KR101656063B1

KR101656063B1 - 사이코스 에퍼머화 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 사이코스의 생산

Info

Publication number: KR101656063B1
Application number: KR1020150072090A
Authority: KR
Inventors: 허진솔; 김혜정; 박종진; 이강표
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2016-09-08

Abstract

본 발명은 사이코스 에퍼머화 효소를 높은 안정성과 발현율로 생산할 수 있는 유전자 발현 시스템, 이를 이용한 형질전환 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물, 상기 형질전환 GRAS 미생물 또는 형질전환 미생물로부터 얻어진 효소를 이용한 사이코스 생산방법에 관한 것이다.

Description

사이코스 에퍼머화 효소의 발현 시스템 및 이를 이용한 사이코스의 생산{Expression system for psicose epimerase and production for psicose using the same}

본 발명은 사이코스 에퍼머화 효소를 높은 발현율과 안정성으로 생산할 수 있는 발현 시스템, 이를 이용한 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물, 및 상기 발현 시스템을 이용한 미생물 및 효소를 포함하는 사이코스 생산방법에 관한 것이다.

다양한 생합성 산물이 자연 대상 과정에 의해 세포에서 생산되며, 식료품, 사료, 화장품, 먹이, 식품 및 제약 산업을 비롯한 수많은 산업 분야에서 사용되고 있다. 이들은, 가장 편리하게는, 각각의 경우에 요구되는 특정 물질을 다량으로 생산 및 분비하도록 개발된 세균 균주 또는 다른 미생물의 성장에 의해 대규모로 생산된다. 현재 코리네박테리움 균주는 산업적으로 아미노산 생산에 가장 많이 이용되는 미생물로 1950년대 중반에 글루탐산을 효율적으로 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이 발견되어 산업화가 이루어졌고, 코리네박테리움 글루타미쿰의 영양 요구성 변이주를 이용하여 발효법을 통해 산업적으로 다양한 아미노산을 생산하고 있다.

세포를 엔지니어링하는 데에는 다양한 관련 유전자의 발현 정도를 확실히 조절할 필요가 있고, 이러한 유전자 발현 조절은 다양한 효율적인 발현 시스템을 요구한다. 세포의 조절 서열의 다양한 구성 성분은 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 오퍼레이터(operator)에 대한 결합 부위, -35 및 -10 영역으로 지칭되는 RNA 폴리머라제 효소에 대한 결합 부위, 및 리보좀 결합 부위 또는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열로 지칭되는 리보좀 16S RNA에 대한 결합 부위로 구분되어 있다.

발현 시스템을 개발하는 데에는 프로모터의 선택이 가장 중요하게 여겨지는데 프로모터가 유전자의 발현정도와 발현조절에 상당히 크게 관여하기 때문이다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 이용가능한 프로모터로는 몇 가지가 보고되어 있는데 주로 코리네박테리움 유래 또는 대장균 유래의 프로모터들이다 (J. Biotechnol., 104:311-323, 2003).

그러나, 대장균 유래의 프로모터는 발현유도인자의 낮은 투과성과 유전자 발현 억제 물질의 부재 등의 이유로 코리네박테리움에서 상대적으로 낮은 활성을 나타낸다. 또한 같은 프로모터라 하더라도 목적단백질을 코딩하는 유전자에 따라 발현 효율이 제각각이며, 코리네박테리움에서 사용할 수 있는 프로모터들의 세기 또한 선택의 폭이 작아서 목적에 맞게 발현시스템을 제작하는 것이 용이하지 않다. 특히 대사경로의 구축과 같이 다양한 유전자들의 발현을 함께 조절해야 할 경우에 코리네박테리움에서는 대장균에서와 같이 다양한 선택을 할 수 있지 못한 것이 현실이다.

사이코스는 다이어트 감미료로서 각광을 받고 있지만, 자연계에 극히 드물게 존재하는 희소당에 속하기 때문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 사이코스를 효율적으로 대량 생산하는 기술의 개발이 필요하다. 종래의 사이코스 제조 방법은 주로 화학적 합성 과정을 거쳐 제조하는 방법이 대부분이었다. 효소적 방법에 의한 사이코스 제조방법에 관한 기술로는, 한국등록특허 10-0744479호 형질전환 대장균을 이용하여 아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 대량 생산하고, 생산된 효소를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 제조하는 방법을 기재하고 있다. 효소 정제의 과정을 생략하여 제조원가가 낮고 사이코스를 높은 효율로 생산할 수 있는 균주를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법에 관한 연구가 진행되고 있으며, 예를 들면 한국등록특허 10-1106253에는 아그로박테리움 투메파시엔스 유래 사이코스-3-에피머라제를 발현하며 특정 유전자가 불활성화된 형질전환 대장균을 제조하고, 이들 균주를 과당 포함배지에 접종하여 배지 내 과당을 사이코스로 전환하는 방법에 관한 기술을 개시하고 있다.

상기 한국등록특허 10-1106253에 기재된 기술은 대장균을 균주로 사용하여 산업적으로 사용하고자 할 때 배양이 어려우며 일반적으로 안전하다고 인증받은 물질(GRAS, Generally Recognized As Safe)로 인정받은 균주가 아니기 때문에 식품 소재를 생산하는 균주로서 사용하기에 적합하지 않다는 문제점이 있으며, 아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 사용하여 효소의 활성이 낮고 열안정성이 좋지 않다는 단점이 있다.

따라서, 높은 활성을 가지는 사이코스 에피머화 효소를, GRAS 균주에서, 높은 안정성을 가지면서도 고수율로 생산하는 발현 시스템, 이를 이용한 사이코스 에피머화 효소의 생산방법, 및 상기 생산된 효소 또는 형질전환 GRAS 균주를 이용한 사이코스 생산방법이 여전히 필요한 실정이다.

본 발명의 일예는 높은 안정성을 가지면서도 고수율로 사이코스 에피머화 효소를 생산할 수 있는 전사 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 예는 상기 전사 프로모터와 사이코스 에피머화 효소의 코딩 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 예는 상기 전사 프로모터와 사이코스 에피머화 효소의 코딩 서열을 포함하는, 코리네박테리움속 균주용 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 예는 상기 발현 카세트로 형질전환되거나, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 코리네박테리움속 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 다른 예는 상기 코리네박테리움속 균주를 이용하여 얻어진 사이코스 에피머화 효소, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 사이코스 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 코리네박테리움속 균주를 이용하여 얻어진 사이코스 에피머화 효소, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여, 과당-함유 원료로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 높은 안정성과 발현율로 사이코스 에퍼머화 효소를 생산할 수 있는 발현 시스템, 이를 이용한 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물, 상기 형질전환 GRAS(Generally recognized as safe) 미생물을 이용한 효소의 제조방법, 및 상기 발현 시스템을 이용한 미생물 및 효소를 포함하는 사이코스 생산방법에 관한 것이다.

대장균 유래의 프로모터는 발현유도인자의 낮은 투과성과 유전자 발현 억제 물질의 부재 등의 이유로 코리네박테리움속 균주에서 상대적으로 낮은 활성을 나타내며, 또한 코리네박테리움속 균주에서 생산하고자 하는 사이코스 에피머화 효소의 발현에 적합한 발현 시스템을 제공하자 한다.

본 발명은 코리네박테리움속 균주에서 높은 발현율로 안정적으로 사이코스 에피머화 효소를 발현할 수 있는 프로모터, 및 상기 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 제공하여, 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 높은 발현율로 안정적으로 대량으로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 식품에 적용 가능한 사이코스를 대량 생산을 하기 위해, GRAS (Generally recognized as safe) 균주에서 안정적이고 높은 효소 생산활성을 갖는 사이코스 에피머화 효소를 다량 발현하기 위하여, 상기 프로모터와 조합시 더욱 우수한 발현율을 나타내는 사이코스 에피머화 효소 및 이의 코딩 뉴클레오타이드 서열을 제공하고자 한다.

본 명세서에서, "프로모터", "프로모터 활성을 갖는 핵산분자" 또는 "프로모터 서열"은 전사대상의 목적 뉴클레오타이드 서열에 기능적으로 연결되어 상기 목적 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절하는 핵산을 의미한다.

전사대상 뉴클레오타이드 서열은 화학적 의미에서 반드시 프로모터에 직접 연결을 필요로 하는 것은 아니며, 추가적인 유전자 조절 서열 및/또는 링커 뉴클레오타이드 서열 등을 포함할 수 있다. 전사대상 목적 뉴클레오타이드 서열이 프로모터 서열의 하부에 (즉, 프로모터 서열의 3' 말단에) 위치하는 배열이 바람직하다. 프로모터 서열과 전사대상 뉴클레오타이드 서열 사이의 거리는 바람직하게는 200개 염기 미만, 특히 바람직하게는 100개 염기 미만이다.

본 발명에 따라 "리보좀 결합 부위" (RBS)의 서열 (또는 샤인-달가노 서열로도 칭함)은 A/G 풍부 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 명세에서 "조절 서열"은 프로모터를 포함하고 발현대상 뉴클레오타이드 서열 또는 유전자에 기능적으로 연결된 후에 상기 핵산 또는 상기 유전자의 발현, 즉 전사 및 번역을 조절하는 발현 활성을 갖는 핵산을 의미한다. 따라서, 이와 관련하여 상기 뉴클레오타이드 서열은 "조절 뉴클레오타이드 서열"로도 불린다.

"발현 카세트"는 발현대상 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면 사이코스 에피머화 효소의 코딩 뉴클레오타이드 서열에 기능적으로 연결된 조절 서열을 의미한다. 따라서, 발현 유닛과 달리, 발현 카세트는 전사 및 번역을 조절하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 전사 및 번역의 결과로서 단백질로서 발현되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 모든 핵산 분자는 바람직하게는 자연에 존재하지 않는 형태이며(non-naturally occurring), 단리된 핵산 분자의 형태 또는 합성된 또는 재조합 방법에 의해서 제조되는 핵산분자이다. "단리된" 핵산 분자는 상기 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 제거되고, 추가로, 재조합 기술에 의해 제조될 경우 본질적으로 다른 세포성 물질 또는 배양 배지가 존재하지 않거나, 화학적으로 합성될 경우에는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 존재하지 않을 수 있다.

본 발명의 일예는 코리네박테리움속 균주 발현용 조절서열의 핵산분자에 관한 것으로서, 높은 안정성과 활성을 가지는 사이코스 에피머화 효소를, GRAS 균주에서 높은 안정성을 가지면서도 고수율로 생산할 수 있도록 한다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다

본 발명의 또 다른 일예는 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과, 그 상류(upstream)에 작동 가능하도록 연결되며 코리네박테리움속 균주에서 상기 사이코스 에피머화 효소의 발현을 조절하는 조절서열을 포함하는, 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화제를 발현하는 유전자 발현 카세트(gene expression cassette)를 제공한다.

본 발명에 따른 조절서열은, GRAS 균주, 예를 들면 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 발현하는 전사 프로모터를 포함한다. 상기 조절서열은 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 발현하는 비변형 조절서열 또는 이의 변형 조절서열일 수 있다.

구체적으로, 상기 조절서열이 하나의 RBS 서열을 포함하는 경우, 예를 들면 상기 조절서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 전사 프로모터, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 RBS 서열 및 서열번호 3 내지 서열번호 6 의 뉴크레오타이드 서열중에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 스페이서를 포함하는 핵산분자일 수 있다 (전사 프로모터 -제1 RBS-제1 스페이서). 또한, 선택적으로 상기 조절서열의 제1 스페이서의 3'말단에 연결되는 1개 내지 100개 염기로 이루어지는 링커 서열을 포함하는 핵산분자일 수 있다(전사 프로모터 -제1 RBS-제1 스페이서-링커).

상기 조절 서열이 두 개의 RBS 서열을 포함하는 경우, 예를 들면 상기 조절서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 전사 프로모터, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 RBS 서열, 서열번호 3 내지 서열번호 6의 뉴크레오타이서 서열중에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 스페이서, 및 제2 RBS서열을 포함하는 핵산분자일 수 있으며, 제2 RBS서열을 상기 제1 스페이서의 3'-말단에 직접 또는 링커를 통해 연결될 수 있다(전사 프로모터 -제1 RBS-제1 스페이서-제2RBS 또는 전사 프로모터 -제1 RBS-제1 스페이서-링커-제2RBS). 상기 두 개의 RBS 서열을 포함하는 조절서열에 있어서, 제2 RBS의 3'-말단에 연결된 제2 스페이서 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 비변형 조절서열의 구체적인 예는 다음과 같다.

(1) 전사 프로모터 뉴클레오타이드 서열의 3'말단에 직접 또는 링커를 통해 연결된 리보좀 결합영역과 스페이서 서열을 포함하는 것(예, 프로모터 - 제1링커 - 제1 RBS - 제1 스페이서, 또는 프로모터 - 제1 RBS - 제1 스페이서),

(2) 전사 프로모터 뉴클레오타이드 서열의 3'말단에 연결된 리보좀 결합영역과 스페이서 서열을 2회 이상 반복하여 포함하는 것 (예, 프로모터 - 제1 RBS - 제1 스페이서 - 제2 RBS - 제2 스페이서), 및

(3) 전사 프로모터 뉴클레오타이드 서열의 3'말단에 연결된 리보좀 결합영역과 스페이서 서열을 2회 이상 반복하여 포함하며, 제1 스페이서 서열과 제2 리보좀 결합영역 사이에 링커를 추가로 포함하는 것(예, 프로모터 - 제1 RBS - 제1 스페이서 - 링커 서열 - 제2 RBS - 제2 스페이서), 및

(4) 전사 프로모터 뉴클레오타이드 서열의 3'말단에 연결된 리보좀 결합영역과 스페이서 서열을 2회 이상 반복하여 포함하며, 제2 스페이서 서열을 1회 내지 3회 반복하여 연결된 것임(예, 프로모터 - 제1 RBS - 제1 스페이서 - 링커 서열 - 제2 RBS - (제2 스페이서)1~3, 또는 프로모터 - 제1 RBS - 제1 스페이서 - RBS- (제2 스페이서)1~3).

상기 조절서열에 포함되는 링커 서열은 1개 내지 100개의 염기, 또는 5개 내지 80 염기를 가지는 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 예를 들면 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자일 수 있다.

본 발명에 따른 변형 조절서열은, 상기 비변형 조절서열의 제1 스페이서 및 제2 스페이서로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 스페이서의 뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 염기가 치환된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

예들 들어, 상기 변형 조절서열이 하나의 RBS 서열을 포함하는 경우, 상기 변형 조절서열은 전사 프로모터, 제1 리보좀 결합 영역(ribosome binding region) 및 제1 스페이서를 포함하며, 상기 제1 스페이서의 뉴클레오타이드 서열의 첫 번째 및 두 번째 염기인 TT가 GA, GT 또는 GC 염기로 치환된 것인 변형 조절서열일 수 있다.

또한, 상기 변형 조절서열이 두 개의 RBS 서열을 포함하는 경우, 제1 RBS 서열의 3'말단에 연결된 제1 스페이서의 첫 번째 및 두 번째 염기인 TT가 GA, GT 또는 GC로 치환되거나, 제2 RBS 서열의 3'말단에 연결된 제2 스페이서의 첫 번째 및 두 번째 염기인 TT가 GG, GA, GT 또는 GC 염기로 치환되거나, 또는 제1 스페이서의 첫 번째 및 두 번째 염기인 TT가 GA, GT 또는 GC로 치환되고 제2 RBS 서열의 3'말단에 연결된 제2 스페이서의 첫 번째 및 두 번째 염기인 TT가 GG, GA, GT 또는 GC 염기로 치환된 변형 조절서열일 수 있다.

예를 들면, 비변형 조절서열은 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과, 그 상류(upstream)에 작동 가능하도록 연결되며 코리네박테리움속 균주에서 상기 사이코스 에피머화 효소의 발현을 조절하는 조절서열을 포함하며,

본 발명의 일 예에서, 상기 조절서열에 포함되는 스페이서 서열은 리보좀 결합 영역과 유전자 코딩 서열의 사이에 위치하며, 통상 3 내지 15 염기를 가지는 핵산분자이며 다양한 종류의 염기 및 길이로 제조될 수 있으며, 스페이서 서열을 조절서열에 포함시킴으로써 하부에 위치하는 유전자의 발현효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 발현하고자 하는 단백질의 코딩서열과 대상 숙주세포의 종류 등을 고려하여 다양한 종류의 핵산조성 및 크기로 제조하여 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 제 1 스페이서 서열은 서열번호 3 내지 6의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것 일 수 있으며, 제 2스페이서 서열은 서열번호 7 내지 11의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 발현 카세트는 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 그 상류(upstream)에 작동 가능하도록 연결되며, 코리네박테리움속 균주에서 상기 사이코스 에피머화 효소의 발현을 조절하는 조절서열을 포함한다. 상기 조절 서열에 포함된 전사 프로모터는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자 및 기능 변이체에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 다른 예에서, 상기 기능 변이체는, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 서열과의 서열 동일성이, 적어도 90%, 즉, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90% 이상이다.

본 발명에 따른 구체적인 조절서열 및 이의 구성 뉴클레오타이드 서열을 하기 표 1에 예시적으로 기재한다. 상기 조절서열은 서열번호 13 내지 서열번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화제를 발현하는 것일 수 있다.

서열 번호	서열(5' -> 3')	명명
1	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac	전사 프로모터
2	gaaagga	RBS
3	ttttttaccc	1^ST SPACER R1TT
4	gattttaccc	1^ST SPACER R1GA
5	gtttttaccc	1^ST SPACER R1GT
6	gcttttaccc	1^ST SPACER R1GC
7	ttacaaa	2nd SPACER R2TT
8	gaacaaa	2nd SPACER R2GA
9	gtacaaa	2nd SPACER R2GT
10	gcacaaa	2nd SPACER R2GC
11	ggacaaa	2nd SPACER R2GG
12	atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac	링커
13	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga ttttttaccc	RBS1/1^st SPACER-TT
14	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gattttaccc	RBS1/1^st SPACER-GA
15	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gtttttaccc	RBS1/1^st SPACER-GT
16	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gcttttaccc	RBS1/1^st SPACER-GC
17	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga tt ttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac
18	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gattttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga ttacaaa	R1GA/R2TT
19	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gattttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga gaacaaa	R1GA/R2GA
20	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gattttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga gtacaaa	R1GA/R2GT
21	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gattttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga gcacaaa	R1GA/R2GC
22	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gattttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga ggacaaa	R1GA/R2GG
23	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gtttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga ttacaaa	R1GT/R2TT
24	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gtttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga gaacaaa	R1GT/R2GA
25	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gtttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga gtacaaa	R1GT/R2GT
26	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gtttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga gcacaaa	R1GT/R2GC
27	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gtttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga ggacaaa	R1GT/R2GG
28	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gcttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga ttacaaa	R1GC/R2TT
29	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gcttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga gaacaaa	R1GC/R2GA
30	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gcttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga gtacaaa	R1GC/R2GT
31	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gcttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga gcacaaa	R1GC/R2GC
32	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga gcttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga ggacaaa	R1GC/R2GG

상기 표 1에서 밑줄 및 진하게 표시된 부분은 조절서열 중, 리보솜 결합 영역, 스페이서 서열, 링커 서열 등을 나타낸다.

본 발명에 따른 전사 프로모터는 그 하부에 연결된 사이코스 에피머화 효소를 코리네박테리움속 균주에서 발현할 수 있도록 조절하는 것이다. 대장균 유래의 프로모터는 발현유도인자의 낮은 투과성과 유전자 발현 억제 물질의 부재 등의 이유로 코리네박테리움에서 상대적으로 낮은 활성을 나타낸다. 또한 같은 프로모터라 하더라도 목적단백질을 코딩하는 유전자에 따라 발현 효율이 상이하며, 코리네박테리움에서 사용할 수 있는 프로모터들의 세기 또한 선택의 폭이 작아서 목적에 맞게 발현시스템을 제작하는 것이 용이하지 않다. 또한, 코리네박테리움속 균주 발현용 전사 프로모터일 지라도 특정 목적 단백질에 따라 그 전사조절 활성이 상이할 수 있으며, 이에 본 발명에 따른 전사 프로모터, 조절서열 또는 유전자 발현 카세트는 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 것이 적합하다.

상기 목적 단백질은 코리네박테리움속 균주 발현용 핵산분자의 3'말단에 직접 연결되거나, 링커를 통해 연결될 수 있다.

본 발명에 따른 사이코스 에피머화 효소는 효소활성 및 열안정성이 우수한 것이 바람직하고, 이에 본 발명의 구체예에서, 전사 프로모터 또는 조절서열은 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자와의 조합이 중요하며, 본 발명에 사용된 사이코스 에피머화 효소와는 전사 프로모터는 적정 이상의 단백질 발현을 제공할 수 있으며, 전사 프로모터를 사용한 경우에는 단백질의 폴딩(folding)이 견고하여 열안정성이 높게 나타나는 결과를 얻을 수 있어 더욱 바람직하다.

본 발명의 일예에서, 상기 사이코스 에피머라제는 클로스트리디움 신댄스(Clostridiun scidens), 트로포네마 프리미샤(Treponema primitia), 엔시퍼 아드해렌스(Ensifer adhaerens) 또는 루미노코코스 토르크 (Ruminococcus torques)에서 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 33 내지 36의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 사이코스 에피머화 효소일 수 있다.

상기 사이코스 에피머화 효소는 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 유지되는 한, 서열번호 33 내지 36의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 중 일부 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 단백질은 서열번호 33 내지 36의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 사이코스 에피머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 클로스트리디움 신댄스(Clostridiun scidens), 트로포네마 프리미샤(Treponema primitia), 엔시퍼 아드해렌스(Ensifer adhaerens) 또는 루미노코코스 토르크 (Ruminococcus torques)에서 얻어진 사이코스 에피머화 효소의 암호화 뉴클레오타이드 서열이거나, 대장균 또는 코리네박테리움속 균주에서 발현에 최적화할 수 있도록 변형된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

예를 들면, 상기 사이코스 에피머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 33 내지 36의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

구체적으로, 상기 사이코스 에피머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 37 내지 서열번호 44로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자일 수 있다. 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은 서열번호 37 내지 서열번호 44로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 서열이 서열번호 37 내지 서열번호 44로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.

당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열 중 하나 또는 그 이상의 염기를 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 실질적 상동성을 갖는 범위에서 동일한 활성을 갖는 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일 예에서, 클로스트리디움 신댄스 (Clostridiun scidens)에서 유래한 것으로, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질(CDPE)이 제공된다. 예컨대, 상기 단백질은 서열번호 33의 아미노산 서열을 가지며, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 사이코스 에피머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 서열번호 37의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 38의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.

상기 단백질은 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 법(SDS-PAGE)으로 측정된 단량체의 분자량이 30 내지 37 kDa, 예컨대 30 내지 35 kDa인 것일 수 있다. 상기 단백질의 최적 온도는 40 내지 65℃, 구체적으로 50 내지 65℃ 일 수 있다. 상기 최적 온도는, 예컨대, pH 7.0, 1mM Co² ⁺ 존재 하에서 5분간 반응 진행 시의 결과일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 단백질의 최적 pH는 pH 6 내지 9, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8.5, 또는 pH 7 내지 8일 수 있다. 상기 최적 pH는 예컨대, 60℃, 1mM Co² ⁺ 존재 하에서 5분간 반응 진행의 결과일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 예에서, 트로포네마 프리미샤(Treponema primitia)에서 유래한 것으로, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질(TDPE)이 제공된다. 예컨대, 상기 단백질은 서열번호 34의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 사이코스 에피머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 서열번호 39의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 40의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 예에서, 엔시퍼 아드해렌스(Ensifer adhaerens)에서 유래한 것으로, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질(EDPE)이 제공된다. 예컨대, 상기 단백질은 서열번호 35의 아미노산 서열을 가지며, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 사이코스 에피머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 서열번호 41의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 42의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 예에서, 루미노코코스 토르크 (Ruminococcus torques)에서 유래한 것으로, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질(RDPE)이 제공된다. 예컨대, 상기 단백질은 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 사이코스 에피머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 서열번호 43의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 44의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 발현 카세트는 복제 기점, 리더(leader), 선택 가능한 마커, 클로닝 부위 및 제한효소 인식부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 추가 예는, 본 발명에 따른 코리네박테리움속 균주 발현용 전사 프로모터, 이를 포함하는 조절서열, 또는 상기 조절서열과 및 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 코리네박테리움속 균주용 유전자 발현 카세트를 제공한다.

상기 코리네박테리움속 균주 발현용 핵산분자, 및 조절 서열과 사이코스 에피머화 효소는 상술한 바와 같다.

본 발명의 일예에서, 상기 발현 카세트는 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 서열로서, 복제 기점, 리더(leader), 선택 가능한 마커, 클로닝 부위 및 제한효소 인식부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 상기한 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 특히 바람직하게는 본 발명의 적어도 하나의 발현 카세트를 운반하는 벡터, 특히 셔틀 벡터 또는 플라스미드 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 미생물, 특히 코리박테리움속 균주에 관한 것이다.

상기 재조합 벡터는 당업계에 널리 알려진 방법을 통해 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다(Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:411-421). 상기 재조합 벡터는 유전자 재조합에 이용되어온 벡터라면 모두 사용이 무방하며, 예컨대, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

예컨대, 상기 재조합 벡터는 pET, pKK223-3, pTrc99a, pKD, pXMJ19, pCES208 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것으로부터 제작된 것일 수 있으며, 바람직하게는 E.coli-corynebacterium shuttle vector (pCES208, J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체로, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터란 작동 가능하도록 연결된 목적 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 목적 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 및 전사 종결인자 등으로 이루어지는 하나 이상의 전사 조절 요소와 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다.

상기 전사 종결인자는 rrnB, rrnB_T1, rrnB_T2, T7 terminator 등 일수 있으며, 바람직하게는 pET21a vector로부터 PCR된 T7 전사 종결인자일 수 있다.

본 발명의 일예는 상기 유전자 발현 카세트를 포함하거나, 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움속 숙주세포일 수 있다.

상기 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 모든 형질전환 방법 특별한 제한 없이 선택하여 사용할 수 있으며, 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기 천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등 선택된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환 코리네박테리움속 균주는 높은 안정성을 가지며, 도입된 사이코스 에피머화 효소를 과발현할 수 있으며, 따라서 장기간 안정적으로 높은 사이코스 전환능을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 형질전환 코리네박테리움속 균주는 사이코스 제조에 유용하게 적용될 수 있으며, 사이코스 생산 수율을 보다 증진시킬 수 있다.

바람직한 코리박테리움속 균주는 코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (glutamicum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라쎄콜라 (melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스 (efficiens) 종 세균이다.

본 발명에 따른 형질전환된 재조합 코리네박테리움속 숙주세포는 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.

상기 코리네박테리움속 균주의 배양은 적당한 배지에서 당업계에서 알려진 다양한 배양 방법으로 수행될 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함된다. 상기 유가식 배양에는 주입 배치 및 반복 주입 배치 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및(또는) 미량 원소를 포함한다. 바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당류이다. 질소 공급원은 일반적으로 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 이들 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는 암모니아 기체 또는 암모늄 염, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄, 니트레이트, 우레아, 아미노산, 또는 복합 질소 공급원, 예컨대 옥수수 침지액, 대두 분말, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등이 있다. 질소 공급원은 단독으로 또는 혼합물로 사용할 수 있다. 배지에 존재할 수 있는 무기염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브데늄, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인산염 또는 황산염을 포함한다. 인 공급원으로서, 인산, 인산2수소 칼륨 또는 인산수소 2칼륨, 또는 대응하는 나트륨-함유 염을 사용할 수 있다. 용액 중 금속 이온을 유지시키기 위해 배지에 킬레이팅제를 첨가할 수 있다. 배지의 모든 성분은 가열 (1.5 bar 및 121℃에서 20분) 또는 멸균 여과에 의해 멸균시킨다. 이 성분들은 함께, 또는 필요에 따라 개별적으로 멸균시킬 수 있다. 배지의 모든 성분은 배양 시작시에 존재할 수 있거나, 임의로는 연속 또는 배치식으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예는, 형질전환 코리네박테리움속 균주를 이용하여 얻어진 사이코스 에피머화 효소, 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 사이코스 생산용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 재조합 코리네박테리움속 숙주세포를 이용하여 얻어진 사이코스 에피머화 효소, 상기 세포의 균체, 상기 세포의 배양물, 상기 세포의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 사이코스 생산용 조성물을 과당-함유 원료와 접촉하여 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 배양물은 상기 코리네박테리움속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주의 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 무세포(cell-free) 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 코리네박테리움속 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 코리네박테리움속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사이코스의 제조에 사용되는 코리네박테리움속 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.

상기 사이코스 생산 방법은 상기 코리네박테리움속 균주를 과당-함유 원료와 반응시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 코리네박테리움속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 상기 코리네박테리움속 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 코리네박테리움속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 상기 균주(균체, 균주의 배양물, 및/또는 균주의 파쇄물)를 과당과 접촉시키는 단계, 예컨대, 상기 균주를 과당과 혼합하는 단계 또는 상기 균주가 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 코리네박테리움속 균주를 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하여 과당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 사이코스 생산방법에 있어서, 상기 반응은 pH 6 내지 9.5, 예컨대, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8 또는 pH 8 내지 9의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 반응은 30℃ 이상, 예컨대 40℃ 이상의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 온도가 80℃ 이상이 되면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반응은 40 내지 80℃, 예컨대, 50 내지 75℃, 60 내지 75℃, 또는 68 내지 75℃의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한 상기 반응 시간이 길수록 사이코스 전환률이 높아진다. 예컨대, 상기 반응 시간은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반응시간이 48 시간을 넘어가면 사이코스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 48 시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반응 시간은 1 내지 48시간, 2 내지 48시간, 3 내지 48시간, 4 내지 48시간, 5 내지 48시간, 또는 6 내지 48시간으로 할 수 있으며, 산업적 및 경제적 측면을 고려하여, 1 내지 48시간, 2 내지 36 시간, 3 내지 24 시간, 3 내지 12시간, 또는 3 내지 6시간 정도로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조건은 과당에서 사이코스로의 전환 효율이 최대화되는 조건으로서 선정된 것이다.

또한, 상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물 기준으로 5 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 5 내지 100mg(dcw)/ml, 10 내지 90mg(dcw)/ml, 20 내지 80mg(dcw)/ml, 30 내지 70 mg(dcw)/ml, 40 내지 60 mg(dcw)/ml, 또는 45 내지 55 mg(dcw)/ml일 수 있다. 균체 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 사이코스 전환 활성이 낮거나 거의 없고, 상기 범위를 초과하면 균체가 너무 많아져서 사이코스 전환 반응의 전체적인 효율이 낮아지므로, 균체 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다.

상기 과당을 사이코스로 전환시키는 효소(예컨대, 에피머레이즈)는 금속 이온에 의하여 활성화가 조절될 수 있으므로, 상기 사이코스 생산에 있어서, 금속 이온을 첨가하면 과당에서 사이코스로의 전환 효율, 즉 사이코스 생산률이 증가될 수 있다.

따라서, 상기 코리네박테리움속 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물은 금속 이온을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 코리네박테리움속 균주를 이용한 사이코스 생산 방법은 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 금속 이온은 상기 배양 단계의 배양 배지에 첨가되거나, 상기 배양 단계가 상기 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 수행되는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 금속 이온은 과당에 첨가되거나, 상기 코리네박테리움속 균주와 과당과의 혼합물에 첨가될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 코리네박테리움속 균주가 고정화된 담체에 첨가되거나(과당 첨가 전), 상기 코리네박테리움속 균주가 고정화된 담체와 과당과의 혼합물에 첨가되거나(과당 첨가 후), 또는 과당 첨가시에 과당과 혼합물의 형태로 또는 각각 첨가될 수 있다.

상기 금속 이온은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온은 망간 이온, 마그네슘 이온, 니켈 이온, 코발트 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 일 예에서 상기 금속 이온은 망간 이온, 코발트 이온, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 금속 이온의 첨가량이 0.5mM 미만인 경우에는 사이코스 생산 수율 증진 효과가 미미하므로, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.5mM 이상으로 할 수 있다. 한편, 상기 금속 이온의 첨가량이 5mM을 초과하면 그 초과량에 비하여 효과가 미미하기 때문에, 상기 금속 이온의 첨가량은 5mM 이하로 할 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.5mM 내지 5mM, 예컨대, 0.5 mM 내지 2mM 범위로 할 수 있다.

상기 담체는 고정된 균주, 또는 상기 균주로부터 생산되는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체일 수 있다. 예컨대, 상기 담체로서 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 균주 또는 효소가 안정적으로 고정되어 우수한 사이코스 수율을 나타내는 데 유리할 수 있다.

일 구체예에서, 사이코스의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액(예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 예컨대 약 2.5%의 (w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 균주의 고정화에 사용할 수 있다. 예컨대, 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양액, 또는 상기 균주의 파쇄물의 1 내지 2 부피배의 알긴산나트륨 수용액에 상기 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물을 첨가하여 혼합한 후, 상기 얻어진 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 약 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써, 알긴산나트륨 담체에 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물이 고정화시킬 수 있다. 상기 효소는 상기 균주, 균주 배양물 또는 상기 균주의 파쇄물로부터 통상의 방법, 예컨대 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 친화 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법에 의하여 정제된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계는 상기 효소 단백질을 과당과 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 접촉시키는 단계는, 예컨대, 상기 효소 단백질 등을 과당과 혼합하는 단계 또는 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담 체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계는 상기 재조합 균주의 균체를 과당-함유 원료화 접촉하여 적정온도에서 반응을 시켜 수행할 수 있다. 이와 같이 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하여 과당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다.

상기 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 사용되는 효소 단백질의 양은 전체 반응물 기준으로 0.001 mg/ml 내지 1.0mg/ml, 0.005mg/ml 내지 1.0mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 1.0mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, 또는 0.05mg/ml 내지 0.1mg/ml일 수 있다. 효소의 사용량이 상기 농도보다 낮으면 사이코스 전환 효율이 낮아 질 수 있고, 상기 농도보다 높으면 산업에서의 경제성이 낮아지므로 상기 범위가 적당하다.

상기 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 효소 단백질의 최적 조건을 고려할하여 반응 pH, 반응온도 및 효소의 농도 등을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예컨대, 상기 반응 pH는 pH 6 내지 9, 반응온도는 온도가 80℃을 넘으면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 30℃ 이상, 예컨대 40℃ 이상의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한, 효소 농도에 따라서 달라지지만, 대체적으로 반응시간이 길수록 사이코스 전환률이 높아진다. 예컨대, 효소의 열안정성(예컨대, 50℃에서의 열안정성)을 고려하여, 상기 반응 시간은 1시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반응시간이 8 시간을 넘어가면 사이코스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 8시간을 넘기지 않는 것이 좋다.

또한, 상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 재조합 균주를 사용하는 경우, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물을 기준으로 0.1 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상일 수 있다.

상기 사이코스 전환효소 활성을 갖는 효소 단백질은 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme) 특성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효소 단백질에 의한 반응을 금속 이온 존재 하에서 수행함으로써 사이코스의 생산 수율을 증진시킬 수 있다. 사이코스 생산 수율에 기여할 수 있는 금속이온은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 망간 이온, 철 이온, 및 코발트 이온로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 금속 이온의 첨가량이 0.1mM 미만인 경우에는 사이코스 생산 수율 증진 효과가 미미하므로, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.1mM 이상으로 할 수 있다. 한편, 상기 금속 이온의 첨가량이 5mM을 초과하면 그 초과량에 비하여 효과가 미미하기 때문에, 상기 금속 이온의 첨가량은 5mM 이하로 할 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.1mM 내지 5mM, 예컨대, 0.1 내지 2mM, 또는 0.5 mM 내지 1.5mM 범위로 할 수 있다.

따라서, 상기 사이코스 제조용 조성물은 첨가량은 상기한 금속 이온을 추가로 포함할 수 있으며, 금속 이온의 종류와 함량은 상기한 바와 같다. 또한, 상기 사이코스 생산 방법은 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 금속 이온의 종류와 함량은 상기한 바와 같다.

다른 일 구현 예에 있어서, 상기 사이코스의 생산 방법은 사이코스 에피머화효소를 발현하는 재조합 균주 또는 상기 재조합 균주로부터 분리된 효소 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 반응 단계 이전에 사이코스 에피머화효소를 발현하는 재조합 균주를 배양 및 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 과당으로부터 수득된 사이코스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명은 과당으로부터 사이코스를 대량 제조하여 식품소재로 사용할 수 있도록 GRAS 균주인 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 유전자 발현 시스템, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 코리네박테리움속 균주를 제공하며, 상기 유전자 발현 시스템를 이용하여 생산된 사이코스 에피머화 효소를 이용하여 과당-함유 원료를 이용하여 사이코스를 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 corynebacterium glutamicum에서 발현하기 위한 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 대장균에서 사이코스 전환반응의 전환율을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 효소반응을 통하여 사이코스 전환반응의 전환율을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 CDPE를 발현시킨 코리네박테리움 세포의 세포 반응 진행 시 60℃에서의 전환율을 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 CDPE를 발현시킨 세포에 50℃의 열을 가하여 시간이 지날수록 효소의 활성이 감소하는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 Bead beater를 이용하여 배양한 corynebacterium 세포를 용해시킨 후 SDS-PAGE를 통해 단백질의 발현량을 비교한 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 double mutation를 통해 CDPE를 발현시킨 세포의 세포 반응 진행 시 60℃에서의 전환율을 비교한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 double mutation를 통해 CDPE를 발현시킨 세포의 세포 반응 진행 시 50℃에서의 열 안정성을 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 플라스미드의 제조

실시예 1-1: sod 프로모터를 이용한 벡터제조

클로스트리디움 신댄스(Clostridiuim scindens ATCC 35704)로부터 유래된 사이코스 에피머화 효소의 암호화 유전자(DPE gene; Gene bank: EDS06411.1)를, 대장균에 최적화하여 변형한 형태의 폴리뉴클리오티드로 합성하고 CDPE라 명명하였다. 대장균에 최적화된 폴리뉴클리오티드(서열번호 36), 코리네박테리움의 gDNA에서 확보한 sod 조절서열(서열번호 17: sod promoter-RBS-SPACER R1TT-LINKER), 및 pET21a 벡터로부터 확보한 T7 터미네이터를 포함한 서열을 PCR을 통해 각각의 주형으로 확보하였고, 이를 오버랩 PCR 법으로 하나의 주형으로 연결하여, T-vector cloning을 통해 pGEM T-easy vector에 클로닝하여 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하였으며, 구체적으로 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 17의 sod 조절서열, 서열번호 36의 E.coli에 최적화 서열인 CDPE 서열, 및 T7-터미네이터를 포함한다.

상기 확인된 전체 폴리뉴클레오티드를 제한효소 NotI과 XbaI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pCES208(J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pCES208/사이코스 에피머화 효소(pCES_sodCDPE)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_sodCDPE)의 개열지도를 도 1에 개시하였다.

실시예 1-2: Saturation mutagenesis 를 이용한 벡터제조

Saturation mutagenesis을 이용한 벡터 제조를 진행하기 위해서 target site를 -NN-으로 한 프라이머를 제작하였다. 구체적으로, Target site는 클로닝할 때 추가로 첨가한 제2 RBS와 sod promoter에 앞쪽에 위치한 제1 RBS(GAAGGA)의 3'쪽 뒷부분에 위치하는 TT로 정하였고, 이 부분을 -NN-으로 한 프라이머를 제작하였다(제노텍 의뢰). 프라이머의 서열 및 saturation mutagenesis site, primer binding site는 하기 표 2에 나타내었다.

Primer	서열목록(5'->3')	서열번호
RBS1_F	GGTGCGGAAACCTACGAAAGGANNTTTTACCCATGGCTGTATACGAAC	45
RBS1_R	GTTCGTATACAGCCATGGGTAAAANNTCCTTTCGTAGGTTTCCGCACC	46
RBS2_F	GACTACGCATACGACGAAAGGANNACAAAATGAAACACGGTATCTACTAC	47
RBS2_R	GTAGTAGATACCGTGTTTCATTTTGTNNTCCTTTCGTCGTATGCGTAGTC	48

상기 프라이머로 -NN-을 기점으로 앞부분과 뒷부분 fragment를 PCR을 통해 확보한 후, 오버랩(overlap) PCR을 통해 하나의 주형(template)으로 제작하고, 그 다음 pCES208 플라스미드에 XbaI, NotI site로 ligation하여 Saturation mutagenesis된 플라스미드를 제작하였다.

실시예 2. 대장균의 형질전환 및 스크리닝

실시예 2-1: 대장균의 형질전환

실시예 1에서 제작한 플라스미드를 전기천공법(electroporation)을 사용하여 E.coli DH10b strain을 형질전환시켰다. 이 후 E.coli cell에서 전체 돌연변이를 대상으로 스크리닝을 진행하였다. 구체적으로, 1.5ml 튜브에 kanamycin을 최종농도 15㎍/ml로 넣은 1ml LB(tryptone 10mg/L, NaCl 10mg/L, yeast extract 5mg/L)를 분주한 후 플레이트에서 무작위로 선별한 콜로니를 접종하고, 37℃에서 약 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 cell harvest를 통해 배지를 제거하고 50mM PIPES 버퍼 (pH 7.0)에 녹인 50% 과당(기질), 1mM Mn² ⁺를 첨가하여 60℃에서 30분간 전환반응 후, 100℃에서 5분간 끊여서 반응 중지시켰다.

실시예 2-2: 사이코스 전환율을 이용한 스크리닝

그 다음 LC분석을 통해 pCES_sodCDPE와의 사이코스 전환율을 비교하여 전환율이 더 높은 돌연변이들만 선정하였다. 구체적으로, 기질(과당)과 생산물질(사이코스)의 피크 확인 및 피크의 에어리어(area)를 통한 정량분석하는 방법으로 진행하였다.

LC 분석 후 피크의 에어리어를 비교함으로써 사이코스 생산량과 기질의 감소되는 정도를 확인할 수 있었는데, 이러한 계산을 위해서 과당 농도별 샘플(10, 20, 50, 100, 120, 150mM)과 사이코스의 농도별 샘플(1, 2, 5, 10, 20, 50mM)을 준비하여 R제곱값이 0.99 이상이 되도록 standard curve를 각각 그렸고, 그에 따른 수식을 도출하여 피크의 에어리어에 따른 과당 및 사이코스의 농도를 계산하였다.

최종 결과값은 사이코스 전환율로 나타내어 서로 비교하였으며, 사이코스 전환율과 CDPE의 발현량은 서로 비례하므로 사이코스 생산량이 많을수록 CDPE의 발현량이 증가하였다는 것을 의미한다.

그 결과, R1 site 3종, R2 site에서 3종, 총 6가지의 돌연변이를 선정하였다. 각각의 돌연변이를 R1-1, R1-4, R1-8, R2-1, R2-5, 및 R2-11로 명명하였다. 이후 재확인을 위해 다시 한번 LC분석을 통해 돌연변이를 일으키지 않은 대조군인 pCES_sod CDPE와의 사이코스 전환율을 비교하는 재확인 실험을 수행하여 전환율이 더 높은 돌연변이들 4종만 선정하였다. 그 결과를 도 2 및 표 3에 나타내었다.

sample	사이코스 전환율 (%)
sod_CDPE	5.15
R1-1	8.59
R1-4	8.94
R2-5	5.66
R2-11	6.07

상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, 최종적으로 R1 site에서 R1-1 및 R1-4의 2개, R2 site에서 R2-5 및 R2-11의 2개, 총 4개의 돌연변이에서 사이코스 전환율이 향상된 것을 확인할 수 있었고, 이러한 결과를 통해서 CDPE의 발현이 증가된 것이라고 예상할 수 있다.

실시예 2-3: 변이서열의 확인

돌연변이를 일으키지 않은 pCES_sodCDPE의 플라스미드에 포함된 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 기준으로, R1-1은 1번 및 2번째 염기가 TT에서 GA로 치환된 것이고, R1-4는 TT에서 GG로 치환된 것이다.

또한, 돌연변이를 일으키지 않은 pCES_sodCDPE의 플라스미드에 포함된 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 기준으로, R2-5 및 R2-11는 1번째 및 2번째 염기가 TT에서 GG로 치환된 것이다.

실시예 3. Corynebacterium 에서의 CDPE 발현율 측정

실시예 2에서 선정한 4가지 돌연변이들로 corynebacterium에 형질전환 진행 후, 100ml LB에 배양하여 세포를 확보하고, 세포를 용해시킨 후 His-tag 정제를 진행하여 SDS-PAGE상에서 CDPE의 발현율을 확인하였다.

구체적으로, Beadbeater를 이용하여 배양한 세포를 용해(lysis)시킨 후 상등액만 취득하여 샘플버퍼와 1:1로 혼합 후 100℃에서 5분간 가열하였다. 준비한 샘플은 12% SDS-PAGE gel (조성: running gel - 3.3 ml H₂O, 4.0 ml 30% acrylamide, 2.5 ml 1.5M Tris buffer(pH 8.8), 100 ㎕ 10% SDS, 100 ㎕, 10% APS, 4 ㎕ TEMED / stacking gel - 1.4 ml H₂O, 0.33 ml 30% acrylamide, 0.25 ml 1.0M Tris buffer(pH 6.8), 20 ㎕ 10% SDS, 20 ㎕ 10% APS, 2 ㎕ TEMED)에 180V로 50분 가량 전기영동하여 단백질 발현을 확인하였다.

CDPE의 발현을 SDS-PAGE gel상에서 확인 후 정확한 발현량의 측정을 위해 Ni-NTA resin을 이용한 His-tag정제 진행하여, 계산식(발현율(%) = (Purified protein(mg) / Total soluble protein(mg)) * 100)을 이용하여 발현율 계산하여 하기 표 4에 나타내었다.

하기 표 4에서, 균주 내 전체 단백질은 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 균주 내부에 포함된 전체 단백질이고, 사이코스 에피머화 효소는 그 중 사이코스 에피머화 효소만을 정제하여 확보한 것이다. 따라서 발현율은 균주에 존재하는 전체 단백질에서 목적단백질이 어느 정도 비율로 발현되는지 계산한 값이다.

sample	CDPE 발현율 (%)
Sod_CDPE	10
R1-1	15
R1-4	9.5
R2-5	8.3
R2-11	8.5

상기 표 4에서 확인 할 수 있듯이, 재조합 벡터(pCES_sodCDPE)의 형질전환체와 비교하였을 때, R1-1의 정제한 CDPE의 농도가 약 1.5배 높은 것을 확인할 수 있었다. 반면에, 나머지 샘플들은 낮은 발현율을 보임을 확인하였다.

실시예 4. 효소 반응을 통한 사이코스 생산

실시예 2에 따른 4가지 돌연변이들인 R1-1, R1-4, R2-5, 및 R2-11로 corynebacterium에 형질전환 진행 후, 100ml LB에 배양하여 세포를 확보하고, 정제하지 않은 조효소를 이용하여, 50mM 과당을 함유하는 원원료부터 사이코스 생산량을 분석하였다.

구체적으로, 50mM 농도의 과당을 함유하는 원료에 1mM Mn² ⁺ 첨가한 고농도 기질 조건에, 실시예 2에서 얻어진, CDPE 발현 돌연변이 세포를 파쇄하여 단백질을 포함하고 있는 상등액을 확보한 후 전체 단백질의 농도가 0.007mg/ml이 되도록 정량하여 pH 7.0 PIPES 50mM 및 60℃ 조건에서 5, 10, 15분 동안 반응을 진행한 후에 100℃에서 5분간 끓여서 반응 중지하였다.

그 다음, LC분석을 통해 사이코스 전환율을 비교하였다. 구체적으로, 액체 크로마토그래피 (LC) 분석을 기질(과당)과 생산물질(사이코스)의 피크 확인 및 피크의 에어리어(area)를 통해 분석을 진행하였다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하고 (Agilent 1260 RID), 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80 ℃, 유속은 0.6ml/min로 하여 수행하였다. 그 다음, 전환율을 LC의 peak area를 통해 사이코스 생산량과 남아있는 과당의 양을 측정하여 하기의 계산식을 통해 계산하였다. 그 결과를 도 3 및 표 5에 나타냈다.

[계산식]

전환율 (%) = 사이코스 생산량 (g/l) /(사이코스 생산량 + 남아있는 과당) (g/l) * 100

sample	5분 반응시 사이코스 전환율 (%)
Sod-CDPE	15.66
R1-1	17.24
R1-4	14.39
R2-5	14.10
R2-11	13.65

상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, sod-CDPEII과 비교하여 R1-1의 전환율이 높은 결과를 얻을 수 있었다. 그 외에 다른 돌연변이들은 sod-CDPE와 비교하여 약간 감소된 전환율을 보임을 확인하였다.

실시예 5. 코리네박테리움의 세포 반응을 통한 사이코스 생산

실시예 2에 따른 4가지 돌연변이들인 R1-1, R1-4, R2-5 및 R2-11로 corynebacterium 에 형질전환 진행 후, 100ml LB에 배양하여 세포를 확보하고, 세포반응을 이용하여 고형분 함량기준으로 50 중량% 과당을 함유하는 원료로부터 사이코스를 생산하여 사이코스 전환율을 비교하였다.

구체적으로, 고형분 함량기준으로 50 중량% 과당을 함유하는 원료에 1mM Mn²⁺ 첨가한 고농도 기질 조건에, 실시예 2에서 얻어진 CDPE 발현 세포를 0.5 내지 2mg/ml의 농도로 pH 7.0 PIPES 50mM 및 60℃ 조건에서 반응을 진행한 후에 100℃에서 5분간 끓여서 반응 중지하였다. 각각의 세포를 이용하여 상기 조건에서 세포 반응을 진행하고, LC분석을 통해 사이코스 전환율을 비교하였다. 구체적으로, 액체 크로마토그래피 (LC) 분석을 기질(과당)과 생산물질(사이코스)의 피크 확인 및 피크의 에어리어(area)를 통해 분석을 진행하였다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하고 (Agilent 1260 RID), 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80℃, 유속은 0.6ml/min로 하여 수행하였다. 그 다음, 전환율을 LC의 peak area를 통해 사이코스 생산량과 남아있는 과당의 양을 측정하여 하기의 계산식을 통해 계산하였다. 그 결과를 도 4 및 표 6에 나타냈다.

[계산식]

sample	사이코스 전환율 (%)
Sod-CDPEII	6.02
R1-1	8.34
R1-4	5.99
R2-5	4.79
R2-11	5.29

상기 표 6에 나타난 것과 같이, sod-CDPEII과 비교하여 R1-1의 전환율이 높은 결과를 얻을 수 있었다. 그 외에 다른 돌연변이들은 sod-CDPE와 비교하여 약간 감소된 전환율을 보임을 확인하였다.

실시예 6: 코리네박테리움의 세포반응 열안정성 비교

사이코스 에피머화 효소를 고발현율로 생산하는 균주도 중요하지만, 안정적으로 생산하는 균주가 산업적으로 유용하므로, 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주 자체의 열안정성을 확인하고자 본 실험을 수행하였다.

세포 반응 진행 시 50℃에서의 열안정성 확인하기 위하여, 유화제 전처리 과정까지 완료한 세포 1.0mg/ml를 50mM PIPES buffer(pH 7.0)에 재현탁 시킨 후, 50℃의 물에 중탕하여 열을 가하였다. 이 후 시간별로 세포을 sampling하여 기질로 50% fructose 사용하고 Mn²⁺를 1mM 첨가한 상태에서 50℃에서 60분동안 전환반응을 실시하였다. 시간별로 샘플링한 세포에 대한 사이코스 전환율 및 각 세포의 활성 감소 정도를, 각 샘플에 대한 데이터를 전환율과 0분을 기준으로 하였을 때 활성의 감소 정도를 계산한 값을 표 7 및 도 5에 나타내었다.

반응시간	pCES_sodCDPE 사이코스 전환율 (%)	pCES_sodCDPE 상대적 열안정성	R1-1 사이코스 전환율 (%)	R1-1 상대적 열안정성
0분	8.4	100	11.62	100
120분	7.5	89.21	10.77	92.7
240분	7.27	86.56	9.56	82.27
360분	7.02	83.52	9.03	77.74
540분	6.81	81.05	9.19	79.1
840분	6.54	77.88	8.9	76.6
1020분	6.52	77.65	8.4	72.31
1200 분	6.15	73.17	7.32	62.98
1320 분	5.94	70.64	8.04	69.24
1560 분	5.92	70.42	8.15	70.14
1680 분	5.71	67.92	7.75	66.75
1740 분	5.24	62.32	6.82	58.73

상기 표 7에서 볼 수 있듯이, 기존의 pCES_sodCDPE와 R1-1의 열안정성을 비교한 결과, 큰 차이 없는 것으로 확인되어 R1-1 역시 열안정성이 매우 우수함을 확인하였다. R1-1의 반감기는 약 1800분 정도로 예상된다.

실시예 7: 변이 조절서열의 제조 및 CDPE 발현

실시예 7-1: 변이 조절 서열을 포함하는 벡터 제조

Target site를 클로닝할 때 추가로 첨가한 제2 RBS와 sod promoter에 앞쪽에 위치한 제1 RBS(GAAGGA)의 3'-쪽 뒷부분에 위치하는 TT로 정하고, 이 부분을 각각 GT, GC, 또는 GG로 한 프라이머를 제작하였다(제노텍 의뢰). 프로모터의 서열은 하기 표 8에 나타내었다.

Primer	서열목록(5'->3')	서열번호
RBS1GT_F	GGTGCGGAAACCTACGAAAGGAGTTTTTACCCATGGCTGTATACGAAC	49
RBS1GT_R	GTTCGTATACAGCCATGGGTAAAAACTCCTTTCGTAGGTTTCCGCACC	50
RBS1GC_F	GGTGCGGAAACCTACGAAAGGAGCTTTTACCCATGGCTGTATACGAAC	51
RBS1GC_R	GTTCGTATACAGCCATGGGTAAAAGCTCCTTTCGTAGGTTTCCGCACC	52
RBS1GG_F	GGTGCGGAAACCTACGAAAGGAGGTTTTACCCATGGCTGTATACGAAC	53
RBS1GG_R	GTTCGTATACAGCCATGGGTAAAACCTCCTTTCGTAGGTTTCCGCACC	54

실시예 7-2: CDPE 발현율 측정

상기 변이 조절서열을 포함하는 플라스미드로 corynebacterium에 형질전환 진행 후, 100ml LB에 배양하여 세포를 확보하고, 세포를 용해시킨 후 Ni-NTA resin으로 His-tag 정제를 진행하여, 총 단백질의 농도와 정제 단백질(CDPE)의 농도를 Bradford assay법으로 측정한 후 목적단백질의 발현율 계산하였다. 구체적으로, Beadbeater를 이용하여 배양한 세포를 용해(lysis)시킨 후 상등액만 취득하여 샘플버퍼와 1:1로 혼합 후 100℃에서 5분간 가열하였다. 준비한 샘플은 12% SDS-PAGE gel (조성: running gel - 3.3 ml H₂O, 4.0 ml 30% acrylamide, 2.5 ml 1.5M Tris buffer(pH 8.8), 100 ㎕ 10% SDS, 100 ㎕, 10% APS, 4 ㎕ TEMED / stacking gel - 1.4 ml H₂O, 0.33 ml 30% acrylamide, 0.25 ml 1.0M Tris buffer(pH 6.8), 20 ㎕ 10% SDS, 20 ㎕ 10% APS, 2 ㎕ TEMED)에 180V로 50분 가량 전기영동하였다.

그 다음 정확한 발현량의 측정을 위해 Ni-NTA resin을 이용한 His-tag정제 진행하여, 계산식(발현율(%) = (Purified protein(mg) / Total soluble protein(mg)) * 100)을 이용하여 발현율 계산하여 하기 표 9 및 도 6에 나타내었다.

	균주내 전체 단백질(mg)	사이코스 에피머화효소(mg)	발현율 (%)
pCES_sodCII	10.7	1.1	10.3
R1GA	11.5	1.7	14.8
R1GT	10.9	1.6	14.7
R1GC	8.2	0.8	9.8
R1GG	10.8	0.7	6.5

상기 표 9에서 확인 할 수 있듯이, pCES_sodCDPE와 비교하였을 때, CDPE의 발현율에 따라 one point mutation 균주 중에서는 R1GA, R1GT가 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었고, R1GC는 거의 비슷한 활성을 가지며, R1GG는 활성이 감소하였음을 확인할 수 있었다.

실시예 7-3: 세포반응을 이용한 사이코스 생산

실시예 4와 실질적으로 동일한 방법으로, corynebacterium 에 형질전환 진행 후, 100ml LB에 배양하여 세포를 확보하고, 세포반응을 진행하여 사이코스 전환율을 비교하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

sample	사이코스 전환율 (%)	상대적 전환율 (%)
R1GG	4.58	100
R1TT	6.73	147
R1GA	9.76	213
R1GT	9.17	200
R1GC	7.39	161

상기 표 10에 나타난 것과 같이, one point mutation 균주들은, R1GG의 사이코스 전환율을 100으로 하였을 때, R1GA는 213, R1GT는 200, R1GC는 161, R1TT는 147로 모두 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

7-4: 세포 반응 시 열안정성 비교

세포 반응 진행 시 50℃에서의 열안정성 확인하기 위하여, 유화제 전처리 과정까지 완료한 세포 1.0mg/ml를 50mM PIPES buffer(pH 7.0)에 재현탁 시킨 후, 50℃의 물에 중탕하여 열을 가하였다. 이 후 시간별로 세포을 sampling하여 기질로 50% fructose 사용하고 Mn² ⁺를 1mM 첨가한 상태에서 50℃에서 60분동안 전환반응을 실시하였다.

각 세포의 활성 감소 정도를, 각 샘플에 대한 데이터를 전환율과 0분을 기준으로 하였을 때 활성의 감소 정도를 계산한 값으로 측정하여 표 11 및 도 8 에 나타내었다.

	pCES_sodCII	R1GA	R1GT	R1GC	R1GG
0분	100	100	100	100	100
240분	86.6	82.3	83.9	91	83.8
360분	83.5	77.7	74.1	84.8	79.2
840분	77.9	76.6	72.3	84.7	78.1
1200분	73.2	75.8	73.2	81.9	64.2
1560분	70.4	70.1	66.9	77.6	62.3
1680분	67.9	66.7	65.2	73.8	56.1
1740분	62.3	58.7	56.2	52.4	55.3

실시예 8: 변이 조절서열의 제조 및 CDPE 발현

8-1: 변이 조절 서열을 포함하는 벡터 제조

제1 RBS와 제2 RBS의 site를 지정하여 Saturation mutagenesis 실험을 진행한 결과 제1 RBS의 TT가 CDPE의 발현에 영향을 미치는 site라는 것을 확인하였고, 이를 토대로 제1 RBS의 TT가 GT, GC, 또는 GG로 돌연변이, 및 기능이 향상된 돌연변이인 R1-1(제1 RBS의 TT의 GA 돌연변이)를 template로 하여 제2 RBS의 TT를 GA, GT, GC, 또는 GG로 돌연변이시켜 비교실험을 진행하였다.

주형으로는 상기 실시예 5에서 확보한 돌연변이(R1-1)를 사용하였고, 아래의 primer를 이용하여 각각의 double mutant를 포함하는 플라스미드를 제작하였다. 프로모터의 서열은 하기 표 12에 나타내었다.

Primer	서열목록(5'->3')	서열 번호
RBS1GA/RBS2GA_F	GACTACGCATACGACGAAAGGAGAACAAAATGAAACACGGTATCTACTAC	55
RBS1GA/RBS2GA_R	GTAGTAGATACCGTGTTTCATTTTGTTCTCCTTTCGTCGTATGCGTAGTC	56
RBS1GA/RBS2GT_F	GACTACGCATACGACGAAAGGAGTACAAAATGAAACACGGTATCTACTAC	57
RBS1GA/RBS2GT_R	GTAGTAGATACCGTGTTTCATTTTGTACTCCTTTCGTCGTATGCGTAGTC	58
RBS1GA/RBS2GC_F	GACTACGCATACGACGAAAGGAGCACAAAATGAAACACGGTATCTACTAC	59
RBS1GA/RBS2GC_R	GTAGTAGATACCGTGTTTCATTTTGTGCTCCTTTCGTCGTATGCGTAGTC	60
RBS1GA/RBS2GG_F	GACTACGCATACGACGAAAGGAGGACAAAATGAAACACGGTATCTACTAC	61
RBS1GA/RBS2GG_R	GTAGTAGATACCGTGTTTCATTTTGTCCTCCTTTCGTCGTATGCGTAGTC	62

8-2: CDPE 발현율 측정

실시예 7-2와 실질적으로 동일한 방법으로, 상기 변이 조절서열을 포함하는 플라스미드로 corynebacterium에 형질전환하고, CDPE 발현율을 측정하였으며 그 결과를 하기 표 13과 도 7에 나타냈다.

하기 표 13에서, 균주 내 전체 단백질은 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 균주 내부에 포함된 전체 단백질이고, 사이코스 에피머화 효소는 그 중 사이코스 에피머화 효소만을 정제하여 확보한 것이다. 따라서 발현율은 균주에 존재하는 전체 단백질에서 목적단백질이 어느 정도 비율로 발현되는지 계산한 값이다.

	균주내 전체 단백질 (mg)	사이코스 에피머화효소 (mg)	발현율 (%)
pCES_sodCII	10.7	1.1	10.3
R1GA/R2GA	10.3	1.5	14.5
R1GA/R2GT	10.7	1.6	15.0
R1GA/R2GC	12.8	1.8	14.1
R1GA/R2GG	11.9	1.7	14.3

상기 표 13에서 확인 할 수 있듯이, Double mutation 균주들은 pCES_sodCDPE와 CDPE의 발현율을 비교하였을 때, R1GA/R2GA, R1GA/R2GT, R1GA/R2GC, R1GA/R2GG 모두 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

8-3: 세포 반응을 통한 사이코스 생산

실시예 8-2에 따른 double mutant를 corynebacterium 에 형질전환 진행 후, 100ml LB에 배양하여 세포를 확보하고, 세포반응을 진행하여 사이코스 전환율을 비교하였다. 다음의 표 13에 나타내었다.

상기 얻어진 생산물을 확인하고자, 액체 크로마토그래피 (LC) 분석을 기질(과당)과 생산물질(사이코스)의 피크 확인 및 피크의 에어리어(area)를 통한 정량분석 진행하였다. 그 결과 다양한 유화제 용액에 대한 세포의 사이코스 생산에 관한 초기반응속도 (Unit/g-DCW)를 하기 표 14 및 도 7에 나타냈다.

상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하여 (Agilent 1260 RID) 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80℃, 유속은 0.6ml/min로 하였다.

sample	사이코스 전환율 (%)	상대적 전환율 (%)
R1GG	4.58	100
R1GA/R2GC	9.95	217

상기 표 14에 나타난 것과 같이, R1GG의 사이코스 전환율을 100으로 하였을 때, Double mutation 균주인 R1GA/R2GC는 217로 활성이 증가함을 확인할 수 있었다.

8-4: 세포 반응 시 열안정성 비교

각 세포의 활성 감소 정도를, 각 샘플에 대한 데이터를 전환율과 0분을 기준으로 하였을 때 활성의 감소 정도를 계산한 값으로 측정하여 표 15 및 도 8에 나타내었다.

	pCES_sodCII	R1GA/R2GA	R1GA/R2GT	R1GA/R2GC	R1GA/R2GG
0분	100	100	100	100	100
240분	86.6	86.9	90.8	90.4	88.5
360분	83.5	90	81.5	92.2	83.6
840분	77.9	80.9	68.4	77.4	82.4
1200분	73.2	77.3	64.6	73.6	72.2
1560분	70.4	74.1	62.7	70.8	75.4
1680분	67.9	70.5	59.6	67.4	71.8
1740분	62.3	66.4	56.9	61.7	63.2

상기 표 15에서 볼 수 있듯이, pCES_sodCDPE와 Double mutation 균주들 간의 열안정성을 비교한 결과, 큰 차이 없는 것으로 확인되었으며, RBS의 sequence 변화에 따라 CDPE의 발현에는 영향을 주었지만, 발현 단백질의 열안정성에는 크게 영향을 미치지 않는다는 것을 열안정성 실험을 통해 알 수 있었다.

<110> SAMYANG GENEX CORPORATION <120> Expression system for psicose epimerase and production for psicose using the same <130> DPP20150071KR <160> 62 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 283 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promotor <400> 1 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tac 283 <210> 2 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS <400> 2 gaaagga 7 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1ST SPACER R1TT <400> 3 ttttttaccc 10 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1ST SPACER R1GA <400> 4 gattttaccc 10 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1ST SPACER R1GT <400> 5 gtttttaccc 10 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1ST SPACER R1GC <400> 6 gcttttaccc 10 <210> 7 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd SPACER R2TT <400> 7 ttacaaa 7 <210> 8 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd SPACER R2GA <400> 8 gaacaaa 7 <210> 9 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd SPACER R2GT <400> 9 gtacaaa 7 <210> 10 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd SPACER R2GC <400> 10 gcacaaa 7 <210> 11 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd SPACER R2GG <400> 11 ggacaaa 7 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 12 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg ac 42 <210> 13 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1/1st SPACER-TT <400> 13 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc 300 300 <210> 14 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1/1st SPACER-GA <400> 14 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gattttaccc 300 300 <210> 15 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1/1st SPACER-GT <400> 15 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gtttttaccc 300 300 <210> 16 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1/1st SPACER-GC <400> 16 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gcttttaccc 300 300 <210> 17 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1/1st SPACER-TT/linker <400> 17 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg ac 342 <210> 18 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GA/R2TT <400> 18 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gattttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggat tacaaa 356 <210> 19 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GA/R2GA <400> 19 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gattttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggag aacaaa 356 <210> 20 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GA/R2GT <400> 20 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gattttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggag tacaaa 356 <210> 21 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GA/R2GC <400> 21 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gattttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggag cacaaa 356 <210> 22 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GA/R2GG <400> 22 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gattttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggag gacaaa 356 <210> 23 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GT/R2TT <400> 23 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gtttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggat tacaaa 356 <210> 24 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GT/R2GA <400> 24 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gtttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggag aacaaa 356 <210> 25 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GT/R2GT <400> 25 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gtttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggag tacaaa 356 <210> 26 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GT/R2GC <400> 26 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gtttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggag cacaaa 356 <210> 27 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GT/R2GG <400> 27 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gtttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggag gacaaa 356 <210> 28 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GC/R2TT <400> 28 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gcttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggat tacaaa 356 <210> 29 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GC/R2GA <400> 29 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gcttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggag aacaaa 356 <210> 30 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GC/R2GT <400> 30 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gcttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggag tacaaa 356 <210> 31 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GC/R2GC <400> 31 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gcttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggag cacaaa 356 <210> 32 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1GC/R2GG <400> 32 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga gcttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggag gacaaa 356 <210> 33 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of an enzyme protein originated from Clostridium scindens <400> 33 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Ala Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Arg Tyr Val Glu Lys Ala Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Val Gly Ala Ala Pro Leu Pro Asp Tyr Ser Ala Gln Glu Val 35 40 45 Lys Glu Leu Lys Lys Cys Ala Asp Asp Asn Gly Ile Gln Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Tyr Gly Pro Ala Phe Asn His Asn Met Gly Ser Ser Asp Pro Lys 65 70 75 80 Ile Arg Glu Glu Ala Leu Gln Trp Tyr Lys Arg Leu Phe Glu Val Met 85 90 95 Ala Gly Leu Asp Ile His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Val Asp Phe Ala Thr Ala Asn Lys Glu Glu Asp Trp Lys His Ser 115 120 125 Val Glu Gly Met Gln Ile Leu Ala Pro Ile Ala Ser Gln Tyr Gly Ile 130 135 140 Asn Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Ser His Ile Leu Asn 145 150 155 160 Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Phe Val Thr Glu Val Gly Met Asp Asn 165 170 175 Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Ser Ser 180 185 190 Ile Gly Asp Ala Ile Arg His Ala Gly Lys Leu Leu Gly His Phe His 195 200 205 Thr Gly Glu Cys Asn Arg Met Val Pro Gly Lys Gly Arg Thr Pro Trp 210 215 220 Arg Glu Ile Gly Asp Ala Leu Arg Glu Ile Glu Tyr Asp Gly Thr Val 225 230 235 240 Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Gln Val Gly Ser Asp Ile 245 250 255 Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Lys Gly Ala Gly Glu Asp Arg Leu Asp 260 265 270 Glu Asp Ala Arg Arg Ala Val Glu Phe Gln Arg Tyr Met Leu Glu Trp 275 280 285 Lys <210> 34 <211> 295 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of psicose 3-epimerase from Treponema primitia <400> 34 Met Gln Tyr Gly Ile Tyr Phe Ala Tyr Trp Thr Lys Glu Trp Gln Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Lys Tyr Ile Asp Lys Val Ser Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Ile Ser Cys Ala Ala Leu Lys Asp Gln Tyr Val Ser Asp Ser 35 40 45 Gln Leu Phe Asp Leu Arg Asp Tyr Ala Lys Glu Lys Gly Val Thr Leu 50 55 60 Thr Ala Gly Tyr Gly Pro Ala Lys Gly Glu Asn Leu Ser Ser Ser Asp 65 70 75 80 Asn Arg Val Val Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Lys Asp Val Leu Gly 85 90 95 Lys Leu Asn Lys Leu Asp Ile Arg Leu Leu Gly Gly Gly Leu Tyr Ser 100 105 110 Tyr Trp Pro Val Asp Tyr Ser Leu Pro Ile Asp Lys Ala Gly Asp Trp 115 120 125 Lys Arg Ser Val Glu Asn Ile Arg Glu Ile Ala Ala Ile Ala Ala Asp 130 135 140 Arg Asn Val Val Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Leu Leu Asn Thr Cys Glu Glu Gly Ile Lys Phe Val Asp Glu Val Asn 165 170 175 His Pro Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu 180 185 190 Glu Asp Asn Met Ala Glu Ala Ile Arg Met Ala Gly Asp Lys Leu Gly 195 200 205 His Phe His Ile Gly Glu Gln Asn Arg Lys Val Pro Gly Lys Gly Cys 210 215 220 Ile Pro Trp Asn Ala Ile Gly His Ala Leu Arg Asp Ile Arg Tyr Asn 225 230 235 240 Gly Thr Val Val Met Glu Pro Phe Val Met Pro Gly Gly Thr Ile Gly 245 250 255 Gln Asp Ile Lys Val Trp Arg Asn Leu Leu Pro Glu Thr Ser Glu Thr 260 265 270 Ile Leu Asp Arg Asp Ala Lys Gly Ala Leu Glu Phe Val Lys His Val 275 280 285 Phe Gly Ser Thr Ser Val Leu 290 295 <210> 35 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of D-psicose 3-epimerase originated from Ensifer adhaerens <400> 35 Met Gln Gly Phe Gly Val His Thr Ser Met Trp Thr Met Asn Trp Asp 1 5 10 15 Arg Pro Gly Ala Glu Arg Ala Val Ala Ala Ala Val Lys Tyr Ala Val 20 25 30 Asp Phe Ile Glu Ile Pro Met Leu Asn Pro Pro Ala Val Asp Thr Ala 35 40 45 His Thr Arg Ala Leu Leu Glu Lys Asn Lys Leu Arg Ala Val Cys Ser 50 55 60 Leu Gly Leu Pro Glu Arg Ala Trp Ala Ser Val Arg Pro Asp Ala Ala 65 70 75 80 Ile Glu His Leu Lys Val Ala Ile Asp Lys Thr Ala Asp Leu Gly Gly 85 90 95 Glu Ala Leu Ser Gly Val Ile Tyr Gly Gly Ile Gly Glu Arg Thr Gly 100 105 110 Val Pro Pro Thr Glu Ala Glu Tyr Asp Asn Ile Ala Arg Val Leu Gln 115 120 125 Ala Ala Ala Lys His Ala Lys Thr Arg Gly Ile Glu Leu Gly Val Glu 130 135 140 Ala Val Asn Arg Tyr Glu Asn His Leu Ile Asn Thr Gly Trp Gln Ala 145 150 155 160 Val Asp Met Ile Lys Arg Val Gly Ala Asp Asn Val Phe Val His Leu 165 170 175 Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Lys Gly Ile Gly Thr Gly Ile 180 185 190 Leu Asp Ala Arg Asp Phe Ile Lys Tyr Ile His Leu Ser Glu Ser Asp 195 200 205 Arg Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Asn Cys Ala Trp Asp Glu Ile Phe Ala 210 215 220 Thr Leu Ala Ala Ile Gly Phe Lys Gly Gly Leu Ala Met Glu Ser Phe 225 230 235 240 Ile Asn Met Pro Pro Glu Val Ala Tyr Gly Leu Ala Val Trp Arg Pro 245 250 255 Val Ala Arg Asp Glu Glu Glu Val Met Gly Asn Gly Leu Pro Phe Leu 260 265 270 Arg Asn Lys Ala Arg Gln Tyr Gly Leu Ile 275 280 <210> 36 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of D-psicose 3-epimerase originated from Ruminococcus torques <400> 36 Met Lys Met Lys Phe Gly Thr Leu Tyr Ser Tyr Trp Gly Thr Lys Trp 1 5 10 15 Gln Cys Asp Tyr Leu Lys Thr Leu Lys Arg Val Ser Asp Ile Gly Phe 20 25 30 Asp Ile Leu Glu Met Gly Ala Pro His Leu Leu Glu Met Ser Asp Tyr 35 40 45 Glu Leu Ser Glu Leu Arg Arg Ala Ala Lys Asp Met Asp Met Val Leu 50 55 60 Thr Ala Asn Ile Gly Pro Ala Lys Asp Lys Asp Leu Ala Ser Pro Asp 65 70 75 80 Pro Asp Ile Arg Lys Ala Gly Val Asn Tyr Leu Ile Asp Ile Leu Lys 85 90 95 Ala Met Glu Lys Val Gly Ser Lys Ser Leu Val Gly Ala Met Tyr Ser 100 105 110 Tyr Trp Pro Cys Gln Phe Glu Ile Thr Asp Lys Glu Ala Ala Trp Glu 115 120 125 Arg Ser Ile Glu Gly Met Lys Glu Val Ala Glu Ala Ala Glu Ser Leu 130 135 140 Gly Ile Glu Cys Cys Gln Glu Val Leu Asn Arg Tyr Glu Thr Tyr Ile 145 150 155 160 Ile Thr Asp Cys Arg Glu Gly Leu Glu Tyr Cys Arg Arg Val Gly Ser 165 170 175 Glu Asn Val Asn Leu Leu Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu 180 185 190 Asp Asn Ile Pro Glu Ala Ile Arg Leu Ala Gly Arg Lys Leu Gly His 195 200 205 Leu His Val Gly Glu Ser Asn Arg Lys Leu Pro Gly Met Gly Ser Leu 210 215 220 Pro Trp Arg Asp Ile Gly Arg Ala Leu Arg Asp Ile Gly Tyr Glu Lys 225 230 235 240 Gly Val Val Met Glu Pro Phe Leu Leu Gln Gly Gly Glu Val Ala Arg 245 250 255 Asp Cys Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Asn Ala Asp Glu Lys Met 260 265 270 Leu Asp Arg Tyr Ile Lys Glu Ser Leu Thr Phe Leu Lys His Glu Phe 275 280 285 Thr Phe 290 <210> 37 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified nucleic acid sequence (1) of the enzyme protein of SEQ ID NO: 33 <400> 37 atgaaacacg gtatctacta cgcgtactgg gaacaggaat gggcggcgga ctacaaacgt 60 tacgttgaaa aagcggcgaa actgggtttc gacatcctgg aagttggtgc ggcgccgctg 120 ccggactact ctgcgcagga agttaaagaa ctgaaaaaat gcgcggacga caacggtatc 180 cagctgaccg cgggttacgg tccggcgttc aaccacaaca tgggttcttc tgacccgaaa 240 atccgtgaag aagcgctgca gtggtacaaa cgtctgttcg aagttatggc gggtctggac 300 atccacctga tcggtggtgc gctgtactct tactggccgg ttgacttcgc gaccgcgaac 360 aaagaagaag actggaaaca ctctgttgaa ggtatgcaga tcctggcgcc gatcgcgtct 420 cagtacggta tcaacctggg tatggaagtt ctgaaccgtt tcgaatctca catcctgaac 480 acctctgaag aaggtgttaa attcgttacc gaagttggta tggacaacgt taaagttatg 540 ctggacacct tccacatgaa catcgaagaa tcttctatcg gtgacgcgat ccgtcacgcg 600 ggtaaactgc tgggtcactt ccacaccggt gaatgcaacc gtatggttcc gggtaaaggt 660 cgtaccccgt ggcgtgaaat cggtgacgcg ctgcgtgaaa tcgaatacga cggtaccgtt 720 gttatggaac cgttcgttcg tatgggtggt caggttggtt ctgacatcaa agtttggcgt 780 gacatctcta aaggtgcggg tgaagaccgt ctggacgaag acgcgcgtcg tgcggttgaa 840 ttccagcgtt acatgctgga atggaaataa 870 <210> 38 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified nucleic acid sequence (2) of the enzyme protein of SEQ ID NO: 33 <400> 38 atgaagcacg gcatctacta cgcatactgg gagcaggagt gggcagcaga ctacaagcgc 60 tacgttgaga aggcagcaaa gctgggcttc gacatcctgg aggttggcgc agcaccactg 120 ccagactact ccgcacagga ggttaaggag ctgaagaagt gcgcagacga caacggcatc 180 cagctgaccg caggctacgg cccagcattc aaccacaaca tgggctcctc cgacccaaag 240 atccgcgagg aggcactgca gtggtacaag cgcctgttcg aggttatggc aggcctggac 300 atccacctga tcggcggcgc actgtactcc tactggccag ttgacttcgc aaccgcaaac 360 aaggaggagg actggaagca ctccgttgag ggcatgcaga tcctggcacc aatcgcatcc 420 cagtacggca tcaacctggg catggaggtt ctgaaccgct tcgagtccca catcctgaac 480 acctccgagg agggcgttaa gttcgttacc gaggttggca tggacaacgt taaggttatg 540 ctggacacct tccacatgaa catcgaggag tcctccatcg gcgacgcaat ccgccacgca 600 ggcaagctgc tgggccactt ccacaccggc gagtgcaacc gcatggttcc aggcaagggc 660 cgcaccccat ggcgcgagat cggcgacgca ctgcgcgaga tcgagtacga cggcaccgtt 720 gttatggagc cattcgttcg catgggcggc caggttggct ccgacatcaa ggtttggcgc 780 gacatctcca agggcgcagg cgaggaccgc ctggacgagg acgcacgccg cgcagttgag 840 ttccagcgct acatgctgga gtggaagtaa 870 <210> 39 <211> 888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified nucleic acid sequence (1) of the enzyme protein of SEQ ID NO: 34 <400> 39 atgcagtacg gtatctactt cgcgtactgg accaaagaat ggcaggcgga ctacaaaaaa 60 tacatcgaca aagtttctaa actgggtttc gacatcctgg aaatctcttg cgcggcgctg 120 aaagaccagt acgtttctga ctctcagctg ttcgacctgc gtgactacgc gaaagaaaaa 180 ggtgttaccc tgaccgcggg ttacggtccg gcgaaaggtg aaaacctgtc ttcttctgac 240 aaccgtgttg ttaaaaacgc gaaagcgttc tacaaagacg ttctgggtaa actgaacaaa 300 ctggacatcc gtctgctggg tggtggtctg tactcttact ggccggttga ctactctctg 360 ccgatcgaca aagcgggtga ctggaaacgt tctgttgaaa acatccgtga aatcgcggcg 420 atcgcggcgg accgtaacgt tgttctgggt atggaagttc tgaaccgttt cgaaggttac 480 ctgctgaaca cctgcgaaga aggtatcaaa ttcgttgacg aagttaacca cccgaacgtt 540 aaagttatgc tggacacctt ccacatgaac atcgaagaag acaacatggc ggaagcgatc 600 cgtatggcgg gtgacaaact gggtcacttc cacatcggtg aacagaaccg taaagttccg 660 ggtaaaggtt gcatcccgtg gaacgaaatc ggtcacgcgc tgcgtgacat ccgttacaac 720 ggtaccgttg ttatggaacc gttcgttatg ccgggtggta ccatcggtca ggacatcaaa 780 gtttggcgtg acctgctgcc ggaaacctct gaaaccatcc tggaccgtga cgcgaaaggt 840 gcgctggaat tcgttaaaca cgttttcggt tctacctctg ttctgtaa 888 <210> 40 <211> 888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified nucleic acid sequence (2) of the enzyme protein of SEQ ID NO: 34 <400> 40 atgcagtacg gcatctactt cgcatactgg accaaggagt ggcaggcaga ctacaagaag 60 tacatcgaca aggtttccaa gctgggcttc gacatcctgg agatctcctg cgcagcactg 120 aaggaccagt acgtttccga ctcccagctg ttcgacctgc gcgactacgc aaaggagaag 180 ggcgttaccc tgaccgcagg ctacggccca gcaaagggcg agaacctgtc ctcctccgac 240 aaccgcgttg ttaagaacgc aaaggcattc tacaaggacg ttctgggcaa gctgaacaag 300 ctggacatcc gcctgctggg cggcggcctg tactcctact ggccagttga ctactccctg 360 ccaatcgaca aggcaggcga ctggaagcgc tccgttgaga acatccgcga gatcgcagca 420 atcgcagcag accgcaacgt tgttctgggc atggaggttc tgaaccgctt cgagggctac 480 ctgctgaaca cctgcgagga gggcatcaag ttcgttgacg aggttaacca cccaaacgtt 540 aaggttatgc tggacacctt ccacatgaac atcgaggagg acaacatggc agaggcaatc 600 cgcatggcag gcgacaagct gggccacttc cacatcggcg agcagaaccg caaggttcca 660 ggcaagggct gcatcccatg gaacgagatc ggccacgcac tgcgcgacat ccgctacaac 720 ggcaccgttg ttatggagcc attcgttatg ccaggcggca ccatcggcca ggacatcaag 780 gtttggcgcg acctgctgcc agagacctcc gagaccatcc tggaccgcga cgcaaagggc 840 gcactggagt tcgttaagca cgttttcggc tccacctccg ttctgtaa 888 <210> 41 <211> 855 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified nucleic acid sequence (1) of the enzyme protein of SEQ ID NO: 35 <400> 41 atgcagggtt tcggtgttca cacctctatg tggaccatga actgggaccg tccgggtgcg 60 gaacgtgcgg ttgcggcggc ggttaaatac gcggttgact tcatcgaaat cccgatgctg 120 aacccgccgg cggttgacac cgcgcacacc cgtgcgctgc tggaaaaaaa caaactgcgt 180 gcggtttgct ctctgggtct gccggaacgt gcgtgggcgt ctgttcgtcc ggacgcggcg 240 atcgaacacc tgaaagttgc gatcgacaaa accgcggacc tgggtggtga agcgctgtct 300 ggtgttatct acggtggtat cggtgaacgt accggtgttc cgccgaccga agcggaatac 360 gacaacatcg cgcgtgttct gcaggcggcg gcgaaacacg cgaaaacccg tggtatcgaa 420 ctgggtgttg aagcggttaa ccgttacgaa aaccacctga tcaacaccgg ttggcaggcg 480 gttgacatga tcaaacgtgt tggtgcggac aacgttttcg ttcacctgga cacctaccac 540 atgaacatcg aagaaaaagg tatcggtacc ggtatcctgg acgcgcgtga cttcatcaaa 600 tacatccacc tgtctgaatc tgaccgtggt accccgggtt acggtaactg cgcgtgggac 660 gaaatcttcg cgaccctggc ggcgatcggt ttcaaaggtg gtctggcgat ggaatctttc 720 atcaacatgc cgccggaagt tgcgtacggt ctggcggttt ggcgtccggt tgcgcgtgac 780 gaagaagaag ttatgggtaa ctctctgccg ttcctgcgta acaaagcgcg tcagtacggt 840 ctgatcctgg aataa 855 <210> 42 <211> 855 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified nucleic acid sequence (2) of the enzyme protein of SEQ ID NO: 35 <400> 42 atgcagggct tcggcgttca cacctccatg tggaccatga actgggaccg cccaggcgca 60 gagcgcgcag ttgcagcagc agttaagtac gcagttgact tcatcgagat cccaatgctg 120 aacccaccag cagttgacac cgcacacacc cgcgcactgc tggagaagaa caagctgcgc 180 gcagtttgct ccctgggcct gccagagcgc gcatgggcat ccgttcgccc agacgcagca 240 atcgagcacc tgaaggttgc aatcgacaag accgcagacc tgggcggcga ggcactgtcc 300 ggcgttatct acggcggcat cggcgagcgc accggcgttc caccaaccga ggcagagtac 360 gacaacatcg cacgcgttct gcaggcagca gcaaagcacg caaagacccg cggcatcgag 420 ctgggcgttg aggcagttaa ccgctacgag aaccacctga tcaacaccgg ctggcaggca 480 gttgacatga tcaagcgcgt tggcgcagac aacgttttcg ttcacctgga cacctaccac 540 atgaacatcg aggagaaggg catcggcacc ggcatcctgg acgcacgcga cttcatcaag 600 tacatccacc tgtccgagtc cgaccgcggc accccaggct acggcaactg cgcatgggac 660 gagatcttcg caaccctggc agcaatcggc ttcaagggcg gcctggcaat ggagtccttc 720 atcaacatgc caccagaggt tgcatacggc ctggcagttt ggcgcccagt tgcacgcgac 780 gaggaggagg ttatgggcaa ctccctgcca ttcctgcgca acaaggcacg ccagtacggc 840 ctgatcctgg agtaa 855 <210> 43 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified nucleic acid sequence (1) of the enzyme protein of SEQ ID NO: 36 <400> 43 atgaaaatga aattcggtac cctgtactct tactggggta ccaaatggca gtgcgactac 60 ctgaaaaccc tgaaacgtgt ttctgacatc ggtttcgaca tcctggaaat gggtgcgccg 120 cacctgctgg aaatgtctga ctacgaactg tctgaactgc gtcgtgcggc gaaagacatg 180 gacatggttc tgaccgcgaa catcggtccg gcgaaagaca aagacctggc gtctccggac 240 ccggacatcc gtaaagcggg tgttaactac ctgatcgaca tcctgaaagc gatggaaaaa 300 gttggttcta aatctctggt tggtgcgatg tactcttact ggccgtgcca gttcgaaatc 360 accgacaaag aagcggcgtg ggaacgttct atcgaaggta tgaaagaagt tgcggaagcg 420 gcggaatctc tgggtatcga atgctgccag gaagttctga accgttacga aacctacatc 480 atcaccgact gccgtgaagg tctggaatac tgccgtcgtg ttggttctga aaacgttaac 540 ctgctgctgg acaccttcca catgaacatc gaagaagaca acatcccgga agcgatccgt 600 ctggcgggtc gtaaactggg tcacctgcac gttggtgaat ctaaccgtaa actgccgggt 660 atgggttctc tgccgtggcg tgacatcggt cgtgcgctgc gtgacatcgg ttacgaaaaa 720 ggtgttgtta tggaaccgtt cctgctgcag ggtggtgaag ttgcgcgtga ctgcaaagtt 780 tggcgtgacc tgtctggtaa cgcggacgaa aaaatgctgg accgttacat caaagaatct 840 ctgaccttcc tgaaacacga attcaccttc tga 873 <210> 44 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified nucleic acid sequence (2) of the enzyme protein of SEQ ID NO: 36 <400> 44 atgaagatga aatttggaac attatattct tattggggaa caaaatggca atgtgattat 60 ttgaaaacat taaaacgagt ttcagacatc ggatttgaca ttttggaaat gggtgctcct 120 cacttgttgg aaatgtcaga ttatgaactt tcagaattga ggcgcgcggc gaaagatatg 180 gatatggtat tgacggcaaa tatcggaccg gcaaaagata aagatcttgc ttctcctgat 240 ccggatatac gaaaagcggg agtaaactat ttgatcgata tattaaaagc aatggaaaaa 300 gtaggatcta aatcacttgt tggagcaatg tattcttatt ggccgtgtca atttgaaata 360 acggataagg aagctgcctg ggagagaagc atcgagggga tgaaagaggt tgcagaagct 420 gcggaatcat tgggaatcga atgctgtcag gaagttttga atcgatatga aacttatatt 480 atcacagatt gcagggaagg attggaatac tgcaggagag tcggaagtga aaacgttaat 540 ctccttcttg atacatttca tatgaatatc gaagaagata atattccgga ggctatccgg 600 cttgcaggaa gaaaattggg ccatctgcat gtgggagaat caaacagaaa gcttccggga 660 atgggatccc ttccttggag agatatcgga cgggcgctaa gagatatcgg atatgagaaa 720 ggcgtcgtta tggaaccgtt tcttcttcaa ggaggagagg tcgctcggga ctgtaaagtg 780 tggagagatt taagtgggaa tgcagatgag aaaatgctgg atcgctatat aaaagaatct 840 ttaacatttt tgaaacatga atttacgttt tga 873 <210> 45 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1_F <400> 45 ggtgcggaaa cctacgaaag gannttttac ccatggctgt atacgaac 48 <210> 46 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1_R <400> 46 gttcgtatac agccatgggt aaaanntcct ttcgtaggtt tccgcacc 48 <210> 47 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS2_F <400> 47 gactacgcat acgacgaaag gannacaaaa tgaaacacgg tatctactac 50 <210> 48 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS2_R <400> 48 gtagtagata ccgtgtttca ttttgtnntc ctttcgtcgt atgcgtagtc 50 <210> 49 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GT_F <400> 49 ggtgcggaaa cctacgaaag gagtttttac ccatggctgt atacgaac 48 <210> 50 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GT_R <400> 50 gttcgtatac agccatgggt aaaaactcct ttcgtaggtt tccgcacc 48 <210> 51 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GC_F <400> 51 ggtgcggaaa cctacgaaag gagcttttac ccatggctgt atacgaac 48 <210> 52 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GC_R <400> 52 gttcgtatac agccatgggt aaaagctcct ttcgtaggtt tccgcacc 48 <210> 53 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GG_F <400> 53 ggtgcggaaa cctacgaaag gaggttttac ccatggctgt atacgaac 48 <210> 54 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GG_R <400> 54 gttcgtatac agccatgggt aaaacctcct ttcgtaggtt tccgcacc 48 <210> 55 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GA/RBS2GA_F <400> 55 gactacgcat acgacgaaag gagaacaaaa tgaaacacgg tatctactac 50 <210> 56 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GA/RBS2GA_R <400> 56 gtagtagata ccgtgtttca ttttgttctc ctttcgtcgt atgcgtagtc 50 <210> 57 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GA/RBS2GT_F <400> 57 gactacgcat acgacgaaag gagtacaaaa tgaaacacgg tatctactac 50 <210> 58 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GA/RBS2GT_R <400> 58 gtagtagata ccgtgtttca ttttgtactc ctttcgtcgt atgcgtagtc 50 <210> 59 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GA/RBS2GC_F <400> 59 gactacgcat acgacgaaag gagcacaaaa tgaaacacgg tatctactac 50 <210> 60 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GA/RBS2GC_R <400> 60 gtagtagata ccgtgtttca ttttgtgctc ctttcgtcgt atgcgtagtc 50 <210> 61 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GA/RBS2GG_F <400> 61 gactacgcat acgacgaaag gaggacaaaa tgaaacacgg tatctactac 50 <210> 62 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBS1GA/RBS2GG_R <400> 62 gtagtagata ccgtgtttca ttttgtcctc ctttcgtcgt atgcgtagtc 50

Claims

사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및
그 상류(upstream)에 작동 가능하도록 연결되며, 코리네박테리움속 균주에서 상기 사이코스 에피머화 효소의 발현을 조절하는 조절서열을 포함하는 유전자 발현 카세트로서,
상기 조절서열은,
서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 전사 프로모터,
서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 제1 리보솜 결합 영역 (ribosome binding region, RBS) 서열, 및
서열번호 3 내지 6중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 제1 스페이서 서열을 포함하는 핵산분자인 것인,
유전자 발현 카세트.
제 1 항에 있어서, 상기 조절서열은 제1 스페이서 서열의 3'말단에 연결되며, 1개 내지 100개 염기로 구성된 링커 서열을 추가로 포함하는 것인, 유전자 발현 카세트.
제 1 항에 있어서, 상기 조절서열은 제1 스페이서의 3'-말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 제2 RBS 서열을 추가로 포함하는 것인, 유전자 발현 카세트.
제 3 항에 있어서, 상기 조절서열은 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 제2 RBS 서열; 및 서열번호 7 내지 11중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 제2 스페이서 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 RBS 서열은 제1 스페이서의 3'-말단에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 것인, 유전자 발현 카세트.
제 3 항에 있어서, 상기 조절서열은 제1 스페이서 서열의 3'말단에 연결되며, 5개 내지 100개 염기로 이루어진 링커 서열을 추가로 포함하는 것인, 유전자 발현 카세트.
제 1 항에 있어서, 상기 조절서열은 서열번호 13 내지 17의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산분자인 것인, 유전자 발현 카세트.
제 5 항에 있어서, 상기 조절서열은 서열번호 18 내지 32의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산분자인 것인, 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라쎄콜라 (melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스 (efficiens)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 클로스트리디움 신댄스(Clostridiun scidens), 트로포네마 프리미샤(Treponema primitia), 엔시퍼 아드해렌스(Ensifer adhaerens) 또는 루미노코코스 토르크 (Ruminococcus torques)에서 유래된 것인, 유전자 발현 카세트.
제9항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 33 내지 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것인, 유전자 발현 카세트.
제10항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 37의 내지 서열번호 43의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 것인, 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 조절서열은 서열번호 13 내지 서열번호 32의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드이고,
상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 33 내지 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것인, 유전자 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 발현 카세트는 복제 기점, 리더(leader), 선택 가능한 마커, 클로닝 부위 및 제한효소 인식부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 추가로 포함하는 것인, 유전자 발현 카세트.
서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 전사 프로모터, 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 제1 리보솜 결합 영역 (ribosome binding region, RBS)을 필수적으로 포함하는 서열번호 13 내지 서열번호 32의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 핵산분자로 이루어지는 군에서 선택된 폴리뉴클레오타이드로 구성된, 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화제의 발현을 조절하는 핵산분자.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터.
제 15 항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드인 것인, 벡터.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 유전자 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환된 것인 재조합 코리네박테리움속 숙주세포.
제17항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 숙주세포는 코리네박테리움 글루타미쿰 (glutamicum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라쎄콜라 (melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스 (efficiens)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 재조합 코리네박테리움속 숙주세포.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 유전자 발현 카세트 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움속 숙주세포의 균체, 상기 세포의 배양물, 및 상기 세포의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 사이코스 생산용 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 유전자 발현 카세트를 포함하는 코리네박테리움속 숙주세포 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 코리네박테리움속 숙주세포를 배양하는 배양단계, 및
상기 세포의 배양물에서 얻어진 사이코스 에피머화 효소, 상기 세포의 균체, 상기 세포의 배양물, 상기 세포의 파쇄물, 및 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 과당-함유 원료와 반응하여 사이코스를 생산하는 반응단계를 포함하는 사이코스를 생산하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소 또는 상기 세포의 균체가 고정화된 담체에, 과당-함유 원료를 접촉시켜 사이코스를 생산하는 것인, 방법.
제20항에 있어서, 상기 방법은 구리, 망간, 칼슘, 마그네슘, 아연, 니켈, 코발트, 철 및 알루미늄으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 과당-함유 원료는 과당을 40 내지 75%(w/w)의 농도로 포함하는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 방법의 반응단계는 pH 6 내지 9 및 40 내지 80℃의 조건 하에서 수행되는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.