡＣ、配列番号：３の塩基配列の６１０番目〜６１２番目のＧＴＣをＣＧＣ、配列番号：４の塩基配列の３２２番目〜３２４番目のＧＡＧをＧＡＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の５９８番目〜６００番目のＧＣＣをＧＡＧ
    （ａｘ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＧＧＧ、及び、配列番号：３の塩基配列の５６２番目〜５６４番目のＡＣＣをＧＧＣ
    （ａｙ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＧＣＧ、及び、配列番号：３の塩基配列の１４２番目〜１４４番目のＡＡＣをＣＡＡ
    （ａｚ）配列番号：３の塩基配列の１４２番目〜１４４番目のＡＡＣをＧＡＡ、及び、配列番号：４の塩基配列の４３６番目〜４３８番目のＣＧＧをＧＧＧ
    （ｂａ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＴＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の５２６番目〜５２８番目のＴＡＣをＴＧＣ
    （ｂｂ）配列番号：４の塩基配列の５２６番目〜５２８番目のＴＡＣをＡＴＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＧＧＣ
    （ｂｃ）配列番号：３の塩基配列の１０６番目〜１０８番目のＡＣＧをＴＣＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の９７番目〜９９番目のＧＣＧをＧＴＧ
    （ｂｄ）配列番号：４の塩基配列の５２６番目〜５２８番目のＴＡＣをＧＣＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＧＴＣ
    （ｂｅ）配列番号：４の塩基配列の１１８番目〜１２０番目のＡＣＧをＧＴＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６５２番目〜６５４番目のＴＧＣをＡＴＧ
    （ｂｆ）配列番号：４の塩基配列の９７番目〜９９番目のＧＣＧをＡＴＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の５２６番目〜５２８番目のＴＡＣをＡＣＣ
    （ｂｇ）配列番号：４の塩基配列の１１８番目〜１２０番目のＡＣＧをＣＴＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＣＴＣ
    （ｂｈ）配列番号：４の塩基配列の１１８番目〜１２０番目のＡＣＧをＡＴＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の１８１番目〜１８３番目のＧＣＣをＧＴＣ
    （ｂｉ）配列番号：４の塩基配列の１８１番目〜１８３番目のＧＣＣをＡＣＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６５２番目〜６５４番目のＴＧＣをＴＣＣ
    （ｂｊ）配列番号：４の塩基配列の３３４番目〜３３６番目のＡＡＧをＧＴＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＡＴＧ
    （ｂｋ）配列番号：４の塩基配列の１８１番目〜１８３番目のＧＣＣをＴＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＣＡＣ
    （ｂｌ）配列番号：４の塩基配列の１８１番目〜１８３番目のＧＣＣをＣＴＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の３３４番目〜３３６番目のＡＡＧをＡＴＴ
    （ｂｍ）配列番号：４の塩基配列の４３６番目〜４３８番目のＣＧＧをＧＧＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＡＧＣ
    （ｂｎ）配列番号：４の塩基配列の５１１番目〜５１３番目のＡＡＧをＧＣＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＡＣＣ
    （ｂｏ）配列番号：４の塩基配列の４４８番目〜４５０番目のＧＣＧをＴＣＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の６４９番目〜６５１番目のＧＡＣをＴＧＴ
    （ｂｐ）配列番号：４の塩基配列の１８１番目〜１８３番目のＧＣＣをＧＧＣ、及び、配列番号：４の塩基配列の４４８番目〜４５０番目のＧＣＧをＡＡＴ
    （ｂｑ）配列番号：４の塩基配列の１８１番目〜１８３番目のＧＣＣをＴＣＧ、及び、配列番号：４の塩基配列の４７８番目〜４８０番目のＣＧＧをＡＴＧ
    （ｂｒ）配列番号：４の塩基配列の４７８番目〜４８０番目のＣＧＧをＴＧＴ、及び、配列番号：４の塩基配列の５０２番目〜５０４番目のＡＣＧをＧＡＧ
14. 請求項９乃至１３いずれかに記載のニトリルヒドラターゼ変異体をコードする遺伝子の５'末端上流に更に、遺伝子の発現に必要とされるプロモーター配列を含むＤＮＡと、該プロモーターの３'末端の下流に、配列番号：７に含まれるリボゾーム結合配列とを含む、連結されたＤＮＡ。
15. 請求項１４に記載のＤＮＡを含む、プラスミド。
16. 請求項１５に記載のプラスミドによって宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
17. ニトリルヒドラターゼ変異体の生産方法において、請求項１６に記載の形質転換体を培地で培養して、該形質転換体にプラスミドの有するニトリルヒドラターゼ遺伝子に基づくニトリルヒドラターゼ変異体を生産させる工程を含むことを特徴とするニトリルヒドラターゼ変異体の生産方法。