CN107208041B - 用于生产喹啉酸的重组微生物和使用其生产喹啉酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产喹啉酸的重组微生物，更具体地涉及其序列号1的蛋白质的活性被减弱或消除的生产喹啉酸的微生物，以及通过使用所述微生物生产喹啉酸的方法。

Description

用于生产喹啉酸的重组微生物和使用其生产喹啉酸的方法

技术领域

本发明构思涉及生产喹啉酸的重组微生物，以及使用该重组微生物生产喹 啉酸的方法。

背景技术

喹啉酸(2,3-吡啶-二羧酸)作为化学品(例如医药和农业化学品、染料等) 的前体具有广泛的用途。

喹啉酸可以通过化学或生物合成方法来制备。在化学方式中，喹啉酸通常 通过喹啉的氧化来制备。在生物方式中，公开了在大肠杆菌(Escherichia coli(E. coli))菌株中生产喹啉酸的方法，其中在喹啉酸磷酸核糖转移酶(NadC)活性 被消除的大肠杆菌中，大肠杆菌菌株的两种酶的表达被增强，即L-天冬氨酸氧 化酶(NadB)和喹啉酸合成酶(NadA)的表达。

KefA是属于存在于微生物(例如大肠杆菌)中的机械敏感性离子(MS) 通道的膜蛋白，并且已知具有以非特异性方式将离子和溶质穿过细胞膜引入细 胞中的功能。大肠杆菌中的KefA与KefB和KefC一起构成了钾离子(K⁺)外 排系统，更具体地，已知KefA在渗透压冲击(osmotic down shock)下对K⁺的外 排具有重要作用(J.Bacteriol.(细菌学杂志)169,3743-3749,1987)。此外，已 经报道，当在大肠杆菌中使KefA的基因突变时，细胞与野生型细胞相比对K⁺的浓度和压力变得更敏感(J.membrane Biol.(膜生物学杂志)150,143-152)。 然而，如上所述，大多数研究主要关注KefA与细胞中钾离子的控制之间的相关 性，但还没有发现任何关于KefA与喹啉酸生产之间的相关性的研究。

在这一点上，本发明人对MS通道蛋白的活性修饰与高浓度喹啉酸的生产 之间的相关性进行了研究，从而完成了以高产率制备喹啉酸的方法。

发明内容

技术问题

根据本发明构思的一个方面，提供了用于生产喹啉酸的重组微生物，其中 序列号1的蛋白质的活性被减弱或消除。

根据本发明构思的另一个方面，提供了通过使用重组微生物来生产喹啉酸 的方法。

技术方案

根据本发明构思的一个方面，提供了用于生产喹啉酸的重组微生物，其中 KefA的活性被减弱或消除。

本文中所用的术语“KefA”是指属于机械敏感性离子通道的膜蛋白，也称 为“MscK”。KefA依赖于钾，并且可以具有以非特异性方式将离子和溶质穿过 细胞膜引入细胞的活性。具体地，KefA是钾外排蛋白(potassium efflux protein) 的一个实例，并且例如可以在细菌受到渗透压冲击时控制钾的外排。

KefA可以衍生自埃希氏菌属的微生物。具体地，KefA可以具有序列号1 的氨基酸序列，其非限制性实例包括具有与序列号1的氨基酸序列具有80％、 更具体地至少90％同源性的氨基酸序列并且实质上具有KefA的活性的蛋白质。 此外，只要氨基酸序列具有上述同源性并且实质上具有与序列号1的蛋白质相 同或相应的生物学活性，则本发明构思的范围显然也包括氨基酸序列部分地经 历删除、修饰、替换或添加的蛋白质。

此外，kefA基因序列可以包含编码序列号1的氨基酸序列或与序列号1的 氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列的多核苷酸序列。由于密码子的 简并性或考虑到在欲表达蛋白质的生物体中优选的密码子，编码KefA蛋白的多 核苷酸可以在编码区中进行各种修饰，只要不改变编码区中表达的蛋白质的氨 基酸序列即可。kefA基因中的多核苷酸序列可以从公开的大肠杆菌基因组序列 (GI：89107872)或从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和日本DNA数据 库(DDBJ)等数据库中获得。例如，kefA基因中的多核苷酸序列可以包含序列 号10的核苷酸序列或与序列号10的核苷酸序列具有80％同源性、更具体地具有至少90％同源性的核苷酸序列。然而，实施方式不限于此。

本文使用时，术语“同源性”是指氨基酸序列或多核苷酸序列与给定的氨 基酸序列或给定的多核苷酸序列之间一致的程度，并且同源性可以表示为百分 数。在本发明构思中，与给定氨基酸序列或给定多核苷酸序列相同或具有相似 活性的同源性序列表示为“％同源性”。例如，序列的同源性可以通过使用根据 文献中的算法BLAST[参见Karlin和Altschul的Pro.Natl.Acad.Sci.USA(美国 国家科学院院刊),90,5873(1993)]或Pearson的FASTA[参见Methods Enzymol. (酶学方法),183,63(1990)]来确定。基于算法BLAST已开发出被称为BLASTN 或BLASTX的程序[参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov]。

本文中使用时，术语“喹啉酸”是指喹啉酸(酯)或其盐。本文中使用时，术 语“盐”是指由喹啉酸的阴离子和碱的阳离子制备的化合物，其实例包括喹啉 酸钠盐、喹啉酸钾盐、喹啉酸铵盐、喹啉酸钙盐和喹啉酸镁盐。

本文中使用时，术语“重组微生物”是指经天然突变或人工突变或者经基 因改造的微生物。基因工程改造的微生物可以是例如根据基因工程方法引入外 源核酸的微生物，或其中内源基因的序列或位置改变的微生物。

“生产喹啉酸的重组微生物”是指通过使用培养基中的碳源能够生产和积 累喹啉酸的微生物。此外，与未修饰的微生物相比，重组微生物可通过减弱或 消除KefA的活性来以高生产能力生产喹啉酸。重组微生物不受限制，只要微生 物能够生产和积累喹啉酸即可，其实例包括埃希氏菌(Escherichia)属的微生物、 肠杆菌(Enterbacter)属的微生物、欧文氏菌(Erwinia)属的微生物、沙雷氏 菌(Serratia)属的微生物、普罗威登斯菌(Providencia)属微生物、棒状杆菌 (Corynebacterium)属微生物和短杆菌(Brevibacterium)属微生物。具体地， 重组微生物可以是埃希氏菌属的微生物。更具体地，重组微生物可以是埃希氏 菌属的大肠杆菌，但不限于此。

本文中使用时，酶或多肽的“活性去除”是指所提及的蛋白质在微生物中 完全不表达的情况，或所提及的蛋白质在微生物中表达但是没有任何活性的情 况。此外，本文中使用时，表述“活性减弱”是指与所提及的蛋白质的内源活 性相比，所提及的蛋白质在微生物中的活性减弱或弱化的情况。本文中使用时， 术语“内源活性”是指天然状态的蛋白质(即原本包含在微生物中的蛋白质)、 不经历任何基因修饰的蛋白质的活性。

详细地，KefA的活性减弱或活性消除可以通过1)消除或删除编码KefA 蛋白的基因，2)修饰基因表达的调控序列以减弱编码KefA蛋白的基因的表达， 或3)修饰染色体上的基因序列以弱化KefA的活性或用弱启动子替换编码KefA 蛋白的基因的内源启动子来执行，或者可以通过以上方法的一种或多种组合来 执行。然而，实施方式不限于此。

更详细地，KefA的活性减弱或活性消除可以通过消除或删除编码KefA膜 蛋白的基因来执行。本文中使用时，“基因消除或删除”的表述是指为了使基因 不表达、基因以少量表达、或基因表达但酶活性不显示或者减弱，基因的一部 分或全部、或基因的启动子或基因的终止子区域中的调控因子的一部分或全部 经历突变、替换、或删除，或基因中插入至少一个碱基。例如，基因的消除或 删除可以通过基因改造(包括同源重组)、突变诱导或分子进化来实现。当细胞 包含多个相同的基因或至少两个不同的多肽旁系同源基因时，一个或多个基因 可以被消除或删除。

在本发明构思中，在生产喹啉酸的重组微生物中，喹啉酸磷酸核糖基转移 酶(NadC)的活性可以进一步被减弱或消除。

本文中使用时，术语“喹啉酸磷酸核糖基转移酶”是指具有将喹啉酸转化 为烟酸单核苷酸的活性的酶。当具有喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性的基因被消 除时，或者当具有喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性的基因的表达被弱化时，细胞 中的喹啉酸生产可增加。

喹啉酸磷酸核糖基转移酶可以来源于埃希氏菌属的微生物，并且更具体地， 可以具有序列号29的氨基酸序列。喹啉酸磷酸核糖基转移酶的非限制性实例包 括具有与序列号29的氨基酸序列具有80％同源性、更具体地至少90％同源性的 氨基酸序列并且实质上具有喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性的蛋白质。只要氨 基酸序列具有上述同源性并且实质上具有与包含序列号29的氨基酸序列的蛋白 质相同或相应的生物学活性，则本发明构思的范围显然也包括氨基酸序列部分 地经历删除、修饰、替换或添加的蛋白质。

编码喹啉酸磷酸核糖基转移酶的nadC基因序列可以包含编码序列号29的 氨基酸序列的多核苷酸序列。nadC基因序列可以从文献中公开的大肠杆菌基因 组序列(GI：89106990)或从NCBI和DDBJ等数据库中获得。此外，nadC基 因可以包含序列号11的核苷酸序列或与序列号11的核苷酸序列具有80％同源 性、更具体地具有至少90％同源性的核苷酸序列。通过减弱或消除喹啉酸磷酸 核糖基转移酶的活性，可以增加喹啉酸在细胞中的积累。

本文中使用时，喹啉酸磷酸核糖基转移酶的“活性减弱或消除”表述显然 可以被本领域普通技术人员以与上述KefA的“活性减弱或消除”表述相同的方 式理解。

此外，在生产喹啉酸的重组微生物中，选自L-天冬氨酸氧化酶(NadB)和 喹啉酸合成酶(NadA)中的至少一种酶的活性可以进一步被增强。结果，可以 在细胞中增加α-亚氨基琥珀酸(喹啉酸的前体)的积累和由α-亚氨基琥珀酸生 物合成的喹啉酸，从而增加喹啉酸的生产。

本文中使用时，术语“天冬氨酸氧化酶”是指具有氧化L-天冬氨酸的活性 的酶，并且可以被称为“L-天冬氨酸氧化酶”。

因此，当L-天冬氨酸氧化酶的活性增强时，在细胞中增加亚氨基琥珀酸(喹 啉酸的前体)的积累，从而增加喹啉酸的生产。

天冬氨酸氧化酶可以来源于埃希氏菌属的微生物。具体地，天冬氨酸氧化 酶可以具有序列号30的氨基酸序列，并且其非限制性实例包括含有与序列号30 具有80％同源性、更具体地至少90％同源性的氨基酸序列并且实质上具有L-天 冬氨酸氧化酶的活性的蛋白质。只要氨基酸序列具有上述同源性并且实质上具 有与包含序列号30的氨基酸序列的蛋白质相同或相应的生物活性，则本发明构 思的范围显然也包括氨基酸序列部分地经历删除、修饰、替换或添加的蛋白质。

编码天冬氨酸氧化酶的nadB基因可以包含编码序列号30的氨基酸序列的 多核苷酸序列。nadB序列的序列可以从文献中公开的大肠杆菌的基因组序列(GI： 89109380)或从NCBI和DDBJ等数据库中获得。此外，nadB基因可以包含序 列号18的核苷酸序列或与序列号18的核苷酸序列具有80％同源性、更具体地 至少90％同源性的核苷酸序列。然而，实施方式不限于此。

本文中使用时，术语“喹啉合成酶”是指具有从亚氨基琥珀酸合成喹啉酸 的活性的酶。

通过喹啉酸合成酶的催化来加速从由于天冬氨酸氧化酶的活性而产生的α- 亚氨基琥珀酸合成喹啉酸，从而能够以更高的生产能力(producibility)生产喹 啉酸。因此，当编码喹啉酸合成酶的基因的表达或喹啉酸合成酶的活性增强时， 可以在细胞中增加喹啉酸的生产。

喹啉酸合成酶可以从埃希氏菌属的微生物获得。具体地，喹啉酸合成酶可 以具有序列号31的氨基酸序列，并且其非限制性实例包括具有与序列号31的 氨基酸序列具有80％同源性、更具体地具有至少90％同源性的氨基酸序列并且 实质上具有喹啉酸合成酶的活性的蛋白质。只要氨基酸序列具有上述同源性并 且实质上具有与包含序列号31的氨基酸序列的蛋白质相同或相应的生物学活性， 则本发明构思的范围显然也包括氨基酸序列部分地经历删除、修饰、替换或添 加的蛋白质。

编码喹啉酸合成酶的nadA基因可以包含编码序列号31的氨基酸序列的多 核苷酸序列。nadA序列的序列可以从文献中公开的大肠杆菌的基因组序列(GI： 89107601)或从NCBI和DDBJ等数据库中获得。此外，编码喹啉酸合成酶的 nadA基因可以包含序列号21的核苷酸序列或与序列号21的核苷酸序列的序列 具有80％同源性、更具体地至少90％同源性的核苷酸序列。然而，实施方式不 限于此。

本文中使用时，表述“活性的增加”是指与所提及的蛋白质的内源活性相 比活性“增强”。具体地，活性的增加可以通过如下来实现：增加编码所提及的 蛋白质的基因的拷贝数、修饰基因表达的调控序列以增加每个基因的表达，修 饰染色体上每个基因序列以增强每种蛋白质的活性、用强启动子替代基因的内 源启动子或其任何组合。然而，实施方式不限于此。

详细地，可以通过使用包含编码上述酶的多核苷酸的重组载体来进行转化 以增加天冬氨酸氧化酶或喹啉酸合成酶的活性。如本文所用的术语“转化”是 指将基因引入宿主细胞中以在宿主细胞中表达该基因。只要这样的转化基因可 以在宿主细胞中表达，插入宿主细胞染色体中或位于宿主细胞染色体外部的基 因均可以称为转化的基因。此外，转化的基因可以包括任何类型的基因，只要 该基因可以引入宿主细胞后在其中表达即可。例如，可以以表达盒的形式将转 化的基因引入宿主细胞，所述表达盒是多核苷酸结构并且包含自行表达所需的 所有因子。表达盒包括通常与转化的基因连接并能够起作用的启动子、转录终 止信号、核糖体结合区和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，转化基因本身或多核苷酸结构形式的转化基因可被引入宿主 细胞，以与在宿主细胞中表达所需的序列连接成能够起作用。重组载体是通过 将DNA引入宿主细胞来表达蛋白质的手段，并且其示例包括本领域已知的表达 载体，例如质粒载体、黏粒载体和噬菌体载体。使用重组DNA技术根据本领域 已知的方法制备这样的表达载体对本领域普通技术人员来说是显而易见的，但 是实施方式不限于此。

更详细地，可以通过将与基因连接成能够起作用的启动子替换成强启动子 来增加上述酶的活性。在本发明构思的一个实施方式中，当与nadA基因连接成 能够起作用的启动子被替换为更强的启动子pCJ1(参见KR 10-0620092)而不 是启动子pCysK时，证实喹啉酸的生产显着增加(参见表8)。然而，实施方式 不限于此。

根据本发明构思的另一方面，提供了一种生产喹啉酸的方法，所述方法包 括：在培养基中培养生产喹啉酸的重组微生物；和从所述培养基或所述重组微 生物回收喹啉酸。

生产喹啉酸的微生物与上文所描述的相同。

重组微生物的培养可以在本领域已知的培养条件下在合适的培养基中进行。 这样的培养过程可以根据所选择的微生物而容易地调整。培养方法可包括间歇 式培养、连续式培养、补料分批式培养或其任何组合，但实施方式不限于此。

培养基可以包括各种碳源、氮源和微量元素。

例如，碳源可以包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽 糖、淀粉和纤维素；脂质，例如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸 如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油和乙醇；有机酸，例如乙酸，或其 任何组合。例如，可以通过使用葡萄糖作为碳源进行培养。

氮源可包括有机氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、 玉米浆液(CSL)和大豆粉；无机氮源、例如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、 碳酸铵和硝酸铵；或其任何组合。

培养基可以包括例如磷酸二氢钾、磷酸二钾、与其对应的含钠盐、以及金 属盐(如硫酸镁或硫酸铁)作为磷源。此外，培养基可以包括氨基酸、维生素和适当的前体。可以以间歇模式或连续模式将培养基或其单独组分加入培养基 中，但是实施方式不限于此。

另外，在培养过程中，可以以适当的方式向培养物中加入化合物，例如氢 氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸或硫酸，来调节培养物的pH。另外，在培养过程 中可以通过使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯防止气泡的产生。为了保持培养物 的需氧条件，可以将氧气或含氧气体(例如空气)注入培养物中。培养物的温 度可以为20-45℃，例如22-42℃或25-40℃。可以继续培养直至喹啉酸的产量 达到所需水平，例如，培养可进行10小时至160小时。

关于从培养产物中回收喹啉酸，所生产的喹啉酸可以通过以间歇模式、连 续模式或补料分批模式的使用与培养方法相关的本领域已知的合适方法从培养 产物中收集或回收。

发明效果

根据本发明构思的一个方面的重组微生物，其中序列号1的蛋白质的活性 被减弱或消除，可以用于生产喹啉酸。

通过使用根据本发明构思的另一方面的一种生产喹啉酸的方法，可以有效 地生产喹啉酸。

具体实施方式

下文中，将参考实例更详细地描述本申请。然而，这些实例仅仅用于说明 性目的，并且本申请的范围不意图受这些实例限制。

实施例1.生产喹啉酸的菌株的制备

1-1.喹啉酸磷酸核糖基转移酶缺陷的菌株的制备

使用大肠杆菌K12W3110的染色体DNA作为模板，通过PCR(聚合酶链 反应)获得参与喹啉酸的降解途径的nadC基因。从美国国立卫生研究院(NIH) 的GenBank(基因银行)获得nadC基因的核苷酸序列信息(NCBI登记号“GI： 89106990”)，并根据nadC核苷酸序列号11合成了扩增nadC基因的下游区的序 列号12和13的引物、扩增nadC的上游和下游区以及loxpCm的序列号14和 15的引物，以及扩增nadC的上游区的序列号16和17的引物。

使用大肠杆菌K12W3110的染色体DNA作为模板，序列号12和13的寡 核苷酸和序列号16和17的寡核苷酸分别作为引物而进行PCR以扩增0.5kb和 0.3kb的nadC基因的上游区和下游区。此外，使用包含loxpCm的pLoxpCat2 质粒载体(GenBank编号为AJ401047)作为模板并使用序列号14和15的寡核 苷酸作为引物进行PCR以扩增1.0kb的在两端具有与nadC基因同源的序列的 loxpCm基因。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene公司，美国)作为聚合 酶，通过重复循环30次进行PCR，每个循环包括在96℃下变性30秒，在53℃ 下退火30秒，并在72℃下延伸1分钟。

随后，将从PCR反应获得的nadC-上游片段、nadC-下游片段和loxpCm片 段用作模板进行PCR，PCR条件包括重复执行10个循环并在加入序列号12和 17的引物后重复执行20个循环，每个循环包括在96℃下变性60秒，在50℃下 退火60秒，并在72℃下延伸1分钟。结果，获得含有nadC基因上游区-loxpC-nadC 基因下游区的1.8kb的nadC缺陷的盒。

通过电穿孔的方式将nadC缺陷的盒转化至含有pKD46作为lambda red重 组酶表达载体的大肠杆菌K12W3110，然后将菌株涂布在含有氯霉素作为选择 性标记物的Luria-Bertani(LB)平板培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、 10g/L NaCl和1.5％琼脂)上，并在37℃下温育过夜，从而选择显示出对氯霉素 抗性的菌株。

将所选择的菌株直接作为模板并使用序列号13和16的引物在相同条件下 进行PCR，然后通过在1.0％琼脂糖凝胶上鉴定野生菌株和nadC缺陷菌株中的 基因大小分别为1.6kb和1.3kb，来确认nadC基因的缺失。相应地，所得菌株 被命名为W3110-ΔnadC。

此外，根据上述相同的方法，也从K12MG1655菌株中删除nadC基因，相 应地，将所得菌株命名为MG1655-ΔnadC。

1-2.KefA缺陷的菌株的制备

从NIH GenBank获得序列号10的kefA基因的核苷酸序列(NCBI登记号 “GI::89107872”)。相应地，合成了扩增kefA基因的下游区的序列号2和3的 引物，扩增kefA的上游和下游区以及FRT-KM的序列号4和5的引物，以及扩 增kefA的上游区的序列号6和7的引物。

使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板，并利用序列号2和3的引 物以及序列号6和7的引物进行PCR以分别扩增0.8kb和0.6kb的kefA基因的 上游区和下游区。此外，使用包含FRT-Km的pKD4载体作为模板并使用序列 号4和5的寡核苷酸作为引物进行PCR以扩增1.4Kb的在两端具有与kefA基 因同源的序列的FRT-Km基因。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene公司) 作为聚合酶，并通过重复循环30次进行PCR，每个循环包括在96℃下变性30 秒，在53℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟。随后，将从PCR反应获得 的kefA上游片段、kefA下游片段和FRT-Km片段用作模板进行PCR，PCR条 件包括重复执行10个循环并在加入序列号6和7的引物后重复执行20个循环， 每个循环包括在96℃下变性60秒，在50℃下退火60秒，并在72℃下延伸2分 钟。结果，获得含有kefA的上游区-FRT-Km-kefA的下游区的2.6kb的kefA缺 陷的盒。

通过电穿孔的方式将kefA缺陷的盒转化至含有pKD46作为lambda red重 组酶表达载体的大肠杆菌W3110-ΔNadC，然后将菌株涂布在含有卡那霉素作为 选择性标记物的LB平板培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl 和1.5％琼脂)上，并在37℃下温育过夜，从而选择显示对卡那霉素抗性的菌株。 将所选择的菌株直接作为模板，使用序列号8和9的引物在相同条件下进行PCR， 然后通过在1.0％琼脂糖凝胶上鉴定野生菌株和kefA缺陷菌株中的基因大小分 别为4.2kb和1.5kb，来确认kefA基因的缺失。相应地，所得菌株被命名为 W3110-ΔnadCΔkefA。

此外，根据上述相同的方法通过使用kefA缺陷的盒，也从MG1655-ΔnadC 菌株中除去kefA基因，相应地，将所得菌株命名为MG1655-ΔnadCΔkefA。

1-3.在大肠杆菌中表达L-天冬氨酸氧化酶的质粒的制备

在表达载体中克隆来源于大肠杆菌的编码野生型L-天冬氨酸氧化酶的nadB 基因，使用大肠杆菌K12W3110株(ATCC(美国模式培养物保藏所)保藏号 23257)的染色体作为模板。基因序列基于从NIH GenBank获得的序列号18的 核苷酸序列(NCBI登记号“GI：89109380”)。扩增nadB基因的ORF(开放阅 读框)区，并合成具有限制酶NdeI和BamHI的识别位点的序列号19和20的 引物。

使用大肠杆菌K12W3110的染色体DNA作为模板，并使用序列号19和20 的寡核苷酸作为引物，进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene公 司，美国)作为聚合酶，通过重复循环30次进行PCR，每个循环包括在96℃下 变性30秒，在50℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟。因此，获得了包含 nadB ORF基因和限制酶NdeI和BamHI的识别位点的约1.9kb的扩增基因。

通过PCR方法获得的nadB基因通过琼脂糖凝胶洗脱回收，然后用限制酶 NdeI和BamHI处理。然后，将nadB基因连接到用限制酶NdeI和BamHI处理 的pProLar载体(CloneTech公司，美国)中，从而在与pPro启动子连接的nadB 基因中实现L-天冬氨酸氧化酶的表达。由其制备的载体命名为pPro-nadB。

1-4.表达天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的质粒的制备

(1)pPro-nadB_pCysK-nadA载体的制备

首先，使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板，通过PCR获得编码 喹啉酸合成酶的nadA基因。使用从NIH GenBank获得的序列号21的nadA基 因的核苷酸序列信息(NCBI登记号“GI：89107601”)。然后，基于序列号21 的nadA基因，扩增在nadA基因中含有ATG至TAA的ORF区，并合成具有限 制酶ApaI和NotI的识别位点的序列号22和23的引物。

使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板并使用序列号22和23的寡 核苷酸作为引物，进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene公司， 美国)作为聚合酶，并通过重复循环30次进行PCR，每个循环包括在96℃下变 性30秒，在50℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟。因此，获得了包含nadA 基因和限制酶ApaI和NotI的识别位点的约1.0kb的扩增基因。

此外，使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板，通过PCR方法获得 cysK启动子。从NIH GenBank获得位于cysK基因的上游0.3kb内的启动子的核 苷酸序列信息(序列号24)，据此合成具有限制酶BamHI和ApaI的识别位点的 序列号25和26的引物，以便将cysK启动子与扩增的nadA基因连接。

使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板，序列号25和26的寡核苷 酸作为引物，进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene公司)作为 聚合酶，通过重复循环30次进行PCR，每个循环包括在96℃下变性30秒，在 50℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟。结果，获得了包含cysK启动子和 限制酶BamHI和ApaI的约0.3kb的扩增基因。

通过PCR方法获得的nadA基因用限制酶ApaI和NotI处理，扩增的cysK 启动子片段用ApaI和BamHI处理。通过连接，将用限制酶处理的nadA和cysK 启动子片段克隆到用限制酶NotI和BamHI处理的实施例1-2的pPro-nadB载体 中，从而制备5.9kb的pPro-nadB_pCysK-nadA载体，其中克隆了nadB基因和 nadA基因，其中作为组成型启动子的pPro启动子控制nadB基因的表达，并且 cysK基因的启动子控制nadA基因的表达。

(2)pPro-nadB_pCJ1-nadA载体的制备

为了在喹啉酸的生物合成过程中进一步增强编码喹啉酸合成酶的nadA基 因的表达，使用K12W3110中的活性更强的启动子，即pCJ1启动子，而不使用 pCysK启动子。根据KR2006-0068505A，使用包含pCJ1启动子的质粒的DNA 作为模板通过PCR获得pCJ1启动子。为了将pCJ1启动子与扩增的nadA基因 连接，合成具有限制酶BamHI和ApaI的识别位点的序列号27和28的引物。

使用大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板和序列号27和28的寡核苷 酸作为引物进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene公司)作为聚 合酶，并通过重复循环30次进行PCR，每个循环包括在96℃下变性30秒，在 50℃下退火30秒，并在72℃下延伸1分钟。结果，获得了约0.3kb的扩增基因， 其含有pCJ1启动子和限制酶BamHI和ApaI。

用限制酶ApaI和NotI处理通过PCR方法获得的nadA基因，并且用ApaI 和BamHI处理扩增的pCJ1启动子片段。通过连接，将用上述限制酶处理的nadA 和pCJ1启动子片段克隆到用限制酶NotI和BamHI处理的实施例1-2的 pPro-nadB载体中，从而制备5.9kb的pPro-nadB_pCJ1-nadA重组载体，其中克 隆了nadB基因和nadA基因，其中作为组成型启动子的pPro启动子控制nadB 基因的表达，并且pCJ1基因的启动子控制nadA基因的表达。

实施例2.生产喹啉酸的菌株的生产能力的评价

2-1.基于效价确认比较生产喹啉酸的菌株的生产能力

为了评价喹啉酸的生产能力，将包含增强的nadB和nadA的质粒引入到 W3110-ΔnadC和MG1655-ΔnadC菌株中的每一个。关于引入方法，通过CaCl₂方法转化菌株，涂抹在LB-Km平板培养基(10g/L酵母提取物、5g/L NaCl、 10g/L胰蛋白胨、1.5％琼脂和50ug/L卡那霉素)上，然后在37℃下温育过夜。 随后，收集单个卡那霉素抗性菌落，分别以1白金耳接种在25mL喹啉酸效价 (titer)培养基中，然后在33℃下以250rpm温育24-72小时。下表1示出了喹 啉酸的生产培养基的组成。

[表1]

在喹啉酸烧瓶中的效价培养基的组成

通过HPLC(高效液相色谱法)分析培养液中的喹啉酸，结果示于下表2 中。也就是说，结果表明了菌株生产喹啉酸的能力。如表2中所示，根据喹啉 酸系菌株的表达程度和nadBA的表达程度，观察到喹啉酸的生产能力的差异。 具体地，当通过使用具有比pCysK启动子表达强度更强的pCJ1启动子增强nadA 基因的表达时，证实了在野生型大肠杆菌K12菌株W3110-ΔnadC和 MG1655-ΔnadC中，喹啉酸的生产显着增加。

[表2]

2-1.KefA缺陷菌株的喹啉酸生产能力的评价

为了比较kefA缺陷菌株的喹啉酸生产能力，使用pPro-nadB_pCJ1-nadA质 粒通过CaCl₂方法分别转化实施例1-4的W3110-ΔnadCΔkefA和 MG1655-ΔnadCΔkefA菌株。将每个转化的菌株涂抹在37℃的LB-Km平板培养 基(10g/L酵母提取物、5g/L NaCl、10g/L胰蛋白胨、1.5％琼脂和50ug/L卡那 霉素)上，然后温育过夜。随后，收集单个卡那霉素抗性菌落，分别以1白金 耳接种在25mL喹啉酸效价培养基(参见表1)中，然后在33℃下以250rpm温育24-72小时。

通过HPLC分析培养液中的喹啉酸，结果示于下表3中。如表3所示，与 对照菌株相比，在kefA缺陷的菌株中喹啉酸的浓度增加。具体地，证实了在野 生型菌株中删除kefA时喹啉酸的浓度增加至少15％。

[表3]

2-3.确认KefA的活性减弱的效果

(1)替换KefA起始密码子的质粒的制备

为了证实在生产喹啉酸的菌株中KefA弱化的效果，制备了具有弱化的kefA 的质粒。使用从NIH GenBank获得的序列号10的基因的核苷酸序列(NCBI登 记号“GI::89107872”)作为基因序列。通过将kefA的起始密码子从ATG修饰 到TTG，扩增kefA基因的ORF区，并且合成具有限制酶blunt和BamHI的识 别位点的序列号32和33的引物。此外，扩增kefA基因的自身启动子区，并且 合成具有限制酶SacI和blunt的识别位点的序列号34和35的引物。

使用大肠杆菌K12W3110菌株(ATCC保藏号23257)的染色体DNA作为 模板，序列号32和33的寡核苷酸作为引物，进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA 聚合酶(Stratagene公司)作为聚合酶，并通过重复循环30次进行PCR，每个 循环包括在96℃下变性30秒，在50℃下退火30秒，和在72℃下延伸30秒。 通过PCR，获得约0.15kb的扩增基因，其含有kefA的ORF区和限制酶BamHI 的识别位点。

此外，使用K12W3110的染色体DNA作为模板并使用序列号34和35的寡 核苷酸作为引物，进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene公司) 作为聚合酶，并通过重复循环30次进行PCR，每个循环包括在96℃下变性30 秒，在50℃下退火30秒，和在72℃下延伸30秒。通过PCR，获得约0.15kb 的扩增基因，其含有kefA的自身启动子区和限制酶SacII的识别位点。

通过琼脂糖凝胶洗脱回收将通过PCR获得的kefA的ORF区和pKefA启动 子，然后分别用限制酶BamHI和SacI处理。随后，连接到用限制酶BamHI和 SacI处理的pSG76C载体(J.Bacteriol.179(13),4426-4428(1997)，NCBI基因库 Y09892)。

因此，制备具有自身启动子和kefA的ORF区的载体，其中起始密码子ATG 被TTG替换，然后命名为pSG76C_kefA*(ATG->TTG)载体。

(2)具有替换的kefA起始密码子的菌株的制备和喹啉酸的生产能力的评价

通过电穿孔的方式将实施例2-3(1)的pSG76C_kefA*(ATG->TTG)载体 转化至大肠杆菌W3110-ΔNadC，然后将菌株涂抹在含有氯霉素作为选择性标记 物的LB平板培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl和1.5％ 琼脂)，并在37℃的温度下温育过夜，从而选择显示对氯霉素抗性的菌株。将所 选择的菌株直接作为模板使用序列号33和34的引物在相同条件下进行PCR， 然后从1.0％琼脂糖凝胶中获得具有0.30kb大小的PCR产物。通过进行测序， 最终选择用TTG替换kefA的起始密码子ATG的菌株。最终选择的菌株命名为 W3110-ΔnadC_kefA*(ATG->TTG)。

此外，在相同条件下用pSG76C_kefA*(ATG->TTG)载体转化 MG1655-ΔnadC，然后确认kefA的起始密码子的替换。由此获得的菌株命名为 MG1655-ΔnadC_kefA*(ATG->TTG)。

为了比较每个转化菌株的喹啉酸生产能力，从下表4的菌株中收集单个氯 霉素抗性菌落，分别以1白金耳接种在25mL喹啉酸效价培养基(参见表1)中， 然后在33℃下以250rpm温育24至72小时。通过HPLC分析培养液中的喹啉 酸，结果示于下表4中。结果，与对照组相比，具有弱化的kefA的菌株(即具 有替换的kefA起始密码子的菌株)生产的喹啉酸浓度水平增加10％。

[表4]

实施例3.kefA缺陷菌株或kefA增强菌株对喹啉酸的敏感性的评价

3-1.生产喹啉酸的菌株对喹啉酸的敏感性的评价

基于上述喹啉酸生产能力的评价结果，预测KefA的消除将弱化外部喹啉酸 再次进入细胞，从而增加喹啉酸的生产能力。基于这样的预测，对kefA缺陷菌 株和kefA增强菌株进行对喹啉酸的敏感度的评价。

首先，确认了13g/L的喹啉酸(为减弱生产菌株的生长和发育而用KOH滴 定至7.0pH)的添加与否所带来的影响。即，将生产喹啉酸的菌株的单个菌落分 别以1白金耳接种在25mL LB+1％葡萄糖液体培养基(10g/L酵母提取物、5g/L NaCl、10g/L胰蛋白胨、50ug/L的卡那霉素和10g/L的葡萄糖)，然后在33℃ 下以250rpm温育16至24小时。然后，测量菌株的OD 600、葡萄糖消耗和残 余喹啉酸。

[表5]

如表5中所示，当向培养基中额外加入喹啉酸时，证实喹啉酸被引入到细 胞中，从而使生长和发育以及葡萄糖消耗速度降低40％。

在这一点上，将经改造的、W3110ΔnadCΔkefA中引入pPro-nadB_pCJ1-nadA 质粒而得到的菌株根据布达佩斯条约于2013年11月7日保藏在韩国微生物保 藏中心(KCCM)，其中nadC缺失并且nadBA增强，保藏号为KCCM11470P。

3.2.KefA缺陷菌株和KefA增强菌株对喹啉酸的敏感性的评价

(1)KefA蛋白的过表达载体的制备

为了制备能过表达由大肠杆菌获得的kefA基因的载体，使用大肠杆菌K12 W3110菌株(ATCC保藏号23257)的染色体作为模板。此外，使用从NIH GenBank 获得的序列号10的基因的核苷酸序列(NCBI登记号“GI::89107872”)作为基 因序列。扩增kefA基因的ORF区，合成具有限制酶EcoRV和HindIII的识别位 点的序列号36和37的引物。

使用大肠杆菌K12W3110菌株的染色体DNA作为模板，并使用序列号36 和37的寡核苷酸作为引物，进行PCR。使用PfuUltra^TM DNA聚合酶(Stratagene 公司)作为聚合酶，并通过重复循环30次进行PCR，每个循环包括在96℃下变 性30秒，在50℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分钟。通过PCR，获得约3.3 kb的扩增基因，其含有kefA ORF基因和限制酶EcoRV和HindIII的识别位点。

将通过PCR获得的kefA基因通过琼脂糖凝胶洗脱回收，然后用限制酶 EcoRV和HindIII处理。随后，将kefA基因连接到用限制酶EcoRV和HindIII 处理的pCL1920_pRhtB载体中，导致连接到pRhtB启动子的kefA基因的表达。 由其制备的载体命名为pCL_pRhtB-kefA载体。

(2)KefA缺陷菌株和KefA增强菌株的喹啉酸的敏感度的评价

为了确定KefA膜蛋白是否影响喹啉酸的引入，按照与实施例2-4(1)相同的 方法，对kefA基因缺陷菌株和kefA基因增强菌株进行喹啉酸的敏感度评价。

[表6]

如上表6中所示，当在LB液体培养基中kefA基因也被增强时，在 W3110-ΔnadC中，与其中nadBA基因被增强的对照菌株相比，生产喹啉酸的菌 株的生长和发育和葡萄糖消耗速度显着降低约40％。还证实了，根本没有发现 喹啉酸的生产。此外，在向培养基中额外加入喹啉酸的条件下，与对照菌株相 比，kefA缺陷菌株的生长和发育和葡萄糖消耗速度提高至高达110％，而与对照 菌株相比kefA增强菌株的生长和发育和葡萄糖消耗速度降低至50％。

基于上述结果可以确定，KefA膜蛋白影响喹啉酸向细胞中的引入。此外， 证实了，消除kefA可以减弱生产喹啉酸的菌株对喹啉酸的敏感性，并且可以进 一步使得喹啉酸的生产增加。

序列表

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 用于生产喹啉酸的重组微生物和使用其生产喹啉酸的方法

<130> PX049018

<150> KR14-84625

<151> 2014-07-07

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1120

<212> PRT

<213> 大肠杆菌 K12 W3110

<400> 1

Met Thr Met Phe Gln Tyr Tyr Lys Arg Ser Arg His Phe Val Phe Ser

1 5 10 15

Ala Phe Ile Ala Phe Val Phe Val Leu Leu Cys Gln Asn Thr Ala Phe

20 25 30

Ala Arg Ala Ser Ser Asn Gly Asp Leu Pro Thr Lys Ala Asp Leu Gln

35 40 45

Ala Gln Leu Asp Ser Leu Asn Lys Gln Lys Asp Leu Ser Ala Gln Asp

50 55 60

Lys Leu Val Gln Gln Asp Leu Thr Asp Thr Leu Ala Thr Leu Asp Lys

65 70 75 80

Ile Asp Arg Ile Lys Glu Glu Thr Val Gln Leu Arg Gln Lys Val Ala

85 90 95

Glu Ala Pro Glu Lys Met Arg Gln Ala Thr Ala Ala Leu Thr Ala Leu

100 105 110

Ser Asp Val Asp Asn Asp Glu Glu Thr Arg Lys Ile Leu Ser Thr Leu

115 120 125

Ser Leu Arg Gln Leu Glu Thr Arg Val Ala Gln Ala Leu Asp Asp Leu

130 135 140

Gln Asn Ala Gln Asn Asp Leu Ala Ser Tyr Asn Ser Gln Leu Val Ser

145 150 155 160

Leu Gln Thr Gln Pro Glu Arg Val Gln Asn Ala Met Tyr Asn Ala Ser

165 170 175

Gln Gln Leu Gln Gln Ile Arg Ser Arg Leu Asp Gly Thr Asp Val Gly

180 185 190

Glu Thr Ala Leu Arg Pro Ser Gln Lys Val Leu Met Gln Ala Gln Gln

195 200 205

Ala Leu Leu Asn Ala Glu Ile Asp Gln Gln Arg Lys Ser Leu Glu Gly

210 215 220

Asn Thr Val Leu Gln Asp Thr Leu Gln Lys Gln Arg Asp Tyr Val Thr

225 230 235 240

Ala Asn Ser Ala Arg Leu Glu His Gln Leu Gln Leu Leu Gln Glu Ala

245 250 255

Val Asn Ser Lys Arg Leu Thr Leu Thr Glu Lys Thr Ala Gln Glu Ala

260 265 270

Val Ser Pro Asp Glu Ala Ala Arg Ile Gln Ala Asn Pro Leu Val Lys

275 280 285

Gln Glu Leu Glu Ile Asn Gln Gln Leu Ser Gln Arg Leu Ile Thr Ala

290 295 300

Thr Glu Asn Gly Asn Gln Leu Met Gln Gln Asn Ile Lys Val Lys Asn

305 310 315 320

Trp Leu Glu Arg Ala Leu Gln Ser Glu Arg Asn Ile Lys Glu Gln Ile

325 330 335

Ala Val Leu Lys Gly Ser Leu Leu Leu Ser Arg Ile Leu Tyr Gln Gln

340 345 350

Gln Gln Thr Leu Pro Ser Ala Asp Glu Leu Glu Asn Met Thr Asn Arg

355 360 365

Ile Ala Asp Leu Arg Leu Glu Gln Phe Glu Val Asn Gln Gln Arg Asp

370 375 380

Ala Leu Phe Gln Ser Asp Ala Phe Val Asn Lys Leu Glu Glu Gly His

385 390 395 400

Thr Asn Glu Val Asn Ser Glu Val His Asp Ala Leu Leu Gln Val Val

405 410 415

Asp Met Arg Arg Glu Leu Leu Asp Gln Leu Asn Lys Gln Leu Gly Asn

420 425 430

Gln Leu Met Met Ala Ile Asn Leu Gln Ile Asn Gln Gln Gln Leu Met

435 440 445

Ser Val Ser Lys Asn Leu Lys Ser Ile Leu Thr Gln Gln Ile Phe Trp

450 455 460

Val Asn Ser Asn Arg Pro Met Asp Trp Asp Trp Ile Lys Ala Phe Pro

465 470 475 480

Gln Ser Leu Lys Asp Glu Phe Lys Ser Met Lys Ile Thr Val Asn Trp

485 490 495

Gln Lys Ala Trp Pro Ala Val Phe Ile Ala Phe Leu Ala Gly Leu Pro

500 505 510

Leu Leu Leu Ile Ala Gly Leu Ile His Trp Arg Leu Gly Trp Leu Lys

515 520 525

Ala Tyr Gln Gln Lys Leu Ala Ser Ala Val Gly Ser Leu Arg Asn Asp

530 535 540

Ser Gln Leu Asn Thr Pro Lys Ala Ile Leu Ile Asp Leu Ile Arg Ala

545 550 555 560

Leu Pro Val Cys Leu Ile Ile Leu Ala Val Gly Leu Ile Leu Leu Thr

565 570 575

Met Gln Leu Asn Ile Ser Glu Leu Leu Trp Ser Phe Ser Lys Lys Leu

580 585 590

Ala Ile Phe Trp Leu Val Phe Gly Leu Cys Trp Lys Val Leu Glu Lys

595 600 605

Asn Gly Val Ala Val Arg His Phe Gly Met Pro Glu Gln Gln Thr Ser

610 615 620

His Trp Arg Arg Gln Ile Val Arg Ile Ser Leu Ala Leu Leu Pro Ile

625 630 635 640

His Phe Trp Ser Val Val Ala Glu Leu Ser Pro Leu His Leu Met Asp

645 650 655

Asp Val Leu Gly Gln Ala Met Ile Phe Phe Asn Leu Leu Leu Ile Ala

660 665 670

Phe Leu Val Trp Pro Met Cys Arg Glu Ser Trp Arg Asp Lys Glu Ser

675 680 685

His Thr Met Arg Leu Val Thr Ile Thr Val Leu Ser Ile Ile Pro Ile

690 695 700

Ala Leu Met Val Leu Thr Ala Thr Gly Tyr Phe Tyr Thr Thr Leu Arg

705 710 715 720

Leu Ala Gly Arg Trp Ile Glu Thr Val Tyr Leu Val Ile Ile Trp Asn

725 730 735

Leu Leu Tyr Gln Thr Val Leu Arg Gly Leu Ser Val Ala Ala Arg Arg

740 745 750

Ile Ala Trp Arg Arg Ala Leu Ala Arg Arg Gln Asn Leu Val Lys Glu

755 760 765

Gly Ala Glu Gly Ala Glu Pro Pro Glu Glu Pro Thr Ile Ala Leu Glu

770 775 780

Gln Val Asn Gln Gln Thr Leu Arg Ile Thr Met Leu Leu Met Phe Ala

785 790 795 800

Leu Phe Gly Val Met Phe Trp Ala Ile Trp Ser Asp Leu Ile Thr Val

805 810 815

Phe Ser Tyr Leu Asp Ser Ile Thr Leu Trp His Tyr Asn Gly Thr Glu

820 825 830

Ala Gly Ala Ala Val Val Lys Asn Val Thr Met Gly Ser Leu Leu Phe

835 840 845

Ala Ile Ile Ala Ser Met Val Ala Trp Ala Leu Ile Arg Asn Leu Pro

850 855 860

Gly Leu Leu Glu Val Leu Val Leu Ser Arg Leu Asn Met Arg Gln Gly

865 870 875 880

Ala Ser Tyr Ala Ile Thr Thr Ile Leu Asn Tyr Ile Ile Ile Ala Val

885 890 895

Gly Ala Met Thr Val Phe Gly Ser Leu Gly Val Ser Trp Asp Lys Leu

900 905 910

Gln Trp Leu Ala Ala Ala Leu Ser Val Gly Leu Gly Phe Gly Leu Gln

915 920 925

Glu Ile Phe Gly Asn Phe Val Ser Gly Leu Ile Ile Leu Phe Glu Arg

930 935 940

Pro Val Arg Ile Gly Asp Thr Val Thr Ile Gly Ser Phe Ser Gly Thr

945 950 955 960

Val Ser Lys Ile Arg Ile Arg Ala Thr Thr Ile Thr Asp Phe Asp Arg

965 970 975

Lys Glu Val Ile Ile Pro Asn Lys Ala Phe Val Thr Glu Arg Leu Ile

980 985 990

Asn Trp Ser Leu Thr Asp Thr Thr Thr Arg Leu Val Ile Arg Leu Gly

995 1000 1005

Val Ala Tyr Gly Ser Asp Leu Glu Lys Val Arg Lys Val Leu Leu

1010 1015 1020

Lys Ala Ala Thr Glu His Pro Arg Val Met His Glu Pro Met Pro

1025 1030 1035

Glu Val Phe Phe Thr Ala Phe Gly Ala Ser Thr Leu Asp His Glu

1040 1045 1050

Leu Arg Leu Tyr Val Arg Glu Leu Arg Asp Arg Ser Arg Thr Val

1055 1060 1065

Asp Glu Leu Asn Arg Thr Ile Asp Gln Leu Cys Arg Glu Asn Asp

1070 1075 1080

Ile Asn Ile Ala Phe Asn Gln Leu Glu Val His Leu His Asn Glu

1085 1090 1095

Lys Gly Asp Glu Val Thr Glu Val Lys Arg Asp Tyr Lys Gly Asp

1100 1105 1110

Asp Pro Thr Pro Ala Val Gly

1115 1120

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增kefA的下游区的引物

<400> 2

gcctgcggat ttaatgacgc gtcgcgcagc 30

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增kefA的下游区的引物

<400> 3

cgaagcagct ccagcctaca cttccggcgc ttcagcgact tt 42

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增FRT-KM的引物

<400> 4

aaagtcgctg aagcgccgga agtgtaggct ggagctgctt cg 42

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增FRT-KM的引物

<400> 5

ctcagtcgcc gccttcagta aatgggaatt agccatggtc ca 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增kefA的上游区的引物

<400> 6

tggaccatgg ctaattccca tttactgaag gcggcgactg ag 42

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增kefA的上游区的引物

<400> 7

gaaaagaaat taacgcgcga tgatgaggcg 30

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于确认kefA的缺失的引物

<400> 8

ccactctcag tattaagaga gatatta 27

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于确认kefA的缺失的引物

<400> 9

atgtcaaact ggctgtcgat ttgattgt 28

<210> 10

<211> 3363

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 10

atgactatgt tccagtatta caaacgatca cggcattttg ttttttcagc atttattgct 60

tttgtttttg tcttgttatg ccagaacacg gcgtttgcgc gggcgtcatc gaatggtgat 120

ctgccgacaa aagcggacct gcaggcgcaa cttgactcac taaataaaca aaaagatctt 180

tctgctcagg acaaactggt gcagcaggat ctgacagata cattagccac cctcgataaa 240

atcgatcgca taaaagaaga gacagttcag ctacggcaaa aagtcgctga agcgccggaa 300

aaaatgcgcc aggcgaccgc ggcgttaaca gcacttagcg atgtcgataa cgacgaagaa 360

acgcgcaaaa ttctgagcac gctgtcgttg cgccagctgg aaactcgcgt tgcccaggcg 420

ctggacgatt tgcaaaacgc acaaaacgat ctggcgtctt ataacagcca gctggtttcg 480

ttacagacgc agcccgaacg cgtgcaaaat gcgatgtata acgcttcgca gcagctgcaa 540

caaattcgca gtcgtctgga tgggactgat gtcggcgaga cagccttacg tcccagccag 600

aaagtgttaa tgcaggccca gcaggcgttg ctgaatgcgg agattgacca gcagcgtaaa 660

agcctggaag ggaacaccgt cttgcaggat accttgcaaa agcaacgtga ttacgtgacg 720

gcgaacagcg ctcgtctgga gcaccagtta caactgttgc aagaagcggt aaacagcaag 780

cgcctgactt taaccgaaaa aacggcgcag gaagccgtct ccccggatga agccgcgcgt 840

attcaggcta atccgctggt gaagcaggaa ctggaaatta accagcagtt aagtcagcgt 900

ctgattaccg cgactgaaaa cggtaatcag ttgatgcagc aaaacattaa agtcaaaaac 960

tggctggagc gggcgctgca atcggaacgc aatattaaag agcagattgc cgtcctgaag 1020

ggcagcctgc tgttgtctcg tatcctttac cagcaacaac aaacgctgcc ctcggcggat 1080

gaactggaaa acatgaccaa ccgcatcgcg gatttgcgtc tcgaacagtt tgaagttaac 1140

cagcagcgtg atgcactctt ccagagcgat gcgttcgtca acaaactgga agaaggtcac 1200

accaacgaag tcaacagcga agttcacgat gcgttattgc aagtggttga tatgcgtcgc 1260

gaattgctgg atcaactcaa caaacagttg ggtaaccagc tgatgatggc cattaacctg 1320

caaatcaacc agcagcagtt aatgagtgtg tcgaaaaacc tgaaatccat cctgactcag 1380

caaatctttt gggtgaacag taaccgtcca atggactggg actggatcaa agcgttcccg 1440

caaagcctga aagatgaatt taagtcgatg aaaatcacgg tgaactggca aaaagcctgg 1500

cccgccgttt ttatcgcttt cctcgctggt ttgccgctgc tgttgattgc cgggctgatc 1560

cactggcgtc tgggctggct gaaagcgtat caacaaaaac tggcttccgc tgtgggttcc 1620

ctgcgtaacg acagccagct caacacacca aaagcgatcc ttatcgacct gatccgtgcg 1680

ctgccggtgt gcctgattat tctcgcggtt ggcctgattc tgttgaccat gcagctcaac 1740

atcagcgaac tgctatggtc gttcagcaaa aaactggcga tattctggct ggtgtttggc 1800

ctgtgctgga aggtactgga gaaaaacggc gttgccgtac gtcacttcgg catgccggaa 1860

cagcagacca gccactggcg tcggcaaatt gtccgcatca gtctcgcatt gctgcctatc 1920

catttctggt ctgtggtggc agaactttcc ccgctgcatc tgatggatga tgtgctgggg 1980

caagcgatga ttttcttcaa cctgctgctg attgccttcc tggtatggcc gatgtgccgc 2040

gaaagctggc gtgataaaga gtcgcacacc atgcgactgg tcaccattac cgtgctgtcg 2100

ataatcccga ttgcgctgat ggtgctgact gctacaggct acttctacac tacgctgcgt 2160

ctggcaggac gctggattga aaccgtttat ctggtgatca tctggaacct gctgtaccag 2220

acggtactgc gtggcttaag cgtagcggcg cggcgtatcg cctggcgtcg tgcgctggcg 2280

cgtcggcaga atctggtgaa agagggcgca gaaggtgctg aaccgccgga agaacccacc 2340

attgcactgg agcaagttaa ccagcagacg ctgcgtatta ccatgttgct gatgtttgcg 2400

ctgttcggtg tcatgttctg ggcaatttgg tccgatttga tcaccgtgtt cagctatctc 2460

gacagcatca cgctctggca ttacaacggc actgaagctg gcgctgcggt ggtgaaaaac 2520

gtcaccatgg gcagtctgtt gtttgcgatt atcgcctcaa tggtggcctg ggcgttgatt 2580

cgcaacctgc ctggtttact ggaagtgctg gtgctctcgc gactgaatat gcgccagggc 2640

gcgtcgtatg ccattactac catccttaac tacatcatta ttgctgttgg tgcgatgacg 2700

gtgttcggat cgctgggcgt ctcttgggat aaactccagt ggctggccgc agcattatcc 2760

gtaggtcttg gttttggttt acaagaaatt ttcggtaact tcgtctccgg tttgatcatt 2820

ctattcgaac gtccggtgcg tattggcgat acggtaacca ttggtagctt ctcggggacg 2880

gtaagtaaga tccgtattcg tgcgacaacg attaccgatt tcgatcgcaa agaagtgatc 2940

atcccgaaca aagcgtttgt taccgagcgt ctgatcaact ggtcgttgac tgacactact 3000

acgcgtctgg tgatccgtct cggcgtggcc tatggctccg atctggaaaa agtgcgtaaa 3060

gtgttactga aggcggcgac tgagcaccca agggtgatgc acgaaccaat gccggaagtc 3120

ttctttacgg catttggtgc cagcacgttg gatcatgagc tgcgtctgta tgtgcgtgaa 3180

ctgcgtgacc gtagtcgtac tgtcgatgag ctgaaccgta ctatcgatca gctgtgccgt 3240

gaaaacgaca tcaacattgc ctttaaccag cttgaagtgc atctgcacaa cgagaagggc 3300

gatgaggtga cggaagtaaa acgcgactac aaaggcgatg acccgacgcc agcggtaggg 3360

taa 3363

<210> 11

<211> 894

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 11

atgccgcctc gccgctataa ccctgacacc cgacgtgacg agctgctgga acgcattaat 60

ctcgatatcc ccggcgcggt ggcccaggcg ctgcgggaag atttaggcgg aacagtcgat 120

gccaacaatg atattacggc aaaactttta ccggaaaatt ctcgctctca tgccacggtg 180

atcacccgcg agaatggcgt cttttgcggc aaacgctggg ttgaagaggt gtttattcaa 240

ctggcaggcg acgatgtcac cataatctgg catgtggatg acggcgatgt catcaatgcc 300

aatcaatcct tgttcgaact tgaaggccca tcccgcgtgc tgttaacggg cgaacgcact 360

gcgcttaatt ttgtgcaaac cctttcagga gttgccagta aggtacgcca ctatgtcgaa 420

ttgctggaag gcaccaacac gcagttgttg gatacgcgca aaaccttacc cggcctgcgt 480

tcagctctga aatacgcggt actttgcggc ggcggagcga atcaccgtct ggggctttct 540

gatgccttcc tgatcaaaga aaaccatatt attgcctccg gctcagtgcg ccaggcggtc 600

gaaaaagcgt cctggctgca cccggatgcg ccagtagaag tcgaagtaga gaatctggaa 660

gaacttgatg aagccctgaa agcaggagcc gatatcatca tgctggataa cttcgaaaca 720

gaacagatgc gcgaagccgt caaacgcacc aacggcaagg cgctactgga agtgtctggc 780

aacgtcactg acaaaacact gcgtgaattt gccgaaacgg gcgtggactt tatctccgtc 840

ggtgcgctaa ctaaacacgt acaagcactc gacctttcaa tgcgttttcg ctaa 894

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增nadC的下游区的引物

<400> 12

cattatacga acggtacccc cagttgaata aacacctctt ca 42

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增nadC的下游区的引物

<400> 13

tggcggcagg ctaatatt 18

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增loxpCm的引物

<400> 14

gttcttccag attctctact tttcgagctc ggtacctacc g 41

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增loxpCm的引物

<400> 15

tgaagaggtg tttattcaac tgggggtacc gttcgtataa tg 42

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增nadC的上游区的引物

<400> 16

ataaccacca tcagttcgat a 21

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增nadC的上游区的引物

<400> 17

cggtaggtac cgagctcgaa aagtagagaa tctggaagaa c 41

<210> 18

<211> 1551

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 18

ctacgcctgg ctgaccagca tcaggtcatc gttctaagta aaggcccggt aacggaaggt 60

tcaacatttt atgcccaggg cggtattgcc gccgtgtttg atgaaactga cagcattgac 120

tcgcatgtgg aagacacatt gattgccggg gctggtattt gcgatcgcca tgcagttgaa 180

tttgtcgcca gcaatgcacg atcctgtgtg caatggctaa tcgaccaggg ggtgttgttt 240

gatacccaca ttcaaccgaa tggcgaagaa agttaccatc tgacccgtga aggtggacat 300

agtcaccgtc gtattcttca tgccgccgac gccaccggta gagaagtaga aaccacgctg 360

gtgagcaagg cgctgaacca tccgaatatt cgcgtgctgg agcgcagcaa cgcggttgat 420

ctgattgttt ctgacaaaat tggcctgccg ggcacgcgac gggttgttgg cgcgtgggta 480

tggaaccgta ataaagaaac ggtggaaacc tgccacgcaa aagcggtggt gctggcaacc 540

ggcggtgcgt cgaaggttta tcagtacacc accaatccgg atatttcttc tggcgatggc 600

attgctatgg cgtggcgcgc aggctgccgg gttgccaatc tcgaatttaa tcagttccac 660

cctaccgcgc tatatcaccc acaggcacgc aatttcctgt taacagaagc actgcgcggc 720

gaaggcgctt atctcaagcg cccggatggt acgcgtttta tgcccgattt tgatgagcgc 780

ggcgaactgg ccccgcgcga tattgtcgcc cgcgccattg accatgaaat gaaacgcctc 840

ggcgcagatt gtatgttcct tgatatcagc cataagcccg ccgattttat tcgccagcat 900

ttcccgatga tttatgaaaa gctgctcggg ctggggattg atctcacaca agaaccggta 960

ccgattgtgc ctgctgcaca ttatacctgc ggtggtgtaa tggttgatga tcatgggcgt 1020

acggacgtcg agggcttgta tgccattggc gaggtgagtt ataccggctt acacggcgct 1080

aaccgcatgg cctcgaattc attgctggag tgtctggtct atggctggtc ggcggcggaa 1140

gatatcacca gacgtatgcc ttatgcccac gacatcagta cgttaccgcc gtgggatgaa 1200

agccgcgttg agaaccctga cgaacgggta gtaattcagc ataactggca cgagctacgt 1260

ctgtttatgt gggattacgt tggcattgtg cgcacaacga agcgcctgga acgcgccctg 1320

cggcggataa ccatgctcca acaagaaata gacgaatatt acgcccattt ccgcgtctca 1380

aataatttgc tggagctgcg taatctggta caggttgccg agttgattgt tcgctgtgca 1440

atgatgcgta aagagagtcg ggggttgcat ttcacgctgg attatccgga actgctcacc 1500

cattccggtc cgtcgatcct ttcccccggc aatcattaca taaacagata a 1551

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增nadB的ORF区的引物

<400> 19

aattcatatg aatactctcc ctgaacatt 29

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增nadB的ORF区的引物

<400> 20

aattggatcc ctataccact acgcttgatc ac 32

<210> 21

<211> 1044

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 21

atgagcgtaa tgtttgatcc agacacggcg atttatcctt tccccccgaa gccgacgccg 60

ttaagcattg atgaaaaagc gtattaccgc gagaagataa aacgtctgct aaaagaacgt 120

aatgcggtga tggttgccca ctactatacc gatcccgaaa ttcaacaact ggcagaagaa 180

accggtggct gtatttctga ttctctggaa atggcgcgct tcggtgcaaa gcatcccgct 240

tctactttgt tagtcgctgg ggtgagattt atgggagaaa ccgccaaaat tctcagtccg 300

gaaaaaacaa ttctgatgcc gacacttcag gctgaatgtt cactggatct cggctgccct 360

gttgaagaat ttaacgcatt ttgcgatgcc catcccgatc gtactgtcgt cgtctacgcc 420

aacacttctg ctgcggtaaa agcgcgcgca gattgggtgg taacttcaag cattgccgtc 480

gaacttattg atcatcttga tagtttgggt gaaaaaatca tctgggcacc cgacaaacat 540

ctggggcgtt acgtgcaaaa acagacgggt ggagacattc tatgctggca gggtgcctgt 600

attgtgcatg atgaatttaa gactcaggcg ttaacccgct tgcaagaaga atacccggat 660

gctgccatac tggtgcatcc agaatcacca caagctattg tcgatatggc ggatgcggtc 720

ggttccacca gtcaactgat cgctgctgcg aaaacattgc cacatcagag gcttattgtg 780

gcaaccgatc ggggtatttt ctacaaaatg cagcaggcgg tgccagataa agagttactg 840

gaagcaccaa ccgcaggtga gggtgcaacc tgccgcagct gcgcgcattg tccgtggatg 900

gccatgaatg gccttcaggc catcgcagag gcattagaac aggaaggaag caatcacgag 960

gttcatgttg atgaaaggct gcgagagagg gcgctggtgc cgctcaatcg tatgctggat 1020

tttgcggcta cactacgtgg ataa 1044

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增nadA的ORF区的引物

<400> 22

aattgggccc atgagcgtaa tgtttgatcc a 31

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增nadA的ORF区的引物

<400> 23

aattgcggcc gctcgtgcct accgcttcg 29

<210> 24

<211> 294

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 24

ccagcctgtt tacgatgatc ccgctgctta atctgttcat catgcccgtt gccgtttgtg 60

gcgcgacggc gatgtgggtc gattgctatc gcgataaaca cgcgatgtgg cggtaacaat 120

ctaccggtta ttttgtaaac cgtttgtgtg aaacaggggt ggcttatgcc gccccttatt 180

ccatcttgca tgtcattatt tcccttctgt atatagatat gctaaatcct tacttccgca 240

tattctctga gcgggtatgc tacctgttgt atcccaattt catacagtta agga 294

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增cysK启动子的引物

<400> 25

ggatccccag cctgtttacg atgat 25

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增cysK启动子的引物

<400> 26

gggccctcct taactgtatg aaattggg 28

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增pCJ1启动子的引物

<400> 27

ccgcggatcc caccgcgggc ttattccatt ac 32

<210> 28

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增pCJ1启动子的引物

<400> 28

gatgggccca tcttaatctc ctagattggg tttc 34

<210> 29

<211> 297

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 29

Met Pro Pro Arg Arg Tyr Asn Pro Asp Thr Arg Arg Asp Glu Leu Leu

1 5 10 15

Glu Arg Ile Asn Leu Asp Ile Pro Gly Ala Val Ala Gln Ala Leu Arg

20 25 30

Glu Asp Leu Gly Gly Thr Val Asp Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ala Lys

35 40 45

Leu Leu Pro Glu Asn Ser Arg Ser His Ala Thr Val Ile Thr Arg Glu

50 55 60

Asn Gly Val Phe Cys Gly Lys Arg Trp Val Glu Glu Val Phe Ile Gln

65 70 75 80

Leu Ala Gly Asp Asp Val Thr Ile Ile Trp His Val Asp Asp Gly Asp

85 90 95

Val Ile Asn Ala Asn Gln Ser Leu Phe Glu Leu Glu Gly Pro Ser Arg

100 105 110

Val Leu Leu Thr Gly Glu Arg Thr Ala Leu Asn Phe Val Gln Thr Leu

115 120 125

Ser Gly Val Ala Ser Lys Val Arg His Tyr Val Glu Leu Leu Glu Gly

130 135 140

Thr Asn Thr Gln Leu Leu Asp Thr Arg Lys Thr Leu Pro Gly Leu Arg

145 150 155 160

Ser Ala Leu Lys Tyr Ala Val Leu Cys Gly Gly Gly Ala Asn His Arg

165 170 175

Leu Gly Leu Ser Asp Ala Phe Leu Ile Lys Glu Asn His Ile Ile Ala

180 185 190

Ser Gly Ser Val Arg Gln Ala Val Glu Lys Ala Ser Trp Leu His Pro

195 200 205

Asp Ala Pro Val Glu Val Glu Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Asp Glu

210 215 220

Ala Leu Lys Ala Gly Ala Asp Ile Ile Met Leu Asp Asn Phe Glu Thr

225 230 235 240

Glu Gln Met Arg Glu Ala Val Lys Arg Thr Asn Gly Lys Ala Leu Leu

245 250 255

Glu Val Ser Gly Asn Val Thr Asp Lys Thr Leu Arg Glu Phe Ala Glu

260 265 270

Thr Gly Val Asp Phe Ile Ser Val Gly Ala Leu Thr Lys His Val Gln

275 280 285

Ala Leu Asp Leu Ser Met Arg Phe Arg

290 295

<210> 30

<211> 540

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 30

Met Asn Thr Leu Pro Glu His Ser Cys Asp Val Leu Ile Ile Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ala Ala Gly Leu Ser Leu Ala Leu Arg Leu Ala Asp Gln His Gln

20 25 30

Val Ile Val Leu Ser Lys Gly Pro Val Thr Glu Gly Ser Thr Phe Tyr

35 40 45

Ala Gln Gly Gly Ile Ala Ala Val Phe Asp Glu Thr Asp Ser Ile Asp

50 55 60

Ser His Val Glu Asp Thr Leu Ile Ala Gly Ala Gly Ile Cys Asp Arg

65 70 75 80

His Ala Val Glu Phe Val Ala Ser Asn Ala Arg Ser Cys Val Gln Trp

85 90 95

Leu Ile Asp Gln Gly Val Leu Phe Asp Thr His Ile Gln Pro Asn Gly

100 105 110

Glu Glu Ser Tyr His Leu Thr Arg Glu Gly Gly His Ser His Arg Arg

115 120 125

Ile Leu His Ala Ala Asp Ala Thr Gly Arg Glu Val Glu Thr Thr Leu

130 135 140

Val Ser Lys Ala Leu Asn His Pro Asn Ile Arg Val Leu Glu Arg Ser

145 150 155 160

Asn Ala Val Asp Leu Ile Val Ser Asp Lys Ile Gly Leu Pro Gly Thr

165 170 175

Arg Arg Val Val Gly Ala Trp Val Trp Asn Arg Asn Lys Glu Thr Val

180 185 190

Glu Thr Cys His Ala Lys Ala Val Val Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser

195 200 205

Lys Val Tyr Gln Tyr Thr Thr Asn Pro Asp Ile Ser Ser Gly Asp Gly

210 215 220

Ile Ala Met Ala Trp Arg Ala Gly Cys Arg Val Ala Asn Leu Glu Phe

225 230 235 240

Asn Gln Phe His Pro Thr Ala Leu Tyr His Pro Gln Ala Arg Asn Phe

245 250 255

Leu Leu Thr Glu Ala Leu Arg Gly Glu Gly Ala Tyr Leu Lys Arg Pro

260 265 270

Asp Gly Thr Arg Phe Met Pro Asp Phe Asp Glu Arg Gly Glu Leu Ala

275 280 285

Pro Arg Asp Ile Val Ala Arg Ala Ile Asp His Glu Met Lys Arg Leu

290 295 300

Gly Ala Asp Cys Met Phe Leu Asp Ile Ser His Lys Pro Ala Asp Phe

305 310 315 320

Ile Arg Gln His Phe Pro Met Ile Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Leu Gly

325 330 335

Ile Asp Leu Thr Gln Glu Pro Val Pro Ile Val Pro Ala Ala His Tyr

340 345 350

Thr Cys Gly Gly Val Met Val Asp Asp His Gly Arg Thr Asp Val Glu

355 360 365

Gly Leu Tyr Ala Ile Gly Glu Val Ser Tyr Thr Gly Leu His Gly Ala

370 375 380

Asn Arg Met Ala Ser Asn Ser Leu Leu Glu Cys Leu Val Tyr Gly Trp

385 390 395 400

Ser Ala Ala Glu Asp Ile Thr Arg Arg Met Pro Tyr Ala His Asp Ile

405 410 415

Ser Thr Leu Pro Pro Trp Asp Glu Ser Arg Val Glu Asn Pro Asp Glu

420 425 430

Arg Val Val Ile Gln His Asn Trp His Glu Leu Arg Leu Phe Met Trp

435 440 445

Asp Tyr Val Gly Ile Val Arg Thr Thr Lys Arg Leu Glu Arg Ala Leu

450 455 460

Arg Arg Ile Thr Met Leu Gln Gln Glu Ile Asp Glu Tyr Tyr Ala His

465 470 475 480

Phe Arg Val Ser Asn Asn Leu Leu Glu Leu Arg Asn Leu Val Gln Val

485 490 495

Ala Glu Leu Ile Val Arg Cys Ala Met Met Arg Lys Glu Ser Arg Gly

500 505 510

Leu His Phe Thr Leu Asp Tyr Pro Glu Leu Leu Thr His Ser Gly Pro

515 520 525

Ser Ile Leu Ser Pro Gly Asn His Tyr Ile Asn Arg

530 535 540

<210> 31

<211> 347

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 31

Met Ser Val Met Phe Asp Pro Asp Thr Ala Ile Tyr Pro Phe Pro Pro

1 5 10 15

Lys Pro Thr Pro Leu Ser Ile Asp Glu Lys Ala Tyr Tyr Arg Glu Lys

20 25 30

Ile Lys Arg Leu Leu Lys Glu Arg Asn Ala Val Met Val Ala His Tyr

35 40 45

Tyr Thr Asp Pro Glu Ile Gln Gln Leu Ala Glu Glu Thr Gly Gly Cys

50 55 60

Ile Ser Asp Ser Leu Glu Met Ala Arg Phe Gly Ala Lys His Pro Ala

65 70 75 80

Ser Thr Leu Leu Val Ala Gly Val Arg Phe Met Gly Glu Thr Ala Lys

85 90 95

Ile Leu Ser Pro Glu Lys Thr Ile Leu Met Pro Thr Leu Gln Ala Glu

100 105 110

Cys Ser Leu Asp Leu Gly Cys Pro Val Glu Glu Phe Asn Ala Phe Cys

115 120 125

Asp Ala His Pro Asp Arg Thr Val Val Val Tyr Ala Asn Thr Ser Ala

130 135 140

Ala Val Lys Ala Arg Ala Asp Trp Val Val Thr Ser Ser Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Leu Ile Asp His Leu Asp Ser Leu Gly Glu Lys Ile Ile Trp Ala

165 170 175

Pro Asp Lys His Leu Gly Arg Tyr Val Gln Lys Gln Thr Gly Gly Asp

180 185 190

Ile Leu Cys Trp Gln Gly Ala Cys Ile Val His Asp Glu Phe Lys Thr

195 200 205

Gln Ala Leu Thr Arg Leu Gln Glu Glu Tyr Pro Asp Ala Ala Ile Leu

210 215 220

Val His Pro Glu Ser Pro Gln Ala Ile Val Asp Met Ala Asp Ala Val

225 230 235 240

Gly Ser Thr Ser Gln Leu Ile Ala Ala Ala Lys Thr Leu Pro His Gln

245 250 255

Arg Leu Ile Val Ala Thr Asp Arg Gly Ile Phe Tyr Lys Met Gln Gln

260 265 270

Ala Val Pro Asp Lys Glu Leu Leu Glu Ala Pro Thr Ala Gly Glu Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Arg Ser Cys Ala His Cys Pro Trp Met Ala Met Asn Gly

290 295 300

Leu Gln Ala Ile Ala Glu Ala Leu Glu Gln Glu Gly Ser Asn His Glu

305 310 315 320

Val His Val Asp Glu Arg Leu Arg Glu Arg Ala Leu Val Pro Leu Asn

325 330 335

Arg Met Leu Asp Phe Ala Ala Thr Leu Arg Gly

340 345

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增具有TTG的kefA ORF的引物

<400> 32

ttgactatgt tccagtatta c 21

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增具有TTG的kefA ORF的引物

<400> 33

cgcggatccg tgagtcaagt tgcgcc 26

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增kefA的自身启动子的引物

<400> 34

cgcgagctcc cctgaatctg actccagga 29

<210> 35

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增kefA的自身启动子的引物

<400> 35

cgcgagctcc cctgaatctg actccagga 29

<210> 36

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于pRhtB kefA的引物

<400> 36

ccgatatcat gactatgttc cagtattac 29

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于pRhtB kefA的引物

<400> 37

cccaagcttt taccctaccg ctggcgtcgg 30

Claims (10)

1.一种生产喹啉酸的埃希氏菌属的重组微生物，其中由SEQ ID NO：1的序列组成的蛋白质的活性被减弱或消除，并且所述重组微生物与亲本微生物相比具有提高的喹啉酸生产力，其中喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性进一步被减弱或消除，其中所述重组微生物是大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中选自L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶中的至少一种酶的活性进一步被增强。

3.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述喹啉酸磷酸核糖基转移酶由SEQ IDNO：29的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述L-天冬氨酸氧化酶由SEQ ID NO：30的氨基酸序列组成，并且所述喹啉酸合成酶由SEQ ID NO：31的氨基酸序列组成。

5.一种生产喹啉酸的方法，所述方法包括：

在培养基中培养重组微生物；和

从所述培养基或所述重组微生物回收喹啉酸，

其中所述微生物是生产喹啉酸的埃希氏菌属的重组微生物，其中由SEQ ID NO：1的序列组成的蛋白质的活性被减弱或消除，并且所述重组微生物与亲本微生物相比具有提高的喹啉酸生产力，其中所述重组微生物是大肠杆菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其中喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性进一步被减弱或消除。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中选自L-天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶中的至少一种酶的活性进一步被增强。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述喹啉酸磷酸核糖基转移酶由SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述L-天冬氨酸氧化酶由SEQ ID NO：30的氨基酸序列组成，并且所述喹啉酸合成酶由SEQ ID NO：31的氨基酸序列组成。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的重组微生物在生产喹啉酸的方法中的用途，所述方法包括：

在培养基中培养根据权利要求1至4中任一项所述的重组微生物；和

从所述培养基或所述重组微生物回收喹啉酸。