CN117417873A - 一种生产依克多因的工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生产依克多因的工程菌及其制备方法和应用，所述工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，解除天冬氨酸激酶LysC的反馈抑制，降低编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE的活性，表达依克多因合成基因簇ectABC。在此基础上增强了二氨基丁酸乙酰转移酶EctA、丙酮酸羧化酶Pyc或天冬氨酸激酶LysC中任意一种或至少两种的组合的活性，和/或降低了苹果酸醌氧化还原酶Mqo或高丝氨酸脱氢酶Hom中任意一种或两种组合的活性以进一步提高依克多因的产量。

Description

一种生产依克多因的工程菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产依克多因的工程菌及其制备方法和应用。
背景技术
依克多因(Ectoine)，化学名为2-甲基-1,4,5,6,-四氢嘧啶-4-羧酸，又名四氢甲基嘧啶羧酸。研究发现，依克多因是细胞内产生的一种渗透压补偿性溶质，可以维持细胞渗透压平衡，在许多嗜盐微生物中普遍存在，其能够在高温、高渗、冷冻和干燥等逆环境下，作为稳定剂对酶、DNA、细胞膜和整个细胞提供保护作用。因此，依克多因在生物制剂、酶制剂和制药等领域具有很大的应用价值和广泛的应用前景。此外，由于其具有显著的抗炎、防晒、保湿的功效，是目前市场上多款高档化妆品的主要活性成分之一。2020年，依克多因预计年需求量大于20吨，全球市场价值为1900万美元，并将以6.4％的复合年增长率增长。
目前，依克多因主要是通过嗜盐微生物采用一种被称为“细菌挤奶法”的高密度发酵来生产，即通过反复高盐诱导合成、低盐促进释放的方式以获得较高浓度的依克多因。但该生产方式发酵周期较长同时过程操作繁琐复杂，此外，高盐发酵不仅影响发酵容器的寿命，对后续发酵废液处理也是很大的挑战。
随着基因工程技术的发展，研究人员尝试用大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌等常规发酵宿主，通过基因工程改造使其产依克多因。目前，已经有工艺成功实现了利用重组大肠杆菌为底盘细胞在低盐环境下进行依克多因的生产，并取得了较高的产量。然而由于大肠杆菌自身会产生内毒素，而其主要应用市场是生物制药和医美行业，这也严重阻滞了其工业化开发的脚步。与大肠杆菌相比，谷氨酸棒杆菌是一种公认的可用于微生物安全生产的菌株，具有耐噬菌体侵染、发酵稳定、不产内毒素等优点。因此，开发一种高产依克多因的谷氨酸棒杆菌重组微生物对于依克多因的工业化生产和进一步的市场化推广具有重大实践意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种生产依克多因的工程菌及其制备方法和应用。本发明所述生产依克多因的工程菌发酵稳定、产量高，在依克多因的工业化生产中具有重要的应用价值。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种生产依克多因的工程菌，所述工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
(1)以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，解除天冬氨酸激酶LysC的反馈抑制；
(2)降低编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE的活性；
(3)表达依克多因合成基因簇ectABC；
(4)增强二氨基丁酸乙酰转移酶EctA、丙酮酸羧化酶Pyc或天冬氨酸激酶LysC中任意一种或至少两种的组合的活性，和/或降低了苹果酸醌氧化还原酶Mqo或高丝氨酸脱氢酶Hom中任意一种或两种组合的活性以进一步提高依克多因的产量。
优选地，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。
优选地，所述解除天冬氨酸激酶LysC的反馈抑制是通过如下(1)、(2)中的任意一种方式实现：
(1)引入LysC-S301Y位点突变；
(2)引入LysC-T311I位点突变。
优选地，所述降低编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE的活性是通过如下(1)、(2)、(3)中的任意一种方式实现：
(1)对目标酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得目标酶失活或活性降低；
(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件；
(3)通过CRISPRi基因抑制或反义RNA等技术手段使得目标酶失活或活性降低。
优选地，所述表达依克多因合成基因簇ectABC来源于施氏假单胞菌。
优选地，所述依克多因合成基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID No.45所示。
优选地，以质粒或者染色体整合的方式表达依克多因合成基因簇ectABC。
优选地，所述增强二氨基丁酸乙酰转移酶EctA、丙酮酸羧化酶Pyc或天冬氨酸激酶LysC中任意一种或至少两种组合的活性是通过如下(1)、(2)中的任意一种或多种方式实现：
(1)增加目标酶的编码基因的拷贝数；
(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更高的调控元件。
优选地，增加目标酶的编码基因的拷贝数通过导入携带所述编码基因的质粒和/或在基因组上整合所述编码基因实现。
优选地，所述转录或翻译调控元件选自启动子、核糖体结合位点或增强子中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述降低苹果酸醌氧化还原酶Mqo或高丝氨酸脱氢酶Hom中任意一种或两种组合的活性是通过如下(1)、(2)、(3)中的任意一种或多种方式实现：
(1)对目标酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得目标酶失活或活性降低；
(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件；
(3)通过CRISPRi基因抑制或反义RNA等技术手段使得目标酶失活或活性降低。
优选地，编码所述二氨基丁酸乙酰转移酶EctA的核苷酸序列如SEQ ID No.46所示。
优选地，编码所述天冬氨酸激酶LysC的核苷酸序列如SEQ ID No.47所示。
优选地，编码所述苹果酸醌氧化还原酶Mqo的核苷酸序列如SEQ ID No.48所示。
优选地，编码所述高丝氨酸脱氢酶Hom的核苷酸序列如SEQ ID No.49所示。
优选地，编码所述丙酮酸羧化酶Pyc的核苷酸序列如SEQ ID No.50所示。
具体的，本发明中通过引入LysC-S301Y位点突变或引入LysC-T311I位点突变的方式以解除天冬氨酸激酶LysC的反馈抑制。
再通过SacB反筛的方式敲除编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE，从而实现降低赖氨酸外排渗透酶LysE活性的目的。
对于导入携带目标酶的编码基因的质粒的方式，这些目标酶可存在于同一质粒上，或者分别存在于不同的质粒上。对于质粒，本发明没有特别的限制，只要能够在出发菌株中克隆、表达目标酶的质粒均可使用。对于质粒的拷贝数，本发明没有特别的限制，可为高拷贝质粒、中拷贝质粒或低拷贝质粒。为获得高产依克多因的生产菌株，优选的质粒为拷贝数为10～100的质粒。
具体的，本发明中，以质粒pXMJ19为表达载体表达依克多因合成基因簇ectABC，所述依克多因合成基因簇ectABC来源于施氏假单胞菌；
以质粒pJC1为表达载体进一步增强二氨基丁酸乙酰转移酶EctA和或天冬氨酸激酶LysC的活性；
通过引入pycP458S位点突变以及将起始密码子由gtg突变为atg的方式，实现提高丙酮酸羧化酶Pyc活性的目的；同时也可以利用pJC1质粒载体进一步增强突变后丙酮酸羧化酶PycP458S的活性；
通过引入homV59A位点突变的方式，实现降低高丝氨酸脱氢酶Hom活性的目的；
通过引入mqoW224taa位点突变的方式，实现降低苹果酸醌氧化还原酶Mqo活性的目的。
在一个实施方案中，所述生产依克多因的工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，引入LysC-S301Y位点突变，敲除编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE，将源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的依克多因合成基因簇ectABC引入LysC-S301Y位点突变和lysE基因敲除的突变菌株中，得到生产依克多因的工程菌。
在一个实施方案中，所述生产依克多因的工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，引入LysC-T311I位点突变，敲除编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE，将源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的依克多因合成基因簇ectABC引入LysC-S301Y位点突变和lysE基因敲除的突变菌株中，得到生产依克多因的工程菌。
在一个实施方案中，所述生产依克多因的工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，引入LysC-S301Y位点突变，敲除编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE，将源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的依克多因合成基因簇ectABC引入LysC-S301Y位点突变和lysE基因敲除的突变菌株中；进一步通过质粒引入301位丝氨酸突变为酪氨酸的lysC基因以实现在解除天冬氨酸激酶LysC的反馈抑制的同时又提高天冬氨酸激酶LysC活性的目的，得到生产依克多因的工程菌。
在一个实施方案中，所述生产依克多因的工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，引入LysC-S301Y位点突变，敲除编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE，将源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的依克多因合成基因簇ectABC引入LysC-S301Y位点突变和lysE基因敲除的突变菌株中；进一步通过同源重组引入pycP458S位点突变以及将起始密码子由gtg突变为atg的方式，提高丙酮酸羧化酶Pyc活性，得到生产依克多因的工程菌。
在一个实施方案中，所述生产依克多因的工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，引入LysC-S301Y位点突变，敲除编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE，将源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的依克多因合成基因簇ectABC引入LysC-S301Y位点突变和lysE基因敲除的突变菌株中；同时通过质粒引入458位脯氨酸突变为丝氨酸并同时将起始密码子由gtg突变为atg的pyc基因以进一步提高丙酮酸羧化酶Pyc活性，得到生产依克多因的工程菌。
在一个实施方案中，所述生产依克多因的工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，引入LysC-S301Y位点突变，敲除编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE，将源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的依克多因合成基因簇ectABC引入LysC-S301Y位点突变和lysE基因敲除的突变菌株中；进一步通过引入homV59A位点突变的方式，实现降低高丝氨酸脱氢酶Hom活性，得到生产依克多因的工程菌。
在一个实施方案中，所述生产依克多因的工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，引入LysC-S301Y位点突变，敲除编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE，将源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的依克多因合成基因簇ectABC引入LysC-S301Y位点突变和lysE基因敲除的突变菌株中；进一步通过引入mqoW224taa位点突变的方式，实现降低苹果酸醌氧化还原酶Mqo活性，得到生产依克多因的工程菌。
在一个实施方案中，所述生产依克多因的工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，引入LysC-S301Y位点突变，敲除编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE，将源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的依克多因合成基因簇ectABC引入LysC-S301Y位点突变和lysE基因敲除的突变菌株中；进一步通过质粒引入ectA基因，增强二氨基丁酸乙酰转移酶EctA的活性，得到生产依克多因的工程菌。
在一个实施方案中，所述生产依克多因的工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，引入LysC-S301Y位点突变，敲除编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE，将源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的依克多因合成基因簇ectABC引入LysC-S301Y位点突变和lysE基因敲除的突变菌株中；进一步通过敲除ISCg2f基因并同位点引入另一份lysCS301Y和另一份pycP458S拷贝，得到生产依克多因的工程菌。
在一个实施方案中，所述生产依克多因的工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，引入LysC-S301Y位点突变，敲除编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE，将源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的依克多因合成基因簇ectABC引入LysC-S301Y位点突变和lysE基因敲除的突变菌株中；通过敲除ISCg2f基因并同位点引入另一份lysCS301Y和另一份pycP458S拷贝；再进一步通过质粒引入ectA基因，增强二氨基丁酸乙酰转移酶EctA的活性，得到生产依克多因的工程菌。
在一个实施方案中，所述生产依克多因的工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032为出发菌株，引入LysC-S301Y位点突变，敲除编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE，将源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的依克多因合成基因簇ectABC引入LysC-S301Y位点突变和lysE基因敲除的突变菌株中；进一步通过引入homV59A位点突变、mqoW224taa位点突变，实现降低高丝氨酸脱氢酶Hom活性和苹果酸醌氧化还原酶Mqo活性；再进一步通过质粒引入ectA基因，增强二氨基丁酸乙酰转移酶EctA的活性，得到生产依克多因的工程菌。
本发明中，所述依克多因合成基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID No.45所示。编码所述二氨基丁酸乙酰转移酶EctA的核苷酸序列如SEQ ID No.46所示。编码所述天冬氨酸激酶LysC的核苷酸序列如SEQ ID No.47所示。编码所述苹果酸醌氧化还原酶Mqo的核苷酸序列如SEQ ID No.48所示。编码所述高丝氨酸脱氢酶Hom的核苷酸序列如SEQ ID No.49所示。编码所述丙酮酸羧化酶Pyc的核苷酸序列如SEQ ID No.50所示。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的生产依克多因的工程菌在发酵依克多因中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
与大肠杆菌相比，谷氨酸棒杆菌是一种公认的可用于微生物安全生产的菌株，具有耐噬菌体侵染、发酵稳定、不产内毒素等优点。本发明通过基因编辑等手段构建了依克多因的高产基础菌株，并构建了多株性能进一步提升的改良菌株，最终在2L发酵罐上经过96小时发酵，最高产量可达到112g/L，具有发酵时间短，生产强度高的特点。
附图说明
图1是实施例1中的产物HPLC图。
图2是实施例1中的产物质谱分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1基础菌株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC的构建与发酵
(1)突变株lysC-S301Y的构建
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，分别以引物对lysC-S301Y-U-F/lysC-S301Y-U-R和lysC-S301Y-R-F/lysC-S301Y-R-R进行PCR扩增得到同源臂lysC-S301Y-Up和lysC-S301Y-Down(PCR体系采用2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)，Vazyme)；质粒pK18mobsacB用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，得到线性化片段line-pK18mobsacB；将上述三个片段：lysC-S301Y-Up、lysC-S301Y-Down、line-pK18mobsacB利用重组克隆试剂盒(ClonExpress Multis One Step Cloning Kit，Vazyme，货号：C113-02)进行无缝组装，反应体系及反应条件均参考试剂盒说明书进行，无缝组装完成后转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-lysC-S301Y。将验证后的质粒电转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，先后利用卡那霉素抗性和SacB抗性反筛，得到LysC中301位丝氨酸突变为酪氨酸的突变株lysC-S301Y。
引物对lysC-S301Y-U-F/lysC-S301Y-U-R：
lysC-S301Y-U-F：gaaacagctatgacatgattacgaattcgcgatgtcaccacgttgggtcg(SEQID No.1)；
lysC-S301Y-U-R：tggtgccgtcttctacagaaTagacgttctgcagaaccat(SEQ ID No.2)；
引物对lysC-S301Y-R-F/lysC-S301Y-R-R：
lysC-S301Y-R-F：atggttctgcagaacgtctattctgtagaagacggcacca(SEQ ID No.3)；
lysC-S301Y-R-R：atgcctgcaggtcgactctagaaatcttacggcctgcggaacgt(SEQ IDNo.4)。
(2)突变株lysC-S301Y-ΔlysE的构建
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，分别以引物对lysE-U-F/lysE-U-R进行PCR扩增得到上游同源臂lysE-Up和lysC-Down(PCR体系采用2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)，Vazyme)；质粒pK18mobsacB用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，得到线性化片段line-pK18mobsacB；将上述三个片段：lysE-Up、lysE-Down、line-pK18mobsacB利用重组克隆试剂盒(ClonExpress Multis One Step Cloning Kit，Vazyme，货号：C113-02)进行无缝组装，反应体系及反应条件均参考试剂盒说明书进行，无缝组装完成后转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-ΔlysE。将验证后的质粒电转化到前述获得的突变株lysC-S301Y中，先后利用卡那霉素抗性和SacB抗性反筛，进一步得到lysE敲除的突变株lysC-S301Y-ΔlysE。
引物对lysE-U-F/lysE-U-R：
lysE-U-F：gaaacagctatgacatgattacgaattcatctgcgttgatggcgatggtt(SEQ IDNo.5)；
lysE-U-R：tattgcgcgccgacgccgccgatgatgaacaaaaagacgtca(SEQ ID No.6)；
引物对lysE-R-F/lysE-R-R：
lysE-R-F：tgacgtctttttgttcatcatcggcggcgtcggcgcgcaata(SEQ ID No.7)；
lysE-R-R：atgcctgcaggtcgactctagatgagggcatgttgaacgtgaac(SEQ ID No.8)。
(3)重组菌lysC-S301Y-ΔlysE-ectABC的构建
将源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)中的依克多因合成基因簇ectABC进行密码子优化并同时在该基因簇的5’和3’端分别预留XbaI和EcoRI酶切位点后进行人工合成(苏州金唯智生物有限公司)。将谷氨酸棒杆菌商业化高表达质粒pXMJ19用限制性内切酶XbaI/EcoRI进行双酶切，利用重组克隆试剂盒(ClonExpress Multis One Step CloningKit，Vazyme，货号：C113-02)进行无缝组装，将ectABC基因片段连接到pXMJ19上，获得的重组质粒命名为pXMJ19-ectABC。利用电穿孔仪(伯乐)将质粒pXMJ19-ectABC通过电转化转入到前述突变株lysC-S301Y-ΔlysE中(电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF，电击杯宽度为2mm)，后在含5mg/L氯霉素LBHIS平板上筛选重组菌，将该重组菌命名为lysC-S301Y-ΔlysE-ectABC。
将保存于-80℃的突变株lysC-S301Y-ΔlysE-ectABC甘油菌接入种子培养基中，30℃条件下培养24小时后，得到种子液，然后以OD600 0.3的接种量接入到含有200μL发酵培养基的96圆孔板(1.6mL，爱津生物)中，孔板用封口膜密封，放置于孔板摇床中，保持80％湿度，950rpm发酵72小时，得到发酵液，发酵液离心后取上清进行HPLC检测。
分析条件如下：超高效液相色谱仪(Agilent UHPLC 1290)，配备DAD检测器。色谱柱：Agilent SB-Aq；4.6*250mm；5μm。流动相：5％乙腈，95％磷酸二氢钠水溶液(20mmol)，磷酸调pH 2.0。柱温：30℃。UV：210nm。流速：0.6mL/min，等梯度洗脱。进样量：2μL。运行时间：8分钟。经HPLC检测依克多因产量为2.8g/L。超高效液相色谱仪的检测结果如图1所示。进一步采用质谱对产物进行检测，结果如图2所示。
其中，上述种子培养基成分如下：脑心浸粉(品牌：Oxoid，货号：CM1135)15g/L，胰蛋白胨(品牌：Oxoid，货号：LP0042)5g/L，NaCl 5g/L，酵母粉(品牌：Oxoid，货号：LP0021)2.5g/L。
发酵培养基成分如下：葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 0.45g/L，酵母粉5g/L，胰蛋白胨3g/L，K2HPO4 0.5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，NaCl 1g/L，生物素0.0004g/L，维生素B1 0.0001g/L。
实施例2基础菌株lysCT311I-ΔlysE-ectABC的构建与发酵
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，分别以引物对lysC-T311I-U-F/lysC-T311I-U-R和lysC-T311I-R-F/lysC-T311I-R-R进行PCR扩增得到同源臂lysC-T311I-Up和lysC-T311I-Down(PCR体系采用2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)，Vazyme)；质粒pK18mobsacB用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，得到线性化片段line-pK18mobsacB；将上述三个片段：lysC-T311I-Up、lysC-T311I-Down、line-pK18mobsacB利用重组克隆试剂盒(ClonExpress Multis One Step Cloning Kit，Vazyme，货号：C113-02)进行无缝组装，反应体系及反应条件均参考试剂盒说明书进行，无缝组装完成后转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-lysC-T311I。将验证后的质粒电转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，先后利用卡那霉素抗性和SacB抗性反筛，得到LysC中311位苏氨酸突变为异亮氨酸的突变株lysC-T311I。
引物对lysC-T311I-U-F/lysC-T311I-U-R：
lysC-T311I-U-F：aacagctatgacatgattacgaattcagtcccttggcgcagaa(SEQ IDNo.9)；
lysC-T311I-U-R：cgtcggaacgagggcaggtgaagAtgatgtcggtggtgccgtcttcta(SEQID No.10)；
引物对lysC-R-F/lysC-R-R：
lysC-T311I-R-F：tagaagacggcaccaccgacatcaTcttcacctgccctcgttccgacg(SEQID No.11)；
lysC-T311I-R-R：gtaaaacgacggccagtgccaagctttcgtccttgcgccaag(SEQ IDNo.12)。
将实施例1中获得的重组质粒pK18mobsacB-ΔlysE电转化到获得的突变株lysC-T311I中，先后利用卡那霉素抗性和SacB抗性反筛，进一步得到lysE敲除的突变株lysC-T311I-ΔlysE。
将实施例1中获得的过表达质粒pXMJ19-ectABC利用电穿孔仪(伯乐)将质粒pXMJ19-ectABC通过电转化转入到前述突变株lysC-T311I-ΔlysE中(电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF，电击杯宽度为2mm)，后在含5mg/L氯霉素LBHIS平板上筛选重组菌，将该重组菌命名为lysC-T311I-ΔlysE-ectABC。
将突变株lysCT311I-ΔlysE-ectABC-lysC接入种子培养基中，30℃条件下培养24小时后，得到种子液，然后以OD600 0.3的接种量接入到含有200μL发酵培养基的96圆孔板(1.6mL，爱津生物)中，孔板用封口膜密封，放置于孔板摇床中，保持80％湿度，950rpm发酵72小时，得到发酵液，发酵过程中使用的种子培养基和发酵培养基参照实施例1，经HPLC检测依克多因产量为2.6g/L。
实施例3谷氨酸棒杆菌菌株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-lysCS301Y(pJC1)的构建与发酵
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以Pcg2195-1/Pcg2195-2为引物进行PCR扩增得到启动子片段Pcg2195-lysCS301Y；以实施例1中获得的谷氨酸棒杆菌菌株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC基因组为模板，以引物lysCS301Y-1/lysCS301Y-2进行PCR扩增得到插入片段lysCS301Y；质粒pJC1用酶BamHI和SalI酶切，得到线性化片段line-pJC1；将以上三个片段：Pcg2195-lysCS301Y、lysCS301Y、line-pJC1利用上述相同重组克隆试剂盒进行无缝组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pJC1-lysCS301Y。将验证后的质粒电转化到突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC中，并在含5mg/L氯霉素和20mg/L卡那霉素的LBHIS平板上筛选重组菌，得到突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-lysCS301Y(pJC1)。
引物对Pcg2195-1/Pcg2195-2：
Pcg2195-1：gcgatcagcgacgccgcagggggatccgagtatcgaaaaatttccacgtcaag(SEQID No.13)；
Pcg2195-2：atatttctgtacgaccagggccaTgagaatagtccttcggaaatagtcg(SEQ IDNo.14)；
引物对lysCS301Y-1/lysCS301Y-2：
lysCS301Y-1：cccgactatttccgaaggactattctcAtggccctggtcgtacagaaata(SEQ IDNo.15)；
lysCS301Y-2：AGGCCTTAttgttcgtcgtcgacttagcgtccggtgcctgcataa(SEQ IDNo.16)。
将突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-lysCS301Y(pJC1)接入种子培养基中，30℃条件下培养24小时后，得到种子液，然后以OD600 0.3的接种量接入到含有200μL发酵培养基的96圆孔板(1.6mL，爱津生物)中，孔板用封口膜密封，放置于孔板摇床中，保持80％湿度，950rpm发酵72小时，得到发酵液，发酵过程中使用的种子培养基和发酵培养基参照实施例1，经HPLC检测依克多因产量为3.5g/L。
实施例4谷氨酸棒杆菌菌株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-pycP458S的构建与发酵
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，分别以引物对pyc-P458S-U-F/pyc-P458S-U-R和pyc-P458S-R-F/pyc-P458S-R-R进行PCR扩增得到同源臂pyc-P458S-Up和pyc-P458S-Down(PCR体系采用2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)，Vazyme)；质粒pK18mobsacB用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，得到线性化片段line-pK18mobsacB；将上述三个片段：pyc-P458S-Up、pyc-P458S-Down、line-pK18mobsacB利用重组克隆试剂盒(ClonExpress Multis One Step Cloning Kit，Vazyme，货号：C113-02)进行无缝组装，反应体系及反应条件均参考试剂盒说明书进行，无缝组装完成后转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-pyc-P458S。将验证后的质粒电转化到实施例1中获得的突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC中，先后利用氯霉素、卡那霉素抗性和SacB反筛，得到Pyc中458位脯氨酸突变为丝氨酸同时初始密码子由gtg突变为atg的突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-pycP458S。
引物对pyc-P458S-U-F/pyc-P458S-U-R：
pyc-P458S-U-F：gaaacagctatgacatgattacgaattcttgaaaggaataattactctaAtgtcgact(SEQ ID No.17)；
pyc-P458S-U-R：caggtggagcctgaaggaggtgcgAgtgatcggcaatgaatccggtgg(SEQ IDNo.18)；
引物对pyc-P458S-R-F/pyc-P458S-R-R：
pyc-P458S-R-F：ccaccggattcattgccgatcacTcgcacctccttcaggctccacctg(SEQ IDNo.19)；
pyc-P458S-R-R：gcatgcctgcaggtcgactctagacagcaaagtctgctggatccacac(SEQ IDNo.20)。
将突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-pycP458S接入种子培养基中，30℃条件下培养24小时后，得到种子液，然后以OD600 0.3的接种量接入到含有200μL发酵培养基的96圆孔板(1.6mL，爱津生物)中，孔板用封口膜密封，放置于孔板摇床中，保持80％湿度，950rpm发酵72小时，得到发酵液，发酵过程中使用的种子培养基和发酵培养基参照实施例1，经HPLC检测依克多因产量为3.0g/L。
实施例5谷氨酸棒杆菌菌株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-pycP458S(pJC1)的构建与发酵
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以Pcg2195-3/Pcg2195-4为引物进行PCR扩增得到启动子片段Pcg2195-pycP458S；以实施例4中突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-pycP458S的基因组为模板，以引物pyc-P458S-1/pyc-P458S-2进行PCR扩增得到插入片段pyc-P458S；质粒pJC1用酶BamHI和SalI酶切，得到线性化片段line-pJC1；将以上三个片段：Pcg2195-pycP458S、pyc-P458S、line-pJC1利用上述相同重组克隆试剂盒进行无缝组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pJC1-pycP458S。将验证后的质粒电转化到突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC中，并在含5mg/L氯霉素和20mg/L卡那霉素的LBHIS平板上筛选重组菌，得到突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-pycP458S(pJC1)。
引物对Pcg2195-3/Pcg2195-4：
Pcg2195-3：gcgatcagcgacgccgcagggggatccgagtatcgaaaaatttccacgtcaag(SEQID No.21)；
Pcg2195-4：gagaatagtccttcggaaatagtcg(SEQ ID No.22)；
引物对pyc-P458S-1/pyc-P458S-2：
pyc-P458S-1：cccgactatttccgaaggactattctcAtgtcgactcacacatcttcaac(SEQ IDNo.23)；
pyc-P458S-2：GATTTGGGAGGCCTTAttgttcgtcgtcgacttaggaaacgacgacgatcaagtc(SEQ ID No.24)。
将突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-pycP458S(pJC1)接入种子培养基中，30℃条件下培养24小时后，得到种子液，然后以OD600 0.3的接种量接入到含有200μL发酵培养基的96圆孔板(1.6mL，爱津生物)中，孔板用封口膜密封，放置于孔板摇床中，保持80％湿度，950rpm发酵72小时，得到发酵液，发酵过程中使用的种子培养基和发酵培养基参照实施例1，经HPLC检测依克多因产量为3.7g/L。
实施例6谷氨酸棒杆菌菌株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-homV59A的构建与发酵。
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以hom-up-1/hom-up-2为引物进行PCR扩增得到上游同源臂片段hom-up；以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以引物hom-down-1/hom-down-2进行PCR扩增得到下游同源臂片段hom-down；质粒pK18mobsacB用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，得到线性化片段line-pK18mobsacB；将上述三个片段：hom-up、hom-down、line-pK18mobsacB利用重组克隆试剂盒(ClonExpress Multis One StepCloning Kit，Vazyme，货号：C113-02)进行无缝组装，反应体系及反应条件均参考试剂盒说明书进行，无缝组装完成后转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-homV59A。将验证后的质粒电转化到前述获得的突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC中，先后利用卡那霉素抗性、氯霉素抗性和SacB抗性反筛，进一步得到Hom中59位缬氨酸突变为丙氨酸的突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-homV59A。
引物对hom-up-1/hom-up-2：
hom-up-1：gaaacagctatgacatgattacgaattcgttcatgtgaaaaatacact(SEQ IDNo.25)；
hom-up-2：acgtggctttgagatatcagaaGcagcaatgccacgaacctcc(SEQ ID No.26)；
引物对hom-down-1/hom-down-2：
hom-down-1：ggaggttcgtggcattgctgCttctgatatctcaaagccacgt(SEQ ID No.27)；
hom-down-2：gcttgcatgcctgcaggtcgactctagaacacatcatccgcggtaacacgg(SEQ IDNo.28)。
将突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-homV59A接入种子培养基中，30℃条件下培养24小时后，得到种子液，然后以OD600 0.3的接种量接入到含有200μL发酵培养基的96圆孔板(1.6mL，爱津生物)中，孔板用封口膜密封，放置于孔板摇床中，保持80％湿度，950rpm发酵72小时，得到发酵液，发酵过程中使用的种子培养基和发酵培养基参照实施例1，经HPLC检测依克多因产量为3.1g/L。
实施例7谷氨酸棒杆菌菌株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-mqoW224taa的构建与发酵。
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以mqo-up-1/mqo-up-2为引物进行PCR扩增得到上游同源臂片段mqo-up；以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以引物mqo-down-1/mqo-down-2进行PCR扩增得到下游同源臂片段mqo-down；质粒pK18mobsacB用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，得到线性化片段line-pK18mobsacB；将上述三个片段：mqo-up、mqo-down、line-pK18mobsacB利用重组克隆试剂盒(ClonExpress Multis One StepCloning Kit，Vazyme，货号：C113-02)进行无缝组装，反应体系及反应条件均参考试剂盒说明书进行，无缝组装完成后转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-mqoW224taa。将验证后的质粒电转化到前述获得的突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC中，先后利用卡那霉素抗性、氯霉素抗性和SacB反筛，进一步得到Mqo中224位色氨酸突变为终止密码子的突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-mqoW224taa。
引物对mqo-up-1/mqo-up-2：
mqo-up-1：gaaacagctatgacatgattacgaattccgtggaacaatgcaggaacc(SEQ IDNo.29)；
mqo-up-2：gtacgttcttgacggtcacgatTTactttgcgccatcagccttg(SEQ ID No.30)；
引物对mqo-down-1/mqo-down-2：
mqo-down-1：caaggctgatggcgcaaagtAAatcgtgaccgtcaagaacgtac(SEQ IDNo.31)；
mqo-down-2：gcttgcatgcctgcaggtcgactctagaccgttttgtgcctctggcatgta(SEQ IDNo.32)。
将突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-mqoW224taa接入种子培养基中，30℃条件下培养24小时后，得到种子液，然后以OD600 0.3的接种量接入到含有200μL发酵培养基的96圆孔板(1.6mL，爱津生物)中，孔板用封口膜密封，放置于孔板摇床中，保持80％湿度，950rpm发酵72小时，得到发酵液，发酵过程中使用的种子培养基和发酵培养基参照实施例1，经HPLC检测依克多因产量为3.0g/L。
实施例8谷氨酸棒杆菌菌株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-ectA(pJC1)的构建与发酵
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以Pcg2195-5/Pcg2195-6为引物进行PCR扩增得到启动子片段Pcg2195-ectA；以基因合成的依克多因合成基因簇ectABC为模板，以引物ectA-1/ectA-2进行PCR扩增得到插入片段ectA；质粒pJC1用酶BamHI和SalI酶切，得到线性化片段line-pJC1；将以上三个片段：Pcg2195-ectA、ectA、line-pJC1利用上述相同重组克隆试剂盒进行无缝组装，转化Trans1 T1感受态细胞，获得重组质粒pJC1-ectA。将验证后的质粒电转化到突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC中，并在含5mg/L氯霉素和20mg/L卡那霉素的LBHIS平板上筛选重组菌，得到突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-ectA(pJC1)。
引物对Pcg2195-5/Pcg2195-6：
Pcg2195-5：gcgatcagcgacgccgcagggggatccgagtatcgaaaaatttccacgtcaag(SEQID No.33)；
Pcg2195-6：GTTGCGCTTCAGGGTTGGCATgagaatagtccttcggaaatagtcg(SEQ IDNo.34)；
引物对ectA-1/ectA-2：
ectA-1：cccgactatttccgaaggactattctcATGCCAACCCTGAAGCGCAA(SEQ ID No.35)；
ectA-2：TTGGGAGGCCTTAttgttcgtcgtcgacTTATGCGTGTTCTTTCAGTTCTTCTTCCAGG(SEQ ID No.36)。
将突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-ectA(pJC1)接入种子培养基中，30℃条件下培养24小时后，得到种子液，然后以OD600 0.3的接种量接入到含有200μL发酵培养基的96圆孔板(1.6mL，爱津生物)中，孔板用封口膜密封，放置于孔板摇床中，保持80％湿度，950rpm发酵72小时，得到发酵液，发酵过程中使用的种子培养基和发酵培养基参照实施例1，经HPLC检测依克多因产量为3.8g/L。
实施例9谷氨酸棒杆菌菌株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-ΔISCg2f-lysCS301Y-pycP458S的构建与发酵
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以引物ISCg2f-U-F/ISCg2f-U-R进行PCR扩增得到上游同源臂ISCg2f-up；以实施例3中获得的质粒pJC1-lysCS301Y为模板，以引物lysCS301Y-F/lysCS301Y-R进行PCR扩增得到lysCS301Y(insert)；以实施例5中获得的质粒pJC1-pycP458S为模板，以引物pycP458S-F/pycP458S-R进行PCR扩增得到pycP458S(insert)；以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，以ISCg2f-D-F/ISCg2f-D-R为引物进行PCR扩增得到下游同源臂ISCg2f-down；质粒pK18mobsacB用酶EcoRI和XbaI酶切，得到线性化片段line-pK18mobsacB；将上述五个片段：ISCg2f-up、lysCS301Y(insert)、pycP458S(insert)、ISCg2f-down、line-pK18mobsacB在重组酶的作用下进行无缝组装，转化Trans1T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-ΔISCg2f-lysCS301Y-pycP458S。将验证后的质粒电转化到电转化到突变株lysC-S301Y-ΔlysE-ectABC中，先后利用氯霉素、卡那霉素抗性和SacB反筛，进一步得到ISCg2f敲除并同位点引入另一份lysCS301Y和另一份pycP458S拷贝的突变株lysC-S301Y-ΔlysE-ectABC-ΔISCg2f-lysCS301Y-pycP458S。
引物对ISCg2f-U-F/ISCg2f-U-R：
ISCg2f-U-F：gaaacagctatgacatgattacgaattcctagccatcttgtctcctaa(SEQ IDNo.37)；
ISCg2f-U-R：gacgtggaaatttttcgatactcggatatattggcccgagtcatgccg(SEQ IDNo.38)；
引物对lysCS301Y-F/lysCS301Y-R：
lysCS301Y-F：cggcatgactcgggccaatatatccgagtatcgaaaaatttccacgtc(SEQ IDNo.39)；
lysCS301Y-R：gacgtggaaatttttcgatactcttaggaaacgacgacgatcaagtcg(SEQ IDNo.40)；
引物对pycP458S-F/pycP458S-R：
pycP458S-F：cgacttgatcgtcgtcgtttcctaagagtatcgaaaaatttccacgtc(SEQ IDNo.41)；
pycP458S-R：atccgtcacagtcgacgcctcatgattaacttagcgtccggtgcctgcataaac(SEQID No.42)；
引物对ISCg2f-D-F/ISCg2f-D-R：
ISCg2f-D-F：tttatgcaggcaccggacgctaagttaatcatgaggcgtcgactgtgacggat(SEQID No.43)；
ISCg2f-D-R：gcatgcctgcaggtcgactctagaacacatcacaggatatggtagaag(SEQ IDNo.44)。
将突变株lysC-S301Y-ΔlysE-ectABC-ΔISCg2f-lysCS301Y-pycP458S接入种子培养基中，30℃条件下培养24小时后，得到种子液，然后以OD600 0.3的接种量接入到含有200μL发酵培养基的96圆孔板中(1.6mL，爱津生物)，孔板用封口膜密封，放置于孔板摇床中，保持80％湿度，950rpm发酵72小时，得到发酵液，发酵过程中使用的种子培养基和发酵培养基参照实施例1，经HPLC检测依克多因产量为4.4g/L。
实施例10谷氨酸棒杆菌菌株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-ΔISCg2f-lysCS301Y-pycP458S-ectA(pJC1)的构建与发酵
将实施例8中获得的重组质粒pJC1-ectA电转化到实施例9中获得的突变株lysC-S301Y-ΔlysE-ectABC-ΔISCg2f-lysCS301Y-pycP458S中，并在含5mg/L氯霉素和20mg/L卡那霉素的LBHIS平板上筛选重组菌，得到突变株lysC-S301Y-ΔlysE-ectABC-ΔISCg2f-lysCS301Y-pycP458S-ectA(pJC1)。
将突变株lysC-S301Y-ΔlysE-ectABC-ΔISCg2f-lysCS301Y-pycP458S-ectA(pJC1)接入种子培养基中，30℃条件下培养24小时后，得到种子液，然后以OD600 0.3的接种量接入到含有200μL发酵培养基的96圆孔板中(1.6mL，爱津生物)，孔板用封口膜密封，放置于孔板摇床中，保持80％湿度，950rpm发酵72小时，得到发酵液，发酵过程中使用的种子培养基和发酵培养基参照实施例1，经HPLC检测依克多因产量为5.2g/L。
实施例11谷氨酸棒杆菌菌株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-homV59A-mqoW224taa-ectA(pJC1)的构建与发酵。
将实施例7中获得的重组质粒pK18mobsacB-mqoW224taa电转进实施例6中获得的突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-homV59A中，先后利用卡那霉素抗性、氯霉素抗性和SacB抗性反筛，进一步得到突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-homV59A-mqoW224taa。
将实施例8中获得的重组质粒pJC1-ectA电转化到上述突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-homV59A-mqoW224taa中，并在含5mg/L氯霉素和20mg/L卡那霉素的LBHIS平板上筛选重组菌，得到突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-homV59A-mqoW224taa-ectA(pJC1)。
将突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-homV59A-mqoW224taa-ectA(pJC1)接入种子培养基中，30℃条件下培养24小时后，得到种子液，然后以OD600 0.3的接种量接入到含有200μL发酵培养基的96圆孔板中(1.6mL，爱津生物)，孔板用封口膜密封，放置于孔板摇床中，保持80％湿度，950rpm发酵72小时，得到发酵液，发酵过程中使用的种子培养基和发酵培养基参照实施例1，经HPLC检测依克多因产量为5.6g/L。
实施例12突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-homV59A-mqoW224taa-ectA(pJC1)在2L生物反应器中的发酵
生物反应器的菌株来自突变株lysCS301Y-ΔlysE-ectABC-homV59A-mqoW224taa-ectA(pJC1)的1mL甘油冻存管，在含有100mL培养基的1L摇瓶中接种，在恒温振荡摇床中，以28℃、160rpm培育20小时。然后接种到2L生物反应器中，初始装液量0.8L，接种量5％。温度设置为28℃，通气比1.0vvm，使用0.5M H2SO4及25％ NH4OH将pH控制在6.8，搅拌转速与溶氧联动(控制DO不低于20％)，当初始糖耗尽时，以10g/h补糖速度开始补料，直至发酵结束。在发酵期间产生泡沫时，添加50％聚硅氧消泡剂溶液控制泡沫。最终在2L发酵罐上经过96小时发酵，最高产量可达到112g/L。
综上，本发明以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过点突变解除天冬氨酸激酶LysC的反馈抑制，降低赖氨酸外排渗透酶LysE的活性，然后导入依克多因合成基因簇ectABC。在此基础上增强了二氨基丁酸乙酰转移酶EctA、丙酮酸羧化酶Pyc和天冬氨酸激酶LysC中任意一种或至少两种的组合的活性，和/或降低了苹果酸醌氧化还原酶Mqo和/或高丝氨酸脱氢酶Hom的活性以进一步提高依克多因的产量，增强后的菌株在2L发酵罐上经过96小时发酵，最高产量可达到112g/L。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种生产依克多因的工程菌，其特征在于，所述工程菌采用包括如下步骤的制备方法制备得到：
(1)以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，解除天冬氨酸激酶LysC的反馈抑制；
(2)降低编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE的活性；
(3)表达依克多因合成基因簇ectABC；
(4)增强二氨基丁酸乙酰转移酶EctA、丙酮酸羧化酶Pyc或天冬氨酸激酶LysC中任意一种或至少两种的组合的活性，和/或降低了苹果酸醌氧化还原酶Mqo或高丝氨酸脱氢酶Hom中任意一种或两种组合的活性以进一步提高依克多因的产量。
2.根据权利要求1所述的生产依克多因的工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。
3.根据权利要求1或2所述的生产依克多因的工程菌，其特征在于，所述解除天冬氨酸激酶LysC的反馈抑制是通过如下(1)、(2)中的任意一种方式实现：
(1)引入LysC-S301Y位点突变；
(2)引入LysC-T311I位点突变。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的生产依克多因的工程菌，其特征在于，所述降低编码赖氨酸外排渗透酶的基因lysE的活性是通过如下(1)、(2)、(3)中的任意一种方式实现：
(1)对目标酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得目标酶失活或活性降低；
(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件；
(3)通过CRISPRi基因抑制或反义RNA技术手段使得目标酶失活或活性降低。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的生产依克多因的工程菌，其特征在于，所述表达依克多因合成基因簇ectABC来源于施氏假单胞菌；
优选地，所述依克多因合成基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID No.45所示；
优选地，以质粒或者染色体整合的方式表达依克多因合成基因簇ectABC。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的生产依克多因的工程菌，其特征在于，所述增强二氨基丁酸乙酰转移酶EctA、丙酮酸羧化酶Pyc或天冬氨酸激酶LysC中任意一种或至少两种组合的活性是通过如下(1)、(2)中的任意一种或多种方式实现：
(1)增加目标酶的编码基因的拷贝数；
(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更高的调控元件。
7.根据权利要求6所述的生产依克多因的工程菌，其特征在于，增加目标酶的编码基因的拷贝数通过导入携带所述编码基因的质粒和/或在基因组上整合所述编码基因实现；
优选地，所述转录或翻译调控元件选自启动子、核糖体结合位点或增强子中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的生产依克多因的工程菌，其特征在于，所述降低苹果酸醌氧化还原酶Mqo或高丝氨酸脱氢酶Hom中任意一种或两种组合的活性是通过如下(1)、(2)、(3)中的任意一种或多种方式实现：
(1)对目标酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得目标酶失活或活性降低；
(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件；
(3)通过CRISPRi基因抑制或反义RNA技术手段使得目标酶失活或活性降低。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的生产依克多因的工程菌，其特征在于，编码所述二氨基丁酸乙酰转移酶EctA的核苷酸序列如SEQ ID No.46所示；
优选地，编码所述天冬氨酸激酶LysC的核苷酸序列如SEQ ID No.47所示；
优选地，编码所述苹果酸醌氧化还原酶Mqo的核苷酸序列如SEQ IDNo.48所示；
优选地，编码所述高丝氨酸脱氢酶Hom的核苷酸序列如SEQ ID No.49所示；
优选地，编码所述丙酮酸羧化酶Pyc的核苷酸序列如SEQ ID No.50所示。
10.一种如权利要求1-9中任一项所述的生产依克多因的工程菌在发酵依克多因中的应用。
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