WO2015122569A1 - L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법 - Google Patents

L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2015122569A1
WO2015122569A1 PCT/KR2014/003649 KR2014003649W WO2015122569A1 WO 2015122569 A1 WO2015122569 A1 WO 2015122569A1 KR 2014003649 W KR2014003649 W KR 2014003649W WO 2015122569 A1 WO2015122569 A1 WO 2015122569A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
threonine
pcc1bac
coli
iolt2
iolt1
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/003649
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김형준
권수연
고은성
이지선
이근철
황영빈
홍형표
Original Assignee
씨제이제일제당(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/KR2014/001154 external-priority patent/WO2014126384A1/ko
Application filed by 씨제이제일제당(주) filed Critical 씨제이제일제당(주)
Priority to CN201480075400.7A priority Critical patent/CN106029869B/zh
Priority to EP14882402.2A priority patent/EP3106516B1/en
Priority to BR112016016773-2A priority patent/BR112016016773B1/pt
Priority to UAA201609357A priority patent/UA118213C2/uk
Priority to JP2016551216A priority patent/JP6412147B2/ja
Priority to KR1020147030960A priority patent/KR101689451B1/ko
Priority to US15/112,992 priority patent/US10053698B2/en
Publication of WO2015122569A1 publication Critical patent/WO2015122569A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant Escherichia genus microorganism modified to express a permease derived from coryneform bacteria and having improved L-threonine production, and a method for producing L-threonine using the same.
  • L-Threonine is an essential amino acid, widely used in feed and food additives, and as a synthetic raw material for fluids and pharmaceuticals.
  • L-threonine is mainly produced by the fermentation method of the genus Escherichia, thetatia, Prodencia or Corynebacterium or its artificial strains developed by artificial or genetic recombination methods. Genes involved in the biosynthesis of threonine and methods of increasing their expression have been developed in various ways, but there is still a need for a method that can produce higher yields of L-threonine.
  • the GalP protein encoded by the galP gene in E. coli is known to be a galactose permease that transports several species of sugars, including galactose and glucose (V. Hernandez-Montalvo F. Valle F. Bolivar). G. Gosset, Appl Microbiol Biotechnol (2001) 57: 186-191), which is known to act as a glucose permease (Venter, Henrietta et al. , Biochemical Journal (2002) 363: 243-252) . ). Increasing the expression of the galP gene in E. coli through increased copy number has been reported to increase threonine production (WO 2004/087937).
  • inositol permease encoded by the iolT1 and iolT2 genes, can also act as glucose permease ( Ikeda et al. , Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90: 1443-1451) It has also been reported that the genes are highly homologous to the galP gene of Escherichia coli, but there have been no reports showing the relationship between the inositol permease and threonine production.
  • the present inventors have found that when the iolT1 gene and / or iolT2 gene encoding inositol permease in E. coli are introduced into E. coli in a Corynebacterium spp. Microorganism, the Escherichia spp. The invention has been completed.
  • an object of the present invention is to provide a recombinant Escherichia spp. Microorganism modified to express a permease derived from coryneform bacteria, thereby improving L-threonine production capacity.
  • the present invention provides a recombinant Escherichia genus microorganism transformed to express a permease derived from Corynebacterium glutamicum.
  • the present invention also provides a method for producing L-threonine in high yield using the recombinant microorganism.
  • the growth rate of the strain is greatly improved compared to the existing strain, thereby producing L-threonine in high yield.
  • the productivity of L-threonine which has a significant industrial significance, may be greatly improved.
  • Figure 1 shows the galP and Corynebacterium homology alignment of the amino acid of iolT1 and iolT2 of tatami glutamicum-derived sequence derived from E. coli.
  • Figure 2 shows a cleavage map of the recombinant vector pCC1BAC- iolT1 containing the iolT1 gene derived from Corynebacterium glutamicum.
  • Figure 3 shows a cleavage map of the recombinant vector pCC1BAC- iolT2 containing the iolT2 gene derived from Corynebacterium glutamicum.
  • Figure 4 shows a cleavage map of the recombinant vector pCC1BAC- iolT1 - iolT2 containing the iolT1 and iolT2 gene derived from Corynebacterium glutamicum.
  • the present invention is characterized by providing a recombinant Escherichia spp. Microorganism characterized by having an improved L-threonine production capacity, which is transformed to express a permease derived from coryneform bacteria.
  • the permease derived from Coryneform bacteria may be derived from Corynebacterium glutamicum, preferably may be derived from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, but is not limited thereto.
  • the permease derived from coryneform bacteria may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the permease derived from coryneform bacteria having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is encoded by the iolT1 gene having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 3, and the fur derived from coryneform bacteria having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Mises are encoded by the iolT2 gene having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • a variant having some variation on the amino acid sequence of the protein or an amino acid sequence of the protein is 80% or more, preferably 90% or more, more Permeases, which preferably have at least 95% homology, particularly preferably at least 97% homology, are also included in the present invention.
  • homology refers to identity between two amino acid sequences, and is used by those skilled in the art using BLAST 2.0, which calculates parameters such as score, identity, similarity, and the like. It may be determined by a known method.
  • a gene having homology with the galP gene encoding a glucose permease in E. coli was detected .
  • the amino acid sequence and coryne encoding the galP of E. coli The amino acid sequence encoded by iolT1 (NCBI Reference Sequence: NC_006958.1, cg0223) derived from Bacterium glutamicum ATCC 13032 showed 34% homology, and iolT2 (NCBI Reference Sequence: NC_006958.1, cg3387) was encoded.
  • the amino acid sequence showed 31% homology (see FIG. 1).
  • the galP gene of E. coli is known and can be obtained from the genome sequence of E. coli published by Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)) (Accession no. AAC75876), the American Biotechnology Information Center (NCBI). ) And from a database such as the Japanese DNA Data Bank (DDBJ).
  • DDBJ Japanese DNA Data Bank
  • Escherichia microorganisms having L-threonine production ability of the present invention may be E. coli and E. coli mutant strains for L-threonine production. More preferably, the Escherichia spp. Microorganism having the L-threonine production ability is methionine requirement, resistance to threonine analogue, resistance to lysine analogue, resistance to isoleucine analogue and methionine analogue. Strain for L-threonine production, characterized in that the phosphoenol pyruvate carboxylase gene (ppc gene) and threonine operon are introduced into 2-copy abnormal chromosome E. coli KCCM 10541 (Korean Patent Registration No. 10-0576342) derived from Phosphorus E. coli KFCC 10718 (Korean Patent Registration No. 10-0058286).
  • ppc gene phosphoenol pyruvate carboxylase gene
  • Microorganism having the L-threonine production ability of the present invention is not particularly limited.
  • a recombinant vector comprising a gene encoding a permase can be transformed into a microorganism, an increase in the number of copies of the gene encoding a permase, or an expression control sequence of the gene encoding a permase. It can be adjusted, or two or more methods can be used together.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising iolT1 gene and / or iolT 2 gene derived from Corynebacterium glutamicum and an improved L-threonine production capacity transformed with the recombinant vector.
  • a recombinant vector comprising iolT1 gene and / or iolT 2 gene derived from Corynebacterium glutamicum and an improved L-threonine production capacity transformed with the recombinant vector.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding said target protein operably linked to a suitable regulatory sequence to enable expression of the target protein in a suitable host.
  • the regulatory sequence includes a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in the host, and any vector known in the art may be used. Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising the iolT1 gene derived from Corynebacterium glutamicum.
  • the recombinant vector is characterized in that pCC1BAC- iolT1 , more preferably has a cleavage map of FIG.
  • the invention also provides a recombinant vector comprising the iolT2 gene from Corynebacterium glutamicum.
  • the recombinant vector is characterized in that pCC1BAC- iolT2 , more preferably has a cleavage map of FIG.
  • the present invention also provides a recombinant vector for simultaneously expressing iolT1 and iolT2 genes derived from Corynebacterium glutamicum.
  • the recombinant vector is characterized in that pCC1BAC- iolT1 - iolT2 , more preferably has a cleavage map of FIG.
  • the term “transformation” means introducing a vector comprising a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • Transformed polynucleotides include all of them, as long as they can be expressed in the host cell, regardless of whether they are inserted into or located outside the chromosome of the host cell.
  • the polynucleotide also includes DNA and RNA encoding the target protein.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced into and expressed in a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a polynucleotide construct containing all the elements necessary for self expression.
  • the expression cassette typically includes a promoter, transcription termination signal, ribosomal binding site, and translation termination signal operably linked to the gene.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked with a sequence required for expression in the host cell.
  • the present invention provides a recombinant Escherichia genus microorganism having improved L-threonine production capacity, transformed with a recombinant vector comprising an iolT1 gene or an iolT2 gene derived from Corynebacterium glutamicum. .
  • the present invention provides a recombinant Escherichia spp. Microorganism having improved L-threonine production capacity, transformed with a recombinant vector comprising an iolT1 gene and an iolT2 gene derived from Corynebacterium glutamicum. .
  • the transformed recombinant Escherichia spp. Microorganism of the present invention may be Escherichia coli, and preferably, the microorganism may be E. coli CA03-0230 (KCCM11370P), E. coli CA03-0260 (KCCM11369P) or E. coli CA03-0231 ( KCCM11371P).
  • Recombinant threonine producing strains of the present invention as described above, by introducing the iolT1 and / or iolT2 gene derived from coryneform bacteria in E. coli to increase the expression of permease in Escherichia coli, greatly increase the sugar consumption rate and growth rate of the strain. As a result, L-threonine can be produced at a high concentration.
  • the present invention also provides a method for preparing L-threonine, comprising culturing the transformed recombinant Escherichia spp. Microorganism and separating L-threonine from the culture medium of the microorganism. to provide.
  • Microorganism of the present invention can be carried out through conventional methods. Specifically, the microorganism may be cultured by inoculating the culture medium containing some or all of raw sugar or glucose as a carbon source. The culturing process may be carried out according to suitable media and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected. Examples of the culture method include, but are not limited to, batch, continuous and fed-batch cultivation. The medium used for cultivation should suitably meet the requirements of the particular strain.
  • the medium used in the present invention uses raw sugar or glucose as the main carbon source
  • molasses containing a large amount of raw sugar may also be used as the carbon source
  • other appropriate amounts of the carbon source may be variously used.
  • Purified glucose is used.
  • nitrogen sources that can be used include inorganic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, and organic nitrogen sources such as soybean wheat, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate. Included, preferably peptone. These nitrogen sources may be used alone or in combination.
  • the medium may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and the corresponding sodium-containing salts as personnel. It may also include metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate. In addition, amino acids, vitamins and appropriate precursors may be included. These media or precursors may be added batchwise or continuously to the culture.
  • the temperature of the culture is usually 27 ° C to 37 ° C, preferably 30 ° C to 37 ° C.
  • the incubation period can continue the expression of the desired useful substance, preferably 10 to 100 hours.
  • genomic DNA of E. coli wild type strain W3110 was extracted using Qiagen's Genomic-tip system.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Primers used were SEQ ID NOs: 9 and 10
  • PCR reaction conditions were denaturation 94 °C 30 seconds, annealing (annealing) 56 °C 30 seconds, elongation (elongation) 72 °C 50 seconds, this was repeated 30 times.
  • the PCR result (hereinafter referred to as "galP fragment") was obtained by electrophoresis on 0.8% agarose gel and eluting a band of desired size.
  • the obtained galP fragment was treated with the restriction enzyme HindIII, and then ligated so as to match the direction of the lac promoter on the vector and the linear pCC1BAC vector (hereinafter, identical to EPICENTRE Co., Ltd.) treated with the same restriction enzyme HindIII.
  • E. coli DH5a cells were transformed with the prepared vector, and then plated in chloramphenicol-containing LB solid medium and cultured overnight at 37 ° C.
  • the cultured platinum was inoculated in 3 ml of chloramphenicol-containing LB liquid medium and incubated overnight, and then plasmid DNA was recovered using a plasmid miniprep kit (QIAGEN, hereinafter identical).
  • the size of the recombinant vector was confirmed by treatment with restriction enzyme HindIII (data not shown). PCR was performed under the reaction conditions of 94 ° C. 30 seconds, annealing 56 ° C. 30 seconds, height 72 ° C. and 60 seconds with primers SEQ ID NOs: 11 and 12. Was performed to identify clones.
  • the recombinant vector was named pCC1BAC- galP (data not shown).
  • the gal P fragment was ligated in alignment with the lac promoter on the vector and the linear pCL1920 vector treated with the same restriction enzyme HindIII.
  • E. coli DH5a cells were transformed with the prepared vector, which was then plated in spectinomycin-containing LB solid medium and incubated overnight at 37 ° C.
  • the cultured platinum was inoculated in 3 ml of spectinomycin-containing LB liquid medium and cultured overnight, and then plasmid DNA was recovered using a plasmid miniprep kit.
  • the size of the recombinant vector was confirmed by treatment with restriction enzyme HindIII (data not shown).
  • PCR was performed under the reaction conditions of denaturation 94 ° C. 30 sec, annealing 56 ° C. 30 sec, elongation 72 ° C. 60 sec with primers SEQ ID NOs. 13 and 14. Was performed to identify clones.
  • the recombinant vector was named pCL1920- galP (data not shown).
  • the recombinant vector pCC1BAC- galP was introduced into E. coli KCCM10541, an L-threonine producing strain, by electroporation, and plated on a solid medium containing 15 ⁇ g / ml of chloramphenicol to select single colonies.
  • the recombinant vector pCL1920- galP was introduced into E. coli KCCM10541, an L-threonine producing strain, by electroporation, and plated on a solid medium containing 50 ⁇ g / ml of spectinomycin to select a single colony.
  • the selected strains were named KCCM10541 / pCC1BAC- galP and KCCM10541 / pCL1920- galP , respectively.
  • the recombinant strains prepared in (2) above were cultured in a Erlenmeyer flask using the threonine titer medium of Table 1 as described below to confirm L-threonine productivity.
  • the titer was evaluated using the strains Escherichia coli KCCM10541, KCCM10541 / pCC1BAC- galP and KCCM10541 / pCL1920- galP .
  • the recombinant vector pCC1BAC- galP is one copy
  • pCL1920- galP is a vector expressed five copies, to determine the effect of increasing the number of copies.
  • the recombinant strains having different genetic traits were incubated overnight in an LB solid medium in a 33 ° C. incubator, and then inoculated with one platinum in a 25 ml titer medium containing glucose as shown in Table 1 above. Incubated for 48 hours at 33 °C, 200 rpm incubator, the results are shown in Table 2 below.
  • the parent strain E. coli KCCM10541 strain produced 32.0 g / L L- threonine when incubated for 48 hours
  • E. coli KCCM10541 / pCC1BAC recombinant strain obtained in this Comparative Example GalP was 31.1 g / L and KCCM10541 / pCL1920- galP was 30.8 g / L, and L-threonine production decreased by 0.9 g / L and 1.2 g / L, respectively.
  • the strain E. coli KCCM10541 strain produced 32.0 g / L L L- threonine when incubated for 48 hours
  • E. coli KCCM10541 / pCC1BAC recombinant strain obtained in this Comparative Example GalP was 31.1 g / L and KCCM10541 / pCL1920- galP was 30.8 g / L, and L-threonine production decreased by 0.9 g / L and 1.2 g / L,
  • coli KCCM10541 showed a sugar consumption rate of 0.753 g / L / hr, but KCCM 10541 / pCC1BAC- galP was 0.793 g / L / hr, and KCCM 10541 / pCL1920- galP was 0.816. g / L / hr, which is 5.3% and 8.4% higher sugar consumption rates than the parent strain, respectively.
  • amino acid sequence encoded by E. coli-derived galP and the amino acid sequence encoded by Corynebacterium glutamicum-derived iolT1 showed 34% homology and 31% by iolT2 .
  • Genomic DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 using Qiagen's Genomic-tip system to obtain a 1.5 kb fragment containing the open reading frame of the iolT1 gene of SEQ ID NO: 3 was extracted.
  • PCR was performed using the gDNA as a template. Primers used at this time were SEQ ID NOs: 5 and 6, PCR reaction conditions are denatured 94 °C 30 seconds, annealing 56 °C 30 seconds, elongation 72 °C 60 seconds, this was repeated 30 times.
  • the PCR result (hereinafter referred to as " iolT1 fragment") was obtained by electrophoresis on 0.8% agarose gel and eluting a band of desired size.
  • the iolT1 fragment prepared in (2) above was treated with restriction enzyme HindIII, and then ligated so as to match the direction of the linear promoter and the lac promoter on the vector treated with the same restriction enzyme HindIII.
  • E. coli DH5a cells were transformed with the recombinant vector prepared above, which were plated in chloramphenicol-containing LB solid medium and incubated overnight at 37 ° C.
  • the cultured platinum was inoculated in 3 ml of chloramphenicol-containing LB liquid medium and cultured overnight, and then plasmid DNA was recovered using a plasmid miniprep kit.
  • the size of the recombinant vector was confirmed by treatment with restriction enzyme HindIII (data not shown). PCR was performed under the reaction conditions of 94 ° C. 30 seconds, annealing 56 ° C. 30 seconds, height 72 ° C. and 90 seconds with primers SEQ ID NOs: 11 and 12. Was performed to identify clones.
  • the recombinant vector was named pCC1BACiolT1 .
  • genomic DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 was obtained using Qiagen's Genomic-tip system. Extracted.
  • PCR was performed using the gDNA as a template.
  • the primers used were SEQ ID NOs: 7 and 8, and PCR reaction conditions were denatured 94 ° C. 30 seconds, annealing 56 ° C. 30 seconds, elongation 72 ° C. 60 seconds, and this was repeated 30 times.
  • the PCR result (hereinafter referred to as " iolT2 fragment") was obtained by electrophoresis on 0.8% agarose gel and eluting a band of desired size.
  • the iolT2 fragment prepared in (4) was treated with restriction enzyme EcoRI, and then ligated so as to match the orientation of the linear promoter and the lac promoter on the vector treated with the same restriction enzyme EcoRI.
  • E. coli DH5a cells were transformed with the recombinant vector prepared above, which were plated in chloramphenicol-containing LB solid medium and incubated overnight at 37 ° C.
  • the cultured platinum was inoculated in 3 ml of chloramphenicol-containing LB liquid medium and cultured overnight, and then plasmid DNA was recovered using a plasmid miniprep kit.
  • the size of the recombinant vector was confirmed by treatment with restriction enzyme EcoRI (data not shown). Was performed to identify clones.
  • the recombinant vector was named pCC1BAC-iolT2.
  • the pCC1BAC iolT2 vector prepared in (5) was treated with the restriction enzyme HindIII, and then ligated so that the iolT1 fragment prepared in (2) was aligned with the lac promoter on the vector.
  • E. coli DH5a cells were transformed with the prepared vector, which was plated in chloramphenicol-containing LB solid medium and incubated overnight at 37 ° C.
  • the cultured platinum was inoculated in 3 ml of chloramphenicol-containing LB liquid medium and cultured overnight, and then plasmid DNA was recovered using a plasmid miniprep kit.
  • the size of the recombinant vector was confirmed by treatment with restriction enzyme HindIII (data not shown). PCR was performed under the reaction conditions of 94 ° C 30 seconds, denaturation 56 ° C 30 seconds, annealing 56 ° C 30 seconds, and extension 72 ° C 120 seconds with the primers SEQ ID NOs: 11 and 12. Was performed to identify clones.
  • the recombinant vector was named pCC1BAC- iolT1 - iolT2 .
  • the recombinant vectors pCC1BAC- iolT1 , pCC1BAC- iolT2 and pCC1BAC- iolT1 - iolT2 prepared in Example 1, respectively, include a threonine operon overexpression vector pBRThrABCR3 ( Lee KH et al. , Molecular Systems Biology (2007) 3: 149).
  • a single colony was selected by introducing into wild-type Escherichia coli MG1655 by electroporation and smearing a solid medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin and 15 ⁇ g / ml of chloramphenicol.
  • the selected strains were named MG1655 / pBRThrABCR3 / pCC1BAC- iolT1 , MG1655 / pBRThrABCR3 / pCC1BAC- iolT2 and MG1655 / pBRThrABCR3 / pCC1BAC- iolT1 - iolT2 , respectively.
  • the parent strain E. coli MG1655 strain produced 3.86 g / L L- threonine when incubated for 48 hours
  • the recombinant strain MG1655 / pCC1BAC- iolT1 obtained in this Example is 3.88 g / L
  • MG1655 / pCC1BAC- iolT2 and MG1655 / pCC1BAC- iolT1 - were producing L- threonine of iolT2 is 3.92 g / L, 3.85 g / L respectively.
  • L-threonine was produced at a level similar to that of the parent strain.
  • the wild type parent strain E. coli MG1655 strain exhibited a sugar consumption rate of 0.877 g / L / hr, but MG1655 / pCC1BAC- iolT2 was 1.035 g / L / hr and MG1655 / pCC1BAC- iolT1 was 1.109.
  • g / L / hr MG1655 / pCC1BAC- iolT1 - iolT2 exhibited a 1.123 g / L / hr. This is a 18.0%, 26.5%, and 28.1% improvement in sugar consumption over the parent strain, respectively.
  • the recombinant vectors pCC1BAC- iolT1 , pCC1BAC- iolT2 and pCC1BAC-iolT1-iolT2 prepared in Example 1 were introduced into the L-threonine-producing strain E. coli KCCM10541 by electroporation, respectively, to give 15 ⁇ g / ml of chloramphenicol. Single colonies were selected by smearing on solid media contained.
  • the selected strains were named KCCM10541 / pCC1BAC- iolT 1, KCCM10541 / pCC1BAC- iolT2 and KCCM10541 / pCC1BAC- iolT1 - iolT2 , respectively.
  • the parent strain E. coli KCCM 10541 strain produced 30.3 g / L L- threonine when incubated for 48 hours, in Example 2- (2) of the present invention
  • the recombinant strain KCCM 10541 / pCC1BAC- iolT2 obtained showed 2.2 g / L L-threonine productivity over the parent strain, and KCCM10541 / pCC1BAC- iolT 1 and KCCM10541 / pCC1BAC- iolT1 - iolT2 were 29.5 g / L, respectively. 29.9 g / L of L-threonine was produced. In other words, L-threonine was produced at a level similar to that of the parent strain.
  • KCCM 10541 / pCC1BAC- galP and KCCM 10541 / pCL1920- galP which have enhanced expression of E. coli-derived galP genes, produced 29.8 g / L and 29.3 g / L of L-threonine, respectively.
  • the parent strain E. coli KCCM 10541 showed a sugar consumption rate of 0.823 g / L / hr, but KCCM 10541 / pCC1BAC- iolT2 was 1.093 g / L / hr and KCCM 10541 / pCC1BAC- iolT1- .
  • iolT2 showed 1.200 g / L / hr and KCCM 10541 / pCC1BAC- iolT1 showed 1.213 g / L / hr, which was 32.8%, 45.8%, and 47.4% improved sugar consumption rates, respectively.
  • the transformed Escherichia coli KCCM 10541 / pCC1BAC- iolT1 was designated as CA03-0230
  • KCCM 10541 / pCC1BAC- iolT2 was designated as CA03-0260
  • KCCM 10541 / pCC1BAC- iolT1 - iolT2 was designated as CA03-0231, and on February 05, 2013, It was deposited in Korean Culture Center of Microorganisms (hereinafter abbreviated as 'KCCM') with accession numbers KCCM11370P, KCCM11369P and KCCM11371P, respectively.
  • E. coli which has L-threonine-producing ability, enhances the expression of perinease derived from coryneform microorganisms, i.e., introduces one or more iolT1 or iolT2 genes.
  • the rate of sugar consumption increases and the time required to produce the same concentration of threonine is shortened, ie, the increase in threonine productivity is supported.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 코리네형 세균 유래의 퍼미아제가 도입되어 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 대장균 변이주 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 생산방법
본 발명은 코리네형 세균 유래의 퍼미아제를 발현하도록 변형되어 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다.
L-쓰레오닌은 주로 인공변이법 또는 유전자 재조합 방법에 의해 개발된 에스케리키아속, 세타티아속, 프로덴시아속 또는 코리네형 세균(Corynebacterium) 또는 이의 인공변이주를 이용한 발효법으로 생산된다. 쓰레오닌의 생합성에 관련된 유전자 및 이들의 발현을 증가시키는 방법이 다양하게 개발되었으나, 보다 경제적으로 높은 수율의 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 방법에 대한 요구가 여전히 존재한다.
대장균에서 galP 유전자에 의해 코딩되는 GalP 단백질은 갈락토스 및 포도당을 포함한 여러 종의 당을 세포 내부로 수송하는 갈락토스 퍼미아제(galactose permease)인 것으로 알려져 있으며(V. Hernandez-Montalvo F. Valle F. Bolivar G. Gosset, Appl Microbiol Biotechnol (2001) 57:186-191), 이것은 글루코스 퍼미아제(glucose permease)로도 작용한다는 것이 알려져 있다(Venter, Henrietta et al., Biochemical Journal (2002) 363:243-252). 대장균에서 카피 수 증가 등을 통해 galP 유전자의 발현을 증가시키면 쓰레오닌의 생산능이 증가된다는 보고가 있다(WO 2004/087937).
코리네박테리움 글루타미쿰에서는 iolT1 및 iolT2 유전자에 의해 암호화되는 이노시톨 퍼미아제가 글루코스 퍼미아제로도 작용할 수 있다는 것이 보고되어 있으며(Ikeda et al., Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90:1443-1451), 상기 유전자들이 대장균의 galP 유전자와 상동성이 높다는 것 또한 보고되어 있으나, 상기 이노시톨 퍼미아제와 쓰레오닌 생산과의 관계를 나타낸 보고는 없었다.
본 발명자들은 코리네박테리움 속 미생물에서 이노시톨 퍼미아제를 코딩하는 iolT1 유전자 및/또는 iolT2 유전자를 대장균에 도입할 경우 에스케리키아 속 미생물이 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가짐을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 코리네형 세균 유래의 퍼미아제를 발현하도록 변형되어 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 재조합 에스케리키아 속 미생물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 퍼미아제가 발현되도록 형질전환된 재조합 에스케리키아 속 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 재조합 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면 균주의 생장 속도가 기존의 균주 대비 큰 폭으로 향상되어 L-쓰레오닌을 높은 수율로 생산할 수 있다. 이에 따라 산업적으로 큰 의미가 있는 L-쓰레오닌 생산성이 크게 향상될 수 있다.
도 1은 대장균 유래의 galP와 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 및 iolT2의 아미노산 서열의 상동성 정렬을 나타낸 것이다.
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pCC1BAC-iolT1의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pCC1BAC-iolT2의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 4는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 및 iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pCC1BAC-iolT1-iolT2의 개열지도를 나타낸 것이다.
본 발명은 코리네형 세균 유래의 퍼미아제를 발현하도록 형질전환된, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 에스케리키아 속 미생물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 코리네형 세균 유래의 퍼미아제는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032으로부터 유래될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
가장 바람직하게는, 상기 코리네형 세균 유래의 퍼미아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 코리네형 세균 유래의 퍼미아제는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지는 iolT1 유전자에 의해 암호화되며, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 코리네형 세균 유래의 퍼미아제는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지는 iolT2 유전자에 의해 암호화된다.
또한, 본 발명에서 제시한 퍼미아제의 활성을 가지는 단백질인 한, 상기 단백질의 아미노산 서열 상에 일부 변이가 있는 변이체 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에 대해서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 퍼미아제 또한 본 발명에 포함된다.
본원에서, 상기 용어 "상동성"은 두 아미노산 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0을 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법 등으로 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구현에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 대장균에서 글루코스 퍼미아제를 코딩하는 galP 유전자와 상동성을 가진 유전자를 탐색하였으며, 그 결과 대장균의 galP가 코딩하는 아미노산 서열과 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래의 iolT1(NCBI Reference Sequence: NC_006958.1, cg0223)이 코딩하는 아미노산 서열은 34%의 상동성을 나타내었으며, iolT2(NCBI Reference Sequence: NC_006958.1, cg3387)가 코딩하는 아미노산 서열은 31%의 상동성을 나타내었다(도 1을 참조).
상기 대장균의 galP 유전자는 공지되어 있으며, Blattner 등 (Science 277: 1453-1462 (1997))에 의하여 공개된 대장균의 게놈 서열로부터도 얻을 수 있으며(Accession no. AAC75876), 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터도 얻을 수 있다.
본 발명의 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물은 대장균 및 L-쓰레오닌 생산용 대장균 변이주일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물은 메티오닌 요구성, 쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 라이신 유사체에 대한 내성, 이소루이신 유사체에 대한 내성 및 메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈 유전자(phosphoenol pyruvate carboxylase gene, ppc 유전자)와 쓰레오닌 오페론이 2-카피 이상 염색체 내로 도입된 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌 생산용 균주인 대장균 KFCC 10718 (대한민국특허 등록번호 제10-0058286호)로부터 유래된 대장균 KCCM 10541(대한민국특허 등록번호 제10-0576342호)이다.
본 발명의 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물에서 퍼미아제를 코딩하는 유전자를 발현하도록 하기 위한 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 퍼미아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 형질전환하거나, 퍼미아제를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키거나, 퍼미아제를 코딩하는 유전자의 발현조절서열을 조절할 수 있으며, 둘 이상의 방법을 함께 사용할 수도 있다. 일반적으로, 쓰레오닌 생합성 관련 유전자의 발현량을 높이기 위한 방법으로 1개의 미생물이 가지는 유전자의 수를 높여주는 방법이 있으며, 이를 위해 통상 카피 수가 높게 유지되는 플라스미드를 사용한다(Sambrook et al, Molecular cloning, 2판, 1989, 1.3~1.5). 즉 카피수가 높게 유지되는 플라스미드에 원하는 유전자를 삽입하고 이러한 재조합 플라스미드를 다시 미생물에 형질 전환시킴으로써 1개의 미생물당 그 플라스미드의 카피 수만큼 유전자의 카피수를 늘려주는 효과를 기대할 수 있다. 또한, 쓰레오닌 생합성 관련 유전자를 염색체 DNA 중에 삽입하는 방법이 이용되기도 한다.
본 발명의 일 구현에서, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 유전자 및/또는 iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 재조합 에스케리키아 속 미생물을 제공한다.
본원에서, 상기 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다.
본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 pCC1BAC-iolT1인 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 도 2의 개열지도를 가진다.
본 발명은 또한 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 pCC1BAC-iolT2인 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 도 3의 개열지도를 가진다.
본 발명은 또한 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 및 iolT2 유전자를 동시에 발현시키기 위한 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 pCC1BAC-iolT1-iolT2인 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 도 4의 개열지도를 가진다.
본원에서, 상기 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
일 양상에서, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 유전자 또는 iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 재조합 에스케리키아 속 미생물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 유전자 및 iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 재조합 에스케리키아 속 미생물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 형질전환된 재조합 에스케리키아 속 미생물은 대장균일 수 있고, 바람직하게는 상기 미생물은 대장균 CA03-0230(KCCM11370P), 대장균 CA03-0260(KCCM11369P) 또는 대장균 CA03-0231(KCCM11371P)일 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 재조합 쓰레오닌 생산 균주들은 대장균 내에 코리네형 세균 유래의 iolT1 및/또는 iolT2 유전자를 도입하여 대장균 내 퍼미아제의 발현을 증가시켜 균주의 당소모 속도 및 생장속도가 크게 향상됨으로써 L-쓰레오닌을 고농도로 생산할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 재조합 에스케리키아 속 미생물을 배양하는 단계 및 상기 미생물의 배양액으로부터 L-쓰레오닌을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 에스케리키아 속 미생물의 배양은 통상적인 방법을 통해 수행될 수 있다. 구체적으로, 탄소원으로 원당 또는 포도당의 일부 혹은 전부가 포함된 배양 배지에 상기 미생물을 접종하여 배양할 수 있다. 상기 배양과정은 당 업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
구체적으로, 본 발명에서 사용되는 배지는 원당 혹은 포도당을 주 탄소원으로 사용하고, 원당을 다량으로 포함한 당밀 또한 탄소원으로 이용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있으며, 바람직하게는 정제 포도당을 사용한다. 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함되며, 바람직하게는 펩톤을 사용한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
구체적으로, 배양의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 37℃이다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 발현이 계속 할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[ 실시예 ]
비교예: 대장균 유래 galP 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재 조합 균주의 제조 및 L-쓰레오닌 생산성 비교
대장균에서 갈락토즈 퍼미아제는 글루코즈 퍼미아제의 역할을 수행하며 카피수 증가 등을 통해 발현을 증가시키면 쓰레오닌 생산능이 증가된다는 보고(WO 2004/087937)의 확인을 위하여, L-쓰레오닌 생산균주인 대장균 KCCM 10541에 galP 유전자의 카피 수 증가를 통한 재조합 균주를 제작하여 L-쓰레오닌 생산성을 평가하였다.
(1) 대장균 유래 galP 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작
대장균 유래 galP 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하는 1.4kb 단편을 얻기 위해, 퀴아젠사(Qiagen)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 대장균 야생형 균주 W3110의 genomic DNA를 추출하였다.
상기 gDNA를 주형으로 하여 연쇄종합반응 (polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 약칭함)을 실시하였다. 이때 사용한 프라이머는 서열번호 9와 10이며, PCR 반응 조건은 변성(denaturation) 94℃ 30초, 어닐링(annealing) 56℃ 30초, 신장(elongation) 72℃ 50초이며, 이를 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물 (이하, "galP 단편"이라 명명함)을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.
상기 얻어진 galP 단편을 제한효소 HindIII로 처리한 후, 동일한 제한효소인 HindIII로 처리된 선형 pCC1BAC 벡터 (EPICENTRE사 제품, 이하 동일함)와 벡터 상의 lac 프로모터와 방향이 일치하도록 라이게이션하였다.
상기 제작된 벡터로 대장균 DH5a 세포를 형질전환시킨 후, 이를 클로람페니콜 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 클로람페니콜 함유 LB 액체 배지 3㎖에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트 (QIAGEN사 제품, 이하 동일함)를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 크기는 제한효소 HindIII로 처리하여 확인하였으며 (데이터는 나타내지 않음), 서열번호 11과 12의 프라이머로 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 60초의 반응 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합 벡터를 pCC1BAC-galP라 명명하였다 (데이터는 도시하지 않음).
또한, 상기 galP 단편을 동일한 제한효소인 HindIII로 처리된 선형 pCL1920 벡터와 벡터상의 lac 프로모터와 방향이 일치하도록 라이게이션하였다. 상기 제작된 벡터로 대장균 DH5a 세포를 형질전환시킨 후, 이를 스펙티노마이신 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 스펙티노마이신 함유 LB 액체 배지 3 ㎖에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 크기는 제한효소 HindIII로 처리하여 확인하였으며 (데이터는 나타내지 않음), 서열번호 13과 14의 프라이머로 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 60초의 반응 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합 벡터를 pCL1920-galP라 명명하였다 (데이터는 나타내지 않음).
(2) 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주의 제조
모균주로서 L-쓰레오닌 생산균주인 대장균 KCCM10541에 상기 재조합벡터 pCC1BAC-galP를 전기천공법으로 도입하여 클로람페니콜 15 ㎍/㎖이 포함된 고체배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다. 위와 동일한 방법으로 상기 재조합벡터 pCL1920-galP를 L-쓰레오닌 생산균주인 대장균 KCCM10541에 전기천공법으로 도입하여 스펙티노마이신 50 ㎍/㎖이 포함된 고체배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다.
선별된 균주를 각각 KCCM10541/pCC1BAC-galP 및 KCCM10541/pCL1920-galP로 명명하였다.
(3) 재조합 균주의 L-쓰레오닌 생산성 비교
상기 (2)에서 제조된 재조합 균주들을 하기 표 1의 쓰레오닌 역가 배지를 이용하여 삼각플라스크에서 아래 기술한 방법과 같이 배양하여 L-쓰레오닌 생산성을 확인하였다.
표 1
조성물 농도 (리터당)
포도당 70 g
KH2PO4 2 g
(NH4)2SO4 27.5 g
MgSO4·H2O 1 g
FeSO4·H2O 5 mg
MnSO4·H2O 5 mg
DL-메티오닌 0.15 g
효모액기스 2 g
탄산칼슘 30 g
pH 6.8
모균주인 대장균 KCCM10541, KCCM10541/pCC1BAC-galP 및 KCCM10541/pCL1920-galP 균주를 사용하여 역가 평가를 진행하였다. 각 균주에 도입하였을 때, 상기 재조합벡터 pCC1BAC-galP는 1카피, pCL1920-galP는 5카피 발현되는 벡터로써, 카피 수 증가에 따른 효과를 확인하고자 하였다.
각기 다른 유전적 형질을 가진 상기 재조합 균주들을 33℃ 배양기에서 LB 고체 배지에서 밤새 배양한 후, 상기 표 1의 조성과 같이 포도당이 함유된 25 ㎖의 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 배양하였으며, 이의 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
균주 L-쓰레오닌 (g/L) 당소모속도 (g/L/hr)
KCCM10541 32.0 0.753
KCCM10541/pCC1BAC-galP 31.1 0.793
KCCM10541/pCL1920-galP 30.8 0.816
그 결과, 상기 표 2에 기재된 바와 같이, 모균주인 대장균 KCCM10541 균주는 48시간 배양하였을 경우 32.0 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였으나, 본 비교예에서 수득한 재조합 균주인 대장균 KCCM10541/pCC1BAC-galP는 31.1 g/L, KCCM10541/pCL1920-galP는 30.8 g/L로 모균주보다 각각 0.9 g/L, 1.2 g/L으로 L-쓰레오닌 생산이 하락되었다. 표 2에서 보는 바와 같이, 모균주인 대장균 KCCM10541 균주는 0.753 g/L/hr의 당소모 속도를 나타내었으나, KCCM 10541/pCC1BAC-galP는 0.793 g/L/hr, KCCM 10541/pCL1920-galP는 0.816 g/L/hr를 나타내었고 이는 모균주 대비 각각 5.3%, 8.4% 향상된 당소모 속도이다.
실시예 1: 코리네형 세균 유래의 iolT1 , iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡 터의 제작
(1) 대장균 글루코스 퍼미아제 (galP)와의 상동성 비교
코리네박테리움 글루타미쿰에서 이노시톨 퍼미아제를 코딩하는 iolT1, iolT2 유전자가 대장균의 글루코스 퍼미아제를 코딩하는 galP 유전자와 상동성이 유사하다고 보고되어 있다. 대장균 유래 galP 유전자와 상동성을 지닌 유전자를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)의 게놈으로부터 찾아내어 비교하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
대장균 유래 galP가 코딩하는 아미노산 서열과 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 iolT1이 코딩하는 아미노산 서열은 34%, iolT2가 코딩하는 아미노산 서열은 31%의 상동성을 나타내었다.
(2) iolT1 유전자 단편의 준비
서열번호 3의 iolT1 유전자의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 1.5kb 단편을 얻기 위해, 퀴아젠사(Qiagen)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)의 genomic DNA를 추출하였다.
상기 gDNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. 이 때 사용한 프라이머는 서열번호 5와 6이며, PCR 반응 조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 60초이며, 이를 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물 (이하, "iolT1 단편"이라 명명함)은 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.
(3) 재조합 벡터 pCC1BAC- iolT1 제작
상기 (2)에서 준비한 iolT1 단편을 제한효소 HindIII로 처리한 후, 동일한 제한효소인 HindIII로 처리된 선형 pCC1BAC 벡터와 벡터상의 lac 프로모터와 방향이 일치하도록 라이게이션하였다.
상기 제작된 재조합 벡터로 대장균 DH5a 세포를 형질전환시켰고, 이를 클로람페니콜 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 클로람페니콜 함유 LB 액체 배지 3㎖에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 크기는 제한효소 HindIII로 처리하여 확인하였으며 (데이터는 나타내지 않음), 서열번호 11과 12의 프라이머로 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 90초의 반응 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합 벡터를 pCC1BAC-iolT1이라 명명하였다.
(4) iolT2 유전자 단편의 준비
서열번호 4의 iolT2 유전자의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 1.6kb 단편을 얻기 위해, 퀴아젠(Qiagen)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)의 genomic DNA를 추출하였다.
상기 gDNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. 이 때 사용한 프라이머는 서열번호 7과 8이며, PCR 반응 조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 60초이며, 이를 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물 (이하, "iolT2 단편"이라 명명함)은 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.
(5) 재조합 벡터 pCC1BAC- iolT2 제작
상기 (4)에서 준비한 iolT2 단편을 제한효소 EcoRI으로 처리한 후, 동일한 제한효소인 EcoRI으로 처리된 선형 pCC1BAC 벡터와 벡터상의 lac 프로모터와 방향이 일치하도록 라이게이션하였다.
상기 제작된 재조합 벡터로 대장균 DH5a 세포를 형질 전환시켰고 이를 클로람페니콜 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 클로람페니콜 함유 LB 액체 배지 3㎖에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 크기는 제한효소 EcoRI으로 처리하여 확인하였으며 (데이터는 나타내지 않음), 서열번호 11과 12의 프라이머로 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 90초의 반응 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합 벡터를 pCC1BAC-iolT2라 명명하였다.
(6) 재조합 벡터 pCC1BAC- iolT1 - iolT2 제작
상기 (5)에서 제작된 pCC1BAC-iolT2 벡터를 제한효소 HindIII로 처리한 후, 상기 (2)에서 준비한 iolT1 단편과 벡터상의 lac 프로모터와 방향이 일치하도록 라이게이션하였다.
상기 제작된 벡터로 대장균 DH5a 세포를 형질 전환시켰고, 이를 클로람페니콜 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 클로람페니콜 함유 LB 액체 배지 3㎖에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 크기는 제한효소 HindIII로 처리하여 확인하였으며 (데이터는 나타내지 않음), 서열번호 11과 12의 프라이머로 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 120초의 반응 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합 벡터를 pCC1BAC-iolT1-iolT2라 명명하였다.
실시예 2: 형질전환된 재조합 균주의 제조 및 L-쓰레오닌 생산성 비교
(1) 야생형 대장균을 이용한 재조합 균주의 제조
상기 실시예 1에서 제조한 재조합벡터 pCC1BAC-iolT1, pCC1BAC-iolT2 및 pCC1BAC-iolT1-iolT2를 각각 쓰레오닌 오페론 과발현 벡터 pBRThrABCR3 (Lee KH et al., Molecular Systems Biology (2007) 3:149)를 포함한 야생형 대장균 MG1655에 전기천공법으로 도입하여 암피실린 100 ㎍/㎖와 클로람페니콜 15 ㎍/㎖이 포함된 고체배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다.
선별된 균주를 각각 MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT1, MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT2 및 MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT1-iolT2으로 명명하였다.
이들 균주들을 상기 표 1의 조성으로 만들어진 쓰레오닌 역가배지를 사용하여 비교예 1의 (3)과 동일한 방법으로 L-쓰레오닌 생산성을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 기재하였다.
표 3
균주 L-쓰레오닌 (g/L) 당소모속도 (g/L/hr)
MG1655/pBRThrABCR3 3.86 0.877
MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT1 3.88 1.109
MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT2 3.92 1.035
MG1655/ pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT1-iolT2 3.85 1.123
그 결과, 상기 표 3에 기재된 바와 같이, 모균주인 대장균 MG1655 균주는 48시간 배양하였을 경우 3.86 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였고, 본 실시예에서 수득한 재조합 균주 MG1655/pCC1BAC-iolT1은 3.88 g/L, MG1655/pCC1BAC-iolT2와 MG1655/pCC1BAC-iolT1-iolT2는 각각 3.92 g/L, 3.85 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다. 즉, 모균주와 유사한 수준의 L-쓰레오닌을 생산하였다.
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 야생형 모균주인 대장균 MG1655 균주는 0.877 g/L/hr의 당소모 속도를 나타내었으나, MG1655/pCC1BAC-iolT2는 1.035 g/L/hr, MG1655/pCC1BAC-iolT1은 1.109 g/L/hr, MG1655/pCC1BAC-iolT1-iolT2는 1.123 g/L/hr를 나타내었다. 이는 모균주 대비 각각 18.0%, 26.5%, 그리고 28.1% 향상된 당소모 속도이다.
(2) 대장균 KCCM 10541을 이용한 재조합 균주의 제조
상기 실시예 1에서 제조한 재조합벡터 pCC1BAC-iolT1, pCC1BAC-iolT2 및 pCC1BAC-iolT1-iolT2를 각각 모균주로서 L-쓰레오닌 생산균주인 대장균 KCCM10541에 전기천공법으로 도입하여 클로람페니콜 15 ㎍/㎖이 포함된 고체배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다.
상기 선별된 균주를 각각 KCCM10541/pCC1BAC-iolT1, KCCM10541/pCC1BAC-iolT2 및 KCCM10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2로 명명하였다.
이들 균주들을 상기 비교예 1의 (2)에서 수득한 재조합 미생물과 함께, 상기 표 1의 조성으로 만들어진 쓰레오닌 역가배지를 사용하여 비교예 1의 (3)과 동일한 방법으로 L-쓰레오닌 생산성을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 기재하였다.
표 4
균주 L-쓰레오닌 (g/L) 당소모속도 (g/L/hr)
KCCM 10541 30.3 0.823
KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1 29.5 1.213
KCCM 10541/pCC1BAC-iolT2 32.5 1.093
KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2 29.9 1.200
KCCM 10541/pCC1BAC-galP 29.8 0.862
KCCM 10541/pCL1920-galP 29.3 0.884
그 결과, 상기 표 4에 기재된 바와 같이, 모균주인 대장균 KCCM 10541 균주는 48시간 배양하였을 경우 30.3 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였고, 본 발명의 상기 실시예 2-(2)에서 수득한 재조합 균주 KCCM 10541/pCC1BAC-iolT2는 모균주보다 2.2 g/L 향상된 L-쓰레오닌 생산성을 나타내었고, KCCM10541/pCC1BAC-iolT1과 KCCM10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2는 각각 29.5 g/L, 29.9 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다. 즉, 모균주와 유사한 수준의 L-쓰레오닌을 생산하였다.
대장균 유래 galP 유전자의 발현이 강화된 균주 KCCM 10541/pCC1BAC-galP와 KCCM 10541/pCL1920-galP는 각각 29.8 g/L와 29.3 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다.
표 4에서 보는 바와 같이, 모균주인 대장균 KCCM 10541 균주는 0.823 g/L/hr의 당소모 속도를 나타내었으나, KCCM 10541/pCC1BAC-iolT2는 1.093 g/L/hr, KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2는 1.200 g/L/hr, KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1은 1.213 g/L/hr를 나타내었고, 이는 모균주 대비 각각 32.8%, 45.8%, 그리고 47.4% 향상된 당소모 속도이다. 또한 이는 KCCM 10541/pCC1BAC-galP와 KCCM 10541/pCL1920-galP의 당소모 속도가 모균주 대비 각각 4.7%, 7.4% 증가한 것과 비교했을 때, 코리네박테리움 iolT1, iolT2 유전자 도입 균주의 당소모 속도가 월등히 큰 폭으로 향상된 것임을 확인할 수 있다.
상기 형질전환된 대장균 KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1을 CA03-0230, KCCM 10541/pCC1BAC-iolT2를 CA03-0260, KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2를 CA03-0231로 명명하고 2013년 02월 05일에 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 이하 'KCCM' 이라 약칭함)에 각각 수탁번호 KCCM11370P, KCCM11369P 및 KCCM11371P로 기탁하였다.
상기의 결과들은 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 대장균에 대장균 유래 글루코스 퍼미아제의 발현을 강화한 경우보다, 코리네형 미생물 유래의 퍼미아제의 발현을 강화, 즉 iolT1, iolT2 유전자를 하나이상 도입한 경우에 당소모 속도가 증가하고, 동일 농도의 쓰레오닌을 생산하는 데 소요되는 시간이 단축되어, 즉 쓰레오닌 생산성이 증가하는 것을 뒷받침한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11370P
수탁일자 : 20130205
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11369P
수탁일자 : 20130205
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11371P
수탁일자 : 20130205
Figure PCTKR2014003649-appb-I000001
Figure PCTKR2014003649-appb-I000002
Figure PCTKR2014003649-appb-I000003

Claims (5)

  1. 코리네형 세균 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 퍼미아제(permease)를 포함하도록 형질전환된, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 재조합 에스케리키아 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 재조합 에스케리키아 속 미생물.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 1 및 서열번호 2의 코리네형 유래의 퍼미아제가 모두 포함되도록 형질전환된, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 재조합 에스케리키아 속 미생물.
  4. 제1항에 있어서,
    미생물이 대장균인 재조합 에스케리키아 속 미생물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 미생물을 접종하여 배양하는 단계; 및
    상기 배양물로부터 L-아미노산을 분리하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법.
PCT/KR2014/003649 2013-02-13 2014-04-25 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법 WO2015122569A1 (ko)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201480075400.7A CN106029869B (zh) 2014-02-12 2014-04-25 具有l-苏氨酸生产力的重组埃希氏杆菌属微生物及利用该微生物生产l-苏氨酸的方法
EP14882402.2A EP3106516B1 (en) 2014-02-12 2014-04-25 Recombinant microorganism of genus escherichia with l-threonine productivity, and method for producing l-threonine using same
BR112016016773-2A BR112016016773B1 (pt) 2013-02-13 2014-04-25 Micro-organismos recombinantes do gênero escherichia com produtividade de l-treonina e método de produzir l-treonina usando os mesmos
UAA201609357A UA118213C2 (uk) 2014-02-12 2014-04-25 Рекомбінантний штам мікроорганізму escherichia coli з підвищеним продукуванням l-треоніну та спосіб одержання l-треоніну за допомогою цього штаму мікроорганізму
JP2016551216A JP6412147B2 (ja) 2013-02-13 2014-04-25 Ｌ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物およびこれを用いたｌ−スレオニンの産生方法
KR1020147030960A KR101689451B1 (ko) 2014-02-12 2014-04-25 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법
US15/112,992 US10053698B2 (en) 2013-02-13 2014-04-25 Recombinant microorganisms of Escherichia with L-threonine productivity and method of producing L-threonine using the same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2014/001154 WO2014126384A1 (ko) 2013-02-13 2014-02-12 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법
KRPCT/KR2014/001154 2014-02-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015122569A1 true WO2015122569A1 (ko) 2015-08-20

Family

ID=53801755

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2014/003649 WO2015122569A1 (ko) 2013-02-13 2014-04-25 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP3106516B1 (ko)
KR (1) KR101689451B1 (ko)
CN (1) CN106029869B (ko)
UA (1) UA118213C2 (ko)
WO (1) WO2015122569A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115348969A (zh) * 2021-04-07 2022-11-15 Cj第一制糖株式会社 新糖转运蛋白家族mfs转运蛋白变体及使用其生产l-缬氨酸的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2020009840A (es) 2018-03-23 2020-10-14 Cj Cheiljedang Corp Granulos que comprenden l-aminoacido y procedimiento de preparacion de los mismos.
CN113046282A (zh) * 2019-12-26 2021-06-29 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高转化率的l-苏氨酸的生产菌株及其构建方法与应用
KR102603624B1 (ko) 2020-11-05 2023-11-17 주식회사 엘지화학 포도당으로부터 3-히드록시프로피온산의 생산능을 가지는 미생물 및 이의 용도
KR20230108789A (ko) * 2022-01-11 2023-07-19 대상 주식회사 L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아 속 변이주 및 이를 이용한 l-히스티딘의 생산 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060257979A1 (en) * 2005-05-03 2006-11-16 Degussa Ag. Process for preparing L-amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
US7332310B2 (en) * 1999-12-16 2008-02-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Mutant of homoserine dehydrogenase from Corynebacterium and DNA encoding thereof
KR101058894B1 (ko) * 2009-03-03 2011-08-23 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 생산 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 생산방법
KR101145943B1 (ko) * 2010-03-11 2012-05-15 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10314618A1 (de) * 2003-04-01 2004-10-14 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7332310B2 (en) * 1999-12-16 2008-02-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Mutant of homoserine dehydrogenase from Corynebacterium and DNA encoding thereof
US20060257979A1 (en) * 2005-05-03 2006-11-16 Degussa Ag. Process for preparing L-amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
KR101058894B1 (ko) * 2009-03-03 2011-08-23 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 생산 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 생산방법
KR101145943B1 (ko) * 2010-03-11 2012-05-15 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONG, XUNYAN ET AL.: "Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for the production of L-threonine", BIOTECHNOLOGY ADVANCES, vol. 29, no. 1, 3 August 2010 (2010-08-03), pages 11 - 23, XP027555933, ISSN: 0734-9750 *
See also references of EP3106516A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115348969A (zh) * 2021-04-07 2022-11-15 Cj第一制糖株式会社 新糖转运蛋白家族mfs转运蛋白变体及使用其生产l-缬氨酸的方法
CN115348969B (zh) * 2021-04-07 2023-09-12 Cj第一制糖株式会社 新糖转运蛋白家族mfs转运蛋白变体及使用其生产l-缬氨酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106029869A (zh) 2016-10-12
UA118213C2 (uk) 2018-12-10
EP3106516A4 (en) 2017-11-01
KR20150105600A (ko) 2015-09-17
EP3106516B1 (en) 2024-06-05
EP3106516A1 (en) 2016-12-21
CN106029869B (zh) 2020-03-20
KR101689451B1 (ko) 2017-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100838038B1 (ko) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR100838035B1 (ko) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
WO2019160301A1 (ko) 시트레이트 신타아제의 활성이 약화된 변이형 폴리펩타이드 및 이를 이용한 l-아미노산 생산방법
WO2019027267A2 (ko) Atp 포스포리보실 전이효소 변이체 및 이를 이용한 l-히스티딘 생산방법
WO2009096689A2 (ko) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
WO2013105827A2 (ko) 퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법
WO2013095071A2 (ko) Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는 방법
KR100789270B1 (ko) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는 방법
KR20070056807A (ko) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는 방법
WO2010093182A2 (ko) Ｌ-아미노산 생산용 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
WO2015122569A1 (ko) L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법
WO2014126384A1 (ko) L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법
WO2009096690A2 (ko) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
WO2015163718A1 (ko) 퓨트레신 생산 변이주 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
WO2016171392A1 (ko) 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법
WO2015064917A1 (ko) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
WO2021112469A1 (ko) 신규한 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 류신 생산방법
WO2017034165A1 (ko) L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법
WO2017007159A1 (ko) Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
WO2017034164A1 (ko) L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법
WO2014175663A1 (ko) L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법
WO2015199406A1 (ko) L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법
EP3119875A1 (en) Microorganisms producing l-amino acids and process for producing l-amino acids using the same
WO2020067618A1 (ko) 알파-글루코시다제의 활성이 강화된 l-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
WO2022191357A1 (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20147030960

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14882402

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014882402

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014882402

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15112992

Country of ref document: US

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112016016773

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016551216

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: IDP00201605310

Country of ref document: ID

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: A201609357

Country of ref document: UA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112016016773

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20160720