WO2016006856A1 - 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 퀴놀린산의 생산 방법 - Google Patents

퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 퀴놀린산의 생산 방법 Download PDF

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김주은
김소영
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이재민
이재희
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    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01072—Quinolinate synthase (2.5.1.72)

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant microorganism producing quinoline acid and a method for producing quinoline acid using the same.
  • Quinolinic acid (2,3-pyridine-dicarboxylic acid) is used as a precursor of chemicals used in a wide variety of fields, such as pharmaceuticals, agricultural chemicals, dyeing materials.
  • the quinoline acid can be prepared through chemical or biological synthesis methods. Chemically, it is usually prepared by the oxidation of quinoline. Biologically, Escherichia coli strains enhanced expression of two enzymes, L-aspartic acid oxidase (NadB) and quinoline acid synthase (NadA), in E. coli depleted of quinoline phosphoribosyltransferase (NadC) A method for producing quinoline acid using is disclosed.
  • KefA is a membrane protein belonging to a mechanosensitive (MS) channel present in microorganisms such as E. coli, and has a function of inducing ions and solutes into cells through a cell membrane.
  • KefA in E. coli constitutes the K + efflux system (K + efflux system) with KefB and KefC, particularly KefA the osmotic shock (osmotic down shock) when it is known to play an important role in K + efflux (J. Bacteriol. 169 , 3743-3749, 1987). It has also been reported that the mutation of KefA gene in E. coli is more sensitive to K + concentration and pressure than the wild type (J. membrane Biol. 150, 143-152). However, as mentioned above, most of the studies focus primarily on the association of KefA with the regulation of potassium ions in the cells, and there have been no studies on the association between KefA and the production of quinoline acid.
  • the present inventors conducted a study on the association between the active modification of the mechano-channel protein and the high concentration production of quinoline acid, thereby completing a method of producing quinoline acid at high yield.
  • One aspect is to provide a recombinant microorganism that produces quinoline acid with reduced or eliminated activity of the protein of SEQ ID NO: 1.
  • Another aspect is to provide a method for producing quinoline acid using the microorganism.
  • One aspect provides a recombinant microorganism that produces quinoline acid with reduced or eliminated KefA activity.
  • KefA is a membrane protein belonging to a mechanosensitive channel, also referred to as "MscK".
  • MscK mechanosensitive channel
  • the KefA is potassium dependent, and may have activity of introducing ions and solutes into the cells nonspecifically through the cell membrane.
  • KefA is one of the potassium efflux proteins, for example, can be controlled by potassium outflow when bacteria are subjected to osmotic shock.
  • the KefA may be derived from a microorganism of the genus Escherichia, specifically having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a homologous 80%, specifically, 90% or more amino acid sequence having substantially KefA activity. Can be included without limitation.
  • the sequence having such homology is an amino acid sequence having a biological activity substantially the same as or corresponding to that of the protein of SEQ ID NO: 1, even if some sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added, the scope of the present invention is also included in the scope of the present invention. Inclusion is also obvious.
  • the kefA gene sequence may include a polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or more than 80% homology thereto, the polynucleotide encoding the KefA protein is due to the degeneracy of the codon Alternatively, various modifications may be made to the coding region within the scope of not changing the amino acid sequence of the protein expressed from the coding region in consideration of a codon preferred in the organism to express the protein.
  • the polynucleotide sequence of kefA can be obtained from published genome sequences of Escherichia coli (GI: 89107872) or from databases such as the American Biotechnology Information Center (NCBI) and the Japanese DNA Data Bank (DDBJ), for example SEQ ID NO: 10 It has a nucleotide sequence of, and may have a nucleotide sequence of 80%, specifically 90% or more homology thereto. However, it is not limited thereto.
  • homology refers to the degree of homology to the amino acid sequence or polynucleotide sequence and can be expressed in percentage.
  • homologous sequences thereof having the same or similar activity as a given amino acid sequence or polynucleotide sequence are denoted as "% homology”.
  • algorithm BLAST by the literature [Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] or FASTA by Pearson (Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Based on this algorithm BLAST, a program called BLASTN or BLASTX has been developed (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • quinolinic acid as used herein includes quinolinate or a salt thereof.
  • the “salt” is a compound made by the anion of the quinoline acid and the cation of the base, and may include, for example, sodium quinoline salt, quinoline potassium salt, quinoline ammonium salt, quinoline calcium salt, quinoline magnesium salt, and the like. Can be.
  • the term "recombinant microorganism” may be a naturally or artificially mutated microorganism or a genetically engineered microorganism.
  • An exogenous nucleic acid may be introduced into a microorganism produced by genetic engineering, for example, a genetic engineering method, or a sequence or a location of an endogenous gene of the microorganism may be modified.
  • the "recombinant microorganism that produces quinoline acid” of the present invention is a microorganism capable of producing and accumulating quinoline acid from a carbon source in a medium, and can produce quinoline acid with higher productivity than before modification by reducing or eliminating KefA activity.
  • the recombinant microorganism is not limited as long as it is a microorganism capable of producing and accumulating quinoline acid, but is not limited to the genus Escherichia, Enterbacter, Erwinia, Serratia, and Providen. Microorganisms belonging to the genus Providencia, Corynebacterium, and Brevibacterium.
  • the microorganism may be a microorganism belonging to the genus Escherichia. More specifically, the Escherichia genus microorganism may be Escherichia coli, but is not limited thereto.
  • the term "removal of activity" of an enzyme or polypeptide means that the protein mentioned in the microorganism is not expressed at all, or has no activity at all.
  • the term “reduction of activity” also means that the activity of the mentioned protein is weakened relative to the intrinsic activity.
  • intrinsic activity refers to the activity of a microorganism in its natural state, i.e., the protein that the microorganism originally had without undergoing genetic modification.
  • the reduction or elimination of KefA activity may include 1) removal or deletion of a gene encoding the KefA protein, 2) modification of an expression control sequence such that expression of the gene is reduced, and 3) chromosome to attenuate the activity of KefA.
  • the modification of the gene sequence in the phase or the promoter of the gene can be carried out by a method of replacing the promoter weaker than the intrinsic promoter, or by a combination of one or more of these methods. However, it is not limited thereto.
  • the decrease or removal of the KefA activity may be due to the removal or deletion of the gene encoding the KefA membrane protein.
  • the "removal or deletion of the gene” is a part or all of the gene, or its promoter, its terminator region, or the like, so that the gene is not expressed, or the amount of expression is reduced or expressed, but does not exhibit enzymatic activity or the activity is reduced. It means that some or all of them are mutated, substituted, deleted or one or more bases are inserted into a gene.
  • removal or deletion of the gene can be achieved through genetic manipulation, such as homologous recombination, mutagenesis, molecular evolution. If the cell contains a plurality of the same genes or two or more different polypeptide homologous homologs, one or more genes may be removed or deleted.
  • the recombinant microorganism may be further reduced or eliminated the activity of quinolinate phosphoribosyltransferase (NadC).
  • quinolinic acid phosphoribosyltransferase as used herein is meant to have the activity of converting quinoline acid to nicotinic acid mononucleotide.
  • the production of quinoline acid in cells can be increased by removing or attenuating the gene having the quinoline acid phosphoribosyltransferase activity.
  • the quinoline acid phosphoribosyltransferase may be derived from a microorganism of the genus Escherichia, specifically having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, and having an homology of 80%, specifically 90% or more, substantially as an amino acid sequence.
  • the protein having the activity of the quinoline acid phosphoribosyltransferase includes, without limitation, if the amino acid sequence having a biological activity substantially the same as or corresponding to the protein of SEQ ID NO: 29 as this homology sequence, some sequences It is obvious that cases having an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added are also included in the scope of the present invention.
  • the sequence of the nadC gene encoding the quinoline acid phosphoribosyltransferase may include a polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.
  • the nadC gene sequence can be obtained from the genome sequence of Escherichia coli (GI: 89106990) disclosed in the literature or from a database such as NCBI, DDBJ.
  • the nadC gene may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 or a base sequence having 80%, specifically 90% or more homology thereof.
  • the accumulation of quinoline acid in cells can be increased by reducing or eliminating the activity of the quinoline acid phosphoribosyltransferase.
  • the recombinant microorganism may be additionally increased one or more activities selected from the group consisting of L-aspartate oxidase (NadB) and Quinolinate synthase (NadA).
  • the accumulation of ⁇ -iminosuccinate, a precursor of quinoline acid in the cell, and the biosynthesis of ⁇ -iminosuccinate to quinoline acid can be increased, thereby increasing the production of quinoline acid.
  • aspartic acid oxidase means an enzyme having an activity of oxidizing L-aspartic acid, and may be referred to as 'L-aspartic acid oxidase'.
  • the aspartic acid oxidase may be derived from a microorganism of the genus Escherichia. Specifically, the aspartic acid oxidase has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, and is an amino acid sequence having an homology of 80%, specifically 90% or more. Any protein having an activity is included without limitation, and if it is an amino acid sequence having a biological activity substantially identical to or corresponding to the protein of SEQ ID NO. 30 as the sequence having such homology, some sequences have been deleted, modified, substituted or added. Obviously, it is included in the scope of the present invention.
  • the nadB gene encoding the aspartic acid oxidase may include a polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30.
  • the sequence of the gene nadB can be obtained from the genome sequence of Escherichia coli (GI: 89109380) disclosed in the literature, and from databases such as NCBI and DDBJ.
  • the nadB gene may be a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18, or may have a sequence having at least 80% homology thereto, specifically 90% or more. However, it is not limited thereto.
  • quinolinic acid synthase refers to an enzyme having the activity of synthesizing quinoline acid from iminosuccinic acid.
  • the quinoline synthase may be derived from a microorganism of the genus Escherichia, and specifically has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, and has an amino acid sequence of at least 80%, specifically 90% or more, substantially quinoline acid synthase.
  • Any protein having an activity of an agent is included without limitation. If the sequence having such homology is an amino acid sequence having a biological activity substantially the same as or corresponding to that of the protein of SEQ ID NO: 31, the case where some sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added is also included in the scope of the present invention. Is self-explanatory.
  • the nadA gene encoding the quinoline acid synthase may include a polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31.
  • the sequence of the gene nadA can be obtained from genomic sequences of Escherichia coli (GI: 89107601) published in the literature or from databases such as NCBI and DDBJ.
  • the nadA gene encoding the quinoline synthase may be a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21, or may have a sequence having a homology of 80% or more, specifically 90% or more. However, it is not limited thereto.
  • the term "increase in activity” means that the activity of the mentioned protein is 'enhanced' relative to the intrinsic activity. Specifically, an increase in the number of copies of the gene encoding the mentioned protein, modification of the expression control sequence to increase the expression of each gene, modification of each said gene sequence on the chromosome to enhance the activity of each protein, promoter of the gene May be performed by a replacement with a stronger promoter than the intrinsic promoter or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the increase in the activity of the aspartic acid oxidase or quinoline acid synthase may be by transformation with a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding the enzymes.
  • transformation refers to introducing a gene into a host cell so that it can be expressed in the host cell.
  • Transformed genes are included without limitation, as long as they can be expressed in the host cell, either inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • the gene may be introduced in any form as long as it can be expressed by being introduced into a host cell.
  • the gene may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a polynucleotide construct containing all the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette typically includes a promoter, transcription termination signal, ribosomal binding site, and translation termination signal operably linked to the gene.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the gene may be introduced into the host cell in the form of a polynucleotide structure itself or operably linked to a sequence required for expression in the host cell.
  • the recombinant vector may be a known expression vector such as a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, as a means for expressing a protein by introducing DNA into a host cell.
  • the vector can be easily prepared by those skilled in the art according to any known method using DNA recombination technology, but is not limited thereto.
  • the increased activity of the enzymes may be by replacing a promoter operably linked to a gene with an enhanced promoter.
  • a promoter operably linked to a gene with an enhanced promoter When replacing an nadA and operably linked promoter in embodiments of the present invention in the pCJ1 (Republic of Korea Patent Registration No. 10-0620092) more potent promoter instead pCysK, but confirm that a significant increase quinoline acid production (Table 8) It is not limited to this.
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of culturing the recombinant microorganism producing the quinoline acid; And recovering quinoline acid from the culture.
  • the microorganism producing the quinoline acid is as described above.
  • the culture may be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. Those skilled in the art can easily adjust the medium and culture conditions according to the microorganism selected. Culture methods may include, but are not limited to, batch, continuous, fed-batch, or combination cultures thereof.
  • the medium may comprise various carbon sources, nitrogen sources and trace element components.
  • the carbon source include glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, carbohydrates such as cellulose, soybean oil, sunflower oil, castor oil, fats such as coconut oil, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, glycerol and Alcohols such as ethanol, organic acids such as acetic acid, or combinations thereof, and specifically, may be performed using glucose as a carbon source.
  • the nitrogen source may be organic nitrogen sources and urea such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor (CSL), and soybean wheat, inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate, or Combinations thereof.
  • organic nitrogen sources and urea such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor (CSL), and soybean wheat
  • inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate, or Combinations thereof.
  • the medium may comprise, as a source of phosphorus, metal salts such as, for example, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and the corresponding sodium-containing salts, magnesium sulfate or iron sulfate.
  • metal salts such as, for example, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and the corresponding sodium-containing salts, magnesium sulfate or iron sulfate.
  • amino acids, vitamins, appropriate precursors, and the like may be included in the medium.
  • the medium or individual components may be added batchwise or continuously to the culture, the examples are illustrative only and not limited thereto.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the microbial culture in a suitable manner to adjust the pH of the culture.
  • anti-foaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used during the culture to suppress bubble generation.
  • oxygen or an oxygen-containing gas eg, air
  • the temperature of the culture may be usually 20 °C to 45 °C, for example 25 °C to 40 °C.
  • the incubation period can last until the desired amount of quinoline acid is obtained, for example 10 to 160 hours.
  • the method for recovering quinoline acid from the culture is to collect or recover the quinoline acid produced from the culture broth using a suitable method known in the art according to a culture method, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method. Can be.
  • Microorganisms in which the activity of the protein of SEQ ID NO: 1 is reduced or eliminated according to one aspect may be used for quinoline acid production.
  • the nadC gene of the quinoline acid degradation pathway was obtained by PCR using the chromosomal DNA of E. coli K12 W3110 as a template. Sequence to obtain: ( "89106990 GI” NCBI registration number), and amplifies the downstream (downstream) part of the nadC gene on the basis of the nadC nucleotide sequence 11 base sequence information of nadC gene from a gene bank (NIH GenBank) of the National Institutes of Health No.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of E. coli K12 W3110 as a template and oligonucleotides of SEQ ID NOs: 12, 13, 16, and 17 as primers to amplify the upstream and downstream portions of the nadC gene of 0.5 kb and 0.3 kb, respectively.
  • the plasmid vector pLoxpCat2 vector containing the loxpCm (Genbank Accession No.
  • oligonucleotides of SEQ ID NOS: 14 and 15 to the nucleotide as a primer to perform PCR nadC gene and homologous sequences in both terminals of the 1.0kb LoxpCm gene was amplified.
  • the polymerase was PfuUltra TM DNA polymerase (Stratagene, USA), and PCR was repeated 30 times in a cycle consisting of 30 seconds denaturation at 96 ° C., 30 seconds annealing at 53 ° C., and 1 minute elongation at 72 ° C. Was performed.
  • PCR was performed using the nadC -upstream fragment, nadC -downstream fragment, and loxpCm fragment obtained through the PCR reaction as a template, and PCR conditions were 60 seconds of denaturation at 96 ° C., 60 seconds of denaturation at 50 ° C., and 72 10 repetitions of the cycle consisting of 1 minute elongation at ° C. and 20 repetitions of the cycle after addition of the primers of SEQ ID NOs: 12 and 17.
  • an nadC deletion cassette containing 1.8 kb of nadC gene upstream- loxpCm -downstream was obtained.
  • the produced nadC deletion cassette was transformed by electroporation on Escherichia coli K12 W3110 containing a lambda red recombinase expression vector pKD46, and a LB (Luria-Bertani) plate containing chloramphenicol, a selection marker, Strains on tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 10 g / L, and agar 1.5%) were incubated overnight at 37 ° C., and strains showing resistance to chloramphenicol were selected.
  • PCR was carried out under the same conditions using the primers of SEQ ID NOs: 13 and 16 using the selected strains as templates, and the gene size was 1.6 kb for wild strains and 1.3 for nadC- removing strains on 1.0% agarose gel. Deletion of the nadC gene was confirmed by confirming that it was kb. This was named W3110- ⁇ nadC .
  • nadC gene was deleted based on the K12 MG1655 strain in the same manner as above, and named MG1655- ⁇ nadC .
  • the nucleotide sequence of the kefA gene of SEQ ID NO: 10 (NCBI accession number "GI :: 89107872") from the National Institutes of Health Gene Bank (NIH GenBank), based on SEQ ID NO: 2 and amplifying a downstream portion of the kefA gene; and A primer of SEQ ID NO: 3, a primer of SEQ ID NOs: 4 and 5 upstream and downstream of kefA and amplification of FRT-KM , and a primer of SEQ ID NOs: 6 and 7, amplifying upstream part were synthesized.
  • the chromosomal DNA of Escherichia coli W3110 was used as a template, and PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 2, 3, 6, and 7 to amplify upstream and downstream kefA genes of 0.8 Kb and 0.6 Kb, respectively.
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 2, 3, 6, and 7 to amplify upstream and downstream kefA genes of 0.8 Kb and 0.6 Kb, respectively.
  • the pKD4 vector containing a FRT-Km as the template oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 and 5 and the nucleotide primers to perform the PCR amplification was the FRT-Km gene having the kefA homologous sequences at both terminals of 1.4Kb.
  • PfuUltra TM DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase, and PCR was performed in 30 cycles consisting of 30 seconds of denaturation at 96 ° C, 30 seconds of annealing at 53 ° C, and 2 minutes of elongation at 72 ° C.
  • the prepared kefA removal cassette was transformed by electroporation on E. coli W3110- ⁇ NadC containing a lambda red recombinase expression vector pKD46 and plated Luria-Bertani (LB) containing kanamycin, the selection marker. After spreading on a medium (tryptone 10g / L, yeast extract 5g / L, NaCl 10g / L, and agar 1.5%) and incubated overnight at 37 °C, strains showing resistance to kanamycin were selected.
  • a medium tryptone 10g / L, yeast extract 5g / L, NaCl 10g / L, and agar 1.5
  • PCR was performed under the same conditions using the primers of SEQ ID NOs: 8 and 9 using the selected strain as a direct template, followed by removal of 4.2 kb and kefA- deleting strains for wild strains on 1.0% agarose gel. In the case of confirming that the 1.5kb deletion of the kefA gene was confirmed.
  • the resulting strain was named W3110- ⁇ nadC ⁇ kefA .
  • MG1655- ⁇ nadC ⁇ kefA was deleted from the MG1655- ⁇ nadC strain by the same method using the prepared kefA removal cassette, which was named MG1655- ⁇ nadC ⁇ kefA .
  • the nadB gene encoding wild-type L-aspartic acid oxidase derived from E. coli was cloned into the expression vector.
  • the chromosome of E. coli K12 W3110 strain ATCC No 23257 was used.
  • the gene sequence was used as the nucleotide sequence of the gene of SEQ ID NO: 18 (NCBI accession number "GI: 89109380") from the National Institutes of Health (NIH GenBank).
  • the ORF portion of the nadB gene was amplified and primers of SEQ ID NOs: 19 and 20 having restriction enzyme recognition sites NdeI and BamHI were synthesized.
  • PCR was performed using the primers of the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 19 and 20 as a template of the chromosomal DNA of E. coli K12 W3110 .
  • PfuUltra TM DNA polymerase (Stratagene, USA) was used as a polymerase, and PCR was performed in 30 cycles consisting of 30 seconds denaturation at 96 ° C., 30 seconds annealing at 50 ° C., and 2 minutes elongation at 72 ° C. It was.
  • an amplified gene of about 1.9 kb containing the nadB ORF gene and the recognition sites of restriction enzymes NdeI and BamHI was obtained.
  • nadB gene obtained through the PCR was recovered through agarose gel elution, and then treated with restriction enzymes NdeI and BamHI. After ligation to the pProLar (CloneTech, USA) vector treated with restriction enzymes NdeI and BamHI, L-aspartic acid oxidase was expressed from the nadB gene linked to the pPro promoter.
  • the vector produced by the above method was named pPro-nadB vector.
  • nadA encoding quinoline acid synthase was obtained by PCR using chromosomal DNA of E. coli W3110 as a template.
  • the nucleotide sequence information of the nadA gene of SEQ ID NO: 21 was utilized from the National Institute of Health Gene Bank (NIH GenBank). Based on this, the ATG portion of the nadA gene and the ORF portion containing TAA were amplified and primers of SEQ ID NOs: 22 and 23 having recognition sites of restriction enzymes ApaI and NotI were synthesized.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of Escherichia coli W3110 as a template and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 22 and 23 as primers.
  • the polymerase uses PfuUltra TM DNA polymerase (Stratagene, USA), and PCR uses a 30 cycle cycle consisting of 30 seconds denaturation at 96 ° C., 30 seconds annealing at 50 ° C., and 2 minutes elongation at 72 ° C. It was performed repeatedly. As a result, an amplified gene of about 1.0 kb containing the recognition sites of the nadA gene and restriction enzymes ApaI and NotI was obtained.
  • the cysK promoter was obtained by PCR using the chromosomal DNA of Escherichia coli W3110 as a template. Obtain sequence information of a promoter located within 0.3 kb upstream of the cysK gene from the National Institutes of Health (NIH GenBank) (SEQ ID NO: 24), based on which the cysK promoter and the amplified nadA gene were conjugated. The primers of SEQ ID NOs: 25 and 26 having the recognition sites of restriction enzymes BamHI and ApaI were synthesized.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of Escherichia coli W3110 as a template and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 25 and 26 as primers.
  • PfuUltra TM DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase, and PCR conditions were repeated 30 times with a cycle consisting of 30 seconds denaturation at 96 ° C, 30 seconds annealing at 50 ° C, and 1 minute elongation at 72 ° C.
  • an amplified gene of about 0.3 kb containing the cysK promoter and restriction enzymes BamHI and ApaI was obtained.
  • nadA gene obtained through the PCR was treated with restriction enzymes ApaI and NotI, and the amplified cysK promoter fragments were treated with ApaI and BamHI.
  • Restriction enzyme-treated nadA and cysK promoter fragments were cloned through conjugation to the pPro- nadB vector obtained in 1-2 above treated with restriction enzymes NotI and BamHI to finally regulate expression control by the constitutive promoter pPro promoter.
  • a 5.9Kb pPro-nadB_pCysK-nadA cloned with the nadA gene that is regulated by the nadB gene and the cysK gene promoter Vectors were produced.
  • the pCJ1 promoter having higher activity at K12 W3110 was used instead of the pCysK promoter.
  • the plasmid containing the pCJ1 promoter was obtained by PCR using DNA as a template to obtain the pCJ1 promoter.
  • primers of SEQ ID NOs: 27 and 28 having recognition sites of restriction enzymes BamHI and ApaI were synthesized.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of Escherichia coli W3110 as a template and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 27 and 28 as primers.
  • PfuUltra TM DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase, and PCR conditions were repeated 30 cycles consisting of 30 seconds denaturation at 96 ° C., 30 seconds annealing at 50 ° C., and 1 minute elongation at 72 ° C. It was.
  • pCJ1 An amplified gene of about 0.3 kb containing promoter and restriction enzymes BamHI and ApaI was obtained.
  • the nadA gene obtained through the PCR was treated with restriction enzymes ApaI and NotI, and the amplified pCJ1 promoter fragments were treated with ApaI and BamHI.
  • NadA treated with the restriction enzyme and The pCJ1 promoter fragment was cloned through conjugation to the pPro-nadB vector obtained in the above 1-2 treated with restriction enzymes NotI and BamHI, and finally to the nadB gene and pCJ1 gene promoter, which are controlled by the constitutive promoter pPro promoter. 5.9Kb of pPro-nadB_pCJ1-nadA cloned with nadA gene regulated by Recombinant vectors were constructed.
  • nadB and nadA -enhanced plasmids were introduced into the W3110- ⁇ nadC and MG1655- ⁇ nadC strains, respectively.
  • the transduction method was transformed using CaCl 2 method, and plated with LB-Km (yeast extract 10g / L, NaCl 5g / L, tryptone 10g / L, agar 1.5%, kanamycin 50ug / L) in a 37 ° C. incubator. The plate was incubated overnight.
  • LB-Km yeast extract 10g / L, NaCl 5g / L, tryptone 10g / L, agar 1.5%, kanamycin 50ug / L
  • Quinoline acid in the culture was analyzed by HPLC, and the results are shown in Table 2 below. It shows the quinoline acid production capacity of the strain. As can be seen in Table 2, the difference in quinoline acid production was confirmed according to the degree of expression of the quinoline acid-based strain and nadBA . In particular, when nadA gene expression was enhanced with pCJ1 , whose expression intensity was higher than that of the pCysK promoter, the production of quinoline acid in W3110- ⁇ nadC and MG1655- ⁇ nadC of E. coli K12 wild type was significantly increased.
  • the strains W3110- ⁇ nadC ⁇ kefA and MG1655- ⁇ nadC ⁇ kefA prepared in 1-4 were transformed into pPro-nadB_pCJ1-nadA plasmids using CaCl 2 method, respectively.
  • Each of the transformed strains was plated in LB-Km (yeast extract 10g / L, NaCl 5g / L, tryptone 10g / L, agar 1.5%, kanamycin 50ug / L) in a 37 ° C. incubator and incubated overnight. . Thereafter, single colonies obtained with kanamycin-resistant colonies were inoculated with 1 platinum in 25 mL of quinoline acid titer (Table 1) and incubated at 33 ° C. at 250 rpm for 24 to 72 hours.
  • kefA attenuated plasmid was prepared. Gene sequence was used as the base sequence of the gene of SEQ ID NO: 10 (NCBI accession number "GI :: 89107872") of the National Institutes of Health (NIH GenBank). The kefA initiation codon was mutated from ATG to TTG to amplify the ORF portion of the kefA gene, and the primers of SEQ ID NOs: 32 and 33 with restriction enzymes blunt and BamHI were synthesized. In addition, amplifying the auto promoter region of the kefA gene, and synthesized the primers of SEQ ID NO: 34 and 35 having restriction enzyme recognition site SacI and blunt.
  • PCR was performed using chromosomal DNA of E. coli K12 W3110 strain (ATCC No. 23257) as a template and oligonucleotides of SEQ ID NOs: 32 and 33 as primers.
  • PfuUltra TM DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase, and PCR was performed in 30 cycles consisting of 30 seconds denaturation at 96 ° C., 30 seconds annealing at 50 ° C., and 30 seconds elongation at 72 ° C.
  • an amplified gene of about 0.15 kb containing a kefA ORF site and a restriction site of restriction enzyme BamHI was obtained.
  • PCR was performed using primers using oligonucleotides of SEQ ID NOs: 34 and 35 using K12 W3110 chromosomal DNA as a template.
  • PfuUltra TM DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase, and PCR was performed in 30 cycles consisting of 30 seconds denaturation at 96 ° C., 30 seconds annealing at 50 ° C., and 30 seconds elongation at 72 ° C.
  • an amplified pKefA promoter of about 0.15 kb containing the kefA auto promoter site and the recognition site of restriction enzyme SacII was obtained.
  • the kefA ORF site and pKefA promoter obtained through the PCR were recovered through agarose gel elution, and then treated with BamHI and SacI restriction enzymes, respectively. It was then ligation to the pSG76C (J. Bacteriol. 179 (13), 4426-4428 (1997), NCBI genebank Y09892) vector treated with restriction enzymes BamHI and SacI.
  • the pSG76C_kefA * (ATG-> TTG) vector prepared in (1) was transformed by electroporation on E. coli W3110- ⁇ NadC , and LB (Luria-Bertani) plate medium containing chloramphenicol as a selection marker (tryptone 10g / L, yeast extract 5g / L, NaCl 10g / L, and agar 1.5%) and incubated overnight at 37 ° C, strains showing resistance to chloramphenicol were selected.
  • PCR was carried out under the same conditions using the primers of SEQ ID NOs: 33 and 34 using the selected strain as a template, and then a 0.30 kb PCR product was obtained on a 1.0% agarose gel, followed by initiation of kefA through sequencing. Strains with codon substitutions from ATG to TTG were finally selected. This was named W3110-DnadC_kefA * (ATG-> TTG) .
  • MG1655- ⁇ nadC was transformed by the same method using the pSG76C_kefA * (ATG-> TTG) vector to confirm the initiation codon substitution of kefA , which was named MG1655- ⁇ nadC_kefA * (ATG-> TTG) .
  • the pPro-nadB_pCJ1-nadA plasmid introduction strain to W3110 ⁇ nadC ⁇ kefA, in which the engineered nadC was deleted and nadBA was enhanced, was deposited to the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM) on November 07, 2013 under the Budapest Treaty and granted accession number KCCM11470P. received.
  • KCCM Korea Microorganism Conservation Center
  • a chromosome of E. coli K12 W3110 strain was used as a template to produce a vector capable of overexpressing the kefA gene derived from E. coli, and the gene sequence of the National Bank of Health (NIH GenBank)
  • the base sequence of the gene of SEQ ID NO: 10 (NCBI accession number "GI :: 89107872") was utilized.
  • the ORF portion of the kefA gene was amplified and primers of SEQ ID NOs: 36 and 37 with restriction enzyme recognition sites EcoRV and HindIII were synthesized.
  • PCR was performed using oligonucleotides of SEQ ID NOs: 36 and 37 as primers using the chromosomal DNA of E. coli K12 W3110.
  • PfuUltra TM DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase, and PCR was performed in 30 cycles consisting of 30 seconds denaturation at 96 ° C, 30 seconds annealing at 50 ° C, and 2 minutes elongation at 72 ° C.
  • an amplified gene of about 3.3 kb containing the kefA ORF gene and the recognition sites of restriction enzymes EcoRV and HindIII was obtained.
  • the kefA gene obtained through the PCR was recovered through agarose gel elution, and then treated with restriction enzymes EcoRV and HindIII. It was then ligation to the pCL1920_pRhtB vector treated with restriction enzymes EcoRV and HindIII. Through this, it was expressed from the kefA gene linked to the pRhtB promoter.
  • the vector produced by the above method was named pCL_pRhtB-kefA vector.
  • KefA membrane protein is involved in the intake of quinoline acid into the cells.
  • the removal of kefA may lower the susceptibility to quinoline acid of the quinoline acid-producing strain, and also increase the production of quinoline acid.

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Abstract

본 발명은 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물, 구체적으로 서열번호 1의 단백질 활성이 감소 또는 제거된 퀴놀린산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퀴놀린산을 생산하는 방법에 대한 것이다.

Description

퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 퀴놀린산의 생산 방법
본 발명은 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퀴놀린산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
퀴놀린산 (quinolinic acid, 2,3-피리딘-디카복실산)은 의약 물질, 농업용 화학 물질, 염색 물질 등 매우 다양한 분야에서 사용되는 화학 물질의 전구체로 이용된다.
상기 퀴놀린산은 화학적 또는 생물학적 합성 방법을 통하여 제조될 수 있다. 화학적으로는 보통 퀴놀린(quinoline)의 산화에 의하여 제조된다. 생물학적으로는, 퀴놀린산 포스포리보실트란스퍼라제 (NadC)의 활성이 제거된 대장균에 두 가지 효소, L-아스파르트산 산화효소 (NadB), 퀴놀린산 신타아제 (NadA)의 발현을 강화시킨 대장균 균주를 이용하여 퀴놀린산을 생산하는 방법이 개시되어 있다.
한편, KefA는 대장균 등의 미생물에 존재하는 기계수용채널 (mechanosensitive (MS) channel)에 속하는 막 단백질로, 비특이적으로 세포막을 통해 이온과 용질을 세포 내로 유입시키는 기능이 알려져 있다. 대장균에서 KefA는 KefB 및 KefC와 함께 K+ 유출 시스템 (K+ efflux system)을 구성하며, 특히 KefA가 삼투압 충격(osmotic down shock)시 K+ 유출에 중요한 역할을 하는 것이 알려졌다 (J. Bacteriol. 169, 3743-3749, 1987). 또한 대장균에서 KefA의 유전자를 돌연변이시킬 경우 세포가 야생형보다 K+ 농도 및 압력에 대해 더욱 감수성(sensitive)을 갖는 것이 보고되었다 (J.membrane Biol. 150, 143-152). 그러나 상술한 바와 같이, 대부분의 연구들은 KefA의 세포 내의 칼륨 이온의 조절과의 연관성에 대해 주로 초점을 두고 있을 뿐, KefA와 퀴놀린산의 생산과의 연관성에 대해서는 어떠한 연구 보고도 없었다.
이에 본 발명자들은 기계수용채널 단백질의 활성 변형과 퀴놀린산의 고농도 생산과의 연관성에 대한 연구를 수행하여, 퀴놀린산을 고수율로 생산하는 방법을 완성하였다.
일 양태는 서열번호 1의 단백질의 활성이 감소되거나 제거된, 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
다른 양태는 상기 미생물을 이용하여 퀴놀린산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양태는 KefA의 활성이 감소되거나 제거된, 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "KefA"는 기계수용채널 (mechanosensitive channel)에 속하는 막 단백질로, "MscK"라고도 호칭된다. 상기 KefA는 칼륨 의존적이며, 세포막을 통하여 비특이적으로 이온과 용질을 세포 내로 유입하는 활성을 갖는 것일 수 있다. 특히 KefA는 칼륨 유출 단백질(potassium efflux protein) 중 하나로, 예를 들면 박테리아가 삼투압 충격을 받을 경우 칼륨 유출을 통해 조절할 수 있다.
상기 KefA는 에스케리키아 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상인 아미노산 서열로서 실질적으로 KefA의 활성을 갖는 단백질이라면 제한없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨 역시 자명하다.
또한 상기 kefA 유전자 서열은 상기 서열번호 1 또는 이와 상동성이 80%이상인 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 KefA 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 kefA의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개된 대장균의 게놈 서열 (GI:89107872) 또는 미국생물공학정보센터 (NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ)와 같은 데이터 베이스로부터 얻을 수 있으며, 예를 들면 서열번호 10의 염기서열을 가지며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상인 염기서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 사용된 용어, "상동성"은 상기 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성은 주어진 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 발명에서는 주어진 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]이나 Pearson에 의한 FASTA [참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다[참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov].
본 명세서에서 사용된 용어 "퀴놀린산(quinolinic acid)"은 퀴놀린산(quinolinate) 또는 이의 염을 포함한다. 상기 "염"은 퀴놀린산의 음이온과 염기의 양이온에 의해 만들어지는 화합물로, 예를 들면 퀴놀린산 소듐염, 퀴놀린산 포타슘염, 퀴놀린산 암모늄염, 퀴놀린산 칼슘염, 퀴놀린산 마그네슘염 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "재조합 미생물(recombinant microorganism)"은 자연적 또는 인공적으로 돌연변이화된 미생물이거나 유전적으로 조작된 미생물일 수 있다. 유전공학에 의해 제조된 미생물, 예를 들면 유전공학 방법에 의해 미생물 내로 외인성(exogenous) 핵산이 도입되거나, 미생물의 내인성(endogenous)의 유전자의 서열 또는 위치가 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 "퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물"은 배지 중의 탄소원으로부터 퀴놀린산을 생산하여 축적시킬 수 있는 미생물로서, KefA 활성의 감소 또는 제거에 의해 변형 전보다 높은 생산성으로 퀴놀린산을 생산할 수 있다. 상기 재조합 미생물은 퀴놀린산을 생산하여 축적시킬 수 있는 미생물이면 제한되지 않으나, 에스케리키아(Escherichia) 속, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로 상기 미생물은 에스케리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 효소 또는 폴리펩티드의 "활성의 제거"는 미생물에서 언급된 단백질이 전혀 발현되지 않거나, 또는 발현되더라도 전혀 활성을 가지지 않는 것을 의미한다. 또한 용어 "활성의 감소"는 언급된 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것을 의미한다. 용어 "내재적 활성"이란 미생물이 천연의 상태, 즉 미생물이 본래 가지고 있었던, 유전자 변형을 거치지 않은 단백질의 활성을 의미한다.
구체적인 예로, 상기 KefA의 활성의 감소 또는 제거는 상기 KefA 단백질을 암호화하는 1) 유전자의 제거 또는 결실, 2) 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형 3) 상기 KefA의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 유전자 서열의 변형 또는 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로의 교체 방법에 의해 수행되거나, 이들 방법들의 하나 이상의 조합에 의해 수행될 수 있다. 그러나 이에 제한되지는 않는다.
더욱 구체적으로는, 상기 KefA의 활성의 감소 또는 제거는 상기 KefA 막 단백질을 암호화하는 유전자의 제거 또는 결실에 의한 것일 수 있다. 상기 "유전자의 제거 또는 결실"은 유전자가 발현되지 않거나 발현량이 감소되거나 발현되어도 효소 활성을 나타내지 않거나 또는 활성이 감소되도록, 유전자의 일부 또는 전부가, 또는 그 프로모터, 그 터미네이터 영역 등의 조절인자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것을 말한다. 예를 들어, 상기 유전자의 제거 또는 결실은 상동재조합과 같은 유전자 조작, 돌연변이 유발, 분자 진화를 통해 달성될 수 있다. 세포가 복수개의 같은 유전자를 포함하거나 2개 이상의 다른 폴리펩티드 동종 상동유전자(paralog)를 포함하는 경우, 하나 또는 그 이상의 유전자가 제거 또는 결실될 수 있다.
본 발명에서, 상기 재조합 미생물은 추가적으로 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제(quinolinate phosphoribosyltransferase)(NadC)의 활성의 감소 또는 제거된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제"는 퀴놀린산을 니코틴산 모노뉴클레오티드로 전환시키는 활성을 갖는 것을 의미한다. 상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성을 갖는 유전자를 제거하거나 또는 그의 발현을 약화시킬 경우 세포 내에 퀴놀린산의 생산을 증가시킬 수 있다.
상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제는 에스케리키아 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상인 아미노산 서열로서 실질적으로 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성을 갖는 단백질이라면 제한없이 포함하며, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 29의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제를 코딩하는 nadC 유전자의 서열은 서열번호 29의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 nadC 유전자 서열은 문헌에 공개된 대장균의 게놈 서열 (GI:89106990) 또는 NCBI, DDBJ와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 또한 상기 nadC 유전자는 서열번호 11의 염기서열 또는 이와 80%, 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지는 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성을 감소 또는 제거시킴으로써 세포 내에 퀴놀린산의 축적을 증가시킬 수 있다.
상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제의 '활성의 감소 또는 제거'는 상기 기술한 KefA의 '활성의 감소 또는 제거'와 동일한 의미인 것은 본 발명의 당업자에게 자명한 내용이다.
또한 상기 재조합 미생물은 추가적으로 아스파라긴산 산화 효소(L-aspartate oxidase) (NadB) 및 퀴놀린산 신타아제(Quinolinate synthase)(NadA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성이 추가로 증가된 것일 수 있다. 이의 결과로, 세포 내에 퀴놀린산의 전구 물질인 α-이미노숙시네이트의 축적과 α-이미노숙시네이트에서 퀴놀린산으로의 생합성이 증가되어 퀴놀린산의 생산이 증가될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아스파라긴산 산화효소"는 L-아스파르트산을 산화시키는 활성을 가지는 효소를 의미하여, 'L-아스파르트산 산화효소'라 명명될 수 있다.
따라서, 아스파라긴산 산화 효소의 활성이 강화되면, 세포 내에 퀴놀린산의 전구 물질인 이미노숙신산의 축적이 증가되고, 이에 의해 퀴놀린산의 생산이 증가될 수 있다.
상기 아스파라긴산 산화효소는 에스케리키아 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상인 아미노산 서열로서 실질적으로 아스파라긴산 산화 효소의 활성을 갖는 단백질이라면 제한 없이 포함하며, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 30의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
상기 아스파라긴산 산화효소를 암호화하는 nadB 유전자는 서열번호 30의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 유전자 nadB의 서열은 문헌에 공개된 대장균 (Escherichia coli)의 게놈 서열 (GI:89109380)이나 NCBI, DDBJ와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 상기 nadB 유전자는 서열번호 18의 염기서열 서열일 수 있고, 또는 이와 상동성이 80%이상, 구체적으로는 90% 이상인 서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "퀴놀린산 신타아제"는 이미노숙신산으로부터 퀴놀린산을 합성하는 활성을 가지는 효소를 의미한다.
상기 아스파라긴산 산화효소의 활성으로 인해 생성되는 α-이미노숙시네이트로부터, 퀴놀린산 신타아제의 촉매 작용을 통해 퀴놀린산을 합성하는 속도를 향상시켜, 더욱 높은 생산성으로 퀴놀린산을 생산할 수 있다. 따라서, 퀴놀린산 신타아제를 코딩하는 유전자의 발현이나 이 효소의 활성을 강화할 경우, 세포 내에 퀴놀린산의 생산을 증가시킬 수 있다.
상기 퀴놀린산 신타아제는 에스케리키아 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 31의 아미노산 서열을 가지며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상인 아미노산 서열로서 실질적으로 퀴놀린산 신타아제의 활성을 갖는 단백질이라면 제한 없이 포함한다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 31의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
상기 퀴놀린산 신타아제를 암호화하는 nadA 유전자는 상기 서열번호 31의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 유전자 nadA의 서열은 문헌에 공개된 대장균의 게놈 서열 (GI:89107601)이나 NCBI 및 DDBJ와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 상기 퀴놀린산 신타아제를 암호화하는 nadA 유전자는 서열번호 21의 염기서열일 수 있고, 또는 이와 상동성이 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상인 서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어 "활성의 증가"는 언급된 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 '강화'된 것을 의미한다. 구체적으로는 언급된 단백질을 암호화하는 유전자의 카피 수 증가, 상기 각 유전자의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 상기 각 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 상기 각 유전자 서열의 변형, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 강한 프로모터로의 교체 또는 이의 조합에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 아스파라긴산 산화효소 또는 퀴놀린산 신타아제의 활성의 증가는 상기 효소들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하는 것에 의할 수 있다. 용어 "형질전환"이란 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함된다. 또한, 상기 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터, 전사종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다. 상기 재조합 벡터는 숙주세포에 DNA를 도입하여 단백질을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 발현 벡터를 사용할 수 있다. 상기 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다..
더욱 구체적으로, 상기 효소들의 활성 증가는 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 강화된 프로모터로 교체하는 것에 의할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 nadA와 작동 가능하게 연결된 프로모터를 pCysK 대신 보다 강한 프로모터인 pCJ1 (대한민국 특허등록번호 10-0620092)로 교체하였을 때, 퀴놀린산 생산이 크게 증가하는 것을 확인하였으나 (표 8), 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태는 상기 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배양물로부터 퀴놀린산을 회수하는 단계를 포함하는, 퀴놀린산을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 퀴놀린산을 생산하는 미생물에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
구체적인 예로, 상기 탄소원은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다.
상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 상기 예는 예시일 뿐 이에 한정되지 않는다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 예를 들면 25℃ 내지 40℃일 수 있다.　배양기간은 원하는 퀴놀린산의 생성량이 얻어질 때까지 지속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간일 수 있다.
상기 배양물로부터 퀴놀린산을 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액물로부터 생산된 퀴놀린산을 수집 또는 회수할 수 있다.
일 양태에 따른 서열번호 1의 단백질의 활성이 감소 또는 제거된 미생물은 퀴놀린산 생산을 위해 이용될 수 있다.
다른 양태에 따른 퀴놀린산을 생산하는 방법에 의하면, 퀴놀린산을 효율적으로 생산할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 퀴놀린산을 생산하는 균주 제작
1-1. 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제 제거 균주 제작
대장균 K12 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 퀴놀린산 분해경로의 nadC 유전자를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 nadC 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 "GI:89106990")를 수득하고, nadC 염기서열 11 에 근거하여 nadC 유전자의 하류(downstream) 부분을 증폭하는 서열번호 12 및 13의 프라이머, nadC의 상류(upstream) 및 하류 부분과 loxpCm을 증폭하는 서열번호 14 및 15의 프라이머, 상류 부분을 증폭하는 서열번호 16 및 17의 프라이머를 합성하였다.
대장균 K12 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 12와 13 및 16과 17의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여 각각 0.5 kb 및 0.3 kb의 nadC 유전자의 상류 부분 및 하류 부분을 증폭하였다. 또한, loxpCm을 함유하고 있는 플라스미드 벡터 pLoxpCat2 벡터(Genbank Accession No. AJ401047)를 주형으로 하여 서열번호 14 및 15의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여 1.0kb의 양말단에 nadC 유전자와 상동 서열을 갖는 loxpCm 유전자를 증폭하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제(Stratagene사, 미국)를 사용하였고, PCR은 96℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링, 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다.
이후 상기의 PCR 반응을 통하여 얻어진 nadC-상류 절편, nadC-하류 절편, loxpCm 절편을 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 96℃에서의 60초의 변성, 50℃에서의 60초의 변성, 및 72℃에서의 1분의 신장으로 구성된 사이클의 10회 반복 및 서열번호 12 및 17의 프라이머 첨가 후 사이클의 20회 반복이었다. 그 결과 1.8kb의 nadC 유전자 상류-loxpCm-하류를 함유한 nadC 결손 카세트를 획득하였다.
제작된 nadC 결손 카세트를 람다 레드 재조합효소(lambda red recombinase) 발현 벡터인 pKD46을 함유한 대장균 K12 W3110상에 전기천공을 통하여 형질전환시키고 선별마커인 클로람페니콜이 함유된 LB(Luria-Bertani) 평판배지(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 10g/L, 및 아가 1.5%) 상에 도말하여 37℃에서 밤새 배양한 후, 클로람페니콜에 대한 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 13 및 16의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR을 수행한 후, 1.0% 아가로오스 겔 상에서 유전자의 크기가 야생주의 경우 1.6kb, nadC 제거 균주의 경우 1.3kb인 것을 확인함으로써 nadC 유전자의 결실을 확인하였다. 이를 W3110-ΔnadC 라 명명하였다.
또한 상기와 동일한 방법으로 K12 MG1655 균주를 기반으로 nadC 유전자를 결실하였고, 이를 MG1655-ΔnadC 라 명명하였다.
1-2. KefA 제거 균주 제작
미국 국립보건원의 유전자 은행 (NIH GenBank)으로부터 서열번호 10의 kefA 유전자의 염기서열(NCBI 등록번호 "GI::89107872")을 수득하고, 이에 근거하여 kefA 유전자의 하류 부분을 증폭하는 서열번호 2 및 3의 프라이머, kefA의 상류 및 하류부분과 FRT-KM을 증폭하는 서열번호 4 및 5의 프라이머, 상류 부분을 증폭하는 서열번호 6 및 7의 프라이머를 합성하였다.
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 2와 3 및 6과 7의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 각각 0.8Kb 및 0.6 Kb의 kefA 유전자 상류 부분 및 하류부분을 증폭하였다. 또한, FRT-Km을 함유하는 pKD4 벡터를 주형으로 하여 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여 1.4Kb의 양말단에 kefA 와 상동서열을 갖는 FRT-Km 유전자를 증폭하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하고, PCR은 96℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링, 및 72℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 이후 상기의 PCR 반응을 통하여 얻어진 kefA-상류 절편, kefA-하류 절편, FRT-Km 절편을 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 96℃에서의 60초의 변성, 50℃에서의 60초의 변성, 및 72℃에서의 2분의 신장으로 구성된 사이클의 10회 반복 및 서열번호 6 및 7의 프라이머 첨가 후 사이클의 20회 반복이었다. 그 결과 2.6kb의 kefA 상류 - FRT-Km - kefA 하류를 함유한 kefA 제거 카세트를 획득하였다.
제작된 kefA 제거 카세트를 람다 레드 재조합효소(lambda red recombinase) 발현 벡터인 pKD46을 함유한 대장균 W3110-ΔNadC 상에 전기천공을 통하여 형질전환시키고, 선별마커인 카나마이신이 함유된 LB(Luria-Bertani) 평판배지(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 10g/L, 및 아가 1.5%) 상에 도말하여 37℃에서 밤새 배양한 후, 카나마이신에 대한 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 선별된 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 8 및 9의 프라이머를 이용하여 상기와 같은 조건으로 PCR을 수행한 후, 1.0% 아가로오스 겔 상에서 유전자의 크기가 야생 균주의 경우 4.2kb, kefA 제거 균주의 경우 1.5kb인 것을 확인함으로써 kefA 유전자의 결실을 확인하였다. 이렇게 제작된 균주를 W3110-ΔnadCΔkefA라 명명하였다.
또한, 상기 제작된 kefA 제거 카세트를 이용하여 동일한 방법으로 MG1655-ΔnadC 균주에서 kefA 유전자를 결실하고 이를 MG1655-ΔnadCΔkefA라 명명하였다.
1-3. 대장균 L-아스파라긴산 산화효소 발현용 플라스미드 제작
대장균 유래의 야생형 L-아스파라긴산 산화효소를 코딩하는 nadB 유전자를 발현 벡터에 클로닝하였다. 이를 위한 주형으로는 대장균 K12 W3110 균주(ATCC No 23257)의 염색체를 사용하였다. 유전자 서열은 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 서열번호 18의 유전자의 염기서열 (NCBI 등록번호 "GI:89109380")을 활용하였다. nadB 유전자의 ORF 부분을 증폭하고, 제한효소 인식부위 NdeI과 BamHI를 갖는 서열번호 19 및 20의 프라이머를 합성하였다.
상기 대장균 K12 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 19과 20의 올리고뉴클레오티드를 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene사, 미국)를 사용하였고, PCR은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. PCR을 통하여, nadB ORF 유전자와 제한효소 NdeI 및 BamHI의 인식부위를 함유한 약 1.9 kb의 증폭된 유전자를 수득하였다.
상기 PCR을 통하여 수득된 nadB 유전자는, 아가로즈 겔 용출(agarose gel elution)을 통하여 회수한 후, 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 처리하였다. 이후 제한효소 NdeI 및 BamHI로 처리한 pProLar (CloneTech사, 미국) 벡터에 접합(ligation)하여, pPro 프로모터에 연결된 nadB 유전자로부터 L-아스파라긴산 산화효소가 발현되도록 하였다. 상기의 방법으로 제작된 벡터를 pPro-nadB 벡터라 명명하였다.
1-4. 아스파라긴산 산화효소 및 퀴놀린산 신타아제 발현용 플라스미드 제작
(1) pPro-nadB_pCysK-nadA 벡터 제작
먼저 대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 퀴놀린산 신타제를 코딩하는 유전자 nadA를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 서열번호 21의 nadA 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 "GI:89107601")를 활용하였다. 이에 근거하여 nadA 유전자의 ATG 부분과 TAA를 함유하는 ORF부분을 증폭하고 제한효소 ApaI 및 NotI의 인식부위를 갖는 서열번호 22 및 23의 프라이머를 합성하였다.
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 22 및 23의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene사, 미국)를 사용하고, PCR은 96℃에서의 30초의 변성, 50℃에서의 30초의 어닐링, 및 72℃에서의 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 그 결과, nadA 유전자와 제한효소 ApaI과 NotI의 인식부위를 함유한 약 1.0kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.
또한 대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, cysK 프로모터를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 cysK 유전자의 상류(upstream) 0.3 kb 내에 위치한 프로모터의 염기서열 정보를 수득하고(서열번호 24), 이에 근거하여 cysK 프로모터와 상기에 증폭된 nadA 유전자를 접합시키기 위해 제한효소 BamHI과 ApaI의 인식부위를 갖는 서열번호 25 및 26의 프라이머를 합성하였다.
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서 30초의 변성, 50℃에서 30초의 어닐링, 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 그 결과, cysK 프로모터와 제한효소 BamHI과 ApaI를 함유한 약 0.3kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.
상기 PCR을 통하여 획득한 nadA 유전자를 제한효소 ApaI 및 NotI으로 처리하고, 증폭된 cysK 프로모터 절편을 ApaI 및 BamHI으로 처리하였다. 제한효소로 처리한 nadA 및 cysK 프로모터 절편을 제한효소 NotI 및 BamHI으로 처리한 상기 1-2에서 수득한 pPro-nadB 벡터에 접합을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 구성적 프로모터인 pPro 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadB 유전자 및 cysK 유전자 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadA 유전자가 클로닝된 5.9Kb의 pPro-nadB_pCysK-nadA 벡터를 제작하였다.
(2) pPro-nadB_pCJ1-nadA 벡터 제작
퀴놀린산 생합성 과정 중 가장 말단에 있는 퀴놀린산 신타제를 코딩하는 nadA 유전자의 발현을 더욱 강화하기 위하여, 상기의 pCysK 프로모터 대신 K12 W3110에서 활성이 더욱 큰 pCJ1 프로모터를 이용하였다. 한국특허공개공보 KR2006-0068505A를 근거로 pCJ1 프로모터를 포함한 플라스미드를 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, pCJ1 프로모터를 수득하였다. pCJ1 프로모터와 상기에 증폭된 nadA 유전자를 접합시키기 위해 제한효소 BamHI과 ApaI의 인식부위를 갖는 서열번호 27 및 28의 프라이머를 합성하였다.
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서의 30초의 변성, 50℃에서의 30초의 어닐링, 및 72℃에서의 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 그 결과, pCJ1 프로모터와 제한효소 BamHI과 ApaI를 함유한 약 0.3kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.
상기 PCR을 통하여 획득한 nadA 유전자를 제한효소 ApaI 및 NotI으로 처리하고, 증폭된 pCJ1 프로모터 절편을 ApaI 및 BamHI으로 처리하였다. 상기 제한효소로 처리한 nadA 및 pCJ1 프로모터 절편을 제한효소 NotI 및 BamHI으로 처리한 상기 1-2에서 수득된 pPro-nadB 벡터에 접합을 통하여 클로닝하고 최종적으로 구성적 프로모터인 pPro 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadB 유전자와 pCJ1 유전자 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadA 유전자가 클로닝된 5.9Kb의 pPro-nadB_pCJ1-nadA 재조합 벡터를 제작하였다.
실시예 2. 퀴놀린산 생산 균주의 생산능 평가
2-1. 퀴놀린산 생산균주의 생산 능력의 비교를 위한 역가 확인
퀴놀린산 생산능력을 평가하기 위해 nadB, nadA가 강화된 플라스미드를 W3110-ΔnadC, MG1655-ΔnadC 균주에 각각 도입하였다. 도입방법은 CaCl2 방법을 이용하여 형질전환 하였고, 37℃의 배양기에서 LB-Km (효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 아가 1.5%, 카나마이신 50ug/L) 평판배지에 도말하여 밤새 배양하였다. 그 후 카나마이신 내성을 갖는 수득한 단일 콜로니를 25mL의 퀴놀린산 역가배지에 1 백금이씩 접종하여 33℃에서 250 rpm 으로 24 내지 72 시간 동안 배양하였다. 하기 표 1은 퀴놀린산 생산용 배지의 조성을 나타낸다.
표 1 퀴놀린산 플라스크 역가배지 조성
조성 농도(리터당)
포도당 70 g
황산암모늄 17 g
KH2PO4 1.0 g
MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g
FeSO4ㆍ7H2O 5 mg
MnSO4ㆍ8H2O 5 mg
ZnSO4 5 mg
탄산칼슘 30 g
효모 추출물 2 g
메티오닌 0.15g
배양액 중의 퀴놀린산을 HPLC로 분석하여, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 이는 균주의 퀴놀린산 생산능을 나타낸다. 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 퀴놀린산 기반 균주 및 nadBA의 발현 정도에 따라 퀴놀린산 생산의 차이를 확인하였다. 특히 pCysK 프로모터 보다 발현 강도가 센 pCJ1으로 nadA 유전자 발현을 강화하였을 경우, 대장균 K12 야생형 기반의 W3110-ΔnadC와 MG1655-ΔnadC에서 퀴놀린산의 생산이 크게 증가하는 것을 확인하였다.
표 2
기반 균주 플라스미드 퀴놀린산(g/L)
W3110-△nadC pPro-nadB_pCysK-nadA 0.5
MG1655-△nadC 0.3
W3110-△nadC pPro-nadB_pCJ1-nadA 3.8
MG1655-△nadC 2.0
2-2. KefA 제거주 퀴놀린산 생산능 평가
kefA 제거주의 퀴놀린산 생산능을 비교하기 위하여 상기 1-4에서 제작된 W3110-ΔnadCΔkefA, MG1655-ΔnadCΔkefA 균주를 각각 pPro-nadB_pCJ1-nadA 플라스미드로 CaCl2 방법을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환된 상기 각 균주를 37℃ 의 배양기에서 LB-Km (효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 아가 1.5%, 카나마이신 50ug/L) 평판배지에 도말하여 밤새 배양하였다. 이 후 카나마이신 내성을 갖는 콜로니를 수득한 단일 콜로니를 25mL의 퀴놀린산 역가배지(표 1)에 1 백금이씩 접종하여 33℃ 에서 250 rpm 으로 24 내지 72 시간 동안 배양하였다.
배양액 중의 퀴놀린산을 HPLC에 의하여 분석하여 결과를 표 3에 나타내었다. 하기 표 3에 표시된 바와 같이 kefA 제거주에서 대조군 대비 퀴놀린산 농도가 증가하였으며, 특히 야생형 균주 기반에서 kefA 결손에 의한 퀴놀린산 농도 증가가 15% 이상 수준으로 확인되었다.
표 3
균주 플라스미드 퀴놀린산(g/L)
W3110-ΔnadC pPro-nadB_pCJ1-nadA 3.6
W3110-ΔnadCΔkefA 4.2
MG1655-ΔnadC 2.2
MG1655-ΔnadCΔkefA 2.7
2-3. KefA 활성 감소 효과 확인
(1) KefA 개시코돈(start codon) 치환 플라스미드 제작
퀴놀린산 생산균주에서 KefA의 약화 효과를 확인하기 위해, kefA가 약화된 플라스미드를 제작하였다. 유전자 서열은 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)의 서열번호 10의 유전자의 염기서열 (NCBI 등록번호 "GI::89107872")을 활용하였다. kefA 개시코돈을 ATG로부터 TTG로 변이시켜 kefA 유전자의 ORF 부분을 증폭하고, 제한효소 인식부위 blunt과 BamHI를 갖는 서열번호 32 및 33의 프라이머를 합성하였다. 또한 kefA 유전자의 자가 프로모터 부위를 증폭하고, 제한효소 인식부위 SacI과 blunt를 갖는 서열번호 34 및 35의 프라이머를 합성하였다.
대장균 K12 W3110 균주(ATCC No. 23257)의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 32와 33의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였고, PCR은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. PCR을 통하여, kefA ORF 부위와 제한효소 BamHI의 인식부위를 함유한 약 0.15kb의 증폭된 유전자를 수득하였다.
또한 K12 W3110 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 34와 35의 올리고뉴클레오티드를 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였고, PCR은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. PCR을 통하여, kefA 자가 프로모터 부위와 제한효소 SacII의 인식부위를 함유한 약 0.15kb의 증폭된 pKefA 프로모터를 수득하였다.
상기 PCR을 통하여 수득된 kefA ORF 부위와 pKefA 프로모터는, 아가로즈 겔 용출(agarose gel elution)을 통하여 회수한 후, 각각 BamHI 와 SacI 제한효소로 처리하였다. 이후 제한효소 BamHI 와 SacI으로 처리한 pSG76C(J. Bacteriol. 179 (13), 4426-4428 (1997), NCBI genebank Y09892) 벡터에 접합(ligation)하였다.
이를 통하여, 자가 프로모터를 가지면서 개시코돈 ATG에서 TTG로 치환된 kefA ORF 부위를 가진 벡터를 제작하였으며, pSG76C_kefA*(ATG->TTG) 벡터라 명명하였다.
(2) kefA 개시코돈 치환 균주의 제작 및 퀴놀린산 생산능 평가
상기 (1)에서 제작된 pSG76C_kefA*(ATG->TTG) 벡터를 대장균 W3110-ΔNadC 상에 전기천공을 통하여 형질전환시키고 선별마커인 클로람페니콜이 함유된 LB(Luria-Bertani) 평판배지(트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 10g/L, 및 아가 1.5%) 상에 도말하여 37℃에서 밤새 배양한 후, 클로람페니콜에 대한 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 선별된 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 33 및 34의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR을 수행한 후, 1.0% 아가로오스 겔 상에서 0.30 kb크기의 PCR 산물을 획득하고, 시퀀싱을 통해 kefA의 개시코돈이 ATG에서 TTG로 치환된 균주를 최종적으로 선별하였다. 이를 W3110-DnadC_kefA*(ATG->TTG) 라 명명하였다.
또한, 상기 pSG76C_kefA*(ATG->TTG) 벡터를 이용하여 동일한 방법으로 MG1655-ΔnadC를 형질전환시켜, kefA의 개시코돈 치환을 확인하고, 이를 MG1655-ΔnadC_kefA*(ATG->TTG)라 명명하였다.
각 형질전환된 균주의 퀴놀린산의 생산능을 비교하기 위해, 하기 표 4의 균주들의 클로람페니콜 내성을 갖는 수득한 단일 콜로니를 25mL의 퀴놀린산 역가배지(표 1)에 1 백금이씩 접종하여 33℃에서 250 rpm으로 24 내지 72 시간 동안 배양하였다. 배양액 중의 HPLC에 의한 퀴놀린산 분석 결과를 표 4에 나타내었다. 결과적으로 kefA 약화 균주, 즉 kefA의 개시코돈이 치환된 균주가 생산한 퀴놀린산 농도가 대조군 대비 10% 수준으로 증가되었다.
표 4
균주 플라스미드 퀴놀린산(g/L)
W3110-ΔnadC pPro-nadB_pCJ1-nadA 3.5
W3110-ΔnadC_kefA*(ATG->TTG) 4.0
MG1655-ΔnadC 2.1
MG1655-ΔnadC_kefA*(ATG->TTG) 2.5
실시예 3. kefA 제거 균주 및 강화 균주의 퀴놀린산 민감성 평가
3.1 퀴놀린산 생산 균주의 퀴놀린산에 대한 민감성 평가
상기의 퀴놀린산 생산 능력 평가 결과를 바탕으로, KefA 제거가 외부의 퀴놀린산의 세포 내부로 재유입을 약화시켜 퀴놀린산의 생산 능력이 증가된 것으로 예측하였다. 이에 근거하여 kefA 제거 균주와 강화 균주의 퀴놀린산 민감성을 평가하였다.
우선 생산 균주에 생육 저하를 일으키도록 KOH로 pH 7.0으로 적정한 13g/L 퀴놀린산 첨가 유무에 따른 영향성을 파악하였다. 이에 퀴놀린산 생산균주의 단일 콜로니를 25mL의 LB + 1% 글루코스 (효모 추출물 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 카나마이신 50ug/L, 10g/L 글루코스) 액체배지에 1 백금이씩 접종하여 37℃에서 250 rpm으로 16 내지 24 시간 동안 배양하여 OD600 및 소모당과 잔존 퀴놀린산을 측정하였다.
표 5
기반 균주 플라스미드 배지조건 OD600 소모당(g/L) 잔존 퀴놀린산 (g/L)
W3110-ΔnadC pPro-nadB_pCJ1-nadA 0g/L 퀴놀린산 9.1 10.0 0.1
MG1655-ΔnadC 8.3 9.0 0
W3110-ΔnadC 13g/L퀴놀린산 4.9 6.0 11.9
MG1655-ΔnadC 4.5 6.0 11.8
상기의 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이 추가로 배지에 퀴놀린산을 첨가하였을 경우, 세포 내부로 퀴놀린산이 유입되면서 생육 및 당 소모속도가 40% 수준으로 하락하는 것을 확인하였다.
이에, 상기 조작한 nadC가 결손되고 nadBA가 강화된, W3110ΔnadCΔkefA에 pPro-nadB_pCJ1-nadA 플라스미드 도입주를 부다페스트 조약 하에 2013년 11월 07일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11470P를 부여받았다.
3.2 kefA 제거 균주 및 강화 균주의 퀴놀린산에 대한 민감성 평가
(1) KefA 단백질의 과발현 벡터 제작
대장균 유래의 kefA 유전자를 과발현할 수 있는 벡터를 제작하기 위해, 주형으로는 대장균 K12 W3110 균주(ATCC No 23257)의 염색체를 주형으로 이용하였으며, 유전자 서열은 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)의 서열번호 10의 유전자의 염기서열 (NCBI 등록번호 "GI::89107872")을 활용하였다. kefA 유전자의 ORF 부분을 증폭하고, 제한효소 인식부위 EcoRV과 HindIII를 갖는 서열번호 36 및 37 의 프라이머를 합성하였다.
상기 대장균 K12 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 36과 37의 올리고뉴클레오티드를 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였고, PCR은 96℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. PCR을 통하여, kefA ORF 유전자와 제한효소 EcoRV 및 HindIII의 인식부위를 함유한 약 3.3kb의 증폭된 유전자를 수득하였다.
상기 PCR을 통하여 수득된 kefA 유전자는, 아가로즈 겔 용출(agarose gel elution)을 통하여 회수한 후, 제한효소 EcoRV 및 HindIII으로 처리하였다. 이후 제한효소 EcoRV 및 HindIII로 처리한 pCL1920_pRhtB 벡터에 접합(ligation)하였다. 이를 통하여, pRhtB 프로모터에 연결된 kefA 유전자로부터 발현되도록 하였다. 상기의 방법으로 제작된 벡터를 pCL_pRhtB-kefA 벡터라 명명하였다.
(2) KefA 제거 균주 및 KefA 강화 균주 퀴놀린산 민감성 평가
KefA 막단백질이 퀴놀린산의 유입에 영향을 미치는지 여부를 파악하기 위해 상기의 2-4.(1)의 방법과 동일한 방법으로 kefA 유전자의 제거 균주와 강화 균주의 퀴놀린산 민감성 평가를 수행하였다.
표 6
기반 균주 플라스미드 배지조건 OD600 소모당(g/L) 잔존 퀴놀린산(g/L)
W3110-ΔnadC pPro-nadB_pCJ1-nadApCL1920 0g/L퀴놀린산 10.2 10.0 0.2
W3110-ΔnadC pPro-nadB_pCJ1-nadApCL_PrhtB-kefA 5.2 6.2 0
W3110-ΔnadCΔkefA pPro-nadB_pCJ1-nadApCL1920 10.5 10.0 0.2
W3110-ΔnadC pPro-nadB_pCJ1-nadApCL1920 13g/L퀴놀린산 5.0 6.2 12.0
W3110-ΔnadC pPro-nadB_pCJ1-nadApCL_PrhtB-kefA 2.1 3.2 11.5
W3110-ΔnadCΔkefA pPro-nadB_pCJ1-nadApCL1920 8.2 8.0 12.5
상기의 표 6에서 보듯이, LB 액체 배지 상에서도 kefA 유전자를 강화시켰을 경우, 퀴놀린산 생산 균주의 생육 및 당 소모속도가 W3110-ΔnadC에 nadBA 유전자가 강화된 대조군 균주 대비 40% 수준으로 현저히 감소하고, 퀴놀린산 생산도 전혀 없는 것을 확인하였다. 또한 배지에 추가적으로 퀴놀린산을 첨가한 조건에서 kefA 제거 균주의 경우 대조군 균주 대비 생육 및 당 소모속도가 110% 수준으로 향상되며, kefA 강화 균주는 대조군 균주 대비 생육 및 당 소모속도가 50% 수준으로 감소하였다.
상기 결과를 통해서 KefA 막 단백질이 세포 내부로 퀴놀린산 유입에 관여하는 것으로 판단된다. 또한 kefA 제거에 의해 퀴놀린산 생산 균주의 퀴놀린산에 대한 민감성이 낮아질 수 있으며, 아울러 퀴놀린산 생산 증가까지 이루어질 수 있음을 확인하였다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11470P
수탁일자 : 20131107
[규칙 제26조에 의한 보정 08.07.2015]　
Figure WO-DOC-FIGURE-137

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 단백질의 활성이 감소되거나 제거된, 퀴놀린산을 생산하는 에스케리키아속 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 퀴놀린산 포스포라이보실트랜스퍼라아제(quinolinate phophoribosyltransferase)의 활성이 감소되거나 제거된, 퀴놀린산을 생산하는 에스케리키아속 재조합 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물은 아스파라긴산 산화 효소(L-aspartate oxidase) 및 퀴놀린산 신타아제 (Quinolinate synthase)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 효소의 활성이 추가로 강화되도록 변이된 것인, 퀴놀린산을 생산하는 에스케리키아속 재조합 미생물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라아제는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지는 것인, 퀴놀린산을 생산하는 에스케리키아속 재조합 미생물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 아스파라긴산 산화 효소는 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지며, 상기 퀴놀린산 신타아제는 서열번호 31의 아미노산 서열을 가지는 것인, 퀴놀린산을 생산하는 에스케리키아속 재조합 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것인, 퀴놀린산을 생산하는 에스케리키아속 재조합 미생물.
  7. 제1항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
    배양물로부터 퀴놀린산을 회수하는 단계를 포함하는, 퀴놀린산을 생산하는 방법.
PCT/KR2015/006678 2014-07-07 2015-06-30 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 퀴놀린산의 생산 방법 WO2016006856A1 (ko)

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