KR101532467B1 - 니트릴 히드라타아제 변이체 - Google Patents

니트릴 히드라타아제 변이체 Download PDF

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Abstract

본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체는, 하나의 아미노산 치환에 의해, 니트릴 히드라타아제의 2 이상의 성질을 개선하는 적어도 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함한다.

Description

니트릴 히드라타아제 변이체{NITRILE HYDRATASE VARIANT}
본 발명은, 니트릴 히드라타아제 변이체, 및 그것을 코드하는 유전자, 그 유전자를 포함하는 DNA, 그 유전자를 함유하는 플러스미드, 그 플라스미드에 의한 형질 전환체, 그 형질 전환체를 이용하여 니트릴 히드라타아제 변이체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
최근, 여러 가지의 화합물의 니트릴기를 수화(水和)에 의해 아미드기로 변환하는 니트릴 수화 활성을 갖는 효소인 니트릴 히드라타아제가 발견되어, 그 효소를 산생하는 미생물주가 다수 개시되고 있다. 니트릴 히드라타아제를 이용하여 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 공업적으로 제조하기 위해서는, 아미드 화합물의 제조 비용에 차지하는 그 효소의 제조 비용을 낮추는 것이 중요하다. 보다 구체적으로는, 효소 조제물의 단위중량당의 활성치를 높게 할 필요가 있다.
효소 조제물 중의 효소량을 늘림으로써 활성치를 높게 하는 방법으로서, 이미, 그 효소를 코드하는 유전자를 클로닝하고, 유전자 공학적 수법에 의해 그 효소를 대량으로 발현시키는 시도가 이루어지고 있다.
예를 들어, 슈도노카르디아 서모필라(Pseudonocardia thermophila) 유래의 니트릴 히드라타아제를 형질 전환체 내에서 대량으로 발현할 수 있는 플라스미드 및 동플라스미드에 의해 형질 전환된 세포주가 작출(作出)되고 있다. 더하여, 그 세포주에 의한 그 니트릴 히드라타아제의 생산 및 그 세포주 혹은 그로부터 얻어지는 그 니트릴 히드라타아제를 니트릴 화합물과 접촉시키는 것에 의한 대응하는 아미드 화합물의 제조가 가능해지고 있다(특허문헌 1 참조).
한편, 효소 분자 그 자체의 고활성화를 실현할 수 있으면, 효소 조제물의 활성치를 보다 높게 할 수 있다.
지금까지 그 활성을 해치는 일 없이, 니트릴 히드라타아제의 아미노산 서열 중의 특정의 아미노산 잔기로 변이를 도입함으로써, 기질 특이성, 효소 안정성 등이 개량된 니트릴 히드라타아제 변이체를 탐색하는 시도가 이루어지고 있다(특허문헌 2~4 참조).
또한, 로도코커스·로도크로우스 유래의 니트릴 히드라타아제 변이체로서 특허문헌 5, 6에 기재된 것이 있다.
특허문헌 1: 일본국 특허공개공보 평9-275978호 특허문헌 2: 일본국 특허공개공보 2004-194588호 특허문헌 3: 일본국 특허공개공보 2005-160403호 특허문헌 4: 국제공개 팜플렛 제2004/056990호 특허문헌 5: 일본국 특허공개공보 2007-143409호 특허문헌 6: 일본국 특허공개공보 2008-253182호
그러나, 특허문헌 1에 기재된 야생형 니트릴 히드라타아제와 비교하여, 그 반응초속도 및 효소 안정성이 동시에 향상된 구체적인 변이체는 알려지지 않았다. 반응초속도 및 효소 안정성을 동시에 향상시킴으로써 아미드 화합물의 제조 비용을 삭감할 수 있는 것이 기대된다.
본 발명의 목적은, 높은 반응초속도 및 효소 안정성을 갖는 니트릴 히드라타아제를 제공하는 것이다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 3 이하 1 이상의 아미노산 치환에 의해, 니트릴 히드라타아제의 2 이상의 성질을 개선하는 적어도 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 니트릴 히드라타아제 변이체.
[2] [1]에 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체에 있어서, 개선되는 상기 성질이 반응초(初)속도 및 열 안정성인 것을 특징으로 하는, 니트릴 히드라타아제 변이체.
[3] [1] 또는 [2]에 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체에 있어서,
서열표의 서열 번호: 1에 표시되는 α 서브유닛과, 서열표의 서열 번호: 2에 표시되는 β 서브유닛으로 이루어지며, 하기 (a)~(l)로 이루어지는 아미노산 치환 위치로부터 선택되는, 적어도 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 니트릴 히드라타아제 변이체.
(a) α 서브유닛의 92번째
(b) α 서브유닛의 94번째
(c) α 서브유닛의 197번째
(d) β 서브유닛의 4번째
(e) β 서브유닛의 24번째
(f) β 서브유닛의 79번째
(g) β 서브유닛의 96번째
(h) β 서브유닛의 107번째
(i) β 서브유닛의 226번째
(j) β 서브유닛의 110번째, 및, β 서브유닛의 231번째
(k) β 서브유닛의 206번째, 및, β 서브유닛의 230번째
(l) α 서브유닛의 13번째, α 서브유닛의 27번째, 및, β 서브유닛의 110번째
[4] [3]에 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체에 있어서, 하기 (m)~(u)로 이루어지는 아미노산 치환 위치로부터 선택되는, 적어도 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 니트릴 히드라타아제 변이체.
(m) (b) 또는 (g)일 때, α 서브유닛의 13번째
(n) (b) 또는 (h)일 때, α 서브유닛의 27번째
(o) (d) 및 (f)
(p) (f)일 때, β 서브유닛의 230번째
(q) (a) 및 (i)
(r) (i)일 때, α 서브유닛의 13번째, 및, β 서브유닛의 206번째
(s) (a) 및 (d)일 때, β 서브유닛의 206번째
(t) (c) 및 (h)일 때, β 서브유닛의 230번째
(u) (f)일 때, β 서브유닛의 230번째, 및, β 서브유닛의 231번째
[5] [3]에 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체에 있어서, (e)일 때, (a), (c), (f), (i), (h), β 서브유닛의 230번째, 및 β 서브유닛의 231번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 니트릴 히드라타아제 변이체.
[6] [1]~[5] 중 어느 하나에 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체에 있어서,
α 서브유닛의 13번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Ile가 Leu로 치환되어 있으며,
α 서브유닛의 27번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Met가 Ile로 치환되어 있으며,
α 서브유닛의 92번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Asp가 Glu로 치환되어 있으며,
α 서브유닛의 94번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Met가 Ile로 치환되어 있으며,
α 서브유닛의 197번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Gly가 Cys로 치환되어 있으며,
β 서브유닛의 4번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Val이 Met로 치환되어 있으며,
β 서브유닛의 24번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Val이 Ile로 치환되어 있으며,
β 서브유닛의 79번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, His가 Asn으로 치환되어 있으며,
β 서브유닛의 96번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Gln이 Arg로 치환되어 있으며,
β 서브유닛의 107번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Pro가 Met로 치환되어 있으며,
β 서브유닛의 110번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Glu가 Asn으로 치환되어 있으며,
β 서브유닛의 206번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Pro가 Leu로 치환되어 있으며,
β 서브유닛의 226번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Val이 Ile로 치환되어 있으며,
β 서브유닛의 230번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Ala가 Glu로 치환되고
β 서브유닛의 231번째의 아미노산이 치환되어 있을 때, Ala가 Val로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 니트리르타제 변이체.
[7] [3]~[6] 중 어느 하나에 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체에 있어서, 하기 (aa)~(br)로 이루어지는 아미노산 치환으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 니트릴 히드라타아제 변이체.
(aa) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Met, 및, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr
(ab) α 서브유닛의 148번째의 Gly를 Asp, 및, α 서브유닛의 204번째의 Val을 Arg
(ac) β 서브유닛의 51번째의 Phe를 Val, 및, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp
(ad) β 서브유닛의 118번째의 Phe를 Val, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
(ae) β 서브유닛의 160번째의 Arg를 Trp, 및, β 서브유닛의 186번째의 Leu를 Arg
(af) α 서브유닛의 6번째의 Leu를 Thr, α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Met, 및, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr
(ag) α 서브유닛의 19번째의 Ala를 Val, α 서브유닛의 71번째의 Arg를 His, 및, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr
(ah) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Met, α 서브유닛의 148번째의 Gly를 Asp, 및, α 서브유닛의 204번째의 Val을 Arg
(ai) β 서브유닛의 10번째의 Thr을 Asp, β 서브유닛의 118번째의 Phe를 Val, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
(aj) β 서브유닛의 37번째의 Phe를 Leu, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
(ak) β 서브유닛의 37번째의 Phe를 Val, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
(al) β 서브유닛의 41번째의 Phe를 Ile, β 서브유닛의 51번째의 Phe를 Val, 및, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp
(am) β 서브유닛의 46번째의 Met를 Lys, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Arg, 및, β 서브유닛의 212번째의 Ser을 Tyr
(an) β 서브유닛의 48번째의 Leu를 Val, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Arg, 및, β 서브유닛의 212번째의 Ser을 Tyr
(ao) β 서브유닛의 127번째의 Leu를 Ser, β 서브유닛의 160번째의 Arg를 Trp, 및, β 서브유닛의 186번째의 Leu를 Arg
(ap) α 서브유닛의 6번째의 Leu를 Thr, α 서브유닛의 19번째의 Ala를 Val, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr, β 서브유닛의 46번째의 Met를 Lys, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Arg, 및, β 서브유닛의 212번째의 Ser을 Tyr
(aq) α 서브유닛의 6번째의 Leu를 Thr, α 서브유닛의 19번째의 Ala를 Val, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr, β 서브유닛의 48번째의 Leu를 Val, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Arg, 및, β 서브유닛의 212번째의 Ser을 Tyr
(ar) α 서브유닛의 6번째의 Leu를 Ala, α 서브유닛의 19번째의 Ala를 Val, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr, β 서브유닛의 127번째의 Leu를 Ser, β 서브유닛의 160번째의 Arg를 Trp, 및, β 서브유닛의 186번째의 Leu를 Arg
(as) α 서브유닛의 6번째의 Leu를 Thr, α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Met, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr, β 서브유닛의 10번째의 Thr을 Asp, β 서브유닛의 118번째의 Phe를 Val, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
(at) α 서브유닛의 19번째의 Ala를 Val, α 서브유닛의 71번째의 Arg를 His, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr, β 서브유닛의 37번째의 Phe를 Leu, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
(au) α 서브유닛의 19번째의 Ala를 Val, α 서브유닛의 71번째의 Arg를 His, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr, β 서브유닛의 37번째의 Phe를 Val, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
(av) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Met, α 서브유닛의 148번째의 Gly를 Asp, α 서브유닛의 204번째의 Val을 Arg, β 서브유닛의 41번째의 Phe를 Ile, β 서브유닛의 51번째의 Phe를 Val, 및, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp
(aw) α 서브유닛의 148번째의 Gly를 Asp, α 서브유닛의 204번째의 Val을 Arg, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
(ax) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Gly, 및, α 서브유닛의 188번째의 Thr을 Gly
(ay) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Ala, 및, α 서브유닛의 48번째의 Asn을 Gln
(az) α 서브유닛의 48번째의 Asn을 Glu, 및, β 서브유닛의 146번째의 Arg를 Gly
(ba) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Trp, 및, β 서브유닛의 176번째의 Tyr을 Cys
(bb) β 서브유닛의 176번째의 Tyr을 Met, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Gly
(bc) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Ser, 및, β 서브유닛의 33번째의 Ala를 Val
(bd) β 서브유닛의 176번째의 Tyr을 Ala, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Val
(be) β 서브유닛의 40번째의 Thr을 Val, 및, β 서브유닛의 218번째의 Cys를 Met
(bf) β 서브유닛의 33번째의 Ala를 Met, 및, β 서브유닛의 176번째의 Tyr을 Thr
(bg) β 서브유닛의 40번째의 Thr을 Leu, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Leu
(bh) β 서브유닛의 40번째의 Thr을 Ile, 및, β 서브유닛의 61번째의 Ala를 Val
(bi) β 서브유닛의 61번째의 Ala를 Thr, 및, β 서브유닛의 218번째의 Cys를 Ser
(bj) β 서브유닛의 112번째의 Lys를 Val, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Met
(bk) β 서브유닛의 61번째의 Ala를 Trp, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 His
(bl) β 서브유닛의 61번째의 Ala를 Leu, 및, β 서브유닛의 112번째의 Lys를 Ile
(bm) β 서브유닛의 146번째의 Arg를 Gly, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Ser
(bn) β 서브유닛의 171번째의 Lys를 Ala, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Thr
(bo) β 서브유닛의 150번째의 Ala를 Ser, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Cys
(bp) β 서브유닛의 61번째의 Ala를 Gly, 및, β 서브유닛의 150번째의 Ala를 Asn
(bq) β 서브유닛의 61번째의 Ala를 Ser, 및, β 서브유닛의 160번째의 Arg를 Met
(br) β 서브유닛의 160번째의 Arg를 Cys, 및, β 서브유닛의 168번째의 Thr을 Glu
[8] [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자.
[9] 서열표의 서열 번호: 3에 표시되는 α 서브유닛을 코드하는 유전자와, 서열표의 서열 번호: 4에 표시되는 β 서브유닛을 코드하는 유전자로 이루어지는, 니트릴 히드라타아제를 코드하는 유전자에 있어서, 하기 (a)~(l)로 이루어지는 염기 치환 위치로부터 선택되는, 적어도 하나의 염기 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자.
(a) 서열 번호: 3의 염기 서열의 274번째~276번째
(b) 서열 번호: 3의 염기 서열의 280번째~282번째
(c) 서열 번호: 3의 염기 서열의 589번째~591번째
(d) 서열 번호: 4의 염기 서열의 10번째~12번째
(e) 서열 번호: 4의 염기 서열의 69번째~71번째
(f) 서열 번호: 4의 염기 서열의 235번째~237번째
(g) 서열 번호: 4의 염기 서열의 286번째~288번째
(h) 서열 번호: 4의 염기 서열의 319번째~321번째
(i) 서열 번호: 4의 염기 서열의 676번째~678번째
(j) 서열 번호: 4의 염기 서열의 328번째~330번째, 및, 서열 번호: 4의 691번째~693번째
(k) 서열 번호: 4의 염기 서열의 616번째~618번째, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 688번째~690번째
(l) 서열 번호: 3의 염기 서열의 37번째~39번째, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 79번째~81번째, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 328번째~330번째
[10] [9]에 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자에 있어서, 하기 (m)~(u)로 이루어지는 염기 치환 위치로부터 선택되는, 적어도 하나의 염기 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자.
(m) (b) 또는 (9)일 때, 서열 번호: 3의 염기 서열의 37번째~39번째
(n) (b) 또는 (h)일 때, 서열 번호: 3의 염기 서열의 79번째~81번째
(o) (d) 및 (f)
(p) (f)일 때, 서열 번호: 4의 염기 서열의 688번째~690번째
(q) (a) 및 (i)
(r) (i)일 때, 서열 번호: 3의 염기 서열의 37~39번째 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 616번째~618번째
(s) (a) 및 (d)일 때, 서열 번호: 4의 염기 서열의 616번째~618번째
(t) (c) 및 (h)일 때, 서열 번호: 4의 염기 서열의 688번째~690번째
(u) (f)일 때, 서열 번호: 4의 염기 서열의 688번째~690번째, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 691번째~693번째
[11] [9]에 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자에 있어서, (e)일 때, (a), (c), (f), (i), (h), 서열 번호: 4의 염기 서열의 688번째~690번째, 및 서열 번호: 4의 염기 서열의 691번째~693번째로 이루어지는 염기 치환 위치로부터 선택되는 적어도 하나의 염기의 다른 염기에의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자.
[12] [9]~[11] 중 어느 하나에 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자에 있어서,
서열 번호: 3의 염기 서열의 37번째~39번째가 염기 치환되어 있을 때, ATC가 CTC로 치환되어 있으며,
서열 번호: 3의 염기 서열의 79번째~81번째가 염기 치환되어 있을 때, ATG가 ATC로 치환되어 있으며,
서열 번호: 3의 염기 서열의 274번째~276번째가 염기 치환되어 있을 때, GAC가 GAG로 치환되어 있으며,
서열 번호: 3의 염기 서열의 280번째~282번째가 염기 치환되어 있을 때, ATG가 ATC로 치환되어 있으며,
서열 번호: 3의 염기 서열의 589번째~591번째가 염기 치환되어 있을 때, GGC가 TGC로 치환되어 있으며,
서열 번호: 4의 염기 서열의 10번째~12번째가 염기 치환되어 있을 때, GTG가 ATG로 치환되어 있으며,
서열 번호: 4의 염기 서열의 69번째~71번째가 염기 치환되어 있을 때, GTC가 ATC로 치환되어 있으며,
서열 번호: 4의 염기 서열의 235번째~237번째가 염기 치환되어 있을 때, CAC가 AAC로 치환되어 있으며,
서열 번호: 4의 염기 서열의 286번째~288번째가 염기 치환되어 있을 때, CAG가 CGT로 치환되어 있으며,
서열 번호: 4의 염기 서열의 319번째~321번째가 염기 치환되어 있을 때, CCC가 ATG로 치환되어 있으며,
서열 번호: 4의 염기 서열의 328번째~330번째가 염기 치환되어 있을 때, GAG가 AAC로 치환되어 있으며,
서열 번호: 4의 염기 서열의 616번째~618번째가 염기 치환되어 있을 때, CCG가 CTG로 치환되어 있으며,
서열 번호: 4의 염기 서열의 676번째~678번째가 염기 치환되어 있을 때, GTC가 ATC로 치환되어 있으며,
서열 번호: 4의 염기 서열의 688번째~690번째가 염기 치환되어 있을 때, GCG가 GAG로 치환되어 있으며,
서열 번호: 4의 염기 서열의 691번째~693번째가 염기 치환되어 있을 때, GCC가 GTC로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자.
[13] [9]~[12] 중 어느 하나에 기재된 유전자가, 하기 (aa)~(br)로 이루어지는 염기 치환 위치로부터 선택되는, 적어도 하나의 염기 치환을 포함하고, 또한, 니트릴 히드라타아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자.
(aa) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 ATG, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC
(ab) 서열 번호: 3의 염기 서열의 442번째~444번째의 GGC를 GAC, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 610번째~612번째의 GTC를 CGC
(ac) 서열 번호: 4의 염기 서열의 151번째~153번째의 TTC를 GTC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT
(ad) 서열 번호: 4의 염기 서열의 352번째~354번째의 TTC를 GTC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
(ae) 서열 번호: 4의 염기 서열의 478번째~480번째의 CGG를 TGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 556번째~558번째의 CTG를 CGG
(af) 서열 번호: 3의 염기 서열의 16번째~18번째의 CTG를 ACG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 ATG, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC
(ag) 서열 번호: 3의 염기 서열의 55번째~57번째의 GCG를 GTG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 211번째~213번째의 CGT를 CAT, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC
(ah) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 ATG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 442번째~444번째의 GGC를 GAC, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 610번째~612번째의 GTC를 CGC
(ai) 서열 번호: 4의 염기 서열의 28번째~30번째의 ACC를 GAC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 352번째~354번째의 TTC를 GTC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
(aj) 서열 번호: 4의 염기 서열의 109번째~111번째의 TTC를 CTC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
(ak) 서열 번호: 4의 염기 서열의 109번째~111번째의 TTC를 GTC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
(al) 서열 번호: 4의 염기 서열의 121번째~123번째의 TTC를 ATC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 151번째~153번째의 TTC를 GTC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT
(am) 서열 번호: 4의 염기 서열의 136번째~138번째의 ATG를 AAG, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 CGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 634번째~636번째의 TCC를 TAC(an) 서열 번호: 4의 염기 서열의 142번째~144번째의 CTG를 GTG, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 CGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 634번째~636번째의 TCC를 TAC
(ao) 서열 번호: 4의 염기 서열의 379번째~381번째의 CTG를 TCG, 서열 번호: 4의 염기 서열의 478번째~480번째의 CGG를 TGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 556번째~558번째의 CTG를 CGG
(ap) 서열 번호: 3의 염기 서열의 16번째~18번째의 CTG를 ACG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 55번째~57번째의 GCG를 GTG, 서열 번호 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 136번째~138번째의 ATG를 AAG, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 CGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 634번째~636번째의 TCC를 TAC
(aq) 서열 번호: 3의 염기 서열의 16번째~18번째의 CTG를 ACG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 55번째~57번째의 GCG를 GTG, 서열 번호 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 142번째~144번째의 CTG를 GTG, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 CGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 634번째~636번째의 TCC를 TAC
(ar) 서열 번호: 3의 염기 서열의 16번째~18번째의 CTG를 GCG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 55번째~57번째의 GCG를 GTG, 서열 번호 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 379번째~381번째의 CTG를 TCG, 서열 번호: 4의 염기 서열의 478번째~480번째의 CGG를 TGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 556번째~558번째의 CTG를 CGG
(as) 서열 번호: 3의 염기 서열의 16번째~18번째의 CTG를 ACG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 ATG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC, 서열 번호 4의 염기 서열의 28번째~30번째의 ACC를 GAC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 352번째~354번째의 TTC를 GTC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
(at) 서열 번호: 3의 염기 서열의 55번째~57번째의 GCG를 GTG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 211번째~213번째의 CGT를 CAT, 서열 번호: 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC, 서열 번호 4의 염기 서열의 109번째~111번째의 TTC를 CTC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
(au) 서열 번호: 3의 염기 서열의 55번째~57번째의 GCG를 GTG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 211번째~213번째의 CGT를 CAT, 서열 번호: 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC, 서열 번호 4의 염기 서열의 109번째~111번째의 TTC를 GTC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
(av) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 ATG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 442번째~444번째의 GGC를 GAC, 서열 번호: 3의 염기 서열의 610번째~612번째의 GTC를 CGC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 121번째~123번째의 TTC를 ATC, 서열 번호 4의 염기 서열의 151번째~153번째의 TTC를 GTC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT
(aw) 서열 번호: 3의 염기 서열의 442번째~444번째의 GGC를 GAC, 서열 번호: 3의 염기 서열의 610번째~612번째의 GTC를 CGC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
(ax) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 GGG, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 562번째~564번째의 ACC를 GGC
(ay) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 GCG, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 142번째~144번째의 AAC를 CAA
(az) 서열 번호: 3의 염기 서열의 142번째~144번째의 AAC를 GAA, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 436번째~438번째의 CGG를 GGG
(ba) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 TGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 526번째~528번째의 TAC를 TGC
(bb) 서열 번호: 4의 염기 서열의 526번째~528번째의 TAC를 ATG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 GGC
(bc) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 TCG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 97번째~99번째의 GCG를 GTG
(bd) 서열 번호: 4의 염기 서열의 526번째~528번째의 TAC를 GCC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 GTC
(be) 서열 번호: 4의 염기 서열의 118번째~120번째의 ACG를 GTG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 652번째~654번째의 TGC를 ATG
(bf) 서열 번호: 4의 염기 서열의 97번째~99번째의 GCG를 ATG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 526번째~528번째의 TAC를 ACC
(bg) 서열 번호: 4의 염기 서열의 118번째~120번째의 ACG를 CTG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 CTC
(bh) 서열 번호: 4의 염기 서열의 118번째~120번째의 ACG를 ATT, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 181번째~183번째의 GCC를 GTC
(bi) 서열 번호: 4의 염기 서열의 181번째~183번째의 GCC를 ACG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 652번째~654번째의 TGC를 TCC
(bj) 서열 번호: 4의 염기 서열의 334번째~336번째의 AAG를 GTG, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 ATG
(bk) 서열 번호: 4의 염기 서열의 181번째~183번째의 GCC를 TGG, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 CAC
(bl) 서열 번호: 4의 염기 서열의 181번째~183번째의 GCC를 CTC, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 334번째~336번째의 AAG를 ATT
(bm) 서열 번호: 4의 염기 서열의 436번째~438번째의 CGG를 GGG, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 AGC
(bn) 서열 번호: 4의 염기 서열의 511번째~513번째의 AAG를 GCG, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 ACC
(bo) 서열 번호: 4의 염기 서열의 448번째~450번째의 GCG를 TCG, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 TGT
(bp) 서열 번호: 4의 염기 서열의 181번째~183번째의 GCC를 GGC, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 448번째~450번째의 GCG를 AAT
(bq) 서열 번호: 4의 염기 서열의 181번째~183번째의 GCC를 TCG, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 478번째~480번째의 CGG를 ATG
(br) 서열 번호: 4의 염기 서열의 478번째~480번째의 CGG를 TGT, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 502번째~504번째의 ACG를 GAG
[14] [9]~[13] 중 어느 하나에 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자의 5' 말단 상류에 또한, 유전자의 발현에 필요하게 되는 프로모터 서열을 포함하는 DNA와, 그 프로모터의 3' 말단의 하류에, 서열 번호: 7에 포함되는 리보솜 결합 서열을 포함하는, 연결된 DNA.
[15] [14]에 기재된 DNA를 포함하는, 플라스미드.
[16] [15]에 기재된 플라스미드에 의해 숙주 세포를 형질 전환하여 얻어진 형질 전환체.
[17] 니트릴 히드라타아제 변이체의 생산 방법에 있어서, [16]에 기재된 형질 전환체를 배지에서 배양하여, 그 형질 전환체에 플라스미드가 갖는 니트릴 히드라타아제 유전자에 근거하는 니트릴 히드라타아제 변이체를 생산시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 니트릴 히드라타아제 변이체의 생산 방법.
본 발명에 의하면, 서열표의 서열 번호: 1에 표시되는 α 서브유닛과, 서열표의 서열 번호: 2에 표시되는 β 서브유닛으로 이루어지는 니트릴 히드라타아제에 있어서, 상기 (a)~(l)로 이루어지는 아미노산 치환 위치로부터 선택되는, 적어도 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함하고 있다. 이에 의해, 니트릴 히드라타아제의 반응초속도 및 효소 안정성을 동시에 향상시키고, 효소 조제물의 단위중량당의 활성치를 높게 함과 함께, 공업 이용에서의 온도 변동 등에 의한 효소실활의 리스크를 저감할 수 있다. 따라서, 보다 적은 효소량으로 아미드 화합물을 안정되게 생산할 수가 있어 아미드 화합물의 제조 비용을 저감시키는 것이 가능하게 된다.
본 발명에 의하면, 야생형 니트릴 히드라타아제보다도 반응초속도 및 효소 안정성이 향상된 신규 니트릴 히드라타아제 변이체를 제공할 수 있어, 아미드 화합물의 제조 비용에 차지하는 그 효소의 제조 비용을 내릴 수 있다.
상술한 목적, 및 그 밖의 목적, 특징 및 이점은, 이하에 기술하는 적합한 실시의 형태에 의해서 더욱 분명해질 것이다. 이하, 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체는, 3 이하 1 이상의 아미노산 치환에 의해, 니트릴 히드라타아제의 2 이상의 성질을 개선하는 적어도 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함하고 있다.
본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체로 개선되는 성질이란, 니트릴기를 수화하여 아미드기로 변환하는 반응 그 자체에 관련되는 물성과, 효소 안정성이 있다. 반응 그 자체에 관련되는 물성이란, 효소의 활성, 기질 특이성, Vmax, Km, 및, 반응초속도가 있다. 효소 안정성에는, 열 안정성, 기질에 대한 안정성, 생성물에 대한 안정성이 포함된다.
본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체는, 바람직하게는, 호열성균 유래의 니트릴 히드라타아제의 성질을 개선하는 적어도 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함하는 것이다. 호열성균의 예로서는, 슈도노카르디아(Psuedonocardia)속에 속하는 것을 적합하게 사용할 수 있으며, 구체적으로는 슈도노카르디아 서모필라(Psuedonocardia thermophila)를 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체는, 서열표의 서열 번호: 1에 표시되는 α 서브유닛과, 서열표의 서열 번호: 2에 표시되는 β 서브유닛으로 이루어지는 니트릴 히드라타아제에 있어서, 표 Ⅰ에서 나타내는 바와 같이, (a)~(l)로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환 위치가 다른 아미노산으로 치환되어 있다. 이렇게 함으로써, 본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체는, 특허문헌 1 기재된 야생형 니트릴 히드라타아제보다도 높은 반응초속도 및 효소 안정성을 구비할 수 있다.
[표 1]
Figure 112011043009518-pct00001
표 1에서 표시하는 (a)~(l)의 아미노산 치환은, 복수 조합하여도 되며, (a)~(l) 이외의 다른 위치에 있어서의 아미노산 치환과 조합할 수도 있다. 예를 들어, (e)일 때, (a), (c), (f), (i), (h), β 서브유닛의 230번째, 및 β 서브유닛의 231번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있어도 된다. (a)~(l)에 조합할 수 있는 아미노산 치환의 예로서 예를 들면, 표 II의 것이 있다.
[표 2]
Figure 112011043009518-pct00002
본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체는, 상기 (a)~(x) 중 어느 하나의 니트릴 히드라타아제 변이체에 또한 표 III에서 표시하는 바와 같이, 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 니트릴 히드라타아제의 아미노산 위치 (aa)~(br)에 변이가 포함되어 있어도 된다.
[표 3]
Figure 112011043009518-pct00003
[표 4]
Figure 112011043009518-pct00004
[표 5]
Figure 112011043009518-pct00005
[표 6]
Figure 112011043009518-pct00006
본 발명에 있어서, 「니트릴 히드라타아제 활성」이란, 여러 가지의 화합물의 니트릴기를 수화에 의해 아미드기로 변환하는 니트릴 수화 활성을 가리키며, 보다 바람직하게는, 아크릴로니트릴을 아크릴 아미드로 변환하는 활성을 말한다.
본 발명에 있어서, 「니트릴 히드라타아제 활성을 향상시켰다」라는 것은, 반응초속도를 향상시키는 것을 말한다. 본 발명에 있어서의 「반응초속도」는, 다음과 같이 해서 확인할 수 있다. 우선, 기질로서 2.5%(v/v)의 아크릴로니트릴을 포함하는, 50mM 트리스 염산 수용액(pH8.0)에 니트릴 히드라타아제 표품을 더한다. 니트릴 히드라타아제 표품에 대신하여, 미생물의 균체 및 배양액이나, 니트릴 히드라타아제 조(粗)정제물을 이용할 수도 있다. 니트릴 히드라타아제의 첨가 후, 20℃에서 15분간 반응시킨다. 반응액에 1M 인산을 더하여 반응을 정지하고, 생성한 아크릴 아미드를 정량한다. 아크릴 아미드량은 HPLC에 의해서 분석할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「반응초속도의 향상」이란, 반응초속도가 야생형의 니트릴 히드라타아제, 및 종래 공지의 니트릴 히드라타아제 변이체와 비교하여 의미 있게 향상한 것을 말하며, 구체적으로는 1.2배 이상으로 향상한 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 「효소 안정성을 향상시켰다」라는 것은, 니트릴 히드라타아제의 열 안정성을 향상시키는 것을 말한다. 열 안정성이 향상된 니트릴 히드라타아제는, 단백질의 구조 안정성이 강화되고 있는 것이라고 보여지는 점에서, 가열 이외의 스트레스, 즉 유기용매나, 고농도의 기질, 생성물에 대한 안정성도 증가되고 있는 것이 기대된다.
본 발명에 있어서의 「효소의 열 안정성」은, 다음과 같이 해서 확인할 수 있다. 우선 니트릴 히드라타아제 표품을 60℃에서 2시간 가열 처리한 후에 20℃로 되돌리고, 기질로서 2.5%(v/v)의 아크릴로니트릴을 포함하는, 50mM 트리스 염산 수용액(pH8.0)을 더한다. 니트릴 히드라타아제 표품에 대신하여, 미생물의 균체 및 배양액이나, 니트릴 히드라타아제 조정제물을 이용할 수도 있다. 가열 처리한 그 니트릴 히드라타아제와 기질을 혼화 후, 20℃에서 15분간 반응시켜, 반응초속도를 측정한다.
본 발명에 있어서의 「효소의 열 안정성의 향상」이란, 가열 처리 후의 반응초속도가, 똑같이 가열 처리를 가한 야생형의 니트릴 히드라타아제, 및 종래 공지의 니트릴 히드라타아제 변이체와 비교하여 의미있게 향상한 것, 구체적으로는 1.2배 이상으로 향상한 것을 말한다.
본 발명에 있어서의 야생형의 니트릴 히드라타아제로서는, 특허문헌 1에 기재된 슈도노카르디아 서모필라(Pseudonocardia thermophila) 유래의 니트릴 히드라타아제가 바람직하고, 그 야생형 니트릴 히드라타아제를 형질 전환체 내에서 대량으로 발현할 수 있는 플라스미드 및 동플라스미드에 의해 형질 전환된 세포주로서, MT-10822(수탁 번호 FERM BP-5785로서 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 1996년 2월 7일부터 기탁되어 있다)를 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 종래 공지의 니트릴 히드라타아제 변이체란, 특허문헌 1~4 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체를 들 수 있다.
본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체는, 니트릴 히드라타아제 활성을 향상시키는 것 외에 다음의 특성을 갖는다. 그 효소는, α 서브유닛과 β 서브유닛이 회합한 2량체가 그 기본 구조 단위로 되어 있으며, 그 2량체가 더 회합하여 4량체를 형성한다. α 서브유닛의 111번째의 시스테인 잔기가 시스테인술핀산(Cys-SOOH)에, 113번째의 시스테인 잔기가 시스테인술펜산(Cys-SOH)에 각각 번역 후 수식을 받고, 이 수식 아미노산 잔기를 통해 α 서브유닛의 폴리펩티드사슬과 코발트 원자가 결합하여, 활성 중심을 형성한다. 반응은, 바람직하게는 0~60℃의 범위에서 실시할 수 있으머, 반응 시의 pH는 통상, 4~10, 바람직하게는 6~9의 범위에서 선택된다.
본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체는, 이하와 같이 제조할 수 있다.
우선, 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 DNA를 포함하는 플라스미드를 준비하고, 이 플라스미드를 이용하여 임의의 숙주 세포를 형질 전환해서 형질 전환체 또는 세포주를 얻는다. 다음으로, 상기의 형질 전환체나 세포주를 배양하여 니트릴 히드라타아제 변이체를 산생한다.
야생형의 니트릴 히드라타아제를 코드하는 유전자는, 서열표의 서열 번호 3에 표시되는 염기 서열과, 서열표의 서열 번호: 4에 표시되는 염기 서열으로 이루어진다. 서열표의 서열 번호: 3에 표시되는 염기 서열은, 서열표의 서열 번호: 1로 이루어지는 아미노산 서열에 대응하고, 서열표의 서열 번호: 4에 표시되는 염기 서열은, 서열표의 서열 번호: 2로 이루어지는 아미노산 서열에 대응한다. 서열 번호 3 및/또는 서열 번호 4의 염기 서열을 염기 치환함으로써 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 DNA를 얻을 수 있다. 구체적으로는, 표 Ⅰ에서 표시하는 (a)~(l)의 아미노산 치환은, 표 IV-1에서 표시하는 바와 같이, 염기 치환시킴으로써 실현할 수 있다.
[표 7]
Figure 112011043009518-pct00007
또한, 표 II에서 표시하는 아미노산 치환은, 표 IV-2에서 표시하는 바와 같이, 염기 치환시킴으로써 실현할 수 있다.
[표 8]
Figure 112011043009518-pct00008
또한, 표 III에서 표시하는 아미노산 치환은, 표 V에서 표시하는 바와 같이, 염기 치환시킴으로써 실현할 수 있다.
[표 9]
Figure 112011043009518-pct00009
[표 10]
Figure 112011043009518-pct00010
[표 11]
Figure 112011043009518-pct00011
[표 12]
Figure 112011043009518-pct00012
[표 13]
Figure 112011043009518-pct00013
플라스미드로서, 상기와 같은 니트릴 히드라타아제 변이체의 α 서브유닛을 코드하는 유전자, β 서브유닛을 코드하는 유전자 또는 니트릴 히드라타아제 변이체 유전자에 더하여, 각 유전자의 발현에 필요한 제어 영역 및 자율 복제에 필요한 영역 등의, 임의의 숙주 세포를 형질 전환하여 얻어지는 형질 전환체나 세포주에 의한 니트릴 히드라타아제의 산생을 가능하게 하는 구성을 가질 수 있다. 여기서 말하는 임의의 숙주 세포의 일례로서 대장균을 들 수 있다.
발현에 필요한 제어 영역으로서는, 프로모터 서열(전사를 제어하는 오퍼레이터 서열을 포함한다.), 리보솜 결합 서열(SD서열), 전사 종결 서열 등을 들 수 있다. 구체적인 프로모터 서열의 예로서는, 대장균 유래의 트립토판오페론의 trp 프로모터, 락토오스오페론의 lac 프로모터, 람다 파지 유래의 PL 프로모터 및 PR 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, tac 프로모터나 trc 프로모터와 같이 인위적으로 설계·개변된 서열도 이용할 수 있다.
리보솜 결합 서열로서는, 서열 번호: 7에 포함되는, TAAGGAGGT를 갖는 서열이 바람직하고, 이것들 제어 영역의 플라스미드상에서의 서열 순서는, 프로모터 서열과 리보솜 결합 서열은 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자보다 5' 말단측 상류에 위치하는 것이 바람직하고, 전사 종결 서열은 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자보다 3' 말단측 하류에 위치하는 것이 바람직하다. 또한, 그와 같은 제어 영역에 의해 니트릴 히드라타아제 변이체의 α 서브유닛 유전자 및 β 서브유닛 유전자가 각각 독립의 시스트론으로서 발현되어도 되며, 공통의 제어 영역에 의해 폴리시스트론으로서 발현되어도 된다.
이상의 요건을 만족하고 있는 플라스미드 벡터의 예로서는, 대장균 중에서의 자율 복제 가능한 영역을 가지고 있는 pBR322, pUC18, pBluescript, pKK223-3, pSClO1를 들 수가 있다.
이러한 플라스미드 벡터에 본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자를 그 니트릴 히드라타아제 변이체의 활성 발현에 필요한 영역과 함께 삽입하여 본 발명의 플라스미드를 구축하는 방법, 그 플라스미드를 소망하는 숙주 세포로 형질 전환하는 방법 및 그 형질 전환체 내에서 니트릴 히드라타아제를 산생시키는 방법에는, 예를 들어 「Molecular Cloning 3rd Edition」(J. Sambrook 등; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) 등에 기재되어 있는 분자생물학·생물공학·유전자공학의 분야에 있어 공지의 일반적인 방법과 숙주 세포를 이용할 수 있다.
상기의 플라스미드를 소망하는 숙주 세포로 형질 전환하여 얻어진 형질 전환체는, 배지에서 배양함으로써, 그 플라스미드가 갖는 니트릴 히드라타아제 유전자에 근거하는 니트릴 히드라타아제 변이체를 생산할 수 있다. 숙주 세포가 대장균인 경우, 그 형질 전환체를 배양하는 배지로서 LB배지나 M9배지 등이 일반적으로 이용되지만, 보다 바람직하게는 그러한 배지 성분에 Fe이온 및 Co이온을 0.1㎍/mL 이상 존재시키면 되며, 그 형질 전환체를 식균 한 후, 적당한 배양 온도(일반적으로는, 20℃~50℃)에서 생육시키면 된다.
본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자를 발현시켜 소망하는 효소 활성을 갖는 니트릴 히드라타아제 변이체를 생산하는 경우, 니트릴 히드라타아제의 활성화에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자가 필요하다.
이 니트릴 히드라타아제의 활성화에 관여하는 단백질이란, 그 단백질의 발현의 유무가, 니트릴 히드라타아제의 활성화를 직접 좌우하는 성질을 가지고 있는 단백질을 말하며, 일본국 특허공개공보 평11-253168호에 기재되는 슈도노카르디아 서모필라 유래의 니트릴 히드라타아제 활성화에 관여하는 단백질(니트릴 히드라타아제 활성화 단백질)을 그 대표예로서 들 수가 있다. 그 니트릴 히드라타아제 활성화 단백질의 서열을 서열표: 5, 및, 6에 표시한다.
본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체를 이용하여 이하와 같이 아미드 화합물을 제조할 수 있다. 우선, 본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체를 산생하는 형질 전환체나 세포주를 배양하여, 얻어지는 배양액, 세포 또는 세포 처리물을 매체 중에서 니트릴 화합물과 접촉시킨다. 이렇게 함으로써, 대응하는 아미드 화합물을 제조한다.
여기서 말하는 세포 처리물이란, 그 형질 전환체로부터의 추출물이나 마쇄물, 이들 추출물이나 마쇄물의 니트릴 히드라타아제 활성획분을 분리하여 얻어지는 조효소(粗酵素) 조제물이나 더욱 정제해서 얻어지는 효소 정제물 등의 후분리물, 그 형질 전환체나 그 형질 전환체의 추출물, 마쇄물 또는 후분리물을 적당한 수단을 이용하여 고정화한 고정화물을 나타내고 있다. 접촉시키는 온도는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 니트릴 히드라타아제 변이체가 실활하지 않는 온도 범위 내이며, 보다 바람직하게는 0℃~60℃이다. 니트릴 화합물로서는, 본 발명의 니트릴 히드라타아제 변이체가 기질로서 작용할 수 있는 화합물이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, n-부틸로니트릴, 이소부틸로니트릴, 크로토노니트릴, α-히드록시이소부틸로니트릴 등의 탄소수 2~4의 니트릴 화합물을 그 대표예로서 들 수 있다. 그 니트릴 화합물의 수성 매체 중에서의 농도는, 특별히 한정되는 것이 아니며, 또한, 반응 온도도 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 그 니트릴 히드라타아제가 실활하지 않는 온도 범위 내이며, 보다 바람직하게는 0℃~60℃이다. 또한, 보다 적은 효소량으로 아미드 화합물을 생산하기 위해서는, 아미드 화합물의 제조 조건 하에 있어서 일정한 안정성을 갖는 니트릴 히드라타아제 변이체를 이용하면 바람직하다.
계속해서, 본 발명의 작용 효과에 관하여 상세하게 설명한다. 본 발명자들은, 예의 정예를 거듭한 결과, 3 이하 1 이상의 아미노산 치환에 의해, 2 이상의 성질을 개선하는 적어도 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함함으로써, 종래의 니트릴 히드라타아제보다 반응 그 자체에 관련되는 물성과, 효소 안정성을 모두 향상시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발견하였다. 그리고, 특히, 서열표의 서열 번호: 1에 표시되는 α 서브유닛과, 서열표의 서열 번호: 2에 표시되는 β 서브유닛으로 이루어지는 니트릴 히드라타아제에 관하여, 상기 (a)~(l)로 이루어지는 아미노산 치환 위치로부터 선택되는, 적어도 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킴으로써, 니트릴 히드라타아제의 반응초속도 뿐만 아니라, 효소 안정성을 동시에 향상시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 이렇게 함으로써, 효소 반응의 효율화와 효소의 핸들링의 양립을 실현할 수 있다. 또한, 반응초속도 및 효소 안정성을 동시에 향상시킨 니트릴 히드라타아제를 이용함으로써, 효소 조제물의 단위중량당의 활성치를 높게함과 함께, 공업 이용에서의 온도 변동 등에 의한 효소실활의 리스크를 저감 할 수 있다. 따라서, 보다 적은 효소량으로 아미드 화합물을 안정적으로 생산할 수 있어 아미드 화합물의 제조 비용을 저감시키는 것이 가능하게 된다.
이상, 본 발명의 실시 형태에 관하여 기술하였으나, 이들은 본 발명의 예시이며, 상기 이외의 여러가지 구성을 채용할 수도 있다.
실시예
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 의해서 하등 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)의 취득
주형(鑄型)으로서 특허문헌 1의 실시예 3에 기재된 플라스미드 pPT-DB1, 서열표의 서열 번호: 7, 및, 8에 기재된 프라이머를 이용한 PCR 반응에 의해, 약 0.7kbp의 유전자 단편을 얻었다. 상기 PCR 단편을 제한 효소 EcoRI 및 NotI에 의해 절단한 후, 이 제한 효소 처리액에 대해서 페놀/클로로포름 추출과 에탄올 침전을 실시하여 그 DNA 단편을 정제하였다. 마찬가지로, EcoRI 및 NotI에 의해 pPT-DB1을 절단, 아가로스겔 전기영동을 실시하고, 아가로스겔로부터 약 3.9kbp의 DNA 단편만을 잘랐다. 이와 같게 하여 얻어진 약 0.7kbp와 약 3.9kbp의 DNA 단편을 DNA 라이게이션 키트(타카라슈조사 제)를 이용하여 연결시켜, 상기의 리보솜 결합 서열이 개변된 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 제작하였다.
그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(1)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, pPT-DB1에, 표 1에서 나타내는 개편된 리보솜 결합 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다.
이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(1), 및, 그 베이스가 된 pPT-DB1을 포함하는 형질 전환체, MT-10822(수탁 번호 FERM BP-5785로서 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 평성8년 2월 7일부터 기탁되어 있다)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도를 이하의 방법에 의해 비교하였다.
<반응초속도의 비교>
시험관에 40㎍/mL의 황산 제2철·칠수화물 및 10㎍/mL의 염화 코발트·이수화물을 포함하는 5mL의 LB액체 배지를 조제하여, 121℃·20분간의 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 이 배지에 종농도가 100㎍/mL가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 각 형질 전환체를 일백금이(一白金耳) 식균하여, 37℃·200rpm으로 약 20시간 각각배양하였다. 그 배양 종료액으로부터 40μL를 취하여, 740μL의 54mM 트리스 염산 수용액(pH8.0)에 현탁하고, 이것에 20μL의 아크릴로니트릴을 첨가하여 20℃에서 완만하게 교반하면서 15분간 반응시켜, 아크릴 아미드를 생성시켰다. 반응 종료후, HPLC를 이용하여 반응액 중의 아크릴 아미드 함유량의 분석을 실시하였다.
<효소의 열 안정성의 비교>
상술한 형질 전환체의 배양 종료액으로부터 원심분리(5000G, 15분간)에 의해 각 형질 전환체를 분리하였다.
각 형질 전환체 0.1g을 20ml의 50mM 트리스 염산 수용액(pH8.0)에 각각 현탁하고, 60℃에서 2시간 가열 처리하였다. 가열 처리 후에 20℃로 되돌려, 기질로서 0.5ml의 아크릴로니트릴을 첨가하고, 20℃에서 15분간 반응시켜, 반응초속도를 측정하였다.
<분석 조건>
분석 기기: 일본분광 HPLC
컬럼: YMC Pack ODS-A(150×6.00mm)
분석 온도: 40℃
이동상: 3% 아세토니트릴, 10mM 인산
반응 및 분석은 각 형질 전환체에 대해 3회 이상 실시하여, 분주조작 등에서의 데이터의 격차를 보정하였다.
형질 전환체(1)와 MT-10822의 반응초속도 및 열 안정성, 즉, 상기 반응 조건으로 생성한 아크릴 아미드량의 비교의 결과, 표 1에서 표시하는 개변된 리보솜 결합 서열이 새롭게 추가됨으로써, 1.15배의 반응초속도의 향상을 볼 수 있어 열 안정성은 유지되었다.
[표 14]
Figure 112011043009518-pct00014
[참고예 1] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(2)
표 2에서 표시하는 바와 같이 니트릴 히드라타아제를 (av)의 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(2)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 79에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(2)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(2)를 얻었다.
[참고예 2] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(3)
표 2에서 표시하는 바와 같이 니트릴 히드라타아제를 (bc)의 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(3)를 취득하기 위해서, 타카라슈조사 제의 「LA PCR invitro mutagenesis Kit」(이후, 변이 도입 키트라 부른다)를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하여 PCR 반응을 실시하였다.
PCR 반응 No.1은, 서열표의 서열 번호: 9에 기재된 프라이머 및 M13 프라이머 M4(서열표의 서열 번호: 10에 서열을 기재)를 각각 50pmol 포함하는 전량 50μL의 계(조성은 변이 도입 키트에 기재된 조건에 따른다)로, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장 반응(72℃) 120초의 조건을 25 사이클 반복함으로써 실시되었다.
PCR 반응 No.2는, MUT4 프라이머(서열표의 서열 번호: 11에 서열을 기재) 및 M13 프라이머 RV(서열표의 서열 번호: 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 포함하는 전량 50μL의 계(조성은 변이 도입 키트에 기재된 조건에 따른다)로, PCR 반응 No.1와 같은 조작에 의해 실시하였다.
PCR 반응 No.1및 No.2의 반응 종료액 각 5μL를 이용한 아가로스 전기영동(아가로스 농도 1.0 중량%)에 의해 DNA 증폭 산물의 분석을 실시한 바, 증폭 DNA 산물의 존재를 확인할 수 있었다. Microcon100(타카라슈조 사제)를 이용하여 각각의 PCR 반응 종료액보다 과잉인 프라이머 및 dNTP를 제거한 후, TE를 더해 각각 50μL의 용액을 조제하였다. 그 TE용액을 각 0.5μL씩 포함하는 전량 47.5μL의 어닐링 용액(조성은 변이 도입 키트에 기재된 조건에 따른다)을 조제하여, 열변성 처리(98℃)를 10분간 실시한 후, 37℃까지 60분간에 걸쳐 일정한 속도로 냉각을 실시하고, 계속해서 37℃에서 15분간 유지함으로써 어닐링 처리를 실시하였다.
어닐링 처리액에 TaKaRa LA Taq(다카라바이오주식회사 제)를 0.5μL를 가하여 72℃에서 3분간 가열 처리를 실시하고, 헤테로 2개쇄를 완성시켰다.
이에 M13 프라이머 M4(서열표의 서열 번호: 10에 서열을 기재) 및 M13 프라이머 RV(서열표의 서열 번호: 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 가하여 전량을 50μL로 한 후, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장 반응(72℃) 120초의 조건을 25 사이클 반복하는 것에 의한 PCR 반응 No.3을 실시하였다. PCR 반응 No.3의 반응 종료액 5μL를 이용한 아가로스 전기영동(시그마 사제 타입 VII저융점 아가로스 사용; 아가로스 농도 0.8 중량%)에 의해 DNA 증폭 산물의 분석을 실시한 바, 약 2kb의 증폭 DNA 산물의 존재를 확인할 수 있었다.
계속해서, 아가로스겔로부터 약 2kb의 DNA 단편만을 잘라, 그 아가로스편(약 0.1g)을 잘게 분쇄하여 1mL의 TE 용액에 현탁한 후, 55℃에서 1시간 보온하여 아가로스를 완전하게 융해시켰다. 이 융해액에 대해서 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 실시하여 그 DNA 단편을 정제하고, 최종적으로 10μL의 TE에 용해하였다. 정제한 약 2kb의 증폭 DNA 단편을 제한 효소 EcoRI 및 HindIII에 의해 절단한 후, 이 제한 효소 처리액에 대해서 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 실시해서 그 DNA 단편을 정제하고, 최종적으로 10μL의 TE에 용해하였다.
마찬가지로, EcoRI 및 HindIII에 의해 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 절단하고, 아가로스겔 전기영동(시그마사 제 타입 VII저융점 아가로스 사용；아가로스 농도 0.7%)을 실시하여, 아가로스겔로부터 약 2.7kb의 DNA 단편만을 잘랐다. 자른 아가로스편(약 0.1g)를 잘게 분쇄하여 1mL의 TE용액에 현탁한 후, 55℃에서 1시간 보온하여 아가로스를 완전하게 융해시켰다. 이 융해액에 대해서 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 실시해서 그 DNA 단편을 정제하여, 최종적으로 10μL의 TE에 용해하였다.
이와 같이 해서 얻어진 약 2kbp와 약 2.7kbp의 DNA 단편을 DNA 라이게이션키트(타카라슈조사 제)를 이용하여 연결시킨 후, 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하였다. 그 형질 전환체로부터 추출한 플라스미드를 주형으로 하여, 상기의 조작을, 서열 번호: 9 기재된 프라이머로 바꾸고, 서열 번호: 13 기재된 프라이머를 이용해서 실시하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(3)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(3)를 얻었다.
[참고예 3] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(4)
표 2에서 표시하는 바와 같이 니트릴 히드라타아제를 (bh)의 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(4)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하여, 서열표의 서열 번호 14, 및, 15에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(4)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(4)를 얻었다.
[표 15]
Figure 112011043009518-pct00015
[실시예 2] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(5)
표 3에서 표시하는 바와 같이 니트릴 히드라타아제를 (a) 및 (av)의 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(5)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 1에 기재된 형질 전환체(2)로부터 회수한 플라스미드(2)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 16에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(5)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(5)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하여, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하고, 참고예 1에 기재된 플라스미드(2)에, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다.
이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(5), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(2)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(5)에서는, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(2)에 대하여, 1.65배의 반응초속도의 향상, 및, 1.25배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 3] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(6)
표 3에서 표시하는 바와 같이 니트릴 히드라타아제를 (a) 및 (bc)의 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(6)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 2에 기재된 형질 전환체(3)로부터 회수한 플라스미드(3)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 16에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(6)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(6)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 2에 기재된 플라스미드(3)에, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(6), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(3)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(6)에서는, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(3)에 대해, 1.63배의 반응초속도의 향상, 및, 1.23배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 4] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(7)
표 3에서 표시하는 바와 같이 니트릴 히드라타아제를 (a) 및 (bh)의 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(7)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 3에 기재된 형질 전환체(4)로부터 회수한 플라스미드(4)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 16에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(7)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(7)를 얻었다. 또한 상기균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 3에 기재된 플라스미드(4)에, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(7), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(4)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(7)에서는, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(4)에 대하여, 1.58배의 반응초속도의 향상, 및, 1.30배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 16]
Figure 112011043009518-pct00016
[참고예 4] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(8)
표 4에서 표시하는 바와 같이 니트릴 히드라타아제를 (ak)의 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(8)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 68에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(8)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(8)를 얻었다.
[참고예 5] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(9)
표 4에서 표시하는 바와 같이 (ap)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(9)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 73에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(9)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(9)를 얻었다.
[참고예 6] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(10)
표 4에서 표시하는 바와 같이 (bp)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(10)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 17, 및, 18에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(10)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(10)를 얻었다.
[표 17]
Figure 112011043009518-pct00017
[실시예 5] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(11)
표 5에서 표시하는 바와 같이 (b) 및 (ak)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(11)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 4 기재된 형질 전환체(8)로부터 회수한 플라스미드(8)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 19에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(11)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(11)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 4 기재된 플라스미드(8)에, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(11), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(8)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(11)에서는, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(8)에 대해, 1.45배의 반응초속도의 향상, 및, 1.38배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 6] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(12)
표 5에서 표시하는 바와 같이 (b) 및 (ap)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(12)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 5에 기재된 형질 전환체(9)로부터 회수한 플라스미드(9)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 19에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(12)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(12)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 5에 기재된 플라스미드(9)에, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(12), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(9)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(12)에서는, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(9)에 대해, 1.40배의 반응초속도의 향상, 및, 1.25배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 7] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(13)
표 5에서 표시하는 바와 같이 (b) 및 (bp)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(13)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 6에 기재된 형질 전환체(10)로부터 회수한 플라스미드(10)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 19에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(13)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(13)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 6에 기재된 플라스미드(10)에, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(13), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(10)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(13)에서는, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(10)에 대해, 1.32배의 반응초속도의 향상, 및, 1.35배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 18]
Figure 112011043009518-pct00018
[참고예 7] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(14)
표 6에서 표시하는 바와 같이 (an)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(14)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 71에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(14)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(14)를 얻었다.
[참고예 8] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(15)
표 6에서 표시하는 바와 같이 (be)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(15)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트리르히드라타제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 20, 및, 21에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(15)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(15)를 얻었다.
[참고예 9] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(16)
표 6에서 표시하는 바와 같이 (br)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(16)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 22, 및, 23에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(16)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(16)를 얻었다.
[표 19]
Figure 112011043009518-pct00019
[실시예 8] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(17)
표 7에서 표시하는 바와 같이 (c) 및 (an)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(17)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 7에 기재된 형질 전환체(14)로부터 회수한 플라스미드(14)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 24에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(17)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(17)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 7에 기재된 플라스미드(14)에, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(17), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(14)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(17)에서는, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(14)에 대해, 1.80배의 반응초속도의 향상, 및, 1.25배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 9] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(18)
표 7에서 표시하는 바와 같이 (c) 및 (be)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(18)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 8에 기재된 형질 전환체(15)로부터 회수한 플라스미드(15)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 24에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(18)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(18)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 8에 기재된 플라스미드(15)에, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(18), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(15)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(18)에서는, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(15)에 대해, 1.86배의 반응초속도의 향상, 및, 1.40배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 10] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(19)
표 7에서 표시하는 바와 같이 (c) 및 (br)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(19)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 9에 기재된 형질 전환체(16)로부터 회수한 플라스미드(16)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 24에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(19)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(19)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 9에 기재된 플라스미드(16)에, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질전환체 (19), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(16)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(19)에서는, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(16)에 대해, 1.68배의 반응초속도의 향상, 및, 1.20배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 20]
Figure 112011043009518-pct00020
[참고예 10] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(20)
표 8에서 표시하는 바와 같이 (ar)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(20)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 75에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(20)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(20)를 얻었다.
[참고예 11] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(21)
표 8에서 표시하는 바와 같이 (ax)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(21)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 25, 및, 26에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(21)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(21)를 얻었다.
[참고예 12] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(22)
표 8에서 표시하는 바와 같이 (bd)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(22)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 27, 및, 28에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(22)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(22)를 얻었다.
[표 21]
Figure 112011043009518-pct00021
[실시예 11] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(23)
표 9에서 표시하는 바와 같이 (d) 및 (ar)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(23)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 10에 기재된 형질 전환체(20)로부터 회수한 플라스미드(20)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 29에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(23)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(23)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 10에 기재된 플라스미드(20)에, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(23), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(20)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(23)에서는, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(20)에 대해, 1.25배의 반응초속도의 향상, 및, 1.35배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 12] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(24)
표 9에서 표시하는 바와 같이 (d) 및 (ax)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(24)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 11에 기재된 형질 전환체(21)로부터 회수한 플라스미드(21)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 29에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(24)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(24)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 11에 기재된 플라스미드(21)에, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(24), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(21)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(24)에서는, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(21)에 대해, 1.32배의 반응초속도의 향상, 및, 1.39배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 13] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(25)
표 9에서 표시하는 바와 같이 (d) 및 (bd)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(25)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 12에 기재된 형질 전환체(22)로부터 회수한 플라스미드(22)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 29에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(25)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(19)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 12에 기재된 플라스미드(22)에, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(25), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(22)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
형질 전환체(25)와 형질 전환체(22)의 반응초속도와 열 안정성의 비교의 결과, 형질 전환체(25)에서는, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(22)에 대해, 1.25배의 반응초속도의 향상, 및, 1.25배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 22]
Figure 112011043009518-pct00022
[참고예 13] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(26)
표 10에서 표시하는 바와 같이 (ao)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이한 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(26)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 72에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(26)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(26)를 얻었다.
[참고예 14] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(27)
표 10에서 표시하는 바와 같이 (at)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(27)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 77에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(27)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(27)를 얻었다.
[표 23]
Figure 112011043009518-pct00023
[비교예 1] 니트릴 히드라타아제 활성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(28)
표 11에서 표시하는 바와 같이 β 서브유닛의 8번째 및 (ao)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(28)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 13에 기재된 형질 전환체(26)로부터 회수한 플라스미드(26)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 30에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(28)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(28)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 13애 기재된 플라스미드(26)에, β 서브유닛의 8번째의 Gly를 Ala로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(28), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(26)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 비교의 결과, 형질 전환체(28)에서는, β 서브유닛의 8번째의 Gly를 Ala로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(26)에 대해, 1.35배의 반응초속도의 향상, 및, 0.65배의 열 안정성의 저하를 볼 수 있었다.
[비교예 2] 니트릴 히드라타아제 활성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(29)
표 11에서 표시하는 바와 같이 β 서브유닛의 8번째 및 (at)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(29)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 14에 기재된 형질 전환체(27)로부터 회수한 플라스미드(27)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 30에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(29)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(29)를 얻었다. 또한 상기균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 14에 기재된 플라스미드(27)에, β 서브유닛의 8번째의 Gly를 Ala로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(29), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(27)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(29)에서는, β 서브유닛의 8번째의 Gly를 Ala로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(27)에 대해, 1.40배의 반응초속도의 향상, 및, O.31배의 열 안정성의 저하를 볼 수 있었다.
[비교예 3] 니트릴 히드라타아제 활성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(30)
표 11에서 표시하는 바와 같이 β 서브유닛의 8번째 및 (br)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(30)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 9에 기재된 형질 전환체(16)로부터 회수한 플라스미드(16)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 30에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(30)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(30)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 9에 기재된 플라스미드(16)에, β 서브유닛의 8번째의 Gly를 Ala로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(30), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(16)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(30)에서는, β 서브유닛의 8번째의 Gly를 Ala로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(16)에 대해, 1.32배의 반응초속도의 향상, 및, O.52배의 열 안정성의 저하를 볼 수 있었다.
[표 24]
Figure 112011043009518-pct00024
[참고예 15] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(31)
표 12에서 표시하는 바와 같이 (au)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(31)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 78에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(31)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(31)를 얻었다.
[참고예 16] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(32)
표 12에서 표시하는 바와 같이 (bf)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(32)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 31, 및, 32에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(32)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(32)를 얻었다.
[표 25]
Figure 112011043009518-pct00025
[실시예 14] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(33)
표 13에서 표시하는 바와 같이 (f) 및 (au)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(33)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 15에 기재된 형질 전환체(31)로부터 회수한 플라스미드(31)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 33에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(33)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(33)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 15에 기재된 플라스미드(31)에, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(33), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(31)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(33)에서는, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(31)에 대해, 1.29배의 반응초속도의 향상, 및, 1.82배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 15] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(34)
표 13에서 표시하는 바와 같이 (f) 및 (bf)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(34)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 16에 기재된 형질 전환체(32)로부터 회수한 플라스미드(32)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 33에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(34)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(34)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 16에 기재된 플라스미드(32)에, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(34), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(32)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(34)에서는, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(32)에 대해, 1.25배의 반응초속도의 향상, 및, 1.76배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 16] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(35)
표 13에서 표시하는 바와 같이 (f) 및 (bp)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(35)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 6에 기재된 형질 전환체(10)로부터 회수한 플라스미드(10)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 33에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(35)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(35)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 6에 기재된 플라스미드(10)에, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(35), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(10)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(35)에서는, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(10)에 대해, 1.30배의 반응초속도의 향상, 및, 1.72배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 26]
Figure 112011043009518-pct00026
[참고예 17] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(36)
표 14에서 표시하는 바와 같이 (aa)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(36)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 58에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(36)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(36)를 얻었다.
[참고예 18] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(37)
표 14에서 표시하는 바와 같이 (ah)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(37)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 65에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(37)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(37)를 얻었다.
[참고예 19] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(38)
표 14에서 표시하는 바와 같이 (aq)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(38)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 74에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(38)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(38)를 얻었다.
[표 27]
Figure 112011043009518-pct00027
[실시예 17] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(39)
표 15에서 표시하는 바와 같이 (g) 및 (aa)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(39)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 17에 기재된 형질 전환체(36)로부터 회수한 플라스미드(36)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 34에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(39)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(39)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 17에 기재된 플라스미드(36)에, β 서브유닛의 96번째의 Gln을 Arg로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(39), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(36)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(39)에서는, β 서브유닛의 96번째의 Gln을 Arg로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(36)에 대해, 1.33배의 반응초속도의 향상, 및, 1.25배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 18] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(40)
표 15에서 표시하는 바와 같이 (g) 및 (ah)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(40)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 18에 기재된 형질 전환체(37)로부터 회수한 플라스미드(37)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 34에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(40)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(40)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 18에 기재된 플라스미드(37)에, β 서브유닛의 96번째의 Gln을 Arg로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(40), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(37)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(40)에서는, β 서브유닛의 96번째의 Gln을 Arg로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(37)에 대해, 1.25배의 반응초속도의 향상, 및, 1.36배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 19] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(41)
표 15에서 표시하는 바와 같이 (g) 및 (aq)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(41)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 19에 기재된 형질 전환체(38)로부터 회수한 플라스미드(38)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 34에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(41)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(41)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 19에 기재된 플라스미드(38)에, β 서브유닛의 96번째의 Gln을 Arg로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(41), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(38)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(41)에서는, β 서브유닛의 96번째의 Gln을 Arg로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(38)에 대해, 1.35배의 반응초속도의 향상, 및, 1.42배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 28]
Figure 112011043009518-pct00028
[참고예 20] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(42)
표 16에서 표시하는 바와 같이 (ae)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(42)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 62에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(42)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(42)를 얻었다.
[참고예 21] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(43)
표 16에서 표시하는 바와 같이(bk)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(43)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 35, 및, 36에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(43)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(43)를 얻었다.
[표 29]
Figure 112011043009518-pct00029
[실시예 20] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(44)
표 17에서 표시하는 바와 같이 (h) 및 (ae)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(44)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 20에 기재된 형질 전환체(42)로부터 회수한 플라스미드(42)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 37에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(44)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(44)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 20에 기재된 플라스미드(42)에, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(44), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(42)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(44)에서는, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(42)에 대해, 1.34배의 반응초속도의 향상, 및, 2.25배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 21] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(45)
표 17에서 표시하는 바와 같이 (h) 및 (au)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(45)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 15에 기재된 형질 전환체(31)로부터 회수한 플라스미드(31)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호：68에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(45)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(45)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 15에 기재된 플라스미드(31)에, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(45), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(31)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(45)에서는, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(31)에 대해, 1.40배의 반응초속도의 향상, 및, 2.12배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 22] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(46)
표 17에서 표시하는 바와 같이 (h) 및 (bk)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(46)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 21에 기재된 형질 전환체(43)로부터 회수한 플라스미드(43)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 37에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(46)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(46)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 21에 기재된 플라스미드(43)에, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(46), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(43)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(46)에서는, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(43)에 대해, 1.32배의 반응초속도의 향상, 및, 2.40배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 30]
Figure 112011043009518-pct00030
[실시예 23] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(47)
표 18에서 표시하는 바와 같이 (i) 및 (aa)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(47)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 17에 기재된 형질 전환체(36)로부터 회수한 플라스미드(36)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 38에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(47)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(47)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 17에 기재된 플라스미드(36)에, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(47), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(36)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(47)에서는, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(36)에 대해, 1.26배의 반응초속도의 향상, 및, 1.29배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 24] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(48)
표 18에서 표시하는 바와 같이 (i) 및 (ak)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(48)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 4에 기재된 형질 전환체(8)로부터 회수한 플라스미드(8)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 38에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(48)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(48)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 4에 기재된 플라스미드(8)에, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(48), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(8)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(48)에서는, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(8)에 대해, 1.35배의 반응초속도의 향상, 및, 1.27배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 25] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(49)
표 18에서 표시하는 바와 같이 (i) 및 (be)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이하는 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(49)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 8에 기재된 형질 전환체(15)로부터 회수한 플라스미드(15)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 38에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 방법에 의해, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(49)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(49)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 8에 기재된 플라스미드(15)에, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(49), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(15)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(49)에서는, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(15)에 대해, 1.25배의 반응초속도의 향상, 및, 1.30배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 31]
Figure 112011043009518-pct00031
[참고예 22] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(50)
표 19에서 표시하는 바와 같이 (af)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(50)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 63에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(50)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(50)를 얻었다.
[참고예 23] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(51)
표 19에서 표시하는 바와 같이 (bq)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 39, 및, 40에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(51)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(51)를 얻었다.
[참고예 24] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(52)
표 19에서 표시하는 바와 같이 (bj)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(52)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 41, 및, 42에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(52)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(52)를 얻었다.
[표 32]
Figure 112011043009518-pct00032
[실시예 26] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(53)
표 20에서 표시하는 바와 같이 (m-1) 및 (af)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(53)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 22에 기재된 형질 전환체(50)로부터 회수한 플라스미드(50)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 43, 및, 19에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(53)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(53)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 22에 기재된 플라스미드(50)에, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(53), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(50)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(53)에서는, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(50)에 대해, 1.67배의 반응초속도의 향상과 1.45배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 27] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(54)
표 20에서 표시하는 바와 같이 (m-1) 및 (bq)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(54)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 23에 기재된 형질 전환체(51)로부터 회수한 플라스미드(51)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 43, 및, 19에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(54)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(54)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 23에 기재된 플라스미드(51)에, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(54), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(51)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(54)에서는, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(51)에 대해, 1.59배의 반응초속도의 향상, 및, 1.32배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 28] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(55)
표 20에서 표시하는 바와 같이 (m-1) 및 (bj)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(55)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 24에 기재된 형질 전환체(52)로부터 회수한 플라스미드(52)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 43, 및, 19에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(55)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(55)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 24에 기재된 플라스미드(52)에, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해 얻어진 형질 전환체(55), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(52)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(55)에서는, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(52)에 대해, 1.62배의 반응초속도의 향상, 및, 1.26배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 33]
Figure 112011043009518-pct00033
[참고예 25] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(56)
표 21에서 표시하는 바와 같이 (am)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(56)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 70에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(56)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(56)를 얻었다.
[참고예 26] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(57)
표 21에서 표시하는 바와 같이 (ay)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(57)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 44, 및, 45에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(57)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(57)를 얻었다.
[표 34]
Figure 112011043009518-pct00034
[실시예 29] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(58)
표 22에서 표시하는 바와 같이 (m-2) 및 (am)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(58)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 25에 기재된 형질 전환체(56)로부터 회수한 플라스미드(56)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 43, 및, 34에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(58)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(58)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 25에 기재된 플라스미드(56)에, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, β 서브유닛의 96번째의 Gln을 Arg로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(58), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(56)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(58)에서는, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, β 서브유닛의 96번째의 Gln을 Arg로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(56)에 대해, 1.53배의 반응초속도의 향상, 및, 1.32배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 30] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(59)
표 22에서 표시하는 바와 같이 (m-2) 및 (at)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(59)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 14에 기재된 형질 전환체(27)로부터 회수한 플라스미드(27)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 43, 및, 34에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(59)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(59)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 14에 기재된 플라스미드(27)에, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, β 서브유닛의 96번째의 Gln을 Arg로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(59), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(27)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(59)에서는, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, β 서브유닛의 96번째의 Gln을 Arg로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(27)에 대해, 1.49배의 반응초속도의 향상, 및, 1.28배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 31] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(60)
표 22에서 표시하는 바와 같이 (m-2) 및 (ay)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(60)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 26에 기재된 형질 전환체(57)로부터 회수한 플라스미드(57)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 43, 및, 34에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(60)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(60)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 26에 기재된 플라스미드(57)에, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, β 서브유닛의 96번째의 Gln을 Arg로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(60), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(57)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(60)에서는, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, β 서브유닛의 96번째의 Gln을 Arg로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(57)에 대해, 1.39배의 반응초속도의 향상, 및, 1.45배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 35]
Figure 112011043009518-pct00035
[실시예 32] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(61)
표 23에서 표시하는 바와 같이 (n-1) 및 (af)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(61)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 22에 기재된 형질 전환체(50)로부터 회수한 플라스미드(50)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 46, 및, 19에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(61)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(61)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 22에 기재된 플라스미드(50)에, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(61), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(50)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(61)에서는, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(50)에 대해, 1.65배의 반응초속도의 향상, 및, 1.36배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 33] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(62)
표 23에서 표시하는 바와 같이 (n-1) 및 (ao)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이한 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(62)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 13에 기재된 형질 전환체(26)로부터 회수한 플라스미드(26)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 46, 및, 19에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(62)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(62)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 13에 기재된 플라스미드(26)에, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(62), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(26)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(62)에서는, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(26)에 대해, 1.72배의 반응초속도의 향상, 및, 1.47배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 34] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(63)
표 23에서 표시하는 바와 같이 (n-1) 및 (ax)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(63)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 11에 기재된 형질 전환체(21)로부터 회수한 플라스미드(21)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 46, 및, 19에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(63)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(63)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 11에 기재된 플라스미드(21)에, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(63), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(21)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(63)에서는, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, α 서브유닛의 94번째의 Met를 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(21)에 대해, 1.55배의 반응초속도의 향상, 및, 1.27배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 36]
Figure 112011043009518-pct00036
[참고예 27] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(64)
표 24에서 표시하는 바와 같이 (aj)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(64)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 67에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(64)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(64)를 얻었다.
[참고예 28] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(65)
표 24에서 표시하는 바와 같이 (as)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(65)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 76에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(65)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(65)를 얻었다.
[참고예 29] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(66)
표 24에서 표시하는 바와 같이 (bb)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(66)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 47, 및, 48에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(66)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(66)를 얻었다.
[표 37]
Figure 112011043009518-pct00037
[실시예 35] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(67)
표 25에서 표시하는 바와 같이 (n-2) 및 (aj)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(67)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 27에 기재된 형질 전환체(64)로부터 회수한 플라스미드(64)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 46, 및, 68에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(67)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(67)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀀서에서 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 27에 기재된 플라스미드(64)에, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(67), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(64)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(67)에서는, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(64)에 대해, 1.53배의 반응초속도의 향상, 및, 2.23배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 36] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(68)
표 25에서 표시하는 바와 같이 (n-2) 및 (as)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(68)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 28에 기재된 형질 전환체(65)로부터 회수한 플라스미드(65)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 46, 및, 37에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(68)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(68)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 28 기재된 플라스미드(65)에, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(68), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(65)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(68)에서는, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(65)에 대해, 1.55배의 반응초속도의 향상, 및, 2.15배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 37] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(69)
표 25에서 표시하는 바와 같이 (n-2) 및 (bb)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(69)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 29에 기재된 형질 전환체(66)로부터 회수한 플라스미드(66)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 46, 및, 37에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(69)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(69)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 29에 기재된 플라스미드(66)에, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(69), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(66)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(69)에서는, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(66)에 대해, 1.46배의 반응초속도의 향상, 및, 1.92배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 38]
Figure 112011043009518-pct00038
[참고예 30] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(70)
표 26에서 표시하는 바와 같이 (al)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(70)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 69에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(70)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(70)를 얻었다.
[참고예 31] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(71)
표 26에서 표시하는 바와 같이 (aw)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(71)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 80에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(71)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(71)를 얻었다.
[참고예 32] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(72)
표 26에서 표시하는 바와 같이 (bl)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(72)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 49, 및, 50에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(72)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(72)를 얻었다.
[표 39]
Figure 112011043009518-pct00039
[실시예 38] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(73)
표 27에서 표시하는 바와 같이 (q) 및 (al)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(73)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 30에 기재된 형질 전환체(70)로부터 회수한 플라스미드(70)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 16, 및, 38에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(73)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(73)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀀서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 30에 기재된 플라스미드(70)에, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(73), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(70)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(73)에서는, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(70)에 대해, 2.00배의 반응초속도의 향상, 및, 1.52배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 39] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(74)
표 27에서 표시하는 바와 같이 (q) 및 (aw)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(74)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 31에 기재된 형질 전환체(71)로부터 회수한 플라스미드(71)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 16, 및, 38에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(74)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(74)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 31에 기재된 플라스미드(71)에, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(74), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(71)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(74)에서는, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(71)에 대해, 1.78배의 반응초속도의 향상, 및, 1.44배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 40] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(75)
표 27에서 표시하는 바와 같이 (q) 및 (bl)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(75)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 32에 기재된 형질 전환체(72)로부터 회수한 플라스미드(72)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 16, 및, 38에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(75)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(75)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 32에 기재된 플라스미드(72)에, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(75), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(72)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(75)에서는, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(72)에 대해, 1.85배의 반응초속도의 향상, 및, 1.38배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 40]
Figure 112011043009518-pct00040
[참고예 33] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(76)
표 28에서 표시하는 바와 같이 (bi)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(76)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 51, 및, 52에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(76)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(76)를 얻었다.
[참고예 34] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(77)
표 28에서 표시하는 바와 같이 (bm)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(77)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 53, 및, 54에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(77)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(77)를 얻었다.
[표 41]
Figure 112011043009518-pct00041
[실시예 41] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(78)
표 29에서 표시하는 바와 같이 (o) 및 (an)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(78)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 7에 기재된 형질 전환체(14)로부터 회수한 플라스미드(14)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 29, 및, 33에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(78)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(78)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 7에 기재된 플라스미드(14)에, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met, 및, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(78), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(14)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(78)에서는, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met, 및, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(14)에 대해, 1.60배의 반응초속도의 향상, 및, 1.46배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 42] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(79)
표 29에서 표시하는 바와 같이 (o) 및 (bi)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(79)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 33에 기재된 형질 전환체(76)로부터 회수한 플라스미드(76)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 29, 및, 33에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(79)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(79)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 33에 기재된 플라스미드(76)에, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met, 및, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(79), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(76)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(79)에서는, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met, 및, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(76)에 대해, 1.38배의 반응초속도의 향상, 및, 1.35배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 43] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(80)
표 29에서 표시하는 바와 같이 (o) 및 (bm)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(80)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 34에 기재된 형질 전환체(77)로부터 회수한 플라스미드(77)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 29, 및, 33에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(80)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(80)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 34 기재된 플라스미드(77)에, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met, 및, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(80), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(77)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(80)에서는, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met, 및, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(77)에 대해, 1.52배의 반응초속도의 향상, 및, 1.28배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 42]
Figure 112011043009518-pct00042
[참고예 35] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(81)
표 30에서 표시하는 바와 같이 (ag)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(81)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 64에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(81)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(81)를 얻었다.
[참고예 36] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(82)
표 30에서 표시하는 바와 같이 (ai)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(82)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 66에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(82)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(82)를 얻었다.
[표 43]
Figure 112011043009518-pct00043
[실시예 44] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(83)
표 31에서 표시하는 바와 같이 (p) 및 (ag)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(83)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 35에 기재된 형질 전환체(81)로부터 회수한 플라스미드(81)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 33, 및, 60에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(83)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(83)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 35에 기재된 플라스미드(81)에, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(83), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(81)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(83)에서는, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(81)에 대해, 1.25배의 반응초속도의 향상, 및, 2.16배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 45] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(84)
표 31에서 표시하는 바와 같이 (p) 및 (ai)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(84)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 36에 기재된 형질 전환체(82)로부터 회수한 플라스미드(82)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 33, 및, 60에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(84)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(84)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 36에 기재된 플라스미드(82)에, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(84), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(82)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(84)에서는, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(82)에 대해, 1.27배의 반응초속도의 향상, 및, 2.10배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 46] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(85)
표 31에서 표시하는 바와 같이 (p) 및 (aq)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(85)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 19에 기재된 형질 전환체(38)로부터 회수한 플라스미드(38)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 33, 및, 60에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(85)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(85)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 31에 기재된 플라스미드(38)에, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(85), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(38)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(85)에서는, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(38)에 대해, 1.33배의 반응초속도의 향상, 및, 2.52배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 44]
Figure 112011043009518-pct00044
[참고예 37] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(86)
표 32에서 표시하는 바와 같이 (ad)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(86)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 61에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(86)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(86)를 얻었다.
[참고예 38] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(87)
표 32에서 표시하는 바와 같이 (bg)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(87)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 55, 및, 56에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(87)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(87)를 얻었다.
[표 45]
Figure 112011043009518-pct00045
[실시예 47] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(88)
표 33에서 표시하는 바와 같이 (j) 및 (ad)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(88)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 37에 기재된 형질 전환체(86)로부터 회수한 플라스미드(86)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 57, 및, 58에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(88)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(88)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 37에 기재된 플라스미드(86)에, β 서브유닛의 110번째의 Glu를 Asn, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(88), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(86)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(88)에서는, β 서브유닛의 110번째의 Glu를 Asn, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(86)에 대해, 1.29배의 반응초속도의 향상, 및, 1.62배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 48] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(89)
표 33에서 표시하는 바와 같이 (j) 및 (aj)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(89)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 27에 기재된 형질 전환체(64)로부터 회수한 플라스미드(64)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 57, 및, 58에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(89)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(89)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 27에 기재된 플라스미드(64)에, β 서브유닛의 110번째의 Glu를 Asn, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(89), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(64)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(89)에서는, β 서브유닛의 110번째의 Glu를 Asn, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(64)에 대해, 1.34배의 반응초속도의 향상, 및, 1.83배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 49] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(90)
표 33에서 표시하는 바와 같이 (j) 및 (bg)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(90)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 38에 기재된 형질 전환체(87)로부터 회수한 플라스미드(87)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 57, 및, 58에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(90)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(90)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 38 기재된 플라스미드(87)에, β 서브유닛의 110번째의 Glu를 Asn, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(90), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(87)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(90)에서는, β 서브유닛의 110번째의 Glu를 Asn, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(87)에 대해, 1.25배의 반응초속도의 향상, 및, 1.46배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 46]
Figure 112011043009518-pct00046
[실시예 50] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(91)
표 34에서 표시하는 바와 같이 (k) 및 (ad)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(91)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 37에 기재된 형질 전환체(86)로부터 회수한 플라스미드(86)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 59, 및, 60에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(91)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(91)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 37에 기재된 플라스미드(86)에, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(91), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(86)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(91)에서는, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(86)에 대해, 1.44배의 반응초속도의 향상, 및, 1.42배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 51] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(92)
표 34에서 표시하는 바와 같이 (k) 및 (as)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(92)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 28에 기재된 형질 전환체(65)로부터 회수한 플라스미드(65)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 59, 및, 60에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(92)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(92)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 28에 기재된 플라스미드(65)에, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(92), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(65)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(92)에서는, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(65)에 대해, 1.48배의 반응초속도의 향상, 및, 1.39배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 52] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(93)
표 34에서 표시하는 바와 같이 (k) 및 (av)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(93)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 1에 기재된 형질 전환체(2)로부터 회수한 플라스미드(2)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 59, 및, 60에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(93)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(93)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 1에 기재된 플라스미드(2)에, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(93), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(2)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(93)에서는, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(2)에 대해, 1.36배의 반응초속도의 향상, 및, 1.52배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 47]
Figure 112011043009518-pct00047
[참고예 39] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(94)
표 35에서 표시하는 바와 같이 (bo)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(94)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 61, 및, 62에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(94)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(94)를 얻었다.
[표 48]
Figure 112011043009518-pct00048
[실시예 53] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(95)
표 36에서 표시하는 바와 같이 (l) 및 (ag)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(95)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 35에 기재된 형질 전환체(81)로부터 회수한 플라스미드(81)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 43, 46, 및, 57에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(95)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(95)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 35에 기재된 플라스미드(81)에, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, β 서브유닛의 110번째의 Glu를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(95), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(81)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(95)에서는, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및,α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, β 서브유닛의 110번째의 Glu를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(81)에 대해, 1.53배의 반응초속도의 향상, 및, 1.76배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 54] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(96)
표 36에서 표시하는 바와 같이 (l) 및 (am)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(96)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 25에 기재된 형질 전환체(56)로부터 회수한 플라스미드(56)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 43, 46, 및, 57에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(96)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(96)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 25에 기재된 플라스미드(56)에, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, β 서브유닛의 110번째의 Glu를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(96), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(56)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(96)에서는, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, β 서브유닛의 110번째의 Glu를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(56)에 대해, 1.49배의 반응초속도의 향상, 및, 1.69배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 55] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(97)
표 36에서 표시하는 바와 같이 (l) 및 (bo)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(97)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 39에 기재된 형질 전환체(94)로부터 회수한 플라스미드(94)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 43, 46, 및, 57에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(97)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(97)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 39에 기재된 플라스미드(94)에, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, β 서브유닛의 110번째의 Glu를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(97), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(94)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(97)에서는, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, α 서브유닛의 27번째의 Met를 Ile, 및, β 서브유닛의 110번째의 Glu를 Asn로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(94)에 대해, 1.37배의 반응초속도의 향상, 및, 1.83배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 49]
Figure 112011043009518-pct00049
[참고예 40] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(98)
표 37에서 표시하는 바와 같이 (ab)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(98)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 59에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(98)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(98)를 얻었다.
[표 50]
Figure 112011043009518-pct00050
[실시예 56] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(99)
표 38에서 표시하는 바와 같이 (r) 및 (ab)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(99)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 40에 기재된 형질 전환체(98)로부터 회수한 플라스미드(98)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 43, 59, 및, 38에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(99)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(99)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 40에 기재된 플라스미드(98)에, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(99), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(98)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(99)에서는, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(98)에 대해, 1.85배의 반응초속도의 향상, 및, 1.36배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 57] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(100)
표 38에서 표시하는 바와 같이 (r) 및 (ai)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(100)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 36에 기재된 형질 전환체(82)로부터 회수한 플라스미드(82)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 43, 59, 및, 38에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(100)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(100)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 36 기재된 플라스미드(82)에, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(100), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(82)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(100)에서는, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(82)에 대해, 1.72배의 반응초속도의 향상, 및, 1.42배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 58] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(101)
표 38에서 표시하는 바와 같이 (r) 및 (bh)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(101)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 3에 기재된 형질 전환체(4)로부터 회수한 플라스미드(4)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 43, 59, 및, 38에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(101)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(101)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 3에 기재된 플라스미드(4)에, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(101), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(4)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(101)에서는, α 서브유닛의 13번째의 Ile를 Leu, 및, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(4)에 대해, 1.65배의 반응초속도의 향상, 및, 1.29배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 51]
Figure 112011043009518-pct00051
[참고예 41] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(102)
표 39에서 표시하는 바와 같이 (ac)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(102)를 취득하기 위해서, 특허문헌 2의 실시예 60에 기재된 플라스미드를 주형으로 하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 리보솜 결합 서열을 개변하여, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(102)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(102)를 얻었다.
[표 52]
Figure 112011043009518-pct00052
[실시예 59] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(103)
표 40에서 표시하는 바와 같이 (s) 및 (ab)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(103)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 40에 기재된 형질 전환체(98)로부터 회수한 플라스미드(98)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 16, 29, 및, 59에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(103)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(103)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 40에 기재된 플라스미드(98)에, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, 및, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met, 및, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(103), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(98)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(103)에서는, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, 및, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met, 및, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(98)에 대해, 2.50배의 반응초속도의 향상, 및, 1.57배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 60] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(104)
표 40에서 표시하는 바와 같이 (s) 및 (ah)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(104)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 18 기재된 형질 전환체(37)로부터 회수한 플라스미드(37)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 16, 29, 및, 59에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(104)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(104)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 18 기재된 플라스미드(37)에, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, 및, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met, 및, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(104), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(37)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(104)에서는, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, 및, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met, 및, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(37)에 대해, 1.82배의 반응초속도의 향상, 및, 1.41배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 61] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(105)
표 40에서 표시하는 바와 같이 (s) 및 (ac)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(105)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 41에 기재된 형질 전환체(102)로부터 회수한 플라스미드(102)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 16, 29, 및, 59에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(105)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(105)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 41에 기재된 플라스미드(102)에, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, 및, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met, 및, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(105), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(102)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(105)에서는, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, 및, β 서브유닛의 4번째의 Val을 Met, 및, β 서브유닛의 206번째의 Pro를 Leu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(102)에 대해, 1.67배의 반응초속도의 향상, 및, 1.61배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 53]
Figure 112011043009518-pct00053
[참고예 42] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(106)
표 41에서 표시하는 바와 같이 (az)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(106)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 65, 및, 53에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(106)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(106)를 얻었다.
[표 54]
Figure 112011043009518-pct00054
[실시예 62] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(107)
표 42에서 표시하는 바와 같이 (t) 및 (ac)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(107)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 41에 기재된 형질 전환체(102)로부터 회수한 플라스미드(102)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 24, 37, 및, 60에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(107)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(107)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 41에 기재된 플라스미드(102)에, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys, 및, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(107), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(102)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(107)에서는, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys, 및, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(102)에 대해, 2.11배의 반응초속도의 향상, 및, 1.88배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 63] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(108)
표 42에서 표시하는 바와 같이 (t) 및 (al)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(108)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 30에 기재된 형질 전환체(70)로부터 회수한 플라스미드(70)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 24, 37, 및, 60에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(108)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(108)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 30에 기재된 플라스미드(70)에, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys, 및, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(108), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(70)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(108)에서는, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys, 및, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(70)에 대해, 1.98배의 반응초속도의 향상, 및, 2.34배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 64] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(109)
표 42에서 표시하는 바와 같이 (t) 및 (az)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(109)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 42에 기재된 형질 전환체(106)로부터 회수한 플라스미드(106)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 24, 37, 및, 60에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(109)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(109)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 43에 기재된 플라스미드(106)에, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys, 및, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(109), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(106)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(109)에서는, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys, 및, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(106)에 대해, 2.05배의 반응초속도의 향상, 및, 1.62배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 55]
Figure 112011043009518-pct00055
[참고예 43] 니트릴 히드라타아제 활성을 유지한 아미노산 치환체의 취득(110)
표 43에서 표시하는 바와 같이 (ba)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(110)를 취득하기 위해서, 상기 참고예 2에 기재된 변이 도입 키트를 이용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시하였다. 실시예 1에 기재된 리보솜 결합 서열을 개변한 니트릴 히드라타아제 발현 플라스미드(1)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 66, 및, 67에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(110)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(110)를 얻었다.
[표 56]
Figure 112011043009518-pct00056
[실시예 65] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(111)
표 44에서 표시하는 바와 같이 (u) 및 (aq)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(111)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 19에 기재된 형질 전환체(38)로부터 회수한 플라스미드(38)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 33, 및, 69에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(111)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(111)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 19에 기재된 플라스미드(38)에, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(111), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(38)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(111)에서는, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(38)에 대해, 1.46배의 반응초속도의 향상, 및, 1.43배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 66] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(112)
표 44에서 표시하는 바와 같이 (u) 및 (ap)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(112)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 5에 기재된 형질 전환체(9)로부터 회수한 플라스미드(9)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 33, 및, 69에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(112)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(112)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 5에 기재된 플라스미드(9)에, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(112), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(9)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(112)에서는, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(9)에 대해, 1.42배의 반응초속도의 향상, 및, 1.66배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 67] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(113)
표 44에서 표시하는 바와 같이 (u) 및 (ba)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(113)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 43에 기재된 형질 전환체(110)로부터 회수한 플라스미드(110)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 33, 및, 69에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(113)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(113)를 얻었다. 또한 상기균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 43에 기재된 플라스미드(110)에, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(113), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(110)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(113)에서는, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(110)에 대해, 1.39배의 반응초속도의 향상, 및, 1.38배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 57]
Figure 112011043009518-pct00057
[실시예 68] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(114)
표 45에서 표시하는 바와 같이 (v) 및 (al)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(114)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 30에 기재된 형질 전환체(70)로부터 회수한 플라스미드(70)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 16, 38, 및, 70에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(114)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(114)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 30에 기재된 플라스미드(70)에, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, β 서브유닛의 24번째의 Val을 Ile, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(114), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(70)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(114)에서는, α 서브유닛의 92번째의 Asp를 Glu, β 서브유닛의 24번째의 Val을 Ile, 및, β 서브유닛의 226번째의 Val을 Ile로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(70)에 대해, 2.43배의 반응초속도의 향상, 및, 1.63배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 58]
Figure 112011043009518-pct00058
[실시예 69] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(115)
표 46에서 표시하는 바와 같이 (w) 및 (al)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(115)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 30에 기재된 형질 전환체(70)로부터 회수한 플라스미드(70)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 24, 37, 60및, 70에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(115)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(115)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 30에 기재된 플라스미드(70)에, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys, β 서브유닛의 24번째의 Val을 Ile, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(115), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(70)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(115)에서는, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys, β 서브유닛의 24번째의 Val을 Ile, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(70)에 대해, 2.23배의 반응초속도의 향상, 및, 2.51배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[실시예 70] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(116)
표 46에서 표시하는 바와 같이 (w) 및 (az)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(116)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 42에 기재된 형질 전환체(106)로부터 회수한 플라스미드(106)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 24, 37, 60, 및, 70에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(116)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(116)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 42에 기재된 플라스미드(106)에, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys, β 서브유닛의 24번째의 Val을 Ile, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(116), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(106)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(116)에서는, α 서브유닛의 197번째의 Gly를 Cys, β 서브유닛의 24번째의 Val을 Ile, β 서브유닛의 107번째의 Pro를 Met, 및, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(106)에 대해, 2.35배의 반응초속도의 향상, 및, 1.87배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 59]
Figure 112011043009518-pct00059
[실시예 71] 니트릴 히드라타아제 활성 및 열 안정성이 향상된 아미노산 치환체의 취득(117)
표 47에서 표시하는 바와 같이 (x) 및 (aq)의 아미노산 치환 위치에서 니트릴 히드라타아제를 변이시킨 니트릴 히드라타아제 변이체를 발현하는 형질 전환체(117)를 취득하기 위해서, 상기의 참고예 19에 기재된 형질 전환체(38)로부터 회수한 플라스미드(38)를 주형으로 하고, 서열표의 서열 번호: 33, 69, 및 70에 기재된 프라이머를 이용하여 참고예 2에 기재된 방법을 변이점마다 반복함으로써, 상기 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 플라스미드(117)를 제작하였다. 그 플라스미드로 대장균 HB101의 컴피텐트셀(토요보세키사 제)을 형질 전환하여, 형질 전환체(117)를 얻었다. 또한 상기균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 니트릴 히드라타아제 유전자 부분의 염기 서열을 결정하여, 참고예 19에 기재된 플라스미드(38)에, β 서브유닛의 24번째의 Val을 Ile, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가된 목적대로의 서열을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체(117), 및, 그 베이스가 된 형질 전환체(38)를 이용한 아미드 화합물의 제조에 있어서의 반응초속도, 및 열 안정성을 실시예 1에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 비교하였다.
그 결과, 형질 전환체(117)에서는, β 서브유닛의 24번째의 Val을 Ile, β 서브유닛의 79번째의 His를 Asn, β 서브유닛의 230번째의 Ala를 Glu, 및, β 서브유닛의 231번째의 Ala를 Val로 하는 변이가 새롭게 추가됨으로써, 형질 전환체(38)에 대해, 1.73배의 반응초속도의 향상, 및, 1.50배의 열 안정성의 향상을 볼 수 있었다.
[표 60]
Figure 112011043009518-pct00060
독립 행정법인 산업기술 총합 연구소 특허 생물 기탁 센터 IPODFERMBP-5785 19960207
SEQUENCE LISTING <110> MITSUI CHEMICALS, INC. <120> Novel nitrile hydratase <130> P000900008 <150> JP2008-292819 <151> 2008-11-14 <160> 70 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 205 <212> PRT <213> Pseudonocardia thermophila <400> 1 Met Thr Glu Asn Ile Leu Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu 1 5 10 15 Ile Thr Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly 20 25 30 Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn 35 40 45 Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr 50 55 60 Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys 65 70 75 80 Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val 85 90 95 Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser 100 105 110 Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Phe Lys Glu 115 120 125 Pro Gln Tyr Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys 130 135 140 Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp 145 150 155 160 Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala 165 170 175 Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg 180 185 190 Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val Ala 195 200 205 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Pseudonocardia thermophila <400> 2 Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala 225 230 <210> 3 <211> 618 <212> DNA <213> Pseudonocardia thermophila <400> 3 atgaccgaga acatcctgcg caagtcggac gaggagatcc agaaggagat cacggcgcgg 60 gtcaaggccc tggagtcgat gctcatcgaa cagggcatcc tcaccacgtc gatgatcgac 120 cggatggccg agatctacga gaacgaggtc ggcccgcacc tcggcgcgaa ggtcgtcgtg 180 aaggcctgga ccgacccgga gttcaagaag cgtctgctcg ccgacggcac cgaggcctgc 240 aaggagctcg gcatcggcgg cctgcagggc gaggacatga tgtgggtgga gaacaccgac 300 gaggtccacc acgtcgtcgt gtgcacgctc tgctcctgct acccgtggcc ggtgctgggg 360 ctgccgccga actggttcaa ggagccgcag taccgctccc gcgtggtgcg tgagccccgg 420 cagctgctca aggaggagtt cggcttcgag gtcccgccga gcaaggagat caaggtctgg 480 gactccagct ccgagatgcg cttcgtcgtc ctcccgcagc gccccgcggg caccgacggg 540 tggagcgagg aggagctcgc caccctcgtc acccgcgagt cgatgatcgg cgtcgaaccg 600 gcgaaggcgg tcgcgtga 618 <210> 4 <211> 702 <212> DNA <213> Pseudonocardia thermophila <400> 4 atgaacggcg tgtacgacgt cggcggcacc gatgggctgg gcccgatcaa ccggcccgcg 60 gacgaaccgg tcttccgcgc cgagtgggag aaggtcgcgt tcgcgatgtt cccggcgacg 120 ttccgggccg gcttcatggg cctggacgag ttccggttcg gcatcgagca gatgaacccg 180 gccgagtacc tcgagtcgcc gtactactgg cactggatcc gcacctacat ccaccacggc 240 gtccgcaccg gcaagatcga tctcgaggag ctggagcgcc gcacgcagta ctaccgggag 300 aaccccgacg ccccgctgcc cgagcacgag cagaagccgg agttgatcga gttcgtcaac 360 caggccgtct acggcgggct gcccgcaagc cgggaggtcg accgaccgcc caagttcaag 420 gagggcgacg tggtgcggtt ctccaccgcg agcccgaagg gccacgcccg gcgcgcgcgg 480 tacgtgcgcg gcaagaccgg gacggtggtc aagcaccacg gcgcgtacat ctacccggac 540 accgccggca acggcctggg cgagtgcccc gagcacctct acaccgtccg cttcacggcc 600 caggagctgt gggggccgga aggggacccg aactccagcg tctactacga ctgctgggag 660 ccctacatcg agctcgtcga cacgaaggcg gccgcggcat ga 702 <210> 5 <211> 144 <212> PRT <213> Pseudonocardia thermophila <400> 5 Met Ser Ala Glu Ala Lys Val Arg Leu Lys His Cys Pro Thr Ala Glu 1 5 10 15 Asp Arg Ala Ala Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gln Leu Pro Gly Gly Asp 20 25 30 Arg Ala Leu Asp Arg Gly Phe Asp Glu Pro Trp Gln Leu Arg Ala Phe 35 40 45 Ala Leu Ala Val Ala Ala Cys Arg Ala Gly Arg Phe Glu Trp Lys Gln 50 55 60 Leu Gln Gln Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Glu Trp Glu Arg Thr His 65 70 75 80 Asp Leu Asp Asp Pro Ser Trp Ser Tyr Tyr Glu His Phe Val Ala Ala 85 90 95 Leu Glu Ser Val Leu Gly Glu Glu Gly Ile Val Glu Pro Glu Ala Leu 100 105 110 Asp Glu Arg Thr Ala Glu Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Lys Asp His 115 120 125 His Gly Pro His Leu Glu Pro Val Ala Val His Pro Ala Val Arg Ser 130 135 140 <210> 6 <211> 435 <212> DNA <213> Pseudonocardia thermophila <400> 6 gtgagcgccg aggcgaaggt ccgcctgaag cactgcccca cggccgagga ccgggcggcg 60 gccgacgcgc tgctcgcgca gctgcccggc ggcgaccgcg cgctcgaccg cggcttcgac 120 gagccgtggc agctgcgggc gttcgcgctg gcggtcgcgg cgtgcagggc gggccggttc 180 gagtggaagc agctgcagca ggcgctgatc tcctcgatcg gggagtggga gcgcacccac 240 gatctcgacg atccgagctg gtcctactac gagcacttcg tcgccgcgct ggaatccgtg 300 ctcggcgagg aagggatcgt cgagccggag gcgctggacg agcgcaccgc ggaggtcttg 360 gccaacccgc cgaacaagga tcaccatgga ccgcatctgg agcccgtcgc ggtccacccg 420 gccgtgcggt cctga 435 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 7 tacgaattct aaggaggtct cagcatgaac ggc 33 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 8 ctcggtcatg ccgcggccgc c 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 9 atcctcacct cgtcgatgat cgac 24 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 10 caggaaacag ctatgac 17 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 11 ggccagtgcc tagcttacat 20 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 12 gttttcccag tcacgac 17 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 13 gagaaggtcg tgttcgcgat gttc 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 14 ttcccggcga ttttccgggc cggc 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 15 atgaacccgg tcgagtacct cgag 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 16 cagggcgagg agatgatgtg ggtg 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 17 atgaacccgg gcgagtacct cgag 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 18 ttctccacca atagcccgaa gggc 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 19 gaggacatga tgtgggtgga gaac 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 20 ttcccggcgg tgttccgggc cggc 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 21 tactacgaca tgtgggagcc ctac 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 22 cggcgcgcgt gttacgtgcg cggc 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 23 aagaccgggg aggtggtcaa gcac 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 24 tcgatgatct gcgtcgaacc ggcg 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 25 atcctcaccg ggtcgatgat cgac 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 26 gagctcgccg gcctcgtcac ccgc 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 27 cacggcgcgg ccatctaccc ggac 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 28 gtctactacg tctgctggga gccc 24 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 29 atgaacggca tgtacgacgt cggc 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 30 tacgacgtcg ccggcaccga tggg 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 31 gagaaggtca tgttcgcgat gttc 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 32 cacggcgcga ccatctaccc ggac 24 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 33 tacatccaca acggcgtccg cacc 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 34 cgccgcacgc gttactaccg ggag 24 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 35 atgaacccgt gggagtacct cgag 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 36 gtctactacc actgctggga gccc 24 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 37 gccccgctga tggagcacga gcag 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 38 atcgagctca tcgacacgaa ggcg 24 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 39 atgaacccgt cggagtacct cgag 24 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 40 cggcgcgcga tgtacgtgcg cggc 24 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 41 cacgagcagg tgccggagtt gatc 24 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 42 gtctactaca tgtgctggga gccc 24 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 43 gacgaggagc tccagaagga gatc 24 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 44 atcctcaccg cgtcgatgat cgac 24 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 45 atctacgagc aagaggtcgg cccg 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 46 ctggagtcga tcctcatcga acag 24 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 47 cacggcgcga tgatctaccc ggac 24 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 48 gtctactacg gctgctggga gccc 24 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 49 atgaacccgc tggagtacct cgag 24 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 50 cacgagcaga ttccggagtt gatc 24 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 51 atgaacccga cggagtacct cgag 24 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 52 tactacgact cctgggagcc ctac 24 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 53 gacgtggtgg ggttctccac cgcg 24 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 54 gtctactaca gctgctggga gccc 24 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 55 ttcccggcgc tgttccgggc cggc 24 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 56 gtctactacc tctgctggga gccc 24 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 57 cccgagcaca accagaagcc ggag 24 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 58 acgaaggcgg tcgcggcatg accg 24 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 59 ctgtgggggc tggaagggga cccg 24 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 60 gacacgaagg aggccgcggc atga 24 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 61 ttctccacct cgagcccgaa gggc 24 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 62 gtctactact gttgctggga gccc 24 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 63 acggtggtcg cgcaccacgg cgcg 24 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 64 gtctactaca cctgctggga gccc 24 <210> 65 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 65 atctacgagg aagaggtcgg cccg 24 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 66 atcctcacct ggtcgatgat cgac 24 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 67 cacggcgcgt gcatctaccc ggac 24 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 68 gccccgctga tggatcacga gcag 24 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 69 gacacgaagg aggcgcggca tgac 24 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 70 gacgaaccga tcttccgcgc cgag 24

Claims (21)

  1. 3 이하 1 이상의 아미노산 치환에 의해, 니트릴 히드라타아제의 2 이상의 성질을 개선하는 적어도 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함하는, 니트릴 히드라타아제 변이체로서,
    개선되는 상기 성질이 반응초속도 및 열 안정성이고,
    서열표의 서열 번호: 1에 표시되는 α 서브유닛과, 서열표의 서열 번호: 2에 표시되는 β 서브유닛으로 이루어지며, 하기 (a)~(l)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 상기 아미노산 치환을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 니트릴 히드라타아제 변이체.
    (a) 상기 α 서브유닛의 92번째에 위치한 Asp의 Glu로의 치환,
    (b) 상기 α 서브유닛의 94번째에 위치한 Met의 Ile로의 치환,
    (c) 상기 α 서브유닛의 197번째에 위치한 Gly의 Cys로의 치환,
    (d) 상기 β 서브유닛의 4번째에 위치한 Val의 Met로의 치환,
    (e) 상기 β 서브유닛의 24번째에 위치한 Val의 Ile로의 치환,
    (f) 상기 β 서브유닛의 79번째에 위치한 His의 Asn으로의 치환,
    (g) 상기 β 서브유닛의 96번째에 위치한 Gln의 Arg로의 치환,
    (h) 상기 β 서브유닛의 107번째에 위치한 Pro의 Met로의 치환,
    (i) 상기 β 서브유닛의 226번째에 위치한 Val의 Ile로의 치환
    (j) 상기 β 서브유닛의 110번째에 위치한 Glu의 Asn으로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 231번째에 위치한 Ala의 Val로의 치환,
    (k) 상기 β 서브유닛의 206번째에 위치한 Pro의 Leu로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 230번째에 위치한 Ala의 Glu로의 치환,
    (l) 상기 α 서브유닛의 13번째에 위치한 Ile의 Leu로의 치환, 상기 α 서브유닛의 27번째에 위치한 Met의 Ile로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 110번째에 위치한 Glu의 Asn으로의 치환.
  2. 제1항에 있어서,
    하기 (m)~(x)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 니트릴 히드라타아제 변이체.
    (m) (b) 또는 (g)일 때, α 서브유닛의 13번째의 Ile가 Leu로 치환되어 있음
    (n) (b) 또는 (h)일 때, α 서브유닛의 27번째의 Met가 Ile로 치환되어 있음
    (o) (d) 및 (f)
    (p) (f)일 때, β 서브유닛의 230번째의 Ala가 Glu로 치환되어 있음
    (q) (a) 및 (i)
    (r) (i)일 때, α 서브유닛의 13번째의 Ile가 Leu로 치환되어 있고, 또한, β 서브유닛의 206번째의 Pro가 Leu로 치환되어 있음
    (s) (a) 및 (d)일 때, β 서브유닛의 206번째의 Pro가 Leu로 치환되어 있음
    (t) (c) 및 (h)일 때, β 서브유닛의 230번째의 Ala가 Glu로 치환되어 있음
    (u) (f)일 때, β 서브유닛의 230번째의 Ala가 Glu로 치환되어 있고 또한, β 서브유닛의 231번째의 Ala가 Val로 치환되어 있음
    (v) (a) 및 (e) 및 (i)
    (w) (c) 및 (e) 및 (h)일 때, β 서브유닛의 230번째의 Ala가 Glu로 치환되어 있음
    (x) (e) 및 (f)일 때, β 서브유닛의 230번째의 Ala가 Glu로 치환되어 있고, 또한, β 서브유닛의 231번째의 Ala가 Val로 치환되어 있음
  3. 제1항에 있어서,
    하기 (aa)~(br)로 이루어지는 아미노산 치환으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 니트릴 히드라타아제 변이체.
    (aa) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Met, 및, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr
    (ab) α 서브유닛의 148번째의 Gly를 Asp, 및, α 서브유닛의 204번째의 Val을 Arg
    (ac) β 서브유닛의 51번째의 Phe를 Val, 및, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp
    (ad) β 서브유닛의 118번째의 Phe를 Val, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
    (ae) β 서브유닛의 160번째의 Arg를 Trp, 및, β 서브유닛의 186번째의 Leu를 Arg
    (af) α 서브유닛의 6번째의 Leu를 Thr, α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Met, 및, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr
    (ag) α 서브유닛의 19번째의 Ala를 Val, α 서브유닛의 71번째의 Arg를 His, 및, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr
    (ah) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Met, α 서브유닛의 148번째의 Gly를 Asp, 및, α 서브유닛의 204번째의 Val을 Arg
    (ai) β 서브유닛의 10번째의 Thr을 Asp, β 서브유닛의 118번째의 Phe를 Val, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
    (aj) β 서브유닛의 37번째의 Phe를 Leu, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
    (ak) β 서브유닛의 37번째의 Phe를 Val, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
    (al) β 서브유닛의 41번째의 Phe를 Ile, β 서브유닛의 51번째의 Phe를 Val, 및, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp
    (am) β 서브유닛의 46번째의 Met를 Lys, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Arg, 및, β 서브유닛의 212번째의 Ser을 Tyr
    (an) β 서브유닛의 48번째의 Leu를 Val, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Arg, 및, β 서브유닛의 212번째의 Ser을 Tyr
    (ao) β 서브유닛의 127번째의 Leu를 Ser, β 서브유닛의 160번째의 Arg를 Trp, 및, β 서브유닛의 186번째의 Leu를 Arg
    (ap) α 서브유닛의 6번째의 Leu를 Thr, α 서브유닛의 19번째의 Ala를 Val, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr, β 서브유닛의 46번째의 Met를 Lys, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Arg, 및, β 서브유닛의 212번째의 Ser을 Tyr
    (aq) α 서브유닛의 6번째의 Leu를 Thr, α 서브유닛의 19번째의 Ala를 Val, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr, β 서브유닛의 48번째의 Leu를 Val, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Arg, 및, β 서브유닛의 212번째의 Ser을 Tyr
    (ar) α 서브유닛의 6번째의 Leu를 Ala, α 서브유닛의 19번째의 Ala를 Val, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr, β 서브유닛의 127번째의 Leu를 Ser, β 서브유닛의 160번째의 Arg를 Trp, 및, β 서브유닛의 186번째의 Leu를 Arg
    (as) α 서브유닛의 6번째의 Leu를 Thr, α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Met, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr, β 서브유닛의 10번째의 Thr을 Asp, β 서브유닛의 118번째의 Phe를 Val, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
    (at) α 서브유닛의 19번째의 Ala를 Val, α 서브유닛의 71번째의 Arg를 His, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr, β 서브유닛의 37번째의 Phe를 Leu, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
    (au) α 서브유닛의 19번째의 Ala를 Val, α 서브유닛의 71번째의 Arg를 His, α 서브유닛의 126번째의 Phe를 Tyr, β 서브유닛의 37번째의 Phe를 Val, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
    (av) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Met, α 서브유닛의 148번째의 Gly를 Asp, α 서브유닛의 204번째의 Val을 Arg, β 서브유닛의 41번째의 Phe를 Ile, β 서브유닛의 51번째의 Phe를 Val, 및, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp
    (aw) α 서브유닛의 148번째의 Gly를 Asp, α 서브유닛의 204번째의 Val을 Arg, β 서브유닛의 108번째의 Glu를 Asp, 및, β 서브유닛의 200번째의 Ala를 Glu
    (ax) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Gly, 및, α 서브유닛의 188번째의 Thr을 Gly
    (ay) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Ala, 및, α 서브유닛의 48번째의 Asn을 Gln
    (az) α 서브유닛의 48번째의 Asn을 Glu, 및, β 서브유닛의 146번째의 Arg를 Gly
    (ba) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Trp, 및, β 서브유닛의 176번째의 Tyr을 Cys
    (bb) β 서브유닛의 176번째의 Tyr을 Met, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Gly
    (bc) α 서브유닛의 36번째의 Thr을 Ser, 및, β 서브유닛의 33번째의 Ala를 Val
    (bd) β 서브유닛의 176번째의 Tyr을 Ala, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Val
    (be) β 서브유닛의 40번째의 Thr을 Val, 및, β 서브유닛의 218번째의 Cys를 Met
    (bf) β 서브유닛의 33번째의 Ala를 Met, 및, β 서브유닛의 176번째의 Tyr을 Thr
    (bg) β 서브유닛의 40번째의 Thr을 Leu, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Leu
    (bh) β 서브유닛의 40번째의 Thr을 Ile, 및, β 서브유닛의 61번째의 Ala를 Val
    (bi) β 서브유닛의 61번째의 Ala를 Thr, 및, β 서브유닛의 218번째의 Cys를 Ser
    (bj) β 서브유닛의 112번째의 Lys를 Val, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Met
    (bk) β 서브유닛의 61번째의 Ala를 Trp, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 His
    (bl) β 서브유닛의 61번째의 Ala를 Leu, 및, β 서브유닛의 112번째의 Lys를 Ile
    (bm) β 서브유닛의 146번째의 Arg를 Gly, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Ser
    (bn) β 서브유닛의 171번째의 Lys를 Ala, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Thr
    (bo) β 서브유닛의 150번째의 Ala를 Ser, 및, β 서브유닛의 217번째의 Asp를 Cys
    (bp) β 서브유닛의 61번째의 Ala를 Gly, 및, β 서브유닛의 150번째의 Ala를 Asn
    (bq) β 서브유닛의 61번째의 Ala를 Ser, 및, β 서브유닛의 160번째의 Arg를 Met
    (br) β 서브유닛의 160번째의 Arg를 Cys, 및, β 서브유닛의 168번째의 Thr을 Glu
  4. 제1항에 있어서,
    하기 (Ⅰ), (Ⅱ), (Ⅲ), (Ⅳ), (Ⅴ), (Ⅵ), (Ⅶ), (Ⅷ), (Ⅸ), (Ⅹ), (ⅩⅠ), (ⅩⅡ), (ⅩⅢ) 또는 (ⅩⅣ)로 나타내는 변이 개소가 다른 아미노산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 니트릴 히드라타아제 변이체.
    (Ⅰ) 상기 α 서브유닛의 36번째에 위치한 아미노산의 Met로의 치환, 상기 α 서브유닛의 92번째에 위치한 아미노산의 Glu로의 치환, 상기 α 서브유닛의 148번째에 위치한 아미노산의 Asp로의 치환, 상기 α 서브유닛의 204번째에 위치한 아미노산의 Arg로의 치환, 상기 β 서브유닛의 41번째에 위치한 아미노산의 Ile로의 치환, 상기 β 서브유닛의 51번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 108번째에 위치한 아미노산의 Asp로의 치환,
    (Ⅱ) 상기 α 서브유닛의 6번째에 위치한 아미노산의 Thr로의 치환, 상기 α 서브유닛의 19번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 α 서브유닛의 94번째에 위치한 아미노산의 Ile로의 치환, 상기 α 서브유닛의 126번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 46번째에 위치한 아미노산의 Lys로의 치환, 상기 β 서브유닛의 108번째에 위치한 아미노산의 Arg로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 212번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환,
    (Ⅲ) 상기 α 서브유닛의 6번째에 위치한 아미노산의 Ala로의 치환, 상기 α 서브유닛의 19번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 α 서브유닛의 126번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 4번째에 위치한 아미노산의 Met로의 치환, 상기 β 서브유닛의 127번째에 위치한 아미노산의 Ser로의 치환, 상기 β 서브유닛의 160번째에 위치한 아미노산의 Trp로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 186번째에 위치한 아미노산의 Arg로의 치환,
    (Ⅳ) 상기 α 서브유닛의 19번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 α 서브유닛의 71번째에 위치한 아미노산의 His로의 치환, 상기 α 서브유닛의 126번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 37번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 β 서브유닛의 79번째에 위치한 아미노산의 Asn으로의 치환, 상기 β 서브유닛의 108번째에 위치한 아미노산의 Asp로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 200번째에 위치한 아미노산의 Glu로의 치환
    (Ⅴ) 상기 α 서브유닛의 6번째에 위치한 아미노산의 Thr로의 치환, 상기 α 서브유닛의 19번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 α 서브유닛의 126번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 48번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 β 서브유닛의 96번째에 위치한 아미노산의 Arg로의 치환, 상기 β 서브유닛의 108번째에 위치한 아미노산의 Arg로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 212번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환,
    (Ⅵ) 상기 α 서브유닛의 19번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 α 서브유닛의 71번째에 위치한 아미노산의 His로의 치환, 상기 α 서브유닛의 126번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 37번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 β 서브유닛의 107번째에 위치한 아미노산의 Met로의 치환, 상기 β 서브유닛의 108번째에 위치한 아미노산의 Asp로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 200번째에 위치한 아미노산의 Glu로의 치환,
    (Ⅶ) 상기 α 서브유닛의 13번째에 위치한 아미노산의 Leu로의 치환, 상기 α 서브유닛의 19번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 α 서브유닛의 71번째에 위치한 아미노산의 His로의 치환, 상기 α 서브유닛의 126번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 37번째에 위치한 아미노산의 Leu로의 치환, 상기 β 서브유닛의 96번째에 위치한 아미노산의 Arg로의 치환, 상기 β 서브유닛의 108번째에 위치한 아미노산의 Asp로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 200번째에 위치한 아미노산의 Glu로의 치환,
    (Ⅷ) 상기 α 서브유닛의 6번째에 위치한 아미노산의 Thr로의 치환, 상기 α 서브유닛의 27번째에 위치한 아미노산의 Ile로의 치환, 상기 α 서브유닛의 36번째에 위치한 아미노산의 Met로의 치환, 상기 α 서브유닛의 126번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 10번째에 위치한 아미노산의 Asp로의 치환, 상기 β 서브유닛의 107번째에 위치한 아미노산의 Met로의 치환, 상기 β 서브유닛의 118번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 200번째에 위치한 아미노산의 Glu로의 치환,
    (Ⅸ) 상기 α 서브유닛의 6번째에 위치한 아미노산의 Thr로의 치환, 상기 α 서브유닛의 19번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 α 서브유닛의 126번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 48번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 β 서브유닛의 79번째에 위치한 아미노산의 Asn으로의 치환, 상기 β 서브유닛의 108번째에 위치한 아미노산의 Arg로의 치환, 상기 β 서브유닛의 212번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 230번째에 위치한 아미노산의 Glu로의 치환,
    (Ⅹ) 상기 α 서브유닛의 6번째에 위치한 아미노산의 Thr로의 치환, 상기 α 서브유닛의 36번째에 위치한 아미노산의 Met로의 치환, 상기 α 서브유닛의 126번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 10번째에 위치한 아미노산의 Asp로의 치환, 상기 β 서브유닛의 118번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 β 서브유닛의 200번째에 위치한 아미노산의 Glu로의 치환, 상기 β 서브유닛의 206번째에 위치한 아미노산의 Leu로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 230번째에 위치한 아미노산의 Glu로의 치환,
    (ⅩⅠ) 상기 α 서브유닛의 36번째에 위치한 아미노산의 Met로의 치환, 상기 α 서브유닛의 148번째에 위치한 아미노산의 Asp로의 치환, 상기 α 서브유닛의 204번째에 위치한 아미노산의 Arg로의 치환, 상기 β 서브유닛의 41번째에 위치한 아미노산의 Ile로의 치환, 상기 β 서브유닛의 51번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 β 서브유닛의 108번째에 위치한 아미노산의 Asp로의 치환, 상기 β 서브유닛의 206번째에 위치한 아미노산의 Leu로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 230번째에 위치한 아미노산의 Glu로의 치환,
    (ⅩⅡ) 상기 α 서브유닛의 6번째에 위치한 아미노산의 Thr로의 치환, 상기 α 서브유닛의 19번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 α 서브유닛의 126번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 48번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 β 서브유닛의 79번째에 위치한 아미노산의 Asn으로의 치환, 상기 β 서브유닛의 108번째에 위치한 아미노산의 Arg로의 치환, 상기 β 서브유닛의 212번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 230번째에 위치한 아미노산의 Glu로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 231번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환,
    (ⅩⅢ) 상기 α 서브유닛의 6번째에 위치한 아미노산의 Thr로의 치환, 상기 α 서브유닛의 19번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 α 서브유닛의 126번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 46번째에 위치한 아미노산의 Lys로의 치환, 상기 β 서브유닛의 79번째에 위치한 아미노산의 Asn으로의 치환, 상기 β 서브유닛의 108번째에 위치한 아미노산의 Arg로의 치환, 상기 β 서브유닛의 212번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 230번째에 위치한 아미노산의 Glu로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 231번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환,
    (ⅩⅣ) 상기 α 서브유닛의 6번째에 위치한 아미노산의 Thr로의 치환, 상기 α 서브유닛의 19번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 α 서브유닛의 126번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 24번째에 위치한 아미노산의 Ile로의 치환, 상기 β 서브유닛의 48번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환, 상기 β 서브유닛의 79번째에 위치한 아미노산의 Asn으로의 치환, 상기 β 서브유닛의 108번째에 위치한 아미노산의 Arg로의 치환, 상기 β 서브유닛의 212번째에 위치한 아미노산의 Tyr로의 치환, 상기 β 서브유닛의 230번째에 위치한 아미노산의 Glu로의 치환, 및 상기 β 서브유닛의 231번째에 위치한 아미노산의 Val로의 치환.
  5. 서열표의 서열 번호: 3에 표시되는 α 서브유닛을 코드하는 유전자와, 서열표의 서열 번호: 4에 표시되는 β 서브유닛을 코드하는 유전자로 이루어지는, 니트릴 히드라타아제를 코드하는 유전자에 있어서, 하기 (a)~(l)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 적어도 하나의 염기 치환을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자.
    (a) 서열번호: 3의 274번째~276번째의 염기서열이 GAC에서 GAG로 치환,
    (b) 서열 번호: 3의 280번째~282번째의 염기 서열이 ATG에서 ATC로 치환,
    (c) 서열 번호: 3의 589번째~591번째의 염기 서열이 GGC에서 TGC로 치환,
    (d) 서열 번호: 4의 10번째~12번째의 염기 서열이 GTG에서 ATG로 치환,
    (e) 서열 번호: 4의 70번째~72번째의 염기 서열이 GTC에서 ATC로 치환,
    (f) 서열 번호: 4의 235번째~237번째의 염기 서열이 CAC에서 AAC로 치환,
    (g) 서열 번호: 4의 286번째~288번째의 염기 서열이 CAG에서 CGT로 치환,
    (h) 서열 번호: 4의 319번째~321번째의 염기 서열이 CCC에서 ATG로 치환,
    (i) 서열 번호: 4의 676번째~678번째의 염기 서열이 GTC에서 ATC로 치환,
    (j) 서열 번호: 4의 328번째~330번째의 염기 서열이 GAG에서 AAC로 치환, 및, 서열 번호: 4의 691번째~693번째의 염기 서열이 GCC에서 GTC로 치환,
    (k) 서열 번호: 4의 616번째~618번째의 염기 서열이 CCG에서 CTG로 치환, 및, 서열 번호: 4의 688번째~690번째의 염기 서열이 GCG에서 GAG로 치환,
    (l) 서열 번호: 3의 37번째~39번째의 염기 서열이 ATC에서 CTC로 치환, 및, 서열 번호: 3의 79번째~81번째의 염기 서열이 ATG에서 ATC로 치환, 및, 서열 번호: 4의 328번째~330번째의 염기 서열이 GAG에서 AAC로 치환.
  6. 제5항에 있어서,
    하기 (m)~(x)로 이루어지는 염기 치환 위치로부터 선택되는, 적어도 하나의 염기 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자.
    (m) (b) 또는 (g)일 때, 서열 번호: 3의 염기 서열의 37번째~39번째의 ATC가 CTC로 치환되어 있음
    (n) (b) 또는 (h)일 때, 서열 번호: 3의 염기 서열의 79번째~81번째의 ATG가 ATC로 치환되어 있음
    (o) (d) 및 (f)
    (p) (f)일 때, 서열 번호: 4의 염기 서열의 688번째~690번째의 GCG가 GAG로 치환되어 있음
    (q) (a) 및 (i)
    (r) (i)일 때, 서열 번호: 3의 염기 서열의 37~39번째의 ATC가 CTC로 치환되어 있고, 또한, 서열 번호: 4의 염기 서열의 616번째~618번째의 CCG가 CTC로 치환되어 있음
    (s) (a) 및 (d)일 때, 서열 번호: 4의 염기 서열의 616번째~618번째의 CCG가 CTC로 치환되어 있음
    (t) (c) 및 (h)일 때, 서열 번호: 4의 염기 서열의 688번째~690번째의 GCG가 GAG로 치환되어 있음
    (u) (f)일 때, 서열 번호: 4의 염기 서열의 688번째~690번째의 GCG가 GAG로 치환되어 있고, 또한, 서열 번호: 4의 염기 서열의 691번째~693번째의 GCG가 GTC로 치환되어 있음
    (v) (a) 및 (e) 및 (i)
    (w) (c) 및 (e) 및 (h)일 때, 서열번호: 4의 염기서열의 688번째~690번째의 GCG가 GAG로 치환되어 있음
    (x) (e) 및 (f)일 때, 서열번호: 4의 염기서열의 688번째~690번째의 GCG가 GAG로 치환되어 있고, 또한, 서열번호: 4의 서열번호의 691번째~693번째의 GCC가 GTC로 치환되어 있음
  7. 제5항에 있어서,
    하기 (aa)~(br)로 이루어지는 염기 치환 위치로부터 선택되는, 적어도 하나의 염기 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자.
    (aa) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 ATG, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC
    (ab) 서열 번호: 3의 염기 서열의 442번째~444번째의 GGC를 GAC, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 610번째~612번째의 GTC를 CGC
    (ac) 서열 번호: 4의 염기 서열의 151번째~153번째의 TTC를 GTC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT
    (ad) 서열 번호: 4의 염기 서열의 352번째~354번째의 TTC를 GTC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
    (ae) 서열 번호: 4의 염기 서열의 478번째~480번째의 CGG를 TGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 556번째~558번째의 CTG를 CGG
    (af) 서열 번호: 3의 염기 서열의 16번째~18번째의 CTG를 ACG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 ATG, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC
    (ag) 서열 번호: 3의 염기 서열의 55번째~57번째의 GCG를 GTG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 211번째~213번째의 CGT를 CAT, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC
    (ah) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 ATG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 442번째~444번째의 GGC를 GAC, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 610번째~612번째의 GTC를 CGC
    (ai) 서열 번호: 4의 염기 서열의 28번째~30번째의 ACC를 GAC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 352번째~354번째의 TTC를 GTC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
    (aj) 서열 번호: 4의 염기 서열의 109번째~111번째의 TTC를 CTC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
    (ak) 서열 번호: 4의 염기 서열의 109번째~111번째의 TTC를 GTC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
    (al) 서열 번호: 4의 염기 서열의 121번째~123번째의 TTC를 ATC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 151번째~153번째의 TTC를 GTC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT
    (am) 서열 번호: 4의 염기 서열의 136번째~138번째의 ATG를 AAG, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 CGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 634번째~636번째의 TCC를 TAC
    (an) 서열 번호: 4의 염기 서열의 142번째~144번째의 CTG를 GTG, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 CGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 634번째~636번째의 TCC를 TAC
    (ao) 서열 번호: 4의 염기 서열의 379번째~381번째의 CTG를 TCG, 서열 번호: 4의 염기 서열의 478번째~480번째의 CGG를 TGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 556번째~558번째의 CTG를 CGG
    (ap) 서열 번호: 3의 염기 서열의 16번째~18번째의 CTG를 ACG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 55번째~57번째의 GCG를 GTG, 서열 번호 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 136번째~138번째의 ATG를 AAG, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 CGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 634번째~636번째의 TCC를 TAC
    (aq) 서열 번호: 3의 염기 서열의 16번째~18번째의 CTG를 ACG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 55번째~57번째의 GCG를 GTG, 서열 번호 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 142번째~144번째의 CTG를 GTG, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 CGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 634번째~636번째의 TCC를 TAC
    (ar) 서열 번호: 3의 염기 서열의 16번째~18번째의 CTG를 GCG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 55번째~57번째의 GCG를 GTG, 서열 번호 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 379번째~381번째의 CTG를 TCG, 서열 번호: 4의 염기 서열의 478번째~480번째의 CGG를 TGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 556번째~558번째의 CTG를 CGG
    (as) 서열 번호: 3의 염기 서열의 16번째~18번째의 CTG를 ACG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 ATG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC, 서열 번호 4의 염기 서열의 28번째~30번째의 ACC를 GAC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 352번째~354번째의 TTC를 GTC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
    (at) 서열 번호: 3의 염기 서열의 55번째~57번째의 GCG를 GTG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 211번째~213번째의 CGT를 CAT, 서열 번호: 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC, 서열 번호 4의 염기 서열의 109번째~111번째의 TTC를 CTC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
    (au) 서열 번호: 3의 염기 서열의 55번째~57번째의 GCG를 GTG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 211번째~213번째의 CGT를 CAT, 서열 번호: 3의 염기 서열의 376번째~378번째의 TTC를 TAC, 서열 번호 4의 염기 서열의 109번째~111번째의 TTC를 GTC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
    (av) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 ATG, 서열 번호: 3의 염기 서열의 442번째~444번째의 GGC를 GAC, 서열 번호: 3의 염기 서열의 610번째~612번째의 GTC를 CGC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 121번째~123번째의 TTC를 ATC, 서열 번호 4의 염기 서열의 151번째~153번째의 TTC를 GTC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT
    (aw) 서열 번호: 3의 염기 서열의 442번째~444번째의 GGC를 GAC, 서열 번호: 3의 염기 서열의 610번째~612번째의 GTC를 CGC, 서열 번호: 4의 염기 서열의 322번째~324번째의 GAG를 GAT, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 598번째~600번째의 GCC를 GAG
    (ax) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 GGG, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 562번째~564번째의 ACC를 GGC
    (ay) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 GCG, 및, 서열 번호: 3의 염기 서열의 142번째~144번째의 AAC를 CAA
    (az) 서열 번호: 3의 염기 서열의 142번째~144번째의 AAC를 GAA, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 436번째~438번째의 CGG를 GGG
    (ba) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 TGG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 526번째~528번째의 TAC를 TGC
    (bb) 서열 번호: 4의 염기 서열의 526번째~528번째의 TAC를 ATG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 GGC
    (bc) 서열 번호: 3의 염기 서열의 106번째~108번째의 ACG를 TCG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 97번째~99번째의 GCG를 GTG
    (bd) 서열 번호: 4의 염기 서열의 526번째~528번째의 TAC를 GCC, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 GTC
    (be) 서열 번호: 4의 염기 서열의 118번째~120번째의 ACG를 GTG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 652번째~654번째의 TGC를 ATG
    (bf) 서열 번호: 4의 염기 서열의 97번째~99번째의 GCG를 ATG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 526번째~528번째의 TAC를 ACC
    (bg) 서열 번호: 4의 염기 서열의 118번째~120번째의 ACG를 CTG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 CTC
    (bh) 서열 번호: 4의 염기 서열의 118번째~120번째의 ACG를 ATT, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 181번째~183번째의 GCC를 GTC
    (bi) 서열 번호: 4의 염기 서열의 181번째~183번째의 GCC를 ACG, 및, 서열 번호: 4의 염기 서열의 652번째~654번째의 TGC를 TCC
    (bj) 서열 번호: 4의 염기 서열의 334번째~336번째의 AAG를 GTG, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 ATG
    (bk) 서열 번호: 4의 염기 서열의 181번째~183번째의 GCC를 TGG, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 CAC
    (bl) 서열 번호: 4의 염기 서열의 181번째~183번째의 GCC를 CTC, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 334번째~336번째의 AAG를 ATT
    (bm) 서열 번호: 4의 염기 서열의 436번째~438번째의 CGG를 GGG, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 AGC
    (bn) 서열 번호: 4의 염기 서열의 511번째~513번째의 AAG를 GCG, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 ACC
    (bo) 서열 번호: 4의 염기 서열의 448번째~450번째의 GCG를 TCG, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 649번째~651번째의 GAC를 TGT
    (bp) 서열 번호: 4의 염기 서열의 181번째~183번째의 GCC를 GGC, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 448번째~450번째의 GCG를 AAT
    (bq) 서열 번호: 4의 염기 서열의 181번째~183번째의 GCC를 TCG, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 478번째~480번째의 CGG를 ATG
    (br) 서열 번호: 4의 염기 서열의 478번째~480번째의 CGG를 TGT, 및, 서열 번호 4의 염기 서열의 502번째~504번째의 ACG를 GAG
  8. 제5항에 있어서,
    하기 (Ⅰ), (Ⅱ), (Ⅲ), (Ⅳ), (Ⅴ), (Ⅵ), (Ⅶ), (Ⅷ), (Ⅸ), (Ⅹ), (ⅩⅠ), (ⅩⅡ), (ⅩⅢ) 또는 (ⅩⅣ)로 나타내는 염기치환을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자.
    (Ⅰ) 서열번호: 3의 106번째~108번째의 염기서열이 ATG로 치환, 서열번호: 3의 274번째~276번째의 염기서열이 GAG로 치환, 서열번호: 3의 442번째~444번째의 염기서열이 GAC로 치환, 서열번호: 3의 610번째~612번째의 염기서열이 CGC로 치환, 및, 서열번호: 4의 121번째~123번째의 염기서열이 ATC로 치환, 서열번호: 4의 151번째~153번째의 염기서열이 GTC로 치환, 및 서열번호: 4의 322번째~324번째의 염기서열이 GAT로 치환,
    (Ⅱ) 서열번호: 3의 16번째~18번째의 염기서열이 ACG로 치환, 서열번호: 3의 55번째~57번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 3의 280번째~282번째의 염기서열이 ATC로 치환, 서열번호: 3의 376번째~378번째의 염기서열이 TAC로 치환, 및, 서열번호: 4의 136번째~138번째의 염기서열이 AAG로 치환, 서열번호: 4의 322번째~324번째의 염기서열이 CGG로 치환, 및 서열번호: 4의 634번째~636번째의 염기서열이 TAC로 치환,
    (Ⅲ) 서열번호: 3의 16번째~18번째의 염기서열이 GCG로 치환, 서열번호: 3의 55번째~57번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 3의 376번째~378번째의 염기서열이 TAC로 치환, 및, 서열번호: 4의 10번째~12번째의 염기서열이 ATG로 치환, 서열번호: 4의 379번째~381번째의 염기서열이 TCG로 치환, 서열번호: 4의 478번째~480번째의 염기서열이 TGG로 치환, 및 서열번호: 4의 556번째~558번째의 염기서열이 CGG로 치환,
    (Ⅳ) 서열번호: 3의 55번째~57번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 3의 211번째~213번째의 염기서열이 CAT로 치환, 서열번호: 3의 376번째~378번째의 염기서열이 TAC로 치환, 및, 서열번호: 4의 109번째~111번째의 염기서열이 GTC로 치환, 서열번호: 4의 235번째~237번째의 염기서열이 AAC로 치환,서열번호: 4의 322번째~324번째의 염기서열이 GAT로 치환, 및 서열번호: 4의 598번째~600번째의 염기서열이 GAG로 치환,
    (Ⅴ) 서열번호: 3의 16번째~18번째의 염기서열이 ACG로 치환, 서열번호: 3의 55번째~57번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 3의 376번째~378번째의 염기서열이 TAC로 치환, 및, 서열번호: 4의 142번째~144번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 4의 286번째~288번째의 염기서열이 CGT로 치환, 서열번호: 4의 322번째~324번째의 염기서열이 CGG로 치환, 및 서열번호: 4의 634번째~636번째의 염기서열이 TAC로 치환,
    (Ⅵ) 서열번호: 3의 55번째~57번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 3의 211번째~213번째의 염기서열이 CAT로 치환, 서열번호: 3의 376번째~378번째의 염기서열이 TAC로 치환, 서열번호: 4의 109번째~111번째의 염기서열이 GTC로 치환, 서열번호: 4의 319번째~321번째의 염기서열이 ATG로 치환, 서열번호: 4의 322번째~324번째의 염기서열이 GAT로 치환, 및 서열번호: 4의 598번째~600번째의 염기서열이 GAG로 치환,
    (Ⅶ) 서열번호: 3의 37번째~39번째의 염기서열이 CTC로 치환, 서열번호: 3의 55번째~57번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 3의 211번째~213번째의 염기서열이 CAT로 치환, 서열번호: 3의 376번째~378번째의 염기서열이 TAC로 치환, 및, 서열번호: 4의 109번째~111번째의 염기서열이 CTC로 치환, 서열번호: 4의 286번째~288번째의 염기서열이 CGT로 치환, 서열번호: 4의 322번째~324번째의 염기서열이 GAT로 치환, 및 서열번호: 4의 598번째~600번째의 염기서열이 GAG로 치환,
    (Ⅷ) 서열번호: 3의 16번째~18번째의 염기서열이 ACG로 치환, 서열번호: 3의 79번째~81번째의 염기서열이 ATC로 치환, 서열번호: 3의 106번째~108번째의 염기서열이 ATG로 치환, 서열번호: 3의 376번째~378번째의 염기서열이 TAC로 치환, 및, 서열번호: 4의 28번째~30번째의 염기서열이 GAC로 치환, 서열번호: 4의 319번째~321번째의 염기서열이 ATG로 치환, 서열번호: 4의 352번째~354번째의 염기서열이 GTC로 치환, 및 서열번호: 4의 598번째~600번째의 염기서열이 GAG로 치환,
    (Ⅸ) 서열번호: 3의 16번째~18번째의 염기서열이 ACG로 치환, 서열번호: 3의 55번째~57번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 3의 376번째~378번째의 염기서열이 TAC로 치환, 및, 서열번호: 4의 142번째~144번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 4의 235번째~237번째의 염기서열이 AAC로 치환, 서열번호: 4의 322번째~324번째의 염기서열이 CGG로 치환, 서열번호: 4의 634번째~636번째의 염기서열이 TAC로 치환, 및 서열번호: 4의 688번째~690번째의 염기서열이 GAG로 치환,
    (Ⅹ) 서열번호: 3의 16번째~18번째의 염기서열이 ACG로 치환, 서열번호: 3의 106번째~108번째의 염기서열이 ATG로 치환, 서열번호: 3의 376번째~378번째의 염기서열이 TAC로 치환, 및, 서열번호: 4의 28번째~30번째의 염기서열이 GAC로 치환, 서열번호: 4의 352번째~354번째의 염기서열이 GTC로 치환, 서열번호: 4의 598번째~600번째의 염기서열이 GAG로 치환, 서열번호: 4의 616번째~618번째의 염기서열이 CTG로 치환, 및 서열번호: 4의 688번째~690번째의 염기서열이 GAG로 치환,
    (ⅩⅠ) 서열번호: 3의 106번째~108번째의 염기서열이 ATG로 치환, 서열번호: 3의 442번째~444번째의 염기서열이 GAC로 치환, 서열번호: 3의 610번째~612번째의 염기서열이 CGC로 치환, 및, 서열번호: 4의 121번째~123번째의 염기서열이 ATC로 치환, 서열번호: 4의 151번째~153번째의 염기서열이 GTC로 치환, 서열번호: 4의 322번째~324번째의 염기서열이 GAT로 치환, 서열번호: 4의 616번째~618번째의 염기서열이 CTG로 치환, 및 서열번호: 4의 688번째~690번째의 염기서열이 GAG로 치환,
    (ⅩⅡ) 서열번호: 3의 16번째~18번째의 염기서열이 ACG로 치환, 서열번호: 3의 55번째~57번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 3의 376번째~378번째의 염기서열이 TAC로 치환, 및, 서열번호: 4의 142번째~144번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 4의 235번째~237번째의 염기서열이 AAC로 치환, 서열번호: 4의 322번째~324번째의 염기서열이 CGG로 치환, 서열번호: 4의 634번째~636번째의 염기서열이 TAC로 치환, 서열번호: 4의 688번째~690번째의 염기서열이 GAG로 치환, 및 서열번호: 4의 691번째~693번째의 염기서열이 GTC로 치환,
    (ⅩⅢ) 서열번호: 3의 16번째~18번째의 염기서열이 ACG로 치환, 서열번호: 3의 55번째~57번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 3의 376번째~378번째의 염기서열이 TAC로 치환, 및, 서열번호: 4의 136번째~138번째의 염기서열이 AAG로 치환, 서열번호: 4의 235번째~237번째의 염기서열이 AAC로 치환, 서열번호: 4의 322번째~324번째의 염기서열이 CGG로 치환, 서열번호: 4의 634번째~636번째의 염기서열이 TAC로 치환, 서열번호: 4의 688번째~690번째의 염기서열이 GAG로 치환, 및 서열번호: 4의 691번째~693번째의 염기서열이 GTC로 치환,
    (ⅩⅣ) 서열번호: 3의 16번째~18번째의 염기서열이 ACG로 치환, 서열번호: 3의 55번째~57번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 3의 376번째~378번째의 염기서열이 TAC로 치환, 및, 서열번호: 4의 70번째~72번째의 염기서열이 ATC로 치환, 서열번호: 4의 142번째~148번째의 염기서열이 GTG로 치환, 서열번호: 4의 235번째~237번째의 염기서열이 AAC로 치환, 서열번호: 4의 322번째~324번째의 염기서열이 CGG로 치환, 서열번호: 4의 634번째~636번째의 염기서열이 TAC로 치환, 서열번호: 4의 688번째~690번째의 염기서열이 GAG로 치환, 및 서열번호: 4의 691번째~693번째의 염기서열이 GTC로 치환.
  9. 제5항에 기재된 니트릴 히드라타아제 변이체를 코드하는 유전자의 5' 말단 상류에, 유전자의 발현에 필요로 되는 프로모터 서열을 포함하는 DNA와, 그 프로모터의 3' 말단의 하류에, 서열 번호: 7의 10번째에서 18번째의 염기로 이루어지는 리보솜 결합 서열을 더 포함하는, 연결된 DNA.
  10. 제9항에 기재된 DNA를 포함하는, 플라스미드.
  11. 제10항에 기재된 플라스미드에 의해 숙주 세포를 형질 전환하여 얻어진 형질 전환체.
  12. 니트릴 히드라타아제 변이체의 생산 방법에 있어서, 제11항에 기재된 형질 전환체를 배지에서 배양하여, 그 형질 전환체에 플라스미드가 갖는 니트릴 히드라타아제 유전자에 근거하는 니트릴 히드라타아제 변이체를 생산시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 니트릴 히드라타아제 변이체의 생산 방법.
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