TWI479023B - 腈水合酵素變異體 - Google Patents

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TWI479023B
TWI479023B TW098138639A TW98138639A TWI479023B TW I479023 B TWI479023 B TW I479023B TW 098138639 A TW098138639 A TW 098138639A TW 98138639 A TW98138639 A TW 98138639A TW I479023 B TWI479023 B TW I479023B
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Kazuya Matsumoto
Yasushi Kazuno
Daisuke Mochizuki
Junko Tokuda
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Mitsui Chemicals Inc
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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)

Description

腈水合酵素變異體
本發明是有關於一種腈水合酵素(nitrile hydratase)變異體、以及對該腈水合酵素變異體進行編碼(code)的基因、含有該基因的去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)、含有該基因的質體(plasmid)、藉由該質體而形成的轉形體(transformant)、使用該轉形體來生產腈水合酵素變異體的方法。
近年來，發現具有藉由水合將各種化合物的腈基(nitrile group)轉變成醯胺基(amide group)的腈水合活性的酵素即腈水合酵素，揭示有很多產生該酵素的微生物株。為了使用腈水合酵素而在工業上由腈化合物製造醯胺化合物，重要的是降低醯胺化合物製造成本中所佔的該酵素的製造成本。更具體而言，必需提高酵素製備物的每單位重量的活性值。
關於藉由增加酵素製備物中的酵素量來提高活性值的方法，已嘗試選殖對該酵素進行編碼的基因，利用基因工程方法而使該酵素大量表達。
例如，製作出可使源自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酵素在轉形體內大量表達的質體以及藉由該質體進行轉形而成的細胞株。此外，可利用該細胞株來生產該腈水合酵素，以及藉由使該細胞株或者由該細胞株所得的該腈水合酵素與腈化合物相接觸而製造對應的醯胺化合物(參照專利文獻1)。
另一方面，若可實現酵素分子其本身的高活性化，則可進一步提高酵素製備物的活性值。
迄今為止，正嘗試探索如下腈水合酵素變異體，該腈水合酵素變異體是藉由在不損及其活性的情況下，對腈水合酵素的胺基酸序列中的特定胺基酸殘基導入變異，而使基質特異性、酵素穩定性等得到改良(參照專利文獻2～4)。
此外，源自紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)的腈水合酵素變異體有專利文獻5、6中所記載的腈水合酵素變異體。
先前技術文獻
專利文獻
專利文獻1：日本專利特開平9-275978號公報
專利文獻2：日本專利特開2004-194588號公報
專利文獻3：日本專利特開2005-160403號公報
專利文獻4：國際公開第2004/056990號小冊子
專利文獻5：日本專利特開2007-143409號公報
專利文獻6：日本專利特開2008-253182號公報
然而，與專利文獻1中所記載的野生型腈水合酵素相比較，其反應初速度及酵素穩定性同時提高的具體變異體尚未為人所知。期待可藉由使反應初速度及酵素穩定性同時提高來削減醯胺化合物的製造成本。
本發明的目的在於提供一種具有較高的反應初速度及酵素穩定性的腈水合酵素。
即，本發明如下所述。
[1]一種腈水合酵素變異體，其特徵在於包含至少1個胺基酸經取代為其他胺基酸的取代，該取代藉由小於等於3個且大於等於1個胺基酸取代而改善腈水合酵素的兩種以上性質。
[2]如[1]所述之腈水合酵素變異體，其中經改善的上述性質為反應初速度及熱穩定性。
[3]如[1]或[2]所述之腈水合酵素變異體，其中該腈水合酵素變異體包含序列表的序列號：1所示的α次單元(subunit)、及序列表的序列號：2所示的β次單元，且包含選自由下述(a)～(l)所組成之胺基酸取代位置中的至少1個胺基酸經取代為其他胺基酸之取代：
(a)α次單元的第92號；
(b)α次單元的第94號；
(c)α次單元的第197號；
(d)β次單元的第4號；
(e)β次單元的第24號；
(f)β次單元的第79號；
(g)β次單元的第96號；
(h)β次單元的第107號；
(i)β次單元的第226號；
(j)β次單元的第110號及β次單元的第231號；
(k)β次單元的第206號及β次單元的第230號；
(l)α次單元的第13號、α次單元的第27號及β次單元的第110號。
[4]如[3]所述之腈水合酵素變異體，其中該腈水合酵素變異體更包含選自由下述(m)～(u)所組成之胺基酸取代位置中的至少1個胺基酸經取代為其他胺基酸之取代：
(m)(b)或(g)時，α次單元的第13號；
(n)(b)或(h)時，是α次單元的第27號；
(o)(d)及(f)；
(p)(f)時，β次單元的第230號；
(q)(a)及(i)；
(r)(i)時，α次單元的第13號及β次單元的第206號；
(s)(a)及(d)時，β次單元的第206號；
(t)(c)及(h)時，β次單元的第230號；
(u)(f)時，β次單元的第230號、及β次單元的第231號。
[5]如[3]所述之腈水合酵素變異體，其中當上述胺基酸取代位置為(e)時，該腈水合酵素變異體更包含選自由(a)、(c)、(f)、(i)、(h)、β次單元的第230號、及β次單元的第231號所組成之組群中的至少1個胺基酸經取代為其他胺基酸之取代。
[6]如[1]至[5]中任一項所述之腈水合酵素變異體，其中當α次單元的第13號胺基酸經取代時，Ile經取代為Leu；當α次單元的第27號胺基酸經取代時，Met經取代為Ile；當α次單元的第92號胺基酸經取代時，Asp經取代為Glu；當α次單元的第94號胺基酸經取代時，Met經取代為Ile；當α次單元的第197號胺基酸經取代時，Gly經取代為Cys；當β次單元的第4號胺基酸經取代時，Val經取代為Met；當β次單元的第24號胺基酸經取代時，Val經取代為Ile；當β次單元的第79號胺基酸經取代時，His經取代為Asn；當β次單元的第96號胺基酸經取代時，Gln經取代為Arg；當β次單元的第107號胺基酸經取代時，Pro經取代為Met；當β次單元的第110號胺基酸經取代時，Glu經取代為Asn；當β次單元的第206號胺基酸經取代時，Pro經取代為Leu；當β次單元的第226號胺基酸經取代時，Val經取代為Ile；當β次單元的第230號胺基酸經取代時，Ala經取代為Glu；當β次單元的第231號胺基酸經取代時，Ala經取代為Val。
[7]如[3]至[6]中任一項所述之腈水合酵素變異體，其中該腈水合酵素變異體更包含選自由下述(aa)～(br)所組成之胺基酸取代中的至少1個胺基酸之取代：
(aa)將α次單元的第36號Thr取代為Met，以及將α次單元的第126號Phe取代為Tyr；
(ab)將α次單元的第148號Gly取代為Asp，以及將α次單元的第204號Val取代為Arg；
(ac)將β次單元的第51號Phe取代為Val，以及將β次單元的第108號Glu取代為Asp；
(ad)將β次單元的第118號Phe取代為Val，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；
(ae)將β次單元的第160號Arg取代為Trp，以及將β次單元的第186號Leu取代為Arg；
(af)將α次單元的第6號Leu取代為Thr，將α次單元的第36號Thr取代為Met，以及將α次單元的第126號Phe取代為Tyr；
(ag)將α次單元的第19號Ala取代為Val，將α次單元的第71號Arg取代為His，以及將α次單元的第126號Phe取代為Tyr；
(ah)將α次單元的第36號Thr取代為Met，將α次單元的第148號Gly取代為Asp，以及將α次單元的第204號Val取代為Arg；
(ai)將β次單元的第10號Thr取代為Asp，將β次單元的第118號Phe取代為Val，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；
(aj)將β次單元的第37號Phe取代為Leu，將β次單元的第108號Glu取代為Asp，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；
(ak)將β次單元的第37號Phe取代為Val，將β次單元的第108號Glu取代為Asp，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；
(al)將β次單元的第41號Phe取代為Ile，將β次單元的第51號Phe取代為Val，以及將β次單元的第108號Glu取代為Asp；
(am)將β次單元的第46號Met取代為Lys，將β次單元的第108號Glu取代為Arg，以及將β次單元的第212號Ser取代為Tyr；
(an)將β次單元的第48號Leu取代為Val，將β次單元的第108號Glu取代為Arg，以及將β次單元的第212號Ser取代為Tyr；
(ao)將β次單元的第127號Leu取代為Ser，將β次單元的第160號Arg取代為Trp，以及將β次單元的第186號Leu取代為Arg；
(ap)將α次單元的第6號Leu取代為Thr，將α次單元的第19號Ala取代為Val，將α次單元的第126號Phe取代為Tyr，將β次單元的第46號Met取代為Lys，將β次單元的第108號Glu取代為Arg，以及將β次單元的第212號Ser取代為Tyr；
(aq)將α次單元的第6號Leu取代為Thr，將α次單元的第19號Ala取代為Val，將α次單元的第126號Phe取代為Tyr，將β次單元的第48號Leu取代為Val，將β次單元的第108號Glu取代為Arg，以及將β次單元的第212號Ser取代為Tyr；
(ar)將α次單元的第6號Leu取代為Ala，將α次單元的第19號Ala取代為Val，將α次單元的第126號Phe取代為Tyr，將β次單元的第127號Leu取代為Ser，將β次單元的第160號Arg取代為Trp，以及將β次單元的第186號Leu取代為Arg；
(as)將α次單元的第6號Leu取代為Thr，將α次單元的第36號Thr取代為Met，將α次單元的第126號Phe取代為Tyr，將β次單元的第10號Thr取代為Asp，將β次單元的第118號Phe取代為Val，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；
(at)將α次單元的第19號Ala取代為Val，將α次單元的第71號Arg取代為His，將α次單元的第126號Phe取代為Tyr，將β次單元的第37號Phe取代為Leu，將β次單元的第108號Glu取代為Asp，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；
(au)將α次單元的第19號Ala取代為Val，將α次單元的第71號Arg取代為His，將α次單元的第126號Phe取代為Tyr，將β次單元的第37號Phe取代為Val，將β次單元的第108號Glu取代為Asp，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；
(av)將α次單元的第36號Thr取代為Met，將α次單元的第148號Gly取代為Asp，將α次單元的第204號Val取代為Arg，將β次單元的第41號Phe取代為Ile，將β次單元的第51號Phe取代為Val，以及將β次單元的第108號Glu取代為Asp；
(aw)將α次單元的第148號Gly取代為Asp，將α次單元的第204號Val取代為Arg，將β次單元的第108號Glu取代為Asp，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；
(ax)將α次單元的第36號Thr取代為Gly，以及將α次單元的第188號Thr取代為Gly；
(ay)將α次單元的第36號Thr取代為Ala，以及將α次單元的第48號Asn取代為Gln；
(az)將α次單元的第48號Asn取代為Glu，以及將β次單元的第146號Arg取代為Gly；
(ba)將α次單元的第36號Thr取代為Trp，以及將β次單元的第176號Tyr取代為Cys；
(bb)將β次單元的第176號Tyr取代為Met，以及將β次單元的第217號Asp取代為Gly；
(bc)將α次單元的第36號Thr取代為Ser，以及將β次單元的第33號Ala取代為Val；
(bd)將β次單元的第176號Tyr取代為Ala，以及將β次單元的第217號Asp取代為Val；
(be)將β次單元的第40號Thr取代為Val，以及將β次單元的第218號Cys取代為Met；
(bf)將β次單元的第33號Ala取代為Met，以及將β次單元的第176號Tyr取代為Thr；
(bg)將β次單元的第40號Thr取代為Leu，以及將β次單元的第217號Asp取代為Leu；
(bh)將β次單元的第40號Thr取代為Ile，以及將β次單元的第61號Ala取代為Val；
(bi)將β次單元的第61號Ala取代為Thr，以及將β次單元的第218號Cys取代為Ser；
(bj)將β次單元的第112號Lys取代為Val，以及將β次單元的第217號Asp取代為Met；
(bk)將β次單元的第61號Ala取代為Trp，以及將β次單元的第217號Asp取代為His；
(bl)將β次單元的第61號Ala取代為Leu，以及將β次單元的第112號Lys取代為Ile；
(bm)將β次單元的第146號Arg取代為Gly，以及將β次單元的第217號Asp取代為Ser；
(bn)將β次單元的第171號Lys取代為Ala，以及將β次單元的第217號Asp取代為Thr；
(bo)將β次單元的第150號Ala取代為Ser，以及將β次單元的第217號Asp取代為Cys；
(bp)將β次單元的第61號Ala取代為Gly，以及將β次單元的第150號Ala取代為Asn；
(bq)將β次單元的第61號Ala取代為Ser，以及將β次單元的第160號Arg取代為Met；
(br)將β次單元的第160號Arg取代為Cys，以及將β次單元的第168號Thr取代為Glu。
[8]一種對腈水合酵素變異體進行編碼的基因，上述腈水合酵素變異體是如[1]至[7]中任一項所述之腈水合酵素變異體。
[9]一種對腈水合酵素變異體進行編碼的基因，其包含對序列表的序列號：3所示的α次單元進行編碼的基因、及對序列表的序列號：4所示的β次單元進行編碼的基因，上述對腈水合酵素變異體進行編碼的基因的特徵在於包含選自由下述(a)～(l)所組成之鹼基取代位置中的至少1個鹼基取代：
(a)序列號：3的鹼基序列的第274號～第276號；
(b)序列號：3的鹼基序列的第280號～第282號；
(c)序列號：3的鹼基序列的第589號～第591號；
(d)序列號：4的鹼基序列的第10號～第12號；
(e)序列號：4的鹼基序列的第69號～第71號；
(f)序列號：4的鹼基序列的第235號～第237號；
(g)序列號：4的鹼基序列的第286號～第288號；
(h)序列號：4的鹼基序列的第319號～第321號；
(i)序列號：4的鹼基序列的第676號～第678號；
(j)序列號：4的鹼基序列的第328號～第330號、以及序列號4的第691號～第693號；
(k)序列號：4的鹼基序列的第616號～第618號、以及序列號4的鹼基序列的第688號～第690號；
(l)序列號：3的鹼基序列的第37號～第39號、序列號：3的鹼基序列的第79號～第81號、以及序列號：4的鹼基序列的第328號～第330號。
[10]如[9]所述之對腈水合酵素變異體進行編碼的基因，其中該對腈水合酵素變異體進行編碼的基因更包含選自由下述(m)～(u)所組成之鹼基取代位置中的至少1個鹼基取代：
(m)(b)或(g)時，序列號：3的鹼基序列的第37號～第39號；
(n)(b)或(h)時，序列號：3的鹼基序列的第79號～第81號；
(o)(d)及(f)；
(p)(f)時，序列號：4的鹼基序列的第688號～第690號；
(q)(a)及(i)；
(r)(i)時，序列號：3的鹼基序列的第37號～第39號、及序列號：4的鹼基序列的第616號～第618號；
(s)(a)及(d)時，序列號：4的鹼基序列的第616號～第618號；
(t)(c)及(h)時，序列號：4的鹼基序列的第688號～第690號；
(u)(f)時，序列號：4的鹼基序列的第688號～第690號、及序列號：4的鹼基序列的第691號～第693號。
[11]如[9]所述之對腈水合酵素變異體進行編碼的基因，其中當上述鹼基取代位置為(e)時，該對腈水合酵素變異體進行編碼的基因更包含選自由(a)、(c)、(f)、(i)、(h)、序列號：4的鹼基序列的第688號～第690號、及序列號：4的鹼基序列的第691號～第693號所組成之鹼基取代位置中的至少1個鹼基經取代為其他鹼基之取代。
[12]如[9]至[11]中任一項所述之對腈水合酵素變異體進行編碼的基因，其中當序列號：3的鹼基序列的第37號～第39號經鹼基取代時，ATC經取代為CTC；當序列號：3的鹼基序列的第79號～第81號經鹼基取代時，ATG經取代為ATC；當序列號：3的鹼基序列的第274號～第276號經鹼基取代時，GAC經取代為GAG；當序列號：3的鹼基序列的第280號～第282號經鹼基取代時，ATG經取代為ATC；當序列號：3的鹼基序列的第589號～第591號經鹼基取代時，GGC經取代為TGC；當序列號：4的鹼基序列的第10號～第12號經鹼基取代時，GTG經取代為ATG；當序列號：4的鹼基序列的第69號～第71號經鹼基取代時，GTC經取代為ATC；當序列號：4的鹼基序列的第235號～第237號經鹼基取代時，CAC經取代為AAC；當序列號：4的鹼基序列的第286號～第288號經鹼基取代時，CAG經取代為CGT；當序列號：4的鹼基序列的第319號～第321號經鹼基取代時，CCC經取代為ATG；當序列號：4的鹼基序列的第328號～第330號經鹼基取代時，GAG經取代為AAC；當序列號：4的鹼基序列的第616號～第618號經鹼基取代時，CCG經取代為CTG；當序列號：4的鹼基序列的第676號～第678號經鹼基取代時，GTC經取代為ATC；當序列號：4的鹼基序列的第688號～第690號經鹼基取代時，是GCG經取代為GAG；當序列號：4的鹼基序列的第691號～第693號經鹼基取代時，GCC經取代為GTC。
[13]如[9]至[12]中任一項所述之對腈水合酵素變異體進行編碼的基因，其中該對腈水合酵素變異體進行編碼的基因包含選自由下述(aa)～(br)所組成之鹼基取代位置中的至少1個鹼基取代，且具有腈水合酵素活性：
(aa)將序列號：3的鹼基序列的第106號～第108號ACG取代為ATG，以及將序列號：3的鹼基序列的第376號～第378號TTC取代為TAC；
(ab)將序列號：3的鹼基序列的第442號～第444號GGC取代為GAC，以及將序列號：3的鹼基序列的第610號～第612號GTC取代為CGC；
(ac)將序列號：4的鹼基序列的第151號～第153號TTC取代為GTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第322號～第324號GAG取代為GAT；
(ad)將序列號：4的鹼基序列的第352號～第354號TTC取代為GTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號～第600號GCC取代為GAG；
(ae)將序列號：4的鹼基序列的第478號～第480號CGG取代為TGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第556號～第558號CTG取代為CGG；
(af)將序列號：3的鹼基序列的第16號～第18號CTG取代為ACG，將序列號：3的鹼基序列的第106號～第108號ACG取代為ATG，以及將序列號：3的鹼基序列的第376號～第378號TTC取代為TAC；
(ag)將序列號：3的鹼基序列的第55號～第57號GCG取代為GTG，將序列號：3的鹼基序列的第211號～第213號CGT取代為CAT，以及將序列號：3的鹼基序列的第376號～第378號TTC取代為TAC；
(ah)將序列號：3的鹼基序列的第106號～第108號ACG取代為ATG，將序列號：3的鹼基序列的第442號～第444號GGC取代為GAC，以及將序列號：3的鹼基序列的第610號～第612號GTC取代為CGC；
(ai)將序列號：4的鹼基序列的第28號～第30號ACC取代為GAC，將序列號：4的鹼基序列的第352號～第354號TTC取代為GTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號～第600號GCC取代為GAG；
(aj)將序列號：4的鹼基序列的第109號～第111號TTC取代為CTC，將序列號：4的鹼基序列的第322號～第324號GAG取代為GAT，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號～第600號GCC取代為GAG；
(ak)將序列號：4的鹼基序列的第109號～第111號TTC取代為GTC，將序列號：4的鹼基序列的第322號～第324號GAG取代為GAT，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號～第600號GCC取代為GAG；
(al)將序列號：4的鹼基序列的第121號～第123號TTC取代為ATC，將序列號：4的鹼基序列的第151號～第153號TTC取代為GTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第322號～第324號GAG取代為GAT；
(am)將序列號：4的鹼基序列的第136號～第138號ATG取代為AAG，將序列號：4的鹼基序列的第322號～第324號GAG取代為CGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第634號～第636號TCC取代為TAC；
(an)將序列號：4的鹼基序列的第142號～第144號CTG取代為GTG，將序列號：4的鹼基序列的第322號～第324號GAG取代為CGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第634號～第636號TCC取代為TAC；
(ao)將序列號：4的鹼基序列的第379號～第381號CTG取代為TCG，將序列號：4的鹼基序列的第478號～第480號CGG取代為TGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第556號～第558號CTG取代為CGG；
(ap)將序列號：3的鹼基序列的第16號～第18號CTG取代為ACG，將序列號：3的鹼基序列的第55號～第57號GCG取代為GTG，將序列號：3的鹼基序列的第376號～第378號TTC取代為TAC，將序列號：4的鹼基序列的第136號～第138號ATG取代為AAG，將序列號：4的鹼基序列的第322號～第324號GAG取代為CGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第634號～第636號TCC取代為TAC；
(aq)將序列號：3的鹼基序列的第16號～第18號CTG取代為ACG，將序列號：3的鹼基序列的第55號～第57號GCG取代為GTG，將序列號：3的鹼基序列的第376號～第378號TTC取代為TAC，將序列號：4的鹼基序列的第142號～第144號CTG取代為GTG，將序列號：4的鹼基序列的第322號～第324號GAG取代為CGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第634號～第636號TCC取代為TAC；
(ar)將序列號：3的鹼基序列的第16號～第18號CTG取代為GCG，將序列號：3的鹼基序列的第55號～第57號GCG取代為GTG，將序列號：3的鹼基序列的第376號～第378號TTC取代為TAC，將序列號：4的鹼基序列的第379號～第381號CTG取代為TCG，將序列號：4的鹼基序列的第478號～第480號CGG取代為TGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第556號～第558號CTG取代為CGG；
(as)將序列號：3的鹼基序列的第16號～第18號CTG取代為ACG，將序列號：3的鹼基序列的第106號～第108號ACG取代為ATG，將序列號：3的鹼基序列的第376號～第378號TTC取代為TAC，將序列號：4的鹼基序列的第28號～第30號ACC取代為GAC，將序列號：4的鹼基序列的第352號～第354號TTC取代為GTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號～第600號GCC取代為GAG；
(at)將序列號：3的鹼基序列的第55號～第57號GCG取代為GTG，將序列號：3的鹼基序列的第211號～第213號CGT取代為CAT，將序列號：3的鹼基序列的第376號～第378號TTC取代為TAC，將序列號：4的鹼基序列的第109號～第111號TTC取代為CTC，將序列號：4的鹼基序列的第322號～第324號GAG取代為GAT，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號～第600號GCC取代為GAG；
(au)將序列號：3的鹼基序列的第55號～第57號GCG取代為GTG，將序列號：3的鹼基序列的第211號～第213號CGT取代為CAT，將序列號：3的鹼基序列的第376號～第378號TTC取代為TAC，將序列號：4的鹼基序列的第109號～第111號TTC取代為GTC，將序列號：4的鹼基序列的第322號～第324號GAG取代為GAT，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號～第600號GCC取代為GAG；
(av)將序列號：3的鹼基序列的第106號～第108號ACG取代為ATG，將序列號：3的鹼基序列的第442號～第444號GGC取代為GAC，將序列號：3的鹼基序列的第610號～第612號GTC取代為CGC，將序列號：4的鹼基序列的第121號～第123號TTC取代為ATC，將序列號：4的鹼基序列的第151號～第153號TTC取代為GTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第322號～第324號GAG取代為GAT；
(aw)將序列號：3的鹼基序列的第442號～第444號GGC取代為GAC，將序列號：3的鹼基序列的第610號～第612號GTC取代為CGC，將序列號：4的鹼基序列的第322號～第324號GAG取代為GAT，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號～第600號GCC取代為GAG；
(ax)將序列號：3的鹼基序列的第106號～第108號ACG取代為GGG，以及將序列號：3的鹼基序列的第562號～第564號ACC取代為GGC；
(ay)將序列號：3的鹼基序列的第106號～第108號ACG取代為GCG，以及將序列號：3的鹼基序列的第142號～第144號AAC取代為CAA；
(az)將序列號：3的鹼基序列的第142號～第144號AAC取代為GAA，以及將序列號：4的鹼基序列的第436號～第438號CGG取代為GGG；
(ba)將序列號：3的鹼基序列的第106號～第108號ACG取代為TGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第526號～第528號TAC取代為TGC；
(bb)將序列號：4的鹼基序列的第526號～第528號TAC取代為ATG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號～第651號GAC取代為GGC；
(bc)將序列號：3的鹼基序列的第106號～第108號ACG取代為TCG，以及將序列號：4的鹼基序列的第97號～第99號GCG取代為GTG；
(bd)將序列號：4的鹼基序列的第526號～第528號TAC取代為GCC，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號～第651號GAC取代為GTC；
(be)將序列號：4的鹼基序列的第118號～第120號ACG取代為GTG，以及將序列號：4的鹼基序列的第652號～第654號TGC取代為ATG；
(bf)將序列號：4的鹼基序列的第97號～第99號GCG取代為ATG，以及將序列號：4的鹼基序列的第526號～第528號TAC取代為ACC；
(bg)將序列號：4的鹼基序列的第118號～第120號ACG取代為CTG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號～第651號GAC取代為CTC；
(bh)將序列號：4的鹼基序列的第118號～第120號ACG取代為ATT，以及將序列號：4的鹼基序列的第181號～第183號GCC取代為GTC；
(bi)將序列號：4的鹼基序列的第181號～第183號GCC取代為ACG，以及將序列號：4的鹼基序列的第652號～第654號TGC取代為TCC；
(bj)將序列號：4的鹼基序列的第334號～第336號AAG取代為GTG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號～第651號GAC取代為ATG；
(bk)將序列號：4的鹼基序列的第181號～第183號GCC取代為TGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號～第651號GAC取代為CAC；
(bl)將序列號：4的鹼基序列的第181號～第183號GCC取代為CTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第334號～第336號AAG取代為ATT；
(bm)將序列號：4的鹼基序列的第436號～第438號CGG取代為GGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號～第651號GAC取代為AGC；
(bn)將序列號：4的鹼基序列的第511號～第513號AAG取代為GCG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號～第651號GAC取代為ACC；
(bo)將序列號：4的鹼基序列的第448號～第450號GCG取代為TCG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號～第651號GAC取代為TGT；
(bp)將序列號：4的鹼基序列的第181號～第183號GCC取代為GGC，以及將序列號：4的鹼基序列的第448號～第450號GCG取代為AAT；
(bq)將序列號：4的鹼基序列的第181號～第183號GCC取代為TCG，以及將序列號：4的鹼基序列的第478號～第480號CGG取代為ATG；
(br)將序列號：4的鹼基序列的第478號～第480號CGG取代為TGT，以及將序列號：4的鹼基序列的第502號～第504號ACG取代為GAG。
[14]一種經連結的DNA，其於如[9]至[13]中任一項所述之對腈水合酵素變異體進行編碼的基因的5'末端上游更包含基因表達所必需的啟動子序列，並且於該啟動子的3'末端的下游包含序列號：7所含的核糖體結合序列。
[15]一種質體，其含有如[14]所述之DNA。
[16]一種轉形體，其是藉由如[15]所述之質體將宿主細胞轉形而獲得。
[17]一種腈水合酵素變異體的生產方法，其特徵在於包含如下步驟：利用培養基培養如[16]所述之轉形體，於該轉形體中生產基於質體所含有的腈水合酵素基因的腈水合酵素變異體。
根據本發明，於包含序列表的序列號：1所示的α次單元、及序列表的序列號：2所示的β次單元的腈水合酵素中，包含選自由上述(a)～(1)所組成之胺基酸取代位置中的至少1個胺基酸經取代為其他胺基酸之取代。藉此，可同時提高腈水合酵素的反應初速度及酵素穩定性，提高酵素製備物的每單位重量的活性值，並且可降低由工業利用上的溫度變動等所引起的酵素失去活性的風險。因此，可以更少的酵素量來穩定地生產醯胺化合物，從可降低醯胺化合物的製造成本。
根據本發明，可提供一種與野生型腈水合酵素相比較，反應初速度及酵素穩定性提高的新穎的腈水合酵素變異體，從而可降低醯胺化合物製造成本中所佔的該酵素的製造成本。
為讓本發明之上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
上述目的、及其他目的、特徵及優點藉由如下所述的較好實施形態而進一步明確。以下，對本發明進行更加詳細的說明。
本發明的腈水合酵素變異體包含至少1個胺基酸經取代為其他胺基酸的取代，該取代藉由小於等於3個且大於等於1個胺基酸取代而改善腈水合酵素的兩種或兩種以上性質。
所謂以本發明的腈水合酵素變異體所改善的性質，有與使腈基進行水合而轉變成醯胺基的反應本身相關的物性及酵素穩定性。所謂與反應本身相關的物性，有酵素的活牲、基質特異性、Vmax、Km及反應初速度。酵素穩定性中包含熱穩定性、對基質的穩定性、對產物的穩定性。
本發明的腈水合酵素變異體較好的是包含改善源自嗜熱菌(thermophilic bacteria)之腈水合酵素的性質的至少1個胺基酸經取代為其他胺基酸之取代。嗜熱菌的例子可適宜使用屬於假諾卡氏菌(Psuedonocardia)屬的菌，具體可舉出嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)。
更具體而言，本發明的腈水合酵素變異體是於包含序列表的序列號：1所示的α次單元、及序列表的序列號：2所示的β次單元的腈水合酵素中，如表I所示，選自(a)～(1)中的至少1個胺基酸取代位置經取代為其他胺基酸。藉此，本發明的腈水合酵素變異體可具有比專利文獻1中所記載的野生型腈水合酵素更高的反應初速度及酵素穩定性。
表I所示的(a)～(1)的胺基酸取代可組合多個，亦可與(a)～(1)以外的不同位置的胺基酸取代進行組合。例如當胺基酸取代位置為(e)時，選自由(a)、(c)、(f)、(i)、(h)、β次單元的第230號、及β次單元的第231號所組成之組群中的至少1個胺基酸可取代為其他胺基酸。可與(a)～(1)進行組合的胺基酸取代的例子例如有表II之例子。
本發明的腈水合酵素變異體可於上述(a)～(x)的任一腈水合酵素變異體中，進而如表III所示，於序列號1及序列號2的腈水合酵素的胺基酸位置(aa)～(br)包含變異。
於本發明中，所謂「腈水合酵素活性」是指藉由水合將各種化合物的腈基轉變成醯胺基的腈水合活性，更好的是指將丙烯腈轉變成丙烯醯胺的活性。
於本發明中，所謂「提高腈水合酵素活性」是指提高反應初速度。本發明中的「反應初速度」可以如下方式進行確認。首先，於含有2.5%(v/v)之丙烯腈作為基質的50mM三(羥甲基)胺基甲烷-鹽酸(Tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride，Tris-HCl)水溶液(pH值8.0)中添加腈水合酵素樣品。亦可使用微生物的菌體及培養液、或腈水合酵素粗純化物來代替腈水合酵素樣品。添加腈水合酵素後，於20℃下反應15分鐘。然後於反應液中添加1M磷酸，停止反應，對生成的丙烯醯胺進行定量。丙烯醯胺量可藉由高效液相層析法(high performance liquid chromatograph，HPLC)進行分析。
本發明中的所謂「反應初速度的提高」是指與野生型的腈水合酵素、以及先前公知的腈水合酵素變異體相比較，本發明的腈水合酵素變異體的反應初速度顯著提高，具體而言是指提高至1.2倍以上。
於本發明中，所謂「提高酵素穩定性」是指提高腈水合酵素的熱穩定性。熱穩定性提高的腈水合酵素被認為蛋白質的結構穩定性得到強化，因此期待加熱以外的應力即對有機溶劑、或高濃度的基質、產物的穩定性亦增加。
本發明中的所謂「酵素的熱穩定性」可以如下方式進行確認。首先，將腈水合酵素樣品於60℃下加熱處理2小時後，恢復至20℃，添加含有2.5%(v/v)之丙烯腈作為基質的50mM三(羥甲基)胺基甲烷-鹽酸水溶液(pH值8.0)。亦可使用微生物的菌體及培養液、或腈水合酵素粗純化物來代替腈水合酵素樣品。將經加熱處理的該腈水合酵素與基質加以混合後，於20℃下反應15分鐘，然後測定反應初速度。
本發明中的所謂「酵素的熱穩定性的提高」是指與同樣施加了加熱處理的野生型腈水合酵素、以及先前公知的腈水合酵素變異體相比較，本發明的腈水合酵素變異體的加熱處理後的反應初速度顯著提高，具體的而言是指提高至1.2倍以上。
本發明中的野生型腈水合酵素較好的是專利文獻1中所記載的源自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酵素，可使該野生型腈水合酵素於轉形體內大量表達的質體以及藉由該質體進行轉形而成的細胞株可舉出MT-10822(受託編號為FERMBP-5785，自1996年2月7日寄託於茨城縣築波市東1-1-1的獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄託中心)。本發明中的所謂先前公知的腈水合酵素變異體可舉出專利文獻1～4中所記載的腈水合酵素變異體。
本發明的腈水合酵素變異體除了提高腈水合酵素活性以外，還具有如下特性。關於該酵素，α次單元與β次單元凝聚而成的二聚物成為該酵素的基本結構單位，該二聚物進一步凝聚而形成四聚物。α次單元的第111號半胱胺酸(cysteine)殘基轉譯成半胱亞磺酸(cysteine sulfinic acid，Cys-SOOH)，第113號半胱胺酸殘基轉譯成半胱次磺酸(cysteine sulfenic acid，Cys-SOH)後，接受修飾，經由該修飾胺基酸殘基而使α次單元的多肽鏈與鈷原子鍵結，從而形成活性中心。反應較好的是可於0℃～60℃的範圍內進行，反應時的pH值通常是於4～10、較好的是6～9的範圍進行選擇。
本發明的腈水合酵素變異體可以如下方式進行製造。
首先，準備含有對腈水合酵素變異體進行編碼的DNA的質體，使用該質體將任意宿主細胞轉形而獲得轉形體或細胞株。接著，培養上述轉形體或細胞株而產生腈水合酵素變異體。
對野生型腈水合酵素進行編碼的基因包含序列表的序列號：3所示的鹼基序列、及序列表的序列號：4所示的鹼基序列。序列表的序列號：3所示的鹼基序列與由序列表的序列號：1所組成的胺基酸序列相對應，序列表的序列號：4所示的鹼基序列與由序列表的序列號：2所組成的胺基酸序列相對應。藉由對序列號3及/或序列號4的鹼基序列進行鹼基取代，可獲得對腈水合酵素變異體進行編碼的DNA。具體而言，表I所示的(a)～(l)的胺基酸取代可如表IV-1所示，藉由鹼基取代而實現。
另外，表II所示的胺基酸取代可如表IV-2所示，藉由鹼基取代而實現。
另外，表III所示的胺基酸取代可如表V所示，藉由鹼基取代而實現。
質體除了含有如上所述的對腈水合酵素變異體的α次單元進行編碼的基因、對β次單元進行編碼的基因或者腈水合酵素變異體基因以外，可具有如下構成：可利用在各基因表達所需要的控制區域(control region)及自主複製(autonomous replication)所需要的區域等對任意宿主細胞進行轉形而獲得的轉形體或細胞株，來產生腈水合酵素。此處所謂任意宿主細胞的一例可舉出大腸桿菌。
表達所必需的控制區域可舉出：啟動子序列(包含控制轉錄的操縱子序列(operator sequence))、核糖體結合序列(SD序列)、及轉錄終止序列(transcription termination sequence)等。具體的啟動子序列的例子可舉出：源自大腸桿菌的色胺酸操縱子(tryptophan operon)的trp啟動子、乳糖操縱子(lactose operon)的lac啟動子、源自λ噬菌體(lambda phage)的PL啟動子及PR啟動子等。另外，亦可利用如tac啟動子或trc啟動子那樣經人為設計、改變的序列。
核糖體結合序列較理想的是序列號：7中所含的含有TAAGGAGGT的序列，關於該些控制區域於質體上的序列順序，啟動子序列與核糖體結合序列較理想的是位於較對腈水合酵素變異體進行編碼的基因更5'末端側上游，轉錄終止序列較理想的是位於較對腈水合酵素變異體進行編碼的基因更3'末端側下游。此外，藉由此種控制區域，腈水合酵素變異體的α次單元基因及β次單元基因可分別表達為獨立的順反子(cistron)，亦可藉由共用的控制區域而表達為多順反子(polycistron)。
滿足以上必要條件的質體載體(plasmid vector)的例子可舉出大腸桿菌中的具有可進行自主複製之區域的pBR322、pUC18、pBluescript、pKK223-3、pSC101。
將本發明的對腈水合酵素變異體進行編碼的基因與該腈水合酵素變異體的活性表達所必需的區域一起插入至上述質體載體中來構築本發明的質體的方法、利用該質體將所需宿主細胞進行轉形的方法、以及使該轉形體內產生腈水合酵素的方法中，例如可利用「Molecular Cloning 3rd Edition」(J. Sambrook等人；Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)等中所記載的於分子生物學、生物工程學、基因工程學之領域中公知的一般方法與宿主細胞。
利用上述質體將所需宿主細胞轉形而得的轉形體可藉由以培養基進行培養，來生產基於該質體所含有的腈水合酵素基因的腈水合酵素變異體。於宿主細胞為大腸桿菌的情況下，通常使用LB培養基(Luria-Bertani medium)或M9培養基等作為培養該轉形體的培養基，更好的是可使此種培養基成分中存在大於等於0.1μg/mL的Fe離子及Co離子，對該轉形體進行植菌後，使其於適當的培養溫度(通常為20℃～50℃)下生長即可。
於生產使本發明的對腈水合酵素變異體進行編碼的基因表達出而具有所需酵素活性的腈水合酵素變異體的情況下，對參與腈水合酵素之活性化的蛋白質進行編碼的基因成為必需。
該所謂參與腈水合酵素之活性化的蛋白質，是指具有該蛋白質之表達的有無直接影響腈水合酵素之活性化的性質的蛋白質，可舉出日本專利特開平11-253168號公報中所記載的參與源自嗜熱假諾卡氏菌的腈水合酵素活性化的蛋白質(腈水合酵素活性化蛋白質)作為其代表例。將該腈水合酵素活性化蛋白質的序列示於序列表：5及6中。
可使用本發明的腈水合酵素變異體，以如下方式來製造醯胺化合物。首先，對產生本發明的腈水合酵素變異體的轉形體或細胞株進行培養，使所得的培養液、細胞或細胞處理物於介質中與腈化合物相接觸。藉此製造對應的醯胺化合物。
此處所謂細胞處理物是指：來自該轉形體的萃取物或磨碎物，對該些萃取物或磨碎物的腈水合酵素活性餾分進行分離而獲得的粗酵素製備物或進一步純化而獲得的酵素純化物等的後分離物，以及使用適當的方法將該轉形體或該轉形體的萃取物、磨碎物或後分離物固定化而成的固定化物。接觸的溫度並無特別限定，較好的是腈水合酵素變異體不會失去活性的溫度範圍內，更好的是0℃～60℃。腈化合物若為本發明的腈水合酵素變異體可作為基質而發揮作用的化合物，則並無特別限定，較好的是可舉出乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正丁腈、異丁腈、巴豆腈(crotononitrile)、α-羥基異丁腈等碳數為2～4的腈化合物作為其代表例。該腈化合物於水性介質中的濃度並無特別限定，另外反應溫度亦無特別限定，較好的是該腈水合酵素不會失去活性的溫度範圍內，更好的是0℃～60℃。此外，為了以更少的酵素量生產醯胺化合物，較好的是於醯胺化合物的製造條件下使用具有一定穩定性的腈水合酵素變異體。
接著，對本發明的作用效果進行詳細說明。本發明者等人反覆進行銳意研究，結果發現如下腈水合酵素變異體：藉由包含由小於等於3個且大於等於1個胺基酸取代而改善兩種以上性質的至少1個胺基酸經取代為其他胺基酸之取代，而與先前的腈水合酵素相比較，與反應本身相關的物性、及酵素穩定性均得到提高。並且發現，尤其是對於包含序列表的序列號：1所示的α次單元、及序列表的序列號：2所示的β次單元的腈水合酵素，藉由將選自由上述(a)～(1)所組成之胺基酸取代位置中的至少1個胺基酸取代為其他胺基酸，不僅可提高腈水合酵素的反應初速度，而且可同時提高酵素穩定性。藉此，可同時實現酵素反應的效率化與酵素的操作性(handling)。另外，藉由使用同時提高反應初速度及酵素穩定性的腈水合酵素，可提高酵素製備物的每單位重量的活性值，而且可降低由工業利用上的溫度變動等所引起的酵素失去活性的風險。因此，可以更少的酵素量來穩定地生產醯胺化合物，從而可降低醯胺化合物的製造成本。
以上，對本發明的實施形態進行了闡述，但該些實施形態為本發明的例示，亦可採用上述以外的各種構成。
實施例
藉由以下實施例對本發明進行更加詳細的說明，但本發明並不受以下實施例的任何限定。
[實例1]改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)的取得
利用使用專利文獻1的實例3中所記載的質體pPT-DB1、及序列表的序列號：7及8中所記載的引子(primer)作為模板的PCR反應，而獲得約0.7kbp的基因片段。將上述PCR片段利用限制酵素(restriction enzyme) EcoRI及NotI進行切割後，對該限制酵素處理液進行苯酚/氯仿萃取以及乙醇沈澱，以對該DNA片段進行純化。同樣地，利用EcoRI及NotI來切割pPT-DB1，進行瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)，自瓊脂糖凝膠中僅切出約3.9kbp的DNA片段。將如此所得的約0.7kbp與約3.9kbp的DNA片段使用DNA連接套組(DNA ligation kit)(寶酒造公司製造)加以連結，從而製作上述核糖體結合序列經改變的腈水合酵素表達質體(1)。
利用該質體將大腸桿菌HB101的勝任細胞(competent cell)(東洋紡績公司製造)進行轉形而獲得轉形體(1)。另外，利用鹼性十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀(sequencer)來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認pPT-DB1中具有表1所示的經改變的核糖體結合序列。
藉由以下方法，對使用以上述方式所得的轉形體(1)以及含有成為其基礎的pPT-DB1的轉形體、MT-10822(受託編號為FERM BP-5785，自1996年2月7日寄託於茨城縣築波市東1-1-1的獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄託中心)來製造醯胺化合物時的反應初速度進行比較。
〈反應初速度的比較〉
於試驗管中，製備含有40μg/mL的硫酸鐵七水合物及10μg/mL的氯化鈷二水合物的5mL的LB液體培養基，利用121℃、20分鐘的高壓釜(autoclave)進行殺菌。於該培養基中，以最終濃度成為100μg/mL的方式添加安比西林(ampicillin)後，將各轉形體植菌於一白金耳(platinum loop)，於37℃、200rpm下分別培養約20小時。自該培養完畢液中取出40μL，使其懸浮於740μL的54mM三(羥甲基)胺基甲烷-鹽酸水溶液(pH值8.0)中，一面於其中添加20μL的丙烯腈而於20℃下緩緩攪拌，一面使其反應15分鐘，從而生成丙烯醯胺。反應完畢後，使用HPLC來分析反應液中的丙烯醯胺含量。
〈酵素的熱穩定性的比較〉
藉由離心分離(5000G，15分鐘)，自上述轉形體的培養完畢液中分離出各轉形體。
使各轉形體0.1g分別懸浮於20ml的50mM三(羥甲基)胺基甲烷-鹽酸水溶液(pH值8.0)，於60℃下加熱處理2小時。加熱處理後，使其恢復至20℃，添加作為基質的0.5ml的丙烯腈，使其於20℃下反應15分鐘，然後測定反應初速度。
〈分析條件〉
分析機器：日本分光HPLC
管柱：YMC Pack ODS-A(150×6.00mm)
分析溫度：40℃
流動相：3%乙腈、10mM磷酸
反應及分析是對各轉形體進行3次或3次以上，以修正分注操作等等中的資料偏差。
對轉形體(1)與MT-10822的反應初速度及熱穩定性，即於上述反應條件下生成的丙烯醯胺量進行比較的結果為，藉由新追加表1所示的經改變的核糖體結合序列，可表現出1.15倍的反應初速度的提高，且熱穩定性得以維持。
[參考例1]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(2)
為了取得表達如表2所示使腈水合酵素於(av)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(2)，而以專利文獻2的實例79中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(2)。利用該質體，對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(2)。
[參考例2]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(3)
為了取得表達如表2所示使腈水合酵素於(bc)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(3)，而使用寶酒造公司製造的「LA PCR in vitro mutagenesis Kit」(以後稱作突變套組)進行定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，進行PCR反應。
PCR反應No.1是於含有序列表的序列號：9中記載的引子以及M13引子M4(於序列表的序列號：10中記載序列)各50pmol的總量為50μL的系統(組成是根據突變套組中記載的條件而有所不同)中，藉由將熱變性(98℃)為15秒、退火(annealing)(55℃)為30秒、延伸反應(extension reaction)(72℃)為120秒的條件重複25個循環而進行。
PCR反應No.2是於含有MUT4引子(於序列表的序列號：11中記載序列)以及M13引子RV(於序列表的序列號：12中記載序列)各50pmol的總量為50μL的系統(組成是根據變異套組中記載的條件而有所不同)中，藉由與PCR反應No.1相同的操作而進行。
利用使用PCR反應No.1及No.2的反應完畢液各5μL的瓊脂糖電泳(瓊脂糖濃度為1.0重量百分比(wt%))來分析DNA擴增產物(DNA amplification product)，結果可確認擴增DNA產物的存在。使用Microcon 100(寶酒造公司製造)，自各PCR反應完畢液中除去過剩的引子及dNTP後，添加TE，製備各為50μL的溶液。製備各含有該TE溶液0.5μL的總量為47.5μL的退火溶液(組成是根據變異套組中記載的條件而有所不同)，進行10分鐘的熱變性處理(98℃)後，以一定的速度，以60分鐘進行冷卻，直至達到37℃為止，接著於37℃下保持15分鐘，藉此進行退火處理。
於退火處理液中添加0.5μL的TaKaRa LA Taq(寶生物工程(TaKaRa Bio)股份有限公司製造)，於72℃下進行3分鐘的加熱處理，從而完成異源雙鏈。
於其中添加M13引子M4(於序列表的序列號：10中記載序列)以及M13引子RV(於序列表的序列號：12中記載序列)各50pmol，使總量為50μL後，藉由將熱變性(98℃)為15秒、退火(55℃)為30秒、延伸反應(72℃)為120秒的條件重複25個循環而進行PCR反應No.3。利用使用PCR反應No.3的反應完畢液5μL的瓊脂糖電泳(使用Sigma公司製造的Type VII低熔點瓊脂糖；瓊脂糖濃度為0.8wt%)來分析DNA擴增產物，結果可確認約2kb的擴增DNA產物的存在。
接著，自瓊脂糖凝膠中僅切出約2kb的DNA片段，將該瓊脂糖片(約0.1g)粉碎成細粉，使其懸浮於1mL的TE溶液中，然後於55℃下保溫1小時，使瓊脂糖完全熔解。對該熔解液進行苯酚/氯仿萃取以及乙醇沈澱，以對該DNA片段進行純化，最終將其溶解於10μL的TE中。將經純化的約2kb的擴增DNA片段利用限制酵素EcoRI及HindIII進行切割後，對該限制酵素處理液進行苯酚/氯仿萃取以及乙醇沈澱，以對該DNA片段進行純化，最終將其溶解於10μL的TE中。
同樣地，利用EcoRI及HindIII來切割實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)，進行瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma公司製造的Type VII低熔點瓊脂糖；瓊脂糖濃度為0.7%)，自瓊脂糖凝膠中僅切出約2.7kb的DNA片段。將切出的瓊脂糖片(約0.1g)粉碎成細粉，使其懸浮於1mL的TE溶液中，然後於55℃下保溫1小時，使瓊脂糖完全熔解。對該熔解液進行苯酚/氯仿萃取以及乙醇沈澱，以對該DNA片段進行純化，最終將其溶解於10μL的TE中。
將以上述方式所得的約2kbp與約2.7kbp的DNA片段使用DNA連接套組(寶酒造公司製造)加以連結後，對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形。以自該轉形體中萃取出的質體為模板，使用序列號：13中記載的引子代替序列號：9中記載的引子，實施上述操作，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(3)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(3)。
[參考例3]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(4)
為了取得表達如表2所示使腈水合酵素於(bh)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(4)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號14及15中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(4)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(4)。
[實例2]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(5)
為了取得表達如表3所示使腈水合酵素於(a)及(av)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(5)，而以自上述參考例1中記載的轉形體(2)回收所得的質體(2)為模板，使用序列表的序列號：16中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(5)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(5)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例1中記載的質體(2)中含有新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu之變異的符合目的之序列。
藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(5)以及成為其基礎的轉形體(2)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(5)藉由新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu的變異，而對於轉形體(2)表現出1.65倍的反應初速度的提高、以及1.25倍的熱穩定性的提高。
[實例3]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(6)
為了取得表達如表3所示使腈水合酵素於(a)及(bc)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(6)，而以自上述參考例2中記載的轉形體(3)回收所得的質體(3)為模板，使用序列表的序列號：16中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(6)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(6)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例2中記載的質體(3)中含有新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(6)以及成為其基礎的轉形體(3)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(6)藉由新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu的變異，而對於轉形體(3)表現出1.63倍的反應初速度的提高、以及1.23倍的熱穩定性的提高。
[實例4]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(7)
為了取得表達如表3所示使腈水合酵素於(a)及(bh)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(7)，而以自上述參考例3中記載的轉形體(4)回收所得的質體(4)為模板，使用序列表的序列號：16中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(7)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(7)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例3中記載的質體(4)中含有新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(7)以及成為其基礎的轉形體(4)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(7)藉由新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu的變異，而對於轉形體(4)表現出1.58倍的反應初速度的提高、以及1.30倍的熱穩定性的提高。
[參考例4]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(8)
為了取得表達如表4所示使腈水合酵素於(ak)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(8)，而以專利文獻2的實例68中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(8)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(8)。
[參考例5]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(9)
為了取得表達如表4所示使腈水合酵素於(ap)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(9)，而以專利文獻2的實例73中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(9)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(9)。
[參考例6]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(10)
為了取得表達如表4所示使腈水合酵素於(bp)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(10)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：17及18中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(10)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(10)。
[實例5]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(11)
為了取得表達如表5所示使腈水合酵素於(b)及(ak)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(11)，而以自上述參考例4中記載的轉形體(8)回收所得的質體(8)為模板，使用序列表的序列號：19中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(11)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(11)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例4中記載的質體(8)中含有新追加有將α次單元的第94號Met取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(11)以及成為其基礎的轉形體(8)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(11)藉由新追加有將α次單元的第94號Met取代為Ile的變異，而對於轉形體(8)表現出1.45倍的反應初速度的提高、以及1.38倍的熱穩定性的提高。
[實例6]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(12)
為了取得表達如表5所示使腈水合酵素於(b)及(ap)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(12)，而以自上述參考例5中記載的轉形體(9)回收所得的質體(9)為模板，使用序列表的序列號：19中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(12)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(12)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例5中記載的質體(9)中含有新追加有將α次單元的第94號Met取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(12)以及成為其基礎的轉形體(9)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(12)藉由新追加有將α次單元的第94號Met取代為Ile的變異，而對於轉形體(9)表現出1.40倍的反應初速度的提高、以及1.25倍的熱穩定性的提高。
[實例7]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(13)
為了取得表達如表5所示使腈水合酵素於(b)及(bp)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(13)，而以自上述參考例6中記載的轉形體(10)回收所得的質體(10)為模板，使用序列表的序列號：19中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(13)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(13)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例6中記載的質體(10)中含有新追加有將α次單元的第94號Met取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(13)以及成為其基礎的轉形體(10)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(13)藉由新追加有將α次單元的第94號Met取代為Ile的變異，而對於轉形體(10)表現出1.32倍的反應初速度的提高、以及1.35倍的熱穩定性的提高。
[參考例7]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(14)
為了取得表達如表6所示使腈水合酵素於(an)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(14)，而以專利文獻2的實例71中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(14)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(14)。
[參考例8]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(15)
為了取得表達如表6所示使腈水合酵素於(be)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(15)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：20及21中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(15)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(15)。
[參考例9]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(16)
為了取得表達如表6所示使腈水合酵素於(br)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(16)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：22及23中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(16)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(16)。
[實例8]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(17)
為了取得表達如表7所示使腈水合酵素於(c)及(an)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(17)，而以自上述參考例7中記載的轉形體(14)回收所得的質體(14)為模板，使用序列表的序列號：24中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(17)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(17)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例7中記載的質體(14)中含有新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(17)以及成為其基礎的轉形體(14)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(17)藉由新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys的變異，而對於轉形體(14)表現出1.80倍的反應初速度的提高、以及1.25倍的熱穩定性的提高。
[實例9]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(18)
為了取得表達如表7所示使腈水合酵素於(c)及(be)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(18)，而以自上述參考例8中記載的轉形體(15)回收所得的質體(15)為模板，使用序列表的序列號：24中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(18)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(18)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例8中記載的質體(15)中含有新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(18)以及成為其基礎的轉形體(15)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(18)藉由新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys的變異，而對於轉形體(15)表現出1.86倍的反應初速度的提高、以及1.40倍的熱穩定性的提高。
[實例10]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(19)
為了取得表達如表7所示使腈水合酵素於(c)及(br)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(19)，而以自上述參考例9中記載的轉形體(16)回收所得的質體(16)為模板，使用序列表的序列號：24中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(19)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(19)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例9中記載的質體(16)中含有新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(19)以及成為其基礎的轉形體(16)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(19)藉由新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys的變異，而對於轉形體(16)表現出1.68倍的反應初速度的提高、以及1.20倍的熱穩定性的提高。
[參考例10]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(20)
為了取得表達如表8所示使腈水合酵素於(ar)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(20)，而以專利文獻2的實例75中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(20)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(20)。
[參考例17]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(21)
為了取得表達如表8所示使腈水合酵素於(ax)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(21)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：25及26中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(21)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(21)。
[參考例12]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(22)
為了取得表達如表8所示使腈水合酵素於(bd)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(22)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：27及28中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(22)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(22)。
[實例11]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(23)
為了取得表達如表9所示使腈水合酵素於(d)及(ar)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(23)，而以自上述參考例10中記載的轉形體(20)回收所得的質體(20)為模板，使用序列表的序列號：29中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(23)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(23)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例10中記載的質體(20)中含有新追加有將β次單元的第4號Val取代為Met之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(23)以及成為其基礎的轉形體(20)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(23)藉由新追加有將β次單元的第4號Val取代為Met的變異，而對於轉形體(20)表現出1.25倍的反應初速度的提高、以及1.35倍的熱穩定性的提高。
[實例12]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(24)
為了取得表達如表9所示使腈水合酵素於(d)及(ax)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(24)，而以自上述參考例11中記載的轉形體(21)回收所得的質體(21)為模板，使用序列表的序列號：29中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(24)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(24)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例11中記載的質體(21)中含有新追加有將β次單元的第4號Val取代為Met之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(24)以及成為其基礎的轉形體(21)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(24)藉由新追加有將β次單元的第4號Val取代為Met的變異，而對於轉形體(21)表現出1.32倍的反應初速度的提高、以及1.39倍的熱穩定性的提高。
[實例13]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(25)
為了取得表達如表9所示使腈水合酵素於(d)及(bd)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(25)，而以自上述參考例12中記載的轉形體(22)回收所得的質體(22)為模板，使用序列表的序列號：29中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(25)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(19)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例12中記載的質體(22)中含有新追加有將β次單元的第4號Val取代為Met之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(25)以及成為其基礎的轉形體(22)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
將轉形體(25)與轉形體(22)的反應初速度及熱穩定性進行比較的結果為，轉形體(25)藉由新追加有將β次單元的第4號Val取代為Met的變異，而對於轉形體(22)表現出1.25倍的反應初速度的提高、以及1.25倍的熱穩定性的提高。
[參考例13]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(26)
為了取得表達如表10所示使腈水合酵素於(ao)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(26)，而以專利文獻2的實例72中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(26)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(26)。
[參考例14]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(27)
為了取得表達如表10所示使腈水合酵素於(at)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(27)，而以專利文獻2的實例77中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(27)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(27)。
[比較例1]腈水合酵素活性提高的胺基酸取代體的取得(28)
為了取得表達如表11所示使腈水合酵素於β次單元的第8號及(ao)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(28)，而以自上述參考例13中記載的轉形體(26)回收所得的質體(26)為模板，使用序列表的序列號：30中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(28)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(28)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例13中記載的質體(26)中含有新追加有將β次單元的第8號Gly取代為Ala之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(28)以及成為其基礎的轉形體(26)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
上述比較的結果為，轉形體(28)藉由新追加有將β次單元的第8號Gly取代為Ala的變異，而對於轉形體(26)表現出1.35倍的反應初速度的提高、以及0.65倍的熱穩定性的降低。
[比較例2]腈水合酵素活性提高的胺基酸取代體的取得(29)
為了取得表達如表11所示使腈水合酵素於β次單元的第8號及(at)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(29)，而以自上述參考例14中記載的轉形體(27)回收所得的質體(27)為模板，使用序列表的序列號：30中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(29)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(29)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例14中記載的質體(27)中含有新追加有將β次單元的第8號Gly取代為Ala之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(29)以及成為其基礎的轉形體(27)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(29)藉由新追加有將β次單元的第8號Gly取代為Ala的變異，而對於轉形體(27)表現出1.40倍的反應初速度的提高、以及0.31倍的熱穩定性的降低。
[比較例3]腈水合酵素活性提高的胺基酸取代體的取得(30)
為了取得表達如表11所示使腈水合酵素於β次單元的第8號及(br)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(30)，而以自上述參考例9中記載的轉形體(16)回收所得的質體(16)為模板，使用序列表的序列號：30中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(30)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(30)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例9中記載的質體(16)中含有新追加有將β次單元的第8號Gly取代為Ala之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(30)以及成為其基礎的轉形體(16)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(30)藉由新追加有將β次單元的第8號Gly取代為Ala的變異，而對於轉形體(16)表現出1.32倍的反應初速度的提高、以及0.52倍的熱穩定性的降低。
[參考例15]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(31)
為了取得表達如表12所示使腈水合酵素於(au)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(31)，而以專利文獻2的實例78中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(31)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(31)。
[參考例16]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(32)
為了取得表達如表12所示使腈水合酵素於(bf)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(32)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：31及32中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(32)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(32)。
[實例14]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(33)
為了取得表達如表13所示使腈水合酵素於(f)及(au)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(33)，而以自上述參考例15中記載的轉形體(31)回收所得的質體(31)為模板，使用序列表的序列號：33中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(33)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(33)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例15中記載的質體(31)中含有新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(33)以及成為其基礎的轉形體(31)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(33)藉由新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn的變異，而對於轉形體(37)表現出1.29倍的反應初速度的提高、以及1.82倍的熱穩定性的提高。
[實例15]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(34)
為了取得表達如表13所示使腈水合酵素於(f)及(bf)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(34)，而以自上述參考例16中記載的轉形體(32)回收所得的質體(32)為模板，使用序列表的序列號：33中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(34)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(34)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例16中記載的質體(32)中含有新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(34)以及成為其基礎的轉形體(32)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(34)藉由新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn的變異，而對於轉形體(32)表現出1.25倍的反應初速度的提高、以及1.76倍的熱穩定性的提高。
[實例16]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(35)
為了取得表達如表13所示使腈水合酵素於(f)及(bp)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(35)，而以自上述參考例6中記載的轉形體(10)回收所得的質體(10)為模板，使用序列表的序列號：33中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(35)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(35)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例6中記載的質體(10)中含有新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(35)以及成為其基礎的轉形體(10)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(35)藉由新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn的變異，而對於轉形體(10)表現出1.30倍的反應初速度的提高、以及1.72倍的熱穩定性的提高。
[參考例17]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(36)
為了取得表達如表14所示使腈水合酵素於(aa)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(36)，而以專利文獻2的實例58中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(36)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(36)。
[參考例18]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(37)
為了取得表達如表14所示使腈水合酵素於(ah)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(37)，而以專利文獻2的實例65中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(37)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(37)。
[參考例19]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(38)
為了取得表達如表14所示使腈水合酵素於(aq)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(38)，而以專利文獻2的實例74中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(38)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(38)。
[實例17]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(39)
為了取得表達如表15所示使腈水合酵素於(g)及(aa)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(39)，而以自上述參考例17中記載的轉形體(36)回收所得的質體(36)為模板，使用序列表的序列號：34中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(39)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(39)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例17中記載的質體(36)中含有新追加有將β次單元的第96號Gln取代為Arg之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(39)以及成為其基礎的轉形體(36)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(39)藉由新追加有將β次單元的第96號Gln取代為Arg的變異，而對於轉形體(36)表現出1.33倍的反應初速度的提高、以及1.25倍的熱穩定性的提高。
[實例18]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(40)
為了取得表達如表15所示使腈水合酵素於(g)及(ah)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(40)，而以自上述參考例18中記載的轉形體(37)回收所得的質體(37)為模板，使用序列表的序列號：34中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(40)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(40)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例18中記載的質體(37)中含有新追加有將β次單元的第96號Gln取代為Arg之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(40)以及成為其基礎的轉形體(37)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(40)藉由新追加有將β次單元的第96號Gln取代為Arg的變異，而對於轉形體(37)表現出1.25倍的反應初速度的提高、以及1.36倍的熱穩定性的提高。
[實例19]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(47)
為了取得表達如表15所示使腈水合酵素於(g)及(aq)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(41)，而以自上述參考例19中記載的轉形體(38)回收所得的質體(38)為模板，使用序列表的序列號：34中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(41)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(41)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例19中記載的質體(38)中含有新追加有將β次單元的第96號Gln取代為Arg之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(41)以及成為其基礎的轉形體(38)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(47)藉由新追加有將β次單元的第96號Gln取代為Arg的變異，而對於轉形體(38)表現出1.35倍的反應初速度的提高、以及1.42倍的熱穩定性的提高。
[參考例20]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(42)
為了取得表達如表16所示使腈水合酵素於(ae)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(42)，而以專利文獻2的實例62中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(42)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(42)。
[參考例21]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(43)
為了取得表達如表16所示使腈水合酵素於(bk)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(43)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：35及36中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(43)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(43)。
[實例20]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(44)
為了取得表達如表17所示使腈水合酵素於(h)及(ae)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(44)，而以自上述參考例20中記載的轉形體(42)回收所得的質體(42)為模板，使用序列表的序列號：37中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(44)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(44)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例20中記載的質體(42)中含有新追加有將β次單元的第107號Pro取代為Met之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(44)以及成為其基礎的轉形體(42)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(44)藉由新追加有將β次單元的第107號Pro取代為Met的變異，而對於轉形體(42)表現出1.34倍的反應初速度的提高、以及2.25倍的熱穩定性的提高。
[實例21]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(45)
為了取得表達如表17所示使腈水合酵素於(h)及(au)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(45)，而以自上述參考例15中記載的轉形體(31)回收所得的質體(31)為模板，使用序列表的序列號：68中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(45)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(45)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例15中記載的質體(31)中含有新追加有將β次單元的第107號Pro取代為Met之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(45)以及成為其基礎的轉形體(31)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(45)藉由新追加有將β次單元的第107號Pro取代為Met的變異，而對於轉形體(31)表現出1.40倍的反應初速度的提高、以及2.12倍的熱穩定性的提高。
[實例22]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(46)
為了取得表達如表17所示使腈水合酵素於(h)及(bk)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(46)，而以自上述參考例21中記載的轉形體(43)回收所得的質體(43)為模板，使用序列表的序列號：37中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(46)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(46)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例21中記載的質體(43)中含有新追加有將β次單元的第107號Pro取代為Met之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(46)以及成為其基礎的轉形體(43)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(46)藉由新追加有將β次單元的第107號Pro取代為Met的變異，而對於轉形體(43)表現出1.32倍的反應初速度的提高、以及2.40倍的熱穩定性的提高。
[實例23]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(47)
為了取得表達如表18所示使腈水合酵素於(i)及(aa)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(47)，而以自上述參考例17中記載的轉形體(36)回收所得的質體(36)為模板，使用序列表的序列號：38中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(47)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(47)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例17中記載的質體(36)中含有新追加有將β次單元的第226號Val取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(47)以及成為其基礎的轉形體(36)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(47)藉由新追加有將β次單元的第226號Val取代為Ile的變異，而對於轉形體(36)表現出1.26倍的反應初速度的提高、以及1.29倍的熱穩定性的提高。
[實例24]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(48)
為了取得表達如表18所示使腈水合酵素於(i)及(ak)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(48)，而以自上述參考例4中記載的轉形體(8)回收所得的質體(8)為模板，使用序列表的序列號：38中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(48)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(48)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例4中記載的質體(8)中含有新追加有將β次單元的第226號Val取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(48)以及成為其基礎的轉形體(8)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(48)藉由新追加有將β次單元的第226號Val取代為Ile的變異，而對於轉形體(8)表現出1.35倍的反應初速度的提高、以及1.27倍的熱穩定性的提高。
[實例25]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(49)
為了取得表達如表18所示使腈水合酵素於(i)及(be)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(49)，而以自上述參考例8中記載的轉形體(15)回收所得的質體(15)為模板，使用序列表的序列號：38中記載的引子，利用參考例2中記載的使用突變套組的方法，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(49)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(49)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例8中記載的質體(15)中含有新追加有將β次單元的第226號Val取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(49)以及成為其基礎的轉形體(15)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(49)藉由新追加有將β次單元的第226號Val取代為Ile的變異，而對於轉形體(15)表現出1.25倍的反應初速度的提高、以及1.30倍的熱穩定性的提高。
[參考例22]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(50)
為了取得表達如表19所示使腈水合酵素於(af)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(50)，而以專利文獻2的實例63中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(50)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(50)。
[參考例23]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(51)
為了取得對如表19所示使腈水合酵素於(bq)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體進行編碼的質體，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：39及40中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(51)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(51)。
[參考例24]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(52)
為了取得表達如表19所示使腈水合酵素於(bj)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(52)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：41及42中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(52)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(52)。
[實例26]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(53)
為了取得表達如表20所示使腈水合酵素於(m-1)及(af)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(53)，而以自上述參考例22中記載的轉形體(50)回收所得的質體(50)為模板，使用序列表的序列號：43及19中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(53)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(53)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例22中記載的質體(50)中含有新追加有將α次單元的第13號I1e取代為Leu、以及將α次單元的第94號Met取代為I1e之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(53)以及成為其基礎的轉形體(50)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(53)藉由新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、以及將α次單元的第94號Met取代為Ile的變異，而對於轉形體(50)表現出1.67倍的反應初速度的提高、以及1.45倍的熱穩定性的提高。
[實例27]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(54)
為了取得表達如表20所示使腈水合酵素於(m-1)及(bq)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(54)，而以自上述參考例23中記載的轉形體(51)回收所得的質體(51)為模板，使用序列表的序列號：43及19中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(54)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(54)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例23中記載的質體(51)中含有新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、以及將α次單元的第94號Met取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(54)以及成為其基礎的轉形體(51)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(54)藉由新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、以及將α次單元的第94號Met取代為Ile的變異，而對於轉形體(51)表現出1.59倍的反應初速度的提高、以及1.32倍的熱穩定性的提高。
[實例28]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(55)
為了取得表達如表20所示使腈水合酵素於(m-1)及(bj)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(55)，而以自上述參考例24中記載的轉形體(52)回收所得的質體(52)為模板，使用序列表的序列號：43及19中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(55)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(55)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例24中記載的質體(52)中含有新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、以及將α次單元的第94號Met取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(55)以及成為其基礎的轉形體(52)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(55)藉由新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、以及將α次單元的第94號Met取代為Ile的變異，而對於轉形體(52)表現出1.62倍的反應初速度的提高、以及1.26倍的熱穩定性的提高。
[參考例25]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(56)
為了取得表達如表21所示使腈水合酵素於(am)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(56)，而以專利文獻2的實例70中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(56)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(56)。
[參考例26]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(57)
為了取得表達如表21所示使腈水合酵素於(ay)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(57)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：44及45中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(57)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(57)。
[實例29]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(58)
為了取得表達如表22所示使腈水合酵素於(m-2)及(am)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(58)，而以自上述參考例25中記載的轉形體(56)回收所得的質體(56)為模板，使用序列表的序列號：43及34中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(58)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(58)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例25中記載的質體(56)中含有新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、以及將β次單元的第96號Gln取代為Arg之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(58)以及成為其基礎的轉形體(56)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(58)藉由新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、以及將β次單元的第96號Gln取代為Arg的變異，而對於轉形體(56)表現出1.53倍的反應初速度的提高、以及1.32倍的熱穩定性的提高。
[實例30]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(59)
為了取得表達如表22所示使腈水合酵素於(m-2)及(at)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(59)，而以自上述參考例14中記載的轉形體(27)回收所得的質體(27)為模板，使用序列表的序列號：43及34中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(59)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(59)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例14中記載的質體(27)中含有新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、以及將β次單元的第96號Gln取代為Arg之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(59)以及成為其基礎的轉形體(27)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(59)藉由新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、以及將β次單元的第96號Gln取代為Arg的變異，而對於轉形體(27)表現出1.49倍的反應初速度的提高、以及1.28倍的熱穩定性的提高。
[實例31]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(60)
為了取得表達如表22所示使腈水合酵素於(m-2)及(ay)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(60)，而以自上述參考例26中記載的轉形體(57)回收所得的質體(57)為模板，使用序列表的序列號：43及34中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(60)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(60)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例26中記載的質體(57)中含有新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、以及將β次單元的第96號Gln取代為Arg之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(60)以及成為其基礎的轉形體(57)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(60)藉由新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、以及將β次單元的第96號Gln取代為Arg的變異，而對於轉形體(57)表現出1.39倍的反應初速度的提高、以及1.45倍的熱穩定性的提高。
[實例32]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(61)
為了取得表達如表23所示使腈水合酵素於(n-1)及(af)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(61)，而以自上述參考例22中記載的轉形體(50)回收所得的質體(50)為模板，使用序列表的序列號：46及19中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(61)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(61)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例22中記載的質體(50)中含有新追加有將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將α次單元的第94號Met取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(61)以及成為其基礎的轉形體(50)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(61)藉由新追加有將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將α次單元的第94號Met取代為Ile的變異，而對於轉形體(50)表現出1.65倍的反應初速度的提高、以及1.36倍的熱穩定性的提高。
[實例33]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(62)
為了取得表達如表23所示使腈水合酵素於(n-1)及(ao)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(62)，而以自上述參考例13中記載的轉形體(26)回收所得的質體(26)為模板，使用序列表的序列號：46及19中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(62)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(62)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例13中記載的質體(26)中含有新追加有將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將α次單元的第94號Met取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(62)以及成為其基礎的轉形體(26)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(62)藉由新追加有將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將α次單元的第94號Met取代為Ile的變異，而對於轉形體(26)表現出1.72倍的反應初速度的提高、以及1.47倍的熱穩定性的提高。
[實例34]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(63)
為了取得表達如表23所示使腈水合酵素於(n-1)及(ax)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(63)，而以自上述參考例11中記載的轉形體(21)回收所得的質體(21)為模板，使用序列表的序列號：46及19中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(63)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(63)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例11中記載的質體(21)中含有新追加有將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將α次單元的第94號Met取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(63)以及成為其基礎的轉形體(21)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(63)藉由新追加有將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將α次單元的第94號Met取代為Ile的變異，而對於轉形體(21)表現出1.55倍的反應初速度的提高、以及1.27倍的熱穩定性的提高。
[參考例27]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(64)
為了取得表達如表24所示使腈水合酵素於(aj)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(64)，而以專利文獻2的實例67中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(64)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(64)。
[參考例28]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(65)
為了取得表達如表24所示使腈水合酵素於(as)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(65)，而以專利文獻2的實例76中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(65)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(65)。
[參考例29]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(66)
為了取得表達如表24所示使腈水合酵素於(bb)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(66)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：47及48中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(66)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(66)。
[實例35]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(67)
為了取得表達如表25所示使腈水合酵素於(n-2)及(aj)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(67)，而以自上述參考例27中記載的轉形體(64)回收所得的質體(64)為模板，使用序列表的序列號：46及68中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(67)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(67)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例27中記載的質體(64)中含有新追加有將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將β次單元的第107號Pro取代為Met之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(67)以及成為其基礎的轉形體(64)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(67)藉由新追加有將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將β次單元的第107號Pro取代為Met的變異，而對於轉形體(64)表現出1.53倍的反應初速度的提高、以及2.23倍的熱穩定性的提高。
[實例36]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(68)
為了取得表達如表25所示使腈水合酵素於(n-2)及(as)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(68)，而以自上述參考例28中記載的轉形體(65)回收所得的質體(65)為模板，使用序列表的序列號：46及37中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(68)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(68)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例28中記載的質體(65)中含有新追加有將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將β次單元的第107號Pro取代為Met之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(68)以及成為其基礎的轉形體(65)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(68)藉由新追加有將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將β次單元的第107號Pro取代為Met的變異，而對於轉形體(65)表現出1.55倍的反應初速度的提高、以及2.15倍的熱穩定性的提高。
[實例37]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(69)
為了取得表達如表25所示使腈水合酵素於(n-2)及(bb)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(69)，而以自上述參考例29中記載的轉形體(66)回收所得的質體(66)為模板，使用序列表的序列號：46及37中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(69)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(69)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例29中記載的質體(66)中含有新追加有將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將β次單元的第107號Pro取代為Met之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(69)以及成為其基礎的轉形體(66來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(69)藉由新追加有將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將β次單元的第107號Pro取代為Met的變異，而對於轉形體(66)表現出1.46倍的反應初速度的提高、以及1.92倍的熱穩定性的提高。
[參考例30]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(70)
為了取得表達如表26所示使腈水合酵素於(a1)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(70)，而以專利文獻2的實例69中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(70)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(70)。
[參考例37]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(71)
為了取得表達如表26所示使腈水合酵素於(aw)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(71)，而以專利文獻2的實例80中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(71)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(71)。
[參考例32]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(72)
為了取得表達如表26所示使腈水合酵素於(b1)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(72)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：49及50中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(72)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(72)。
[實例38]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(73)
為了取得表達如表27所示使腈水合酵素於(q)及(a1)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(73)，而以自上述參考例30中記載的轉形體(70)回收所得的質體(70)為模板，使用序列表的序列號：16及38中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(73)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(73)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例30中記載的質體(70)中含有新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(73)以及成為其基礎的轉形體(70)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(73)藉由新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile的變異，而對於轉形體(70)表現出2.00倍的反應初速度的提高、以及1.52倍的熱穩定性的提高。
[實例39]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(74)
為了取得表達如表27所示使腈水合酵素於(q)及(aw)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(74)，而以自上述參考例31中記載的轉形體(71)回收所得的質體(71)為模板，使用序列表的序列號：16及38中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(74)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(74)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例31中記載的質體(71)中含有新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(74)以及成為其基礎的轉形體(71)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(74)藉由新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile的變異，而對於轉形體(71)表現出1.78倍的反應初速度的提高、以及1.44倍的熱穩定性的提高。
[實例40]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(75)
為了取得表達如表27所示使腈水合酵素於(q)及(bl)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(75)，而以自上述參考例32中記載的轉形體(72)回收所得的質體(72)為模板，使用序列表的序列號：16及38中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(75)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(75)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例32中記載的質體(72)中含有新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(75)以及成為其基礎的轉形體(72)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(75)藉由新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile的變異，而對於轉形體(72)表現出1.85倍的反應初速度的提高、以及1.38倍的熱穩定性的提高。
[參考例33]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(76)
為了取得表達如表28所示使腈水合酵素於(bi)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(76)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：51及52中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(76)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(76)。
[參考例34]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(77)
為了取得表達如表28所示使腈水合酵素於(bm)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(77)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：53及54中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(77)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(77)。
[實例41]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(78)
為了取得表達如表29所示使腈水合酵素於(0)及(an)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(78)，而以自上述參考例7中記載的轉形體(14)回收所得的質體(14)為模板，使用序列表的序列號：29及33中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(78)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(78)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例7中記載的質體(14)中含有新追加有將β次單元的第4號Val取代為Met、以及將β次單元的第79號His取代為Asn之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(78)以及成為其基礎的轉形體(14)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(78)藉由新追加有將β次單元的第4號Val取代為Met、以及將β次單元的第79號His取代為Asn的變異，而對於轉形體(14)表現出1.60倍的反應初速度的提高、以及1.46倍的熱穩定性的提高。
[實例42]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(79)
為了取得表達如表29所示使腈水合酵素於(o)及(bi)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(79)，而以自上述參考例33中記載的轉形體(76)回收所得的質體(76)為模板，使用序列表的序列號：29及33中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(79)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(79)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例33中記載的質體(76)中含有新追加有將β次單元的第4號Val取代為Met、以及將β次單元的第79號His取代為Asn之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(79)以及成為其基礎的轉形體(76)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(79)藉由新追加有將β次單元的第4號Val取代為Met、以及將β次單元的第79號His取代為Asn的變異，而對於轉形體(76)表現出1.38倍的反應初速度的提高、以及1.35倍的熱穩定性的提高。
[實例43]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(80)
為了取得表達如表29所示使腈水合酵素於(o)及(bm)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(80)，而以自上述參考例34中記載的轉形體(77)回收所得的質體(77)為模板，使用序列表的序列號：29及33中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(80)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(80)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例34中記載的質體(77)中含有新追加有將β次單元的第4號Val取代為Met、以及將β次單元的第79號His取代為Asn之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(80)以及成為其基礎的轉形體(77)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(80)藉由新追加有將β次單元的第4號Val取代為Met、以及將β次單元的第79號His取代為Asn的變異，而對於轉形體(77)表現出1.52倍的反應初速度的提高、以及1.28倍的熱穩定性的提高。
[參考例35]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(81)
為了取得表達如表30所示使腈水合酵素於(ag)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(81)，而以專利文獻2的實例64中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(81)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(81)。
[參考例36]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(82)
為了取得表達如表30所示使腈水合酵素於(ai)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(82)，而以專利文獻2的實例66中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(82)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(82)。
[實例44]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(83)
為了取得表達如表31所示使腈水合酵素於(p)及(ag)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(83)，而以自上述參考例35中記載的轉形體(81)回收所得的質體(81)為模板，使用序列表的序列號：33及60中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(83)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(83)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例35中記載的質體(81)中含有新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(83)以及成為其基礎的轉形體(81)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(83)藉由新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu的變異，而對於轉形體(81)表現出1.25倍的反應初速度的提高、以及2.16倍的熱穩定性的提高。
[實例45]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(84)
為了取得表達如表31所示使腈水合酵素於(p)及(ai)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(84)，而以自上述參考例36中記載的轉形體(82)回收所得的質體(82)為模板，使用序列表的序列號：33及60中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(84)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(84)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例36中記載的質體(82)中含有新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(84)以及成為其基礎的轉形體(82)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(84)藉由新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu的變異，而對於轉形體(82)表現出1.27倍的反應初速度的提高、以及2.10倍的熱穩定性的提高。
[實例46]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(85)
為了取得表達如表31所示使腈水合酵素於(p)及(aq)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(85)，而以自上述參考例19中記載的轉形體(38)回收所得的質體(38)為模板，使用序列表的序列號：33及60中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(85)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(85)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例31中記載的質體(38)中含有新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(85)以及成為其基礎的轉形體(38)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(85)藉由新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu的變異，而對於轉形體(38)表現出1.33倍的反應初速度的提高、以及2.52倍的熱穩定性的提高。
[參考例37]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(86)
為了取得表達如表32所示使腈水合酵素於(ad)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(86)，而以專利文獻2的實例61中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(86)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(86)。
[參考例38]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(87)
為了取得表達如表32所示使腈水合酵素於(bg)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(87)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：55及56中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(87)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(87)。
[實例47]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(88)
為了取得表達如表33所示使腈水合酵素於(j)及(ad)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(88)，而以自上述參考例37中記載的轉形體(86)回收所得的質體(86)為模板，使用序列表的序列號：57及58中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(88)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(88)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例37中記載的質體(86)中含有新追加有將β次單元的第110號Glu取代為Asn、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(88)以及成為其基礎的轉形體(86)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(88)藉由新追加有將β次單元的第110號Glu取代為Asn、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val的變異，而對於轉形體(86)表現出1.29倍的反應初速度的提高、以及1.62倍的熱穩定性的提高。
[實例48]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(89)
為了取得表達如表33所示使腈水合酵素於(j)及(aj)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(89)，而以自上述參考例27中記載的轉形體(64)回收所得的質體(64)為模板，使用序列表的序列號：57及58中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(89)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(89)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例27中記載的質體(64)中含有新追加有將β次單元的第110號Glu取代為Asn、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(89)以及成為其基礎的轉形體(64)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(89)藉由新追加有將β次單元的第110號Glu取代為Asn、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val的變異，而對於轉形體(64)表現出1.34倍的反應初速度的提高、以及1.83倍的熱穩定性的提高。
[實例49]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(90)
為了取得表達如表33所示使腈水合酵素於(j)及(bg)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(90)，而以自上述參考例38中記載的轉形體(87)回收所得的質體(87)為模板，使用序列表的序列號：57及58中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(90)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(90)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例38中記載的質體(87)中含有新追加有將β次單元的第110號Glu取代為Asn、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(90)以及成為其基礎的轉形體(87)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(90)藉由新追加有將β次單元的第110號Glu取代為Asn、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val的變異，而對於轉形體(87)表現出1.25倍的反應初速度的提高、以及1.46倍的熱穩定性的提高。
[實例50]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(91)
為了取得表達如表34所示使腈水合酵素於(k)及(ad)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(91)，而以自上述參考例37中記載的轉形體(86)回收所得的質體(86)為模板，使用序列表的序列號：59及60中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(91)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(91)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例37中記載的質體(86)中含有新追加有將β次單元的第206號Pro取代為Leu、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(91)以及成為其基礎的轉形體(86)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(91)藉由新追加有將β次單元的第206號Pro取代為Leu、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu的變異，而對於轉形體(86)表現出1.44倍的反應初速度的提高、以及1.42倍的熱穩定性的提高。
[實例51]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(92)
為了取得表達如表34所示使腈水合酵素於(k)及(as)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(92)，而以自上述參考例28中記載的轉形體(65)回收所得的質體(65)為模板，使用序列表的序列號：59及60中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(92)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(92)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例28中記載的質體(65)中含有新追加有將β次單元的第206號Pro取代為Leu、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(92)以及成為其基礎的轉形體(65)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(92)藉由新追加有將β次單元的第206號Pro取代為Leu、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu的變異，而對於轉形體(65)表現出1.48倍的反應初速度的提高、以及1.39倍的熱穩定性的提高。
[實例52]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(93)
為了取得表達如表34所示使腈水合酵素於(k)及(av)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(93)，而以自上述參考例1中記載的轉形體(2)回收所得的質體(2)為模板，使用序列表的序列號：59及60中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(93)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(93)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例1中記載的質體(2)中含有新追加有將β次單元的第206號Pro取代為Leu、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(93)以及成為其基礎的轉形體(2)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(93)藉由新追加有將β次單元的第206號Pro取代為Leu、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu的變異，而對於轉形體(2)表現出1.36倍的反應初速度的提高、以及1.52倍的熱穩定性的提高。
[參考例39]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(94)
為了取得表達如表35所示使腈水合酵素於(bo)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(94)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：61及62中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(94)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(94)。
[實例53]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(95)
為了取得表達如表36所示使腈水合酵素於(1)及(ag)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(95)，而以自上述參考例35中記載的轉形體(81)回收所得的質體(81)為模板，使用序列表的序列號：43、46及57中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(95)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(95)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例35中記載的質體(81)中含有新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將β次單元的第110號Glu取代為Asn之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(95)以及成為其基礎的轉形體(81)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(95)藉由新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將β次單元的第110號Glu取代為Asn的變異，而對於轉形體(81)表現出1.53倍的反應初速度的提高、以及1.76倍的熱穩定性的提高。
[實例54]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(96)
為了取得表達如表36所示使腈水合酵素於(l)及(am)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(96)，而以自上述參考例25中記載的轉形體(56)回收所得的質體(56)為模板，使用序列表的序列號：43、46、及57中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(96)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(96)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例25中記載的質體(56)中含有新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將β次單元的第110號Glu取代為Asn之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(96)以及成為其基礎的轉形體(56)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(96)藉由新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將β次單元的第110號Glu取代為Asn的變異，而對於轉形體(56)表現出1.49倍的反應初速度的提高、以及1.69倍的熱穩定性的提高。
[實例55]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(97)
為了取得表達如表36所示使腈水合酵素於(1)及(bo)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(97)，而以自上述參考例39中記載的轉形體(94)回收所得的質體(94)為模板，使用序列表的序列號：43、46、及57中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(97)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(97)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例39中記載的質體(94)中含有新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將β次單元的第110號Glu取代為Asn之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(97)以及成為其基礎的轉形體(94)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(97)藉由新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、將α次單元的第27號Met取代為Ile、以及將β次單元的第110號Glu取代為Asn的變異，而對於轉形體(94)表現出1.37倍的反應初速度的提高、以及1.83倍的熱穩定性的提高。
[參考例40]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(98)
為了取得表達如表37所示使腈水合酵素於(ab)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(98)，而以專利文獻2的實例59中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(98)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(98)。
[實例56]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(99)
為了取得表達如表38所示使腈水合酵素於(r)及(ab)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(99)，而以自上述參考例40中記載的轉形體(98)回收所得的質體(98)為模板，使用序列表的序列號：43、59、及38中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(99)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(99)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例40中記載的質體(98)中含有新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、將β次單元的第206號Pro取代為Leu、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(99)以及成為其基礎的轉形體(98)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(99)藉由新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、將β次單元的第206號Pro取代為Leu、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile的變異，而對於轉形體(98)表現出1.85倍的反應初速度的提高、以及1.36倍的熱穩定性的提高。
[實例57]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(100)
為了取得表達如表38所示使腈水合酵素於(r)及(ai)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(100)，而以自上述參考例36中記載的轉形體(82)回收所得的質體(82)為模板，使用序列表的序列號：43、59、及38中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(100)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(100)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例36中記載的質體(82)中含有新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、將β次單元的第206號Pro取代為Leu、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(100)以及成為其基礎的轉形體(82)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(100)藉由新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、將β次單元的第206號Pro取代為Leu、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile的變異，而對於轉形體(82)表現出1.72倍的反應初速度的提高、以及1.42倍的熱穩定性的提高。
[實例58]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(101)
為了取得表達如表38所示使腈水合酵素於(r)及(bh)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(101)，而以自上述參考例3中記載的轉形體(4)回收所得的質體(4)為模板，使用序列表的序列號：43、59及38中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(101)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(101)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例3中記載的質體(4)中含有新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、將β次單元的第206號Pro取代為Leu、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(101)以及成為其基礎的轉形體(4)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(101)藉由新追加有將α次單元的第13號Ile取代為Leu、將β次單元的第206號Pro取代為Leu、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile的變異，而對於轉形體(4)表現出1.65倍的反應初速度的提高、以及1.29倍的熱穩定性的提高。
[參考例41]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(102)
為了取得表達如表39所示使腈水合酵素於(ac)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(102)，而以專利文獻2的實例60中記載的質體為模板，利用實例1中記載的方法改變核糖體結合序列，來製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(102)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(102)。
[實例59]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(103)
為了取得表達如表40所示使腈水合酵素於(s)及(ab)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(103)，而以自上述參考例40中記載的轉形體(98)回收所得的質體(98)為模板，使用序列表的序列號：16、29及59中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(103)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(103)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例40中記載的質體(98)中含有新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、將β次單元的第4號Val取代為Met、以及將β次單元的第206號Pro取代為Leu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(103)以及成為其基礎的轉形體(98)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(103)藉由新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、將β次單元的第4號Val取代為Met、以及將β次單元的第206號Pro取代為Leu的變異，而對於轉形體(98)表現出2.50倍的反應初速度的提高、以及1.57倍的熱穩定性的提高。
[實例60]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(104)
為了取得表達如表40所示使腈水合酵素於(s)及(ah)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(104)，而以自上述參考例18中記載的轉形體(37)回收所得的質體(37)為模板，使用序列表的序列號：16、29及59中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(104)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(104)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例18中記載的質體(37)中含有新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、將β次單元的第4號Val取代為Met、以及將β次單元的第206號Pro取代為Leu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(104)以及成為其基礎的轉形體(37)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(104)藉由新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、將β次單元的第4號Val取代為Met、以及將β次單元的第206號Pro取代為Leu的變異，而對於轉形體(37)表現出1.82倍的反應初速度的提高、以及1.41倍的熱穩定性的提高。
[實例61]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(105)
為了取得表達如表40所示使腈水合酵素於(s)及(ac)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(105)，而以自上述參考例41中記載的轉形體(102)回收所得的質體(102)為模板，使用序列表的序列號：16、29及59中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(105)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(105)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例41中記載的質體(102)中含有新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、將β次單元的第4號Val取代為Met、以及將β次單元的第206號Pro取代為Leu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(105)以及成為其基礎的轉形體(102)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(105)藉由新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、將β次單元的第4號Val取代為Met、以及將β次單元的第206號Pro取代為Leu的變異，而對於轉形體(102)表現出1.67倍的反應初速度的提高、以及1.61倍的熱穩定性的提高。
[參考例42]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(106)
為了取得表達如表41所示使腈水合酵素於(az)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(106)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：65及53中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(106)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(106)。
[實例62]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(107)
為了取得表達如表42所示使腈水合酵素於(t)及(ac)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(107)，而以自上述參考例41中記載的轉形體(102)回收所得的質體(102)為模板，使用序列表的序列號：24、37及60中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(107)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(107)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例41中記載的質體(102)中含有新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys、將β次單元的第107號Pro取代為Met、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(107)以及成為其基礎的轉形體(102)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(107)藉由新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys、將β次單元的第107號Pro取代為Met、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu的變異，而對於轉形體(102)表現出2.11倍的反應初速度的提高、以及1.88倍的熱穩定性的提高。
[實例63]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(108)
為了取得表達如表42所示使腈水合酵素於(t)及(al)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(108)，而以自上述參考例30中記載的轉形體(70)回收所得的質體(70)為模板，使用序列表的序列號：24、37及60中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(108)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(108)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例30中記載的質體(70)中含有新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys、將β次單元的第107號Pro取代為Met、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(108)以及成為其基礎的轉形體(70)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(108)藉由新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys、將β次單元的第107號Pro取代為Met、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu的變異，而對於轉形體(70)表現出1.98倍的反應初速度的提高、以及2.34倍的熱穩定性的提高。
[實例64]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(109)
為了取得表達如表42所示使腈水合酵素於(t)及(az)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(109)，而以自上述參考例42中記載的轉形體(106)回收所得的質體(106)為模板，使用序列表的序列號：24、37及60中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(109)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(109)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例43中記載的質體(106)中含有新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys、將β次單元的第107號Pro取代為Met、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(109)以及成為其基礎的轉形體(106)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(109)藉由新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys、將β次單元的第107號Pro取代為Met、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu的變異，而對於轉形體(106)表現出2.05倍的反應初速度的提高、以及1.62倍的熱穩定性的提高。
[參考例43]保持腈水合酵素活性的胺基酸取代體的取得(110)
為了取得表達如表43所示使腈水合酵素於(ba)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(110)，而進行上述參考例2中記載的使用突變套組的定點突變。以實例1中記載的改變核糖體結合序列的腈水合酵素表達質體(1)為模板，使用序列表的序列號：66及67中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(110)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(110)。
[實例65]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(111)
為了取得表達如表44所示使腈水合酵素於(u)及(aq)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(111)，而以自上述參考例19中記載的轉形體(38)回收所得的質體(38)為模板，使用序列表的序列號：33及69中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(111)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(111)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例19中記載的質體(38)中含有新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn、將β次單元的第230號Ala取代為Glu、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(111)以及成為其基礎的轉形體(38)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(111)藉由新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn、將β次單元的第230號Ala取代為Glu、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val的變異，而對於轉形體(38)表現出1.46倍的反應初速度的提高、以及1.43倍的熱穩定性的提高。
[實例66]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(112)
為了取得表達如表44所示使腈水合酵素於(u)及(ap)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(112)，而以自上述參考例5中記載的轉形體(9)回收所得的質體(9)為模板，使用序列表的序列號：33及69中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(112)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(112)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例5中記載的質體(9)中含有新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn、將β次單元的第230號Ala取代為Glu、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(112)以及成為其基礎的轉形體(9)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(112)藉由新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn、將β次單元的第230號Ala取代為Glu、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val的變異，而對於轉形體(9)表現出1.42倍的反應初速度的提高、以及1.66倍的熱穩定性的提高。
[實例67]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(113)
為了取得表達如表44所示使腈水合酵素於(u)及(ba)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(113)，而以自上述參考例43中記載的轉形體(110)回收所得的質體(110)為模板，使用序列表的序列號：33及69中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(113)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(113)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例43中記載的質體(110)中含有新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn、將β次單元的第230號Ala取代為Glu、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(113)以及成為其基礎的轉形體(110)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(113)藉由新追加有將β次單元的第79號His取代為Asn、將β次單元的第230號Ala取代為Glu、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val的變異，而對於轉形體(110)表現出1.39倍的反應初速度的提高、以及1.38倍的熱穩定性的提高。
[實例68]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(114)
為了取得表達如表45所示使腈水合酵素於(v)及(al)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(114)，而以自上述參考例30中記載的轉形體(70)回收所得的質體(70)為模板，使用序列表的序列號：16、38及70中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(114)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(114)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例30中記載的質體(70)中含有新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、將β次單元的第24號Val取代為Ile、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(114)以及成為其基礎的轉形體(70)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(114)藉由新追加有將α次單元的第92號Asp取代為Glu、將β次單元的第24號Val取代為Ile、以及將β次單元的第226號Val取代為Ile的變異，而對於轉形體(70)表現出2.43倍的反應初速度的提高、以及1.63倍的熱穩定性的提高。
[實例69]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(115)
為了取得表達如表46所示使腈水合酵素於(w)及(al)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(115)，而以自上述參考例30中記載的轉形體(70)回收所得的質體(70)為模板，使用序列表的序列號：24、37、60及70中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(115)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(115)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例30中記載的質體(70)中含有新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys、將β次單元的第24號Val取代為Ile、將β次單元的第107號Pro取代為Met、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(115)以及成為其基礎的轉形體(70)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(115)藉由新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys、將β次單元的第24號Val取代為Ile、將β次單元的第107號Pro取代為Met、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu的變異，而對於轉形體(70)表現出2.23倍的反應初速度的提高、以及2.51倍的熱穩定性的提高。
[實例70]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(116)
為了取得表達如表46所示使腈水合酵素於(w)及(az)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(116)，而以自上述參考例42中記載的轉形體(106)回收所得的質體(106)為模板，使用序列表的序列號：24、37、60、及70中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(116)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(116)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例42中記載的質體(106)中含有新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys、將β次單元的第24號Val取代為Ile、將β次單元的第107號Pro取代為Met、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(116)以及成為其基礎的轉形體(106)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(116)藉由新追加有將α次單元的第197號Gly取代為Cys、將β次單元的第24號Val取代為Ile、將β次單元的第107號Pro取代為Met、以及將β次單元的第230號Ala取代為Glu的變異，而對於轉形體(106)表現出2.35倍的反應初速度的提高、以及1.87倍的熱穩定性的提高。
[實例71]腈水合酵素活性及熱穩定性提高的胺基酸取代體的取得(117)
為了取得表達如表47所示使腈水合酵素於(x)及(aq)的胺基酸取代位置進行變異而成的腈水合酵素變異體的轉形體(117)，而以自上述參考例19中記載的轉形體(38)回收所得的質體(38)為模板，使用序列表的序列號：33、69及70中記載的引子，對每個變異點反覆進行參考例2中記載的方法，藉此製作對上述腈水合酵素變異體進行編碼的質體(117)。利用該質體對大腸桿菌HB101的勝任細胞(東洋紡績公司製造)進行轉形，從而獲得轉形體(117)。另外，利用鹼性SDS萃取法而由上述菌體來製備質體，然後利用DNA定序儀來確定腈水合酵素基因部分的鹼基序列，確認於參考例19中記載的質體(38)中含有新追加有將β次單元的第24號Val取代為Ile、將β次單元的第79號His取代為Asn、將β次單元的第230號Ala取代為Glu、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val之變異的符合目的之序列。藉由與實例1中記載的方法相同的方法，對使用以上述方式所得的轉形體(117)以及成為其基礎的轉形體(38)來製造醯胺化合物時的反應初速度、以及熱穩定性進行比較。
其結果，轉形體(117)藉由新追加有將β次單元的第24號Val取代為Ile、將β次單元的第79號His取代為Asn、將β次單元的第230號Ala取代為Glu、以及將β次單元的第231號Ala取代為Val的變異，而對於轉形體(38)表現出1.73倍的反應初速度的提高、以及1.50倍的熱穩定性的提高。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，故本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (16)

  1. 一種腈水合酵素變異體，其特徵在於包含至少1個胺基酸經取代為其他胺基酸的取代，上述取代藉由小於等於3個且大於等於1個胺基酸取代而改善腈水合酵素的兩種以上性質，其中經改善的上述性質為在使用丙烯腈作為基質的場合的反應初速度及熱穩定性，上述腈水合酵素變異體包含序列表的序列號：1所示的α次單元、序列表的序列號：2所示的β次單元，且包含選自由下述(a)~(l)所組成之胺基酸取代位置中的至少1個胺基酸經取代為其他胺基酸之取代：(a)α次單元的第92號；(b)α次單元的第94號；(c)α次單元的第197號；(d)β次單元的第4號；(e)β次單元的第24號；(f)β次單元的第79號；(g)β次單元的第96號；(h)β次單元的第107號；(i)β次單元的第226號；(j)β次單元的第110號及β次單元的第231號；(k)β次單元的第206號及β次單元的第230號；(l)α次單元的第13號、α次單元的第27號及β次單元的第110號， 當α次單元的第13號胺基酸經取代時，Ile經取代為Leu；當α次單元的第27號胺基酸經取代時，Met經取代為Ile；當α次單元的第92號胺基酸經取代時，Asp經取代為Glu；當α次單元的第94號胺基酸經取代時，Met經取代為Ile；當α次單元的第197號胺基酸經取代時，Gly經取代為Cys；當β次單元的第4號胺基酸經取代時，Val經取代為Met；當β次單元的第24號胺基酸經取代時，Val經取代為Ile；當β次單元的第79號胺基酸經取代時，His經取代為Asn；當β次單元的第96號胺基酸經取代時，Gln經取代為Arg；當β次單元的第107號胺基酸經取代時，Pro經取代為Met；當β次單元的第110號胺基酸經取代時，Glu經取代為Asn；當β次單元的第206號胺基酸經取代時，Pro經取代為Leu； 當β次單元的第226號胺基酸經取代時，Val經取代為Ile；當β次單元的第230號胺基酸經取代時，Ala經取代為Glu；當β次單元的第231號胺基酸經取代時，Ala經取代為Val。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之腈水合酵素變異體，其中上述腈水合酵素變異體更包含選自由下述(m)~(u)所組成之胺基酸取代位置中的至少1個胺基酸經取代為其他胺基酸之取代：(m)(b)或(g)時，α次單元的第13號；(n)(b)或(h)時，α次單元的第27號；(o)(d)及(f)；(p)(f)時，β次單元的第230號；(q)(a)及(i)；(r)(i)時，α次單元的第13號及β次單元的第206號；(s)(a)及(d)時，β次單元的第206號；(t)(c)及(h)時，β次單元的第230號；(u)(f)時，β次單元的第230號及β次單元的第231號；(v)(a)及(e)及(i)；(w)(c)及(e)及(h)時，β次單元的第230號；(x)(e)及(f)時，β次單元的第230號及β次單 元的第231號。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之腈水合酵素變異體，其中當上述胺基酸取代位置為(e)時，上述腈水合酵素變異體更包含選自由(a)、(c)、(f)、(i)、(h)、β次單元的第230號及β次單元的第231號所組成之組群中的至少1個以上胺基酸經取代為其他胺基酸之取代。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之腈水合酵素變異體，其中上述腈水合酵素變異體更包含選自由下述(aa)~(br)所組成之胺基酸取代中的至少1個胺基酸之取代：(aa)將α次單元的第36號Thr取代為Met，以及將α次單元的第126號Phe取代為Tyr；(ab)將α次單元的第148號Gly取代為Asp，以及將α次單元的第204號Val取代為Arg；(ac)將β次單元的第51號Phe取代為Val，以及將β次單元的第108號Glu取代為Asp；(ad)將β次單元的第118號Phe取代為Val，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；(ae)將β次單元的第160號Arg取代為Trp，以及將β次單元的第186號Leu取代為Arg；(af)將α次單元的第6號Leu取代為Thr，將α次單元的第36號Thr取代為Met，以及將α次單元的第126號Phe取代為Tyr；(ag)將α次單元的第19號Ala取代為Val，將α次 單元的第71號Arg取代為His，以及將α次單元的第126號Phe取代為Tyr；(ah)將α次單元的第36號Thr取代為Met，將α次單元的第148號Gly取代為Asp，以及將α次單元的第204號Val取代為Arg；(ai)將β次單元的第10號Thr取代為Asp，將β次單元的第118號Phe取代為Val，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；(aj)將β次單元的第37號Phe取代為Leu，將β次單元的第108號Glu取代為Asp，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；(ak)將β次單元的第37號Phe取代為Val，將β次單元的第108號Glu取代為Asp，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；(al)將β次單元的第41號Phe取代為Ile，將β次單元的第51號Phe取代為Val，以及將β次單元的第108號Glu取代為Asp；(am)將β次單元的第46號Met取代為Lys，將β次單元的第108號Glu取代為Arg，以及將β次單元的第212號Ser取代為Tyr；(an)將β次單元的第48號Leu取代為Val，將β次單元的第108號Glu取代為Arg，以及將β次單元的第212號Ser取代為Tyr；(ao)將β次單元的第127號Leu取代為Ser，將β 次單元的第160號Arg取代為Trp，以及將β次單元的第186號Leu取代為Arg；(ap)將α次單元的第6號Leu取代為Thr，將α次單元的第19號Ala取代為Val，將α次單元的第126號Phe取代為Tyr，將β次單元的第46號Met取代為Lys，將β次單元的第108號Glu取代為Arg，以及將β次單元的第212號Ser取代為Tyr；(aq)將α次單元的第6號Leu取代為Thr，將α次單元的第19號Ala取代為Val，將α次單元的第126號Phe取代為Tyr，將β次單元的第48號Leu取代為Val，將β次單元的第108號Glu取代為Arg，以及將β次單元的第212號Ser取代為Tyr；(ar)將α次單元的第6號Leu取代為Ala，將α次單元的第19號Ala取代為Val，將α次單元的第126號Phe取代為Tyr，將β次單元的第127號Leu取代為Ser，將β次單元的第160號Arg取代為Trp，以及將β次單元的第186號Leu取代為Arg；(as)將α次單元的第6號Leu取代為Thr，將α次單元的第36號Thr取代為Met，將α次單元的第126號Phe取代為Tyr，將β次單元的第10號Thr取代為Asp，將β次單元的第118號Phe取代為Val，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；(at)將α次單元的第19號Ala取代為Val，將α次單元的第71號Arg取代為His，將α次單元的第126號Phe 取代為Tyr，將β次單元的第37號Phe取代為Leu，將β次單元的第108號Glu取代為Asp，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；(au)將α次單元的第19號Ala取代為Val，將α次單元的第71號Arg取代為His，將α次單元的第126號Phe取代為Tyr，將β次單元的第37號Phe取代為Val，將β次單元的第108號Glu取代為Asp，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；(av)將α次單元的第36號Thr取代為Met，將α次單元的第148號Gly取代為Asp，將α次單元的第204號Val取代為Arg，將β次單元的第41號Phe取代為Ile，將β次單元的第51號Phe取代為Val，以及將β次單元的第108號Glu取代為Asp；(aw)將α次單元的第148號Gly取代為Asp，將α次單元的第204號Val取代為Arg，將β次單元的第108號Glu取代為Asp，以及將β次單元的第200號Ala取代為Glu；(ax)將α次單元的第36號Thr取代為Gly，以及將α次單元的第188號Thr取代為Gly；(ay)將α次單元的第36號Thr取代為Ala，以及將α次單元的第48號Asn取代為Gln；(az)將α次單元的第48號Asn取代為Glu，以及將β次單元的第146號Arg取代為Gly；(ba)將α次單元的第36號Thr取代為Trp，以及將 β次單元的第176號Tyr取代為Cys；(bb)將β次單元的第176號Tyr取代為Met，以及將β次單元的第217號Asp取代為Gly；(bc)將α次單元的第36號Thr取代為Ser，以及將β次單元的第33號Ala取代為Val；(bd)將β次單元的第176號Tyr取代為Ala，以及將β次單元的第217號Asp取代為Val(be)將β次單元的第40號Thr取代為Val，以及將β次單元的第218號Cys取代為Met；(bf)將β次單元的第33號Ala取代為Met，以及將β次單元的第176號Tyr取代為Thr；(bg)將β次單元的第40號Thr取代為Leu，以及將β次單元的第217號Asp取代為Leu；(bh)將β次單元的第40號Thr取代為Ile，以及將β次單元的第61號Ala取代為Val；(bi)將β次單元的第61號Ala取代為Thr，以及將β次單元的第218號Cys取代為Ser；(bj)將β次單元的第112號Lys取代為Val，以及將β次單元的第217號Asp取代為Met；(bk)將β次單元的第61號Ala取代為Trp，以及將β次單元的第217號Asp取代為His；(bl)將β次單元的第61號Ala取代為Leu，以及將β次單元的第112號Lys取代為Ile；(bm)將β次單元的第146號Arg取代為Gly，以及 將β次單元的第217號Asp取代為Ser；(bn)將β次單元的第171號Lys取代為Ala，以及將β次單元的第217號Asp取代為Thr；(bo)將β次單元的第150號Ala取代為Ser，以及將β次單元的第217號Asp取代為Cys；(bp)將β次單元的第61號Ala取代為Gly，以及將β次單元的第150號Ala取代為Asn；(bq)將β次單元的第61號Ala取代為Ser，以及將β次單元的第160號Arg取代為Met；(br)將β次單元的第160號Arg取代為Cys，以及將β次單元的第168號Thr取代為Glu。
  5. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之腈水合酵素變異體，其中上述腈水合酵素變異體更包含選自由下述(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)所示的變異部位經取代為其他胺基酸：(I)α次單元的第36號、第92號、第148號及第204號，以及β次單元的第41號、第51號及第108號；(II)α次單元的第6號、第19號、第94號及第126號，以及β次單元的第46號、第108號及第212號；(III)α次單元的第6號、第19號及第126號，以及β次單元的第4號、第127號、第160號及第186號；(IV)α次單元的第19號、第71號及第126號，以及β次單元的第37號、第79號、第108號及第200號； (V)α次單元的第6號、第19號及第126號，以及β次單元的第48號、第96號、第108號及第212號；(VI)α次單元的第19號、第71號及第126號，以及β次單元的第37號、第107號、第108號及第200號；(VII)α次單元的第13號、第19號、第71號及第126號，以及β次單元的第37號、第96號、第108號及第200號；(VIII)α次單元的第6號、第27號、第36號及第126號，以及β次單元的第10號、第107號、第118號及第200號；(IX)α次單元的第6號、第19號及第126號，以及β次單元的第48號、第79號、第108號、第212號及第230號；(X)α次單元的第6號、第36號及第126號，以及β次單元的第10號、第118號、第200號、第206號及第230號；(XI)α次單元的第36號、第148號及第204號，以及β次單元的第41號、第51號、第108號、第206號及第230號；(XII)α次單元的第6號、第19號及第126號，以及β次單元的第48號、第79號、第108號、第212號、第230號及第231號；(XIII)α次單元的第6號、第19號及第126號，以及β次單元的第46號、第79號、第108號、第212號、 第230號及第231號；(XIV)α次單元的第6號、第19號及第126號，以及β次單元的第24號、第48號、第79號、第108號、第212號、第230號及第231號。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之腈水合酵素變異體，其中上述(I)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第36號經取代為Met；α次單元的第92號經取代為Glu；α次單元的第148號經取代為Asp；α次單元的第204號經取代為Arg；β次單元的第41號經取代為Ile；β次單元的第51號經取代為Val；以及β次單元的第108號經取代為Asp；上述(II)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第6號經取代為Thr；α次單元的第19號經取代為Val；α次單元的第94號經取代為Ile；α次單元的第126號經取代為Tyr；β次單元的第46號經取代為Lys；β次單元的第108號經取代為Arg；以及β次單元的第212號經取代為Tyr；上述(III)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第6號經取代為Ala；α次單元的第19號經取代為Val； α次單元的第126號經取代為Tyr；β次單元的第4號經取代為Met；β次單元的第127號經取代為Ser；β次單元的第160號經取代為Trp；以及β次單元的第186號經取代為Arg；上述(IV)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第19號經取代為Val；α次單元的第71號經取代為His；α次單元的第126號經取代為Tyr；β次單元的第37號經取代為Val；β次單元的第79號經取代為Asn；β次單元的第108號經取代為Asp；以及β次單元的第200號經取代為Glu；上述(V)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第6號經取代為Thr；α次單元的第19號經取代為Val；α次單元的第126號經取代為Tyr；β次單元的第48號經取代為Val；β次單元的第96號經取代為Arg；β次單元的第108號經取代為Arg；以及β次單元的第212號經取代為Tyr；上述(VI)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第19號經取代為Val；α次單元的第71號經取代為His； α次單元的第126號經取代為Tyr；β次單元的第37號經取代為Val；β次單元的第107號經取代為Met；β次單元的第108號經取代為Asp；以及β次單元的第200號經取代為Glu；上述(VII)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第13號經取代為Leu；α次單元的第19號經取代為Val；α次單元的第71號經取代為His；α次單元的第126號經取代為Tyr；β次單元的第37號經取代為Leu；β次單元的第96號經取代為Arg；β次單元的第108號經取代為Asp；以及β次單元的第200號經取代為Glu；上述(VIII)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第6號經取代為Thr；α次單元的第27號經取代為Ile；α次單元的第36號經取代為Met；α次單元的第126號經取代為Tyr；β次單元的第10號經取代為Asp；β次單元的第107號經取代為Met；β次單元的第118號經取代為Val；以及β次單元的第200號經取代為Glu；上述(IX)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時： α次單元的第6號經取代為Thr；α次單元的第19號經取代為Val；α次單元的第126號經取代為Tyr；β次單元的第48號經取代為Val；β次單元的第79號經取代為Asn；β次單元的第108號經取代為Arg；β次單元的第212號經取代為Tyr；以及β次單元的第230號經取代為Glu；上述(X)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第6號經取代為Thr；α次單元的第36號經取代為Met；α次單元的第126號經取代為Tyr；β次單元的第10號經取代為Asp；β次單元的第118號經取代為Val；β次單元的第200號經取代為Glu；β次單元的第206號經取代為Leu；以及β次單元的第230號經取代為Glu；上述(XI)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第36號經取代為Met；α次單元的第148號經取代為Asp；α次單元的第204號經取代為Arg；β次單元的第41號經取代為Ile；β次單元的第51號經取代為Val；β次單元的第108號經取代為Asp； β次單元的第206號經取代為Leu；以及β次單元的第230號經取代為Glu；上述(XII)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第6號經取代為Thr；α次單元的第19號經取代為Val；α次單元的第126號經取代為Tyr；β次單元的第48號經取代為Val；β次單元的第79號經取代為Asn；β次單元的第108號經取代為Arg；β次單元的第212號經取代為Tyr；β次單元的第230號經取代為Glu；以及β次單元的第231號經取代為Val；上述(XIII)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第6號經取代為Thr；α次單元的第19號經取代為Val；α次單元的第126號經取代為Tyr；β次單元的第46號經取代為Lys；β次單元的第79號經取代為Asn；β次單元的第108號經取代為Arg；β次單元的第212號經取代為Tyr；β次單元的第230號經取代為Glu；以及β次單元的第231號經取代為Val；上述(XIV)所示的變異部位經取代為其他胺基酸時：α次單元的第6號經取代為Thr； α次單元的第19號經取代為Val；α次單元的第126號經取代為Tyr；β次單元的第24號經取代為Ile；β次單元的第48號經取代為Val；β次單元的第79號經取代為Asn；β次單元的第108號經取代為Arg；β次單元的第212號經取代為Tyr；β次單元的第230號經取代為Glu；以及β次單元的第231號經取代為Val。
  7. 一種對腈水合酵素變異體進行編碼的基因，其包含對序列表的序列號：3所示的α次單元進行編碼的基因、及對序列表的序列號：4所示的β次單元進行編碼的基因，上述腈水合酵素變異體為如申請專利範圍第1項所述之腈水合酵素變異體，上述對腈水合酵素變異體進行編碼的基因的特徵在於包含選自由下述(a)~(l)所組成之鹼基取代位置中的至少1個鹼基取代：(a)序列號：3的鹼基序列的第274號~第276號；(b)序列號：3的鹼基序列的第280號~第282號；(c)序列號：3的鹼基序列的第589號~第591號；(d)序列號：4的鹼基序列的第10號~第12號；(e)序列號：4的鹼基序列的第70號~第72號；(f)序列號：4的鹼基序列的第235號~第237號；(g)序列號：4的鹼基序列的第286號~第288號；(h)序列號：4的鹼基序列的第319號~第321號； (i)序列號：4的鹼基序列的第676號~第678號；(j)序列號：4的鹼基序列的第328號~第330號以及序列號：4的第691號~第693號；(k)序列號：4的鹼基序列的第616號~第618號以及序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號；(l)序列號：3的鹼基序列的第37號~第39號、序列號：3的鹼基序列的第79號~第81號以及序列號：4的鹼基序列的第328號~第330號；當序列號：3的鹼基序列的第37號~第39號經鹼基取代時，ATC經取代為CTC；當序列號：3的鹼基序列的第79號~第81號經鹼基取代時，ATG經取代為ATC；當序列號：3的鹼基序列的第274號~第276號經鹼基取代時，GAC經取代為GAG；當序列號：3的鹼基序列的第280號~第282號經鹼基取代時，ATG經取代為ATC；當序列號：3的鹼基序列的第589號~第591號經鹼基取代時，GGC經取代為TGC；當序列號：4的鹼基序列的第10號~第12號經鹼基取代時，GTG經取代為ATG；當序列號：4的鹼基序列的第70號~第72號經鹼基取代時，GTC經取代為ATC；當序列號：4的鹼基序列的第235號~第237號經鹼基取代時，CAC經取代為AAC； 當序列號：4的鹼基序列的第286號~第288號經鹼基取代時，CAG經取代為CGT；當序列號：4的鹼基序列的第319號~第321號經鹼基取代時，CCC經取代為ATG；當序列號：4的鹼基序列的第328號~第330號經鹼基取代時，GAG經取代為AAC；當序列號：4的鹼基序列的第616號~第618號經鹼基取代時，CCG經取代為CTG；當序列號：4的鹼基序列的第676號~第678號經鹼基取代時，GTC經取代為ATC；當序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號經鹼基取代時，GCG經取代為GAG；當序列號：4的鹼基序列的第691號~第693號經鹼基取代時，GCC經取代為GTC。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之對腈水合酵素變異體進行編碼的基因，其中上述對腈水合酵素變異體進行編碼的基因更包含選自由下述(m)~(u)所組成之鹼基取代位置中的至少1個鹼基取代：(m)(b)或(g)時，序列號：3的鹼基序列的第37號~第39號；(n)(b)或(h)時，序列號：3的鹼基序列的第79號~第81號；(o)(d)及(f)；(p)(f)時，序列號：4的鹼基序列的第688號~第 690號；(q)(a)及(i)；(r)(i)時，序列號：3的鹼基序列的第37號~第39號及序列號：4的鹼基序列的第616號~第618號；(s)(a)及(d)時，序列號：4的鹼基序列的第616號~第618號；(t)(c)及(h)時，序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號；(u)(f)時，序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號及序列號：4的鹼基序列的第691號~第693號；(v)(a)及(e)及(i)；(w)(c)及(e)及(h)時，序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號；(x)(e)及(f)時，序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號及序列號：4的鹼基序列的第691號~第693號。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之對腈水合酵素變異體進行編碼的基因，其中當上述鹼基取代位置為(e)時，上述對腈水合酵素變異體進行編碼的基因更包含選自由(a)、(c)、(f)、(i)、(h)、序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號、及序列號：4的鹼基序列的第691號~第693號所組成之鹼基取代位置中的至少1個以上鹼基經取代為其他鹼基之取代。
  10. 如申請專利範圍第7項至第9項中任一項所述之 對腈水合酵素變異體進行編碼的基因，其中上述對腈水合酵素變異體進行編碼的基因包含選自由下述(aa)~(br)所組成之鹼基取代位置中的至少1個鹼基取代：(aa)將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號ACG取代為ATG，以及將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號TTC取代為TAC；(ab)將序列號：3的鹼基序列的第442號~第444號GGC取代為GAC，以及將序列號：3的鹼基序列的第610號~第612號GTC取代為CGC；(ac)將序列號：4的鹼基序列的第151號~第153號TTC取代為GTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號GAG取代為GAT；(ad)將序列號：4的鹼基序列的第352號~第354號TTC取代為GTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號GCC取代為GAG；(ae)將序列號：4的鹼基序列的第478號~第480號CGG取代為TGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第556號~第558號CTG取代為CGG；(af)將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號CTG取代為ACG，將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號ACG取代為ATG，以及將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號TTC取代為TAC；(ag)將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號GCG取代為GTG，將序列號：3的鹼基序列的第211號~ 第213號CGT取代為CAT，以及將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號TTC取代為TAC；(ah)將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號ACG取代為ATG，將序列號：3的鹼基序列的第442號~第444號GGC取代為GAC，以及將序列號：3的鹼基序列的第610號~第612號GTC取代為CGC；(ai)將序列號：4的鹼基序列的第28號~第30號ACC取代為GAC，將序列號：4的鹼基序列的第352號~第354號TTC取代為GTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號GCC取代為GAG；(aj)將序列號：4的鹼基序列的第109號~第111號TTC取代為CTC，將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號GAG取代為GAT，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號GCC取代為GAG；(ak)將序列號：4的鹼基序列的第109號~第111號TTC取代為GTC，將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號GAG取代為GAT，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號GCC取代為GAG；(al)將序列號：4的鹼基序列的第121號~第123號TTC取代為ATC，將序列號：4的鹼基序列的第151號~第153號TTC取代為GTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號GAG取代為GAT；(am)將序列號：4的鹼基序列的第136號~第138號ATG取代為AAG，將序列號：4的鹼基序列的第322 號~第324號GAG取代為CGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第634號~第636號TCC取代為TAC；(an)將序列號：4的鹼基序列的第142號~第144號CTG取代為GTG，將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號GAG取代為CGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第634號~第636號TCC取代為TAC；(ao)將序列號：4的鹼基序列的第379號~第381號CTG取代為TCG，將序列號：4的鹼基序列的第478號~第480號CGG取代為TGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第556號~第558號CTG取代為CGG；(ap)將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號CTG取代為ACG，將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號GCG取代為GTG，將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號TTC取代為TAC，將序列號：4的鹼基序列的第136號~第138號ATG取代為AAG，將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號GAG取代為CGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第634號~第636號TCC取代為TAC；(aq)將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號CTG取代為ACG，將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號GCG取代為GTG，將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號TTC取代為TAC，將序列號：4的鹼基序列的第142號~第144號CTG取代為GTG，將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號GAG取代為CGG， 以及將序列號：4的鹼基序列的第634號~第636號TCC取代為TAC；(ar)將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號CTG取代為GCG，將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號GCG取代為GTG，將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號TTC取代為TAC，將序列號：4的鹼基序列的第379號~第381號CTG取代為TCG，將序列號：4的鹼基序列的第478號~第480號CGG取代為TGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第556號~第558號CTG取代為CGG；(as)將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號CTG取代為ACG，將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號ACG取代為ATG，將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號TTC取代為TAC，將序列號：4的鹼基序列的第28號~第30號ACC取代為GAC，將序列號：4的鹼基序列的第352號~第354號TTC取代為GTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號GCC取代為GAG；(at)將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號GCG取代為GTG，將序列號：3的鹼基序列的第211號~第213號CGT取代為CAT，將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號TTC取代為TAC，將序列號：4的鹼基序列的第109號~第111號TTC取代為CTC，將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號GAG取代為GAT， 以及將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號GCC取代為GAG；(au)將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號GCG取代為GTG，將序列號：3的鹼基序列的第211號~第213號CGT取代為CAT，將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號TTC取代為TAC，將序列號：4的鹼基序列的第109號~第111號TTC取代為GTC，將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號GAG取代為GAT，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號GCC取代為GAG；(av)將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號ACG取代為ATG，將序列號：3的鹼基序列的第442號~第444號GGC取代為GAC，將序列號：3的鹼基序列的第610號~第612號GTC取代為CGC，將序列號：4的鹼基序列的第121號~第123號TTC取代為ATC，將序列號：4的鹼基序列的第151號~第153號TTC取代為GTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號GAG取代為GAT；(aw)將序列號：3的鹼基序列的第442號~第444號GGC取代為GAC，將序列號：3的鹼基序列的第610號~第612號GTC取代為CGC，將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號GAG取代為GAT，以及將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號GCC取代為GAG；(ax)將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108 號ACG取代為GGG，以及將序列號：3的鹼基序列的第562號~第564號ACC取代為GGC；(ay)將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號ACG取代為GCG，以及將序列號：3的鹼基序列的第142號~第144號AAC取代為CAA；(az)將序列號：3的鹼基序列的第142號~第144號AAC取代為GAA，以及將序列號：4的鹼基序列的第436號~第438號CGG取代為GGG；(ba)將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號ACG取代為TGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第526號~第528號TAC取代為TGC；(bb)將序列號：4的鹼基序列的第526號~第528號TAC取代為ATG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號~第651號GAC取代為GGC；(bc)將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號ACG取代為TCG，以及將序列號：4的鹼基序列的第97號~第99號GCG取代為GTG；(bd)將序列號：4的鹼基序列的第526號~第528號TAC取代為GCC，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號~第651號GAC取代為GTC；(be)將序列號：4的鹼基序列的第118號~第120號ACG取代為GTG，以及將序列號：4的鹼基序列的第652號~第654號TGC取代為ATG；(bf)將序列號：4的鹼基序列的第97號~第99號 GCG取代為ATG，以及將序列號：4的鹼基序列的第526號~第528號TAC取代為ACC；(bg)將序列號：4的鹼基序列的第118號~第120號ACG取代為CTG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號~第651號GAC取代為CTC；(bh)將序列號：4的鹼基序列的第118號~第120號ACG取代為ATT，以及將序列號：4的鹼基序列的第181號~第183號GCC取代為GTC；(bi)將序列號：4的鹼基序列的第181號~第183號GCC取代為ACG，以及將序列號：4的鹼基序列的第652號~第654號TGC取代為TCC；(bj)將序列號：4的鹼基序列的第334號~第336號AAG取代為GTG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號~第651號GAC取代為ATG；(bk)將序列號：4的鹼基序列的第181號~第183號GCC取代為TGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號~第651號GAC取代為CAC；(bl)將序列號：4的鹼基序列的第181號~第183號GCC取代為CTC，以及將序列號：4的鹼基序列的第334號~第336號AAG取代為ATT；(bm)將序列號：4的鹼基序列的第436號~第438號CGG取代為GGG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號~第651號GAC取代為AGC；(bn)將序列號：4的鹼基序列的第511號~第513 號AAG取代為GCG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號~第651號GAC取代為ACC；(bo)將序列號：4的鹼基序列的第448號~第450號GCG取代為TCG，以及將序列號：4的鹼基序列的第649號~第651號GAC取代為TGT；(bp)將序列號：4的鹼基序列的第181號~第183號GCC取代為GGC，以及將序列號：4的鹼基序列的第448號~第450號GCG取代為AAT；(bq)將序列號：4的鹼基序列的第181號~第183號GCC取代為TCG，以及將序列號：4的鹼基序列的第478號~第480號CGG取代為ATG；(br)將序列號：4的鹼基序列的第478號~第480號CGG取代為TGT，以及將序列號：4的鹼基序列的第502號~第504號ACG取代為GAG。
  11. 如申請專利範圍第7項至第9項中任一項所述之對腈水合酵素變異體進行編碼的基因，其中上述對腈水合酵素變異體進行編碼的基因更包含選自由下述(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)所示的鹼基取代：(I)序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號、第274號~第276號、第442號~第444號及第610號~第612號，以及序列號：4的鹼基序列的第121號~第123號、第151號~第153號及第322號~第324號；(II)序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號、 第55號~第57號、第280號~第282號及第376號~第378號，以及序列號：4的鹼基序列的第136號~第138號、第322號~第324號及第634號~第636號；(III)序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號、第55號~第57號及第376號~第378號，以及序列號：4的鹼基序列的第10號~第12號、第379號~第381號、第478號~第480號及第556號~第558號；(IV)序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號、第211號~第213號及第376號~第378號，以及序列號：4的鹼基序列的第109號~第111號、第235號~第237號、第322號~第324號及第598號~第600號；(V)序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號、第55號~第57號及第376號~第378號，以及序列號：4的鹼基序列的第142號~第144號、第286號~第288號、第322號~第324號及第634號~第636號；(VI)序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號、第211號~第213號及第376號~第378號，以及序列號：4的鹼基序列的第109號~第111號、第319號~第321號、第322號~第324號及第598號~第600號；(VII)序列號：3的鹼基序列的第37號~第39號、第55號~第57號、第211號~第213號及第376號~第378號，以及序列號：4的鹼基序列的第109號~第111號、第286號~第288號、第322號~第324號及第598號~第600號； (VIII)序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號、第79號~第81號、第106號~第108號及第376號~第378號，以及序列號：4的鹼基序列的第28號~第30號、第319號~第321號、第352號~第354號及第598號~第600號；(IX)序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號、第55號~第57號及第376號~第378號，以及序列號：4的鹼基序列的第142號~第144號、第235號~第237號、第322號~第324號、第634號~第636號及第688號~第690號；(X)序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號、第106號~第108號及第376號~第378號，以及序列號：4的鹼基序列的第28號~第30號、第352號~第354號、第598號~第600號、第616號~第618號及第688號~第690號；(XI)序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號、第442號~第444號及第610號~第612號，以及序列號：4的鹼基序列的第121號~第123號、第151號~第153號、第322號~第324號、第616號~第618號及第688號~第690號；(XII)序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號、第55號~第57號及第376號~第378號，以及序列號：4的鹼基序列的第142號~第144號、第235號~第237號、第322號~第324號、第634號~第636號、第688號~ 第690號及第691號~第693號；(XIII)序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號、第55號~第57號及第376號~第378號，以及序列號：4的鹼基序列的第136號~第138號、第235號~第237號、第322號~第324號、第634號~第636號、第688號~第690號及第691號~第693號；(XIV)序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號、第55號~第57號及第376號~第378號，以及序列號：4的鹼基序列的第70號~第72號、第142號~第148號、第235號~第237號、第322號~第324號、第634號~第636號、第688號~第690號及第691號~第693號。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之對腈水合酵素變異體進行編碼的基因，其中包含上述(I)所示的鹼基取代時：將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號取代為ATG；將序列號：3的鹼基序列的第274號~第276號取代為GAG；將序列號：3的鹼基序列的第442號~第444號取代為GAC；將序列號：3的鹼基序列的第610號~第612號取代為CGC；將序列號：4的鹼基序列的第121號~第123號取代為ATC； 將序列號：4的鹼基序列的第151號~第153號取代為GTC；以及將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號取代為GAT；包含上述(II)所示的鹼基取代時：將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號取代為ACG；將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號取代為GTG；將序列號：3的鹼基序列的第280號~第282號取代為ATC；將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第136號~第138號為AAG；將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號取代為CGG；以及將序列號：4的鹼基序列的第634號~第636號取代為TAC；包含上述(III)所示的鹼基取代時： 將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號取代為GCG；將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號取代為GTG；將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第10號~第12號取代為ATG；將序列號：4的鹼基序列的第379號~第381號取代為TCG；將序列號：4的鹼基序列的第478號~第480號取代為TGG；以及將序列號：4的鹼基序列的第556號~第558號取代為CGG；包含上述(IV)所示的鹼基取代時：將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號取代為GTG；將序列號：3的鹼基序列的第211號~第213號取代為CAT；將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第109號~第111號取代為GTC； 將序列號：4的鹼基序列的第235號~第237號取代為AAC；將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號取代為GAT；以及將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號取代為GAG；包含上述(V)所示的鹼基取代時：將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號取代為ACG；將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號取代為GTG；將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第142號~第144號取代為GTG；將序列號：4的鹼基序列的第286號~第288號取代為CGT；將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號取代為CGG；以及將序列號：4的鹼基序列的第634號~第636號取代為TAC；包含上述(VI)所示的鹼基取代時： 將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號取代為GTG；將序列號：3的鹼基序列的第211號~第213號取代為CAT；將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第109號~第111號取代為GTC；將序列號：4的鹼基序列的第319號~第321號取代為ATG；將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號為GAT；以及將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號取代為GAG；包含上述(VII)所示的鹼基取代時：將序列號：3的鹼基序列的第37號~第39號取代為CTC；將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號取代為GTG；將序列號：3的鹼基序列的第211號~第213號取代為CAT；將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號取代為TAC； 將序列號：4的鹼基序列的第109號~第111號取代為CTC；將序列號：4的鹼基序列的第286號~第288號取代為CGT；將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號取代為GAT；以及將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號取代為GAG；包含上述(VIII)所示的鹼基取代時：將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號取代為ACG；將序列號：3的鹼基序列的第79號~第81號取代為ATC；將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號取代為ATG；將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第28號~第30號取代為GAC；將序列號：4的鹼基序列的第319號~第321號取代為ATG；將序列號：4的鹼基序列的第352號~第354號取代為GTC；以及 將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號取代為GAG；包含上述(IX)所示的鹼基取代時：將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號取代為ACG；將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號取代為GTG；將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第142號~第144號取代為GTG；將序列號：4的鹼基序列的第235號~第237號取代為AAC；將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號取代為CGG；將序列號：4的鹼基序列的第634號~第636號取代為TAC；以及將序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號取代為GAG；包含上述(X)所示的鹼基取代時：將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號取代為ACG； 將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號取代為ATG；將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第28號~第30號取代為GAC；將序列號：4的鹼基序列的第352號~第354號取代為GTC；將序列號：4的鹼基序列的第598號~第600號取代為GAG；將序列號：4的鹼基序列的第616號~第618號取代為CTG；以及將序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號取代為GAG；包含上述(XI)所示的鹼基取代時：將序列號：3的鹼基序列的第106號~第108號取代為ATG；將序列號：3的鹼基序列的第442號~第444號取代為GAC；將序列號：3的鹼基序列的第610號~第612號取代為CGC；將序列號：4的鹼基序列的第121號~第123號取代為ATC； 將序列號：4的鹼基序列的第151號~第153號取代為GTC；將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號取代為GAT；將序列號：4的鹼基序列的第616號~第618號取代為CTG；以及將序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號取代為GAG；包含上述(XII)所示的鹼基取代時：將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號取代為ACG；將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號取代為GTG；將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第142號~第144號取代為GTG；將序列號：4的鹼基序列的第235號~第237號取代為AAC；將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號取代為CGG；將序列號：4的鹼基序列的第634號~第636號取代為TAC； 將序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號取代為GAG；以及將序列號：4的鹼基序列的第691號~第693號取代為GTC；包含上述(XIII)所示的鹼基取代時：將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號取代為ACG；將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號取代為GTG；將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第136號~第138號取代為AAG；將序列號：4的鹼基序列的第235號~第237號取代為AAC；將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號取代為CGG；將序列號：4的鹼基序列的第634號~第636號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號取代為GAG；以及將序列號：4的鹼基序列的第691號~第693號取代為GTC；包含上述(XIV)所示的鹼基取代時： 將序列號：3的鹼基序列的第16號~第18號取代為ACG；將序列號：3的鹼基序列的第55號~第57號取代為GTG；將序列號：3的鹼基序列的第376號~第378號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第70號~第72號取代為ATC；將序列號：4的鹼基序列的第142號~第148號取代為GTG；將序列號：4的鹼基序列的第235號~第237號取代為AAC；將序列號：4的鹼基序列的第322號~第324號取代為CGG；將序列號：4的鹼基序列的第634號~第636號取代為TAC；將序列號：4的鹼基序列的第688號~第690號取代為GAG；以及將序列號：4的鹼基序列的第691號~第693號取代為GTC。
  13. 一種經連結的DNA，其於如申請專利範圍第7項所述之對腈水合酵素變異體進行編碼的基因的5'末端上游更包含基因表達所必需的啟動子序列，並且於上述啟動子的3'末端的下游包含序列號：7所含的核糖體結合序列。
  14. 一種質體，其含有如申請專利範圍第13項所述之DNA。
  15. 一種轉形體，其是藉由如申請專利範圍第14項所述之質體將宿主細胞轉形而獲得。
  16. 一種腈水合酵素變異體的生產方法，其特徵在於包含如下步驟：利用培養基培養如申請專利範圍第15項所述之轉形體，於上述轉形體中生產基於質體所含有的腈水合酵素基因的腈水合酵素變異體。
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