WO2014175663A1 - L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법 - Google Patents

L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2014175663A1
WO2014175663A1 PCT/KR2014/003570 KR2014003570W WO2014175663A1 WO 2014175663 A1 WO2014175663 A1 WO 2014175663A1 KR 2014003570 W KR2014003570 W KR 2014003570W WO 2014175663 A1 WO2014175663 A1 WO 2014175663A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
arginine
corynebacterium
microorganism
aspa
aspartate
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/003570
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
배현애
강민경
이한형
김혜원
이성근
Original Assignee
씨제이제일제당(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이제일제당(주) filed Critical 씨제이제일제당(주)
Priority to ES14788335T priority Critical patent/ES2761590T3/es
Priority to BR112015026761-0A priority patent/BR112015026761B1/pt
Priority to JP2016510620A priority patent/JP6218929B2/ja
Priority to US14/785,759 priority patent/US10266858B2/en
Priority to CN201480023370.5A priority patent/CN105143439B/zh
Priority to EP14788335.9A priority patent/EP2990475B1/en
Priority to PL14788335T priority patent/PL2990475T3/pl
Publication of WO2014175663A1 publication Critical patent/WO2014175663A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01001—Aspartate transaminase (2.6.1.1), i.e. aspartate-aminotransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01001—Aspartate ammonia-lyase (4.3.1.1), i.e. aspartase

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant Corynebacterium microorganism with improved L-arginine production capacity and a method for producing L-arginine using the microorganism.
  • L-arginine is freely contained in plant seeds and garlic, and is also used as an amino acid-enhancing agent and widely used in medicines and foods. It is used in medicine for liver function promoter, brain function enhancer, male infertility drug, synthetic amino acid preparation, etc., and for food, fish jelly additive, health drink additive, and salt substitute for hypertension patients have recently been spotlighted.
  • Microorganisms of the genus Corynebacterium produce L-arginine biosynthesis via a cyclic step pathway, and L-arginine is derived from L-glutamate by N-acetylglutamate, N-acetylglutamil phosphate ( N-acetylglutamyl phosphate, N-acetylglutamate semialdehyde, N-acetylornithine, ornithine, citrulline, and argininosuccinate Synthesized via
  • Corynebacterium glutamicum is known to be subject to feedback inhibition by intracellular arginine (Vehary Sakanyan, et al, Microbiology, 142: 9-108, 1996), resulting in high yield of L-arginine It is known that there is a limit in producing.
  • citrulline is combined with aspartate to be arginosuccinate and releases fumarate to be arginine.
  • aspartate ammonia-lyase (aspA) is an enzyme that synthesizes aspartate from fumarate and ammonia (FIG. 1)
  • aspartate aminotransferase (aspB) is aspartic acid and glutamic acid.
  • an enzyme having a catalytic function of synthesizing various L-amino acids by transferring an amino group from various L-amino acids such as aminobutyric acid to ketoacids such as ⁇ -ketoglutaric acid and ⁇ -ketoisovaleric acid.
  • the present inventors have enhanced the expression of aspartate ammonia lyase enzyme and / or aspartate aminotransferase enzyme to increase the influx of aspartate binding to citrulline, thereby providing a Corynebacterium microorganism with improved production capacity of L-arginine. It was confirmed that the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a microorganism of the genus Corynebacterium with improved production capacity of L-arginine.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing L-arginine using the Corynebacterium microorganism.
  • the present invention provides a Corynebacterium microorganism with enhanced activity of aspartate ammonia lyase to improve L-arginine production capacity.
  • the present invention also provides a method for producing L-arginine by culturing the Corynebacterium microorganism.
  • the present invention provides a recombinant Corynebacterium genus microorganism having enhanced aspartate ammonia lyase activity or additionally enhanced aspartate aminotransferase activity, thereby improving L-arginine production capacity, and the recombinant corynebacterium genus Microorganisms can produce L-arginine in high yield and thus can be usefully used in industry.
  • Figure 1 shows the pathway for synthesizing arginine from citrulline and the pathway for synthesizing aspartate from fumarate.
  • the present invention provides a microorganism of the genus Corynebacterium with improved production capacity of L-arginine.
  • the term 'L-arginine productivity' refers to the ability to accumulate L-arginine in the medium when the microorganism of the genus Corynebacterium of the present invention is cultured in the medium.
  • L-arginine production capacity may be a property of wild-type strains of the genus Corynebacterium, or may be added or enhanced by artificial variation.
  • Corynebacterium microorganisms can be bred to be resistant to arginine hydroxamate to confer production capacity of L-arginine; Can be bred to have a trophic composition for succinic acid or to be resistant to nucleic acid base homologs; Can't metabolize arginine and can be bred to be resistant to arginine antagonists and cannabanine and nutritional to lysine; Can be bred to be resistant to arginine, arginine hydroxamate, homoarginine, D-arginine and cannabanine or to arginine hydroxamate and 6-azauracil; May be bred tolerant to cannabanin.
  • L-arginine may be given by modifying the genus Corynebacterium microorganisms to enhance the expression of the gene encoding the L-arginine biosynthetic enzyme.
  • L-arginine biosynthetic enzymes include N-acetylglutamyl phosphate reductase (argC), ornithine acetyl transferase (argJ), N-acetylglutamate kinase (argB), acetylornithine transaminase (argD), ornithine Carbamoyl transferase (argF), argininosuccinic acid synthetase (argG), argininosuccinic acid lyase (argH), and carbamoyl phosphate synthetase.
  • argC N-acetylglutamyl phosphate reductase
  • argJ ornithine acetyl transferas
  • arginine biosynthetic enzymes are present on Arg operon (argCJBDFRGH) and regulated by an arginine refresher encoded by argR (J Bacteriol. 2002 Dec; 184 (23): 6602-14.).
  • argCJBDFRGH Arg operon
  • argR arginine refresher encoded by argR
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having L-arginine producing ability is not particularly limited as long as it has the ability to produce L-arginine.
  • it may be Corynebacterium glutamicum capable of producing L-arginine, more preferably Corynebacterium glutamicum KCCM10741 (Korean Patent No. 0791659) and Corynebacterium glutamicum ATCC21831 Can be.
  • the present invention provides a Corynebacterium microorganism with enhanced activity of aspartate ammonia lyase to improve L- arginine production capacity.
  • Aspartate ammonia-lyase is an enzyme that synthesizes aspartate from fumarate and ammonia, so aspartate synthesis is increased through enhanced expression of the aspartate ammonia lyase and increased by aspartate.
  • the productivity of L-arginine can be increased.
  • the aspartate ammonia lyase can be used as long as it is an enzyme derived from any microorganism as long as it is an enzyme having the activity, preferably an enzyme derived from Escherichia microorganism or coryneform microorganism, more preferably E. coli or Enzymes derived from Corynebacterium glutamicum can be utilized.
  • the aspartate ammonia lyase may have an amino acid sequence specifically as set forth in SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 22.
  • Aspartate ammonia lyase derived from Corynebacterium microorganism having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 is encoded by aspA (NCgl1446) having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 23, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22
  • Aspartate ammonia lyase from the genus Escherichia microorganism is encoded by aspA (NCBI GENE ID: 12933698) having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 24.
  • the amino acid sequence of the protein is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more Aspartate ammonia lyase having homology is also included in the present invention. Homology to the amino acid sequence is described, for example, in the algorithm BLAST by Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] or FASTA by Pearson (Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Based on this algorithm BLAST, a program called BLASTN or BLASTX has been developed (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the present invention further provides a Corynebacterium microorganism with enhanced activity of aspartate aminotransferase.
  • the aspartate aminotransferase is derived from a Corynebacterium microorganism having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and encoded by aspB (NCgl0237) having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26.
  • the amino acid sequence of the protein is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97 Aspartate aminotransferases having a homology of at least% are also included in the present invention.
  • homology to the amino acid sequence is described, for example, in the algorithm BLAST by Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] or FASTA by Pearson (Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Based on this algorithm BLAST, a program called BLASTN or BLASTX has been developed (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the present invention provides a Corynebacterium microorganism with enhanced activity of both aspartate ammonia lyase and aspartate aminotransferase.
  • the present invention is characterized in that the activity of aspartate ammonia lyase and / or aspartate aminotransferase in the microorganism of the genus Corynebacterium having L-arginine production capacity is enhanced (or increased) than the original activity.
  • non-arginine activity refers to the activity of the Corynebacterium microorganisms having L-arginine production capacity without any genetic manipulation or modification to modulate the activity of the enzymes.
  • the "reinforcement” or “increase” means that the L-arginine production capacity is improved than the original activity of the genus Corynebacterium having L-arginine production capacity.
  • Enhancement (or increase) of the activity of the present invention allows the application of various methods well known in the art.
  • Examples of the method include nucleotide sequences encoding aspartate ammonia lyase and / or aspartate aminotransferase by introducing a polynucleotide encoding aspartate ammonia lyase and / or aspartate aminotransferase into a vector system.
  • aspartate ammonia lyase and / or aspartate aminotransfer to enhance the activity of aspartate ammonia lyase and / or aspartate aminotransferase of Corynebacterium microorganisms having L-arginine production capacity.
  • a method of increasing the copy number of a gene by introducing a gene encoding a lagase into a vector and transforming Corynebacterium microorganisms can be used.
  • the term "transformation” means introducing a vector comprising a polynucleotide encoding the target protein into the host cell so that the protein encoded by the polynucleotide in the host cell can be expressed.
  • the introduced polynucleotide can be located in the chromosome of the host cell or located outside the chromosome as long as it can be expressed in the host cell.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced into and expressed in a host cell.
  • a recombinant microorganism containing the genes was introduced into a host microorganism to prepare a transformed microorganism, and an L-arginine producing strain containing 2 copies of the gene in a chromosome was isolated through a second crossover process. .
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target protein operably linked to a suitable regulatory sequence to allow expression of the target protein in a suitable host.
  • the regulatory sequence includes a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in the host, and any vector known in the art may be used. Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • the Corynebacterium glutamicum (KCCM11351P) strain transformed by the method of the present invention encodes aspartate ammonia lyase obtained by PCR from the chromosome of Corynebacterium glutamicum ATCC21831, a production strain of L-arginine. It is a transformed microorganism which increased the expression of aspA by inserting aspA into a vector and then introducing it into L-arginine producing strain Corynebacterium glutamicum KCCM10741P. It was confirmed that the strain KCCM11351P transformed by the method according to the present invention can produce L-arginine in high yield through overexpression of aspA .
  • the present invention also provides a method for producing L-arginine by culturing the transformed Corynebacterium microorganism.
  • the culturing process of the transformed L-arginine overexpressing microorganism may be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art.
  • This culture process can be used by those skilled in the art can be easily adjusted according to the strain selected.
  • Examples of the culture method include, but are not limited to, batch culture, continuous culture, and fed-batch culture. Such various culture methods are disclosed, for example, in "Biochemical Engineering” (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176, 1991).
  • raw sugar or glucose is used as a main carbon source
  • molasses containing a large amount of raw sugar may also be used as a carbon source
  • other appropriate amounts of carbon source may be used in various ways, and preferably, purified glucose may be used.
  • nitrogen sources include organic nitrogen sources and urea such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, and soybean wheat, inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate Included, preferably peptone. These nitrogen sources may be used alone or in combination.
  • the medium may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and the corresponding sodium-containing salts as personnel. It may also include metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate. In addition, amino acids, vitamins and appropriate precursors may be included. These media or precursors may be added batchwise or continuously to the culture.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress bubble generation.
  • oxygen or an oxygen-containing gas eg, air
  • the temperature of the culture is usually 45 ° C., preferably 25 ° C.-40 ° C., at 20 ° C.
  • the incubation period can continue until the desired L-arginine yield is obtained, preferably 10 to 160 hours.
  • Isolation of L-arginine from the culture can be separated by conventional methods known in the art.
  • methods such as centrifugation, filtration, ion exchange chromatography, and crystallization may be used.
  • the supernatant obtained by removing the biomass by centrifugation of the culture at low speed can be separated by ion exchange chromatography.
  • an aspA- deficient vector was produced and transformed to L-arginine by transforming L-arginine producing strain Corynebacterium glutamicum KCCM10741P (Korean Patent Registration No. 0791659). Productivity was evaluated.
  • the prepared pDKO1446 vector was transformed into L-arginine producing strain Corynebacterium glutamicum KCCM10741P, and the L-arginine producing strain having aspA deletion on the chromosome was obtained through the second crossover process.
  • the selected strain was named KCCM10741 ⁇ aspA .
  • Corynebacterium glutamicum KCCM10741 ⁇ aspA a recombinant L-arginine producing strain prepared above, was cultured as follows to determine the effect of deletion of aspA on L-arginine production capacity.
  • a 2copy vector of aspA (Ncgl1446)
  • a gene encoding aspartate ammonia lyase derived from Corynebacterium a primer and sequence of SEQ ID NOs: 5 and 6 were used as a template of the Corynebacterium glutamicum ATCC21831 chromosome.
  • PCR was performed using primers 7 and 8 to obtain DNA fragments each containing aspA .
  • the obtained DNA fragments were separated by GeneAll R Expin TM GEL SV kit (Seoul, Korea), the first fragment was treated with Xma I and Bam HI, the second fragment was treated with Bam HI and Xba I, and the pD vector was Treatment with Xma I and Xba I.
  • a restriction enzyme treated pD vector and two DNA fragments were ligated to prepare a pD1446-2X vector.
  • the pD1446-2X vector prepared in Example 2 was transformed into L-arginine producing strains, Corynebacterium glutamicum KCCM10741P and Corynebacterium glutamicum ATCC21831, respectively, and aspA on the chromosome through the second crossover process. L-arginine producing strains containing 2copy were obtained. The resulting strains were named KCCM10741P :: aspA _2X and ATCC21831 :: aspA _2X, respectively.
  • aspB (Ncgl0237) 2copy vector In order to construct aspB (Ncgl0237) 2copy vector, a gene encoding aspartate aminotransferase, a primer of SEQ ID NOs: 9 and 10 and a primer of SEQ ID NOs: 11 and 12 were used as a template for the Corynebacterium glutamicum ATCC21831 chromosome. PCR was performed using primers to obtain DNA fragments each containing aspB .
  • the obtained DNA fragments were separated by GeneAll R Expin TM GEL SV kit (Seoul, Korea), the first fragment was treated with Xma I and Nde I, the second fragment with Nde I and Spe I, and the pD vector Treatment with Xma I and Xba I.
  • the pD0237-2X vector was constructed by restriction fragment-treated pD vector and three piece ligation of two DNA fragments.
  • the pD0237-2X vector prepared in Example 4 was transformed into L-arginine producing strains, Corynebacterium glutamicum KCCM10741P and Corynebacterium glutamicum ATCC21831, respectively, and subjected to aspB on the chromosome through a second crossover process. L-arginine producing strains containing 2copy were obtained. The resulting strains were named KCCM10741P :: aspB _2X and ATCC21831 :: aspB _2X, respectively .
  • Example 4 The pD0237-2X recombinant microorganism KCCM10741P prepare a vector in Example 3 produced in :: aspA _2X and ATCC21831 :: aspA to _2X switch each transfection, and on the chromosome via a second cross-process aspA and aspB L-arginine producing strains containing 2copy were obtained.
  • the resulting strains were named KCCM10741P :: aspA _2X :: aspB _2X and ATCC21831 :: aspA _2X :: aspB _2X, respectively .
  • L-arginine producing strain Corynebacterium glutamicum KCCM10741P produced in Examples 3, 5 and 6 aspA _2X, ATCC21831 :: aspA _2X, KCCM10741P :: aspB _2X, ATCC21831 :: aspB _2X, KCCM10741P :: :: aspA _2X aspB _2X and ATCC21831 :: ::: aspA _2X aspB using _2X aspA aspB reinforced or reinforced or aspA and aspB simultaneously strengthened and incubated in the same way and to in order to understand the impact neunge production of L- arginine .
  • Corynebacterium glutamicum KCCM10741P and ATCC21831 which were host cells, were cultured, and 1 platinum strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the production medium as in Example 1. And incubated at 200 rpm for 48 hours at 30 ° C. After the end of the culture, the yield of L-arginine was measured by HPLC, and the results are shown in Table 2 below.
  • KCCM10741P : aspA _2X significantly improved L-arginine production capacity by 30% compared to the control group, and as of January 21, 2013, the Korean spawn association, an international depository institution located at 361-221 Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea It was deposited with the accession number KCCM11351P at the Korea Microorganism Conservation Center.
  • a glutamate exporter for introducing aspA (NCBI-GeneID: 12933698), a gene encoding aspartate ammonia lyase from the genus Escherichia, into the chromosome of Corynebacterium glutamicum with L-arginine production capacity Ncgl1221 site, known as exporter, was used (yggB: Appl Environ Microbiol. 2007 Jul; 73 (14): 4491-8).
  • a pDKO1221 vector including a site specific gene disruption of Ncgl1221 was first constructed.
  • the chromosome of Corynebacterium glutamicum ATCC21831 was extracted to obtain a DNA fragment missing the site-specific gene of Ncgl1221, and the chromosome was subjected to cross PCR as a template. Specifically, using the primers of SEQ ID NOS: 13 and 14, denaturing at 94 ° C. for 1 minute, annealing at 58 ° C. for 30 seconds, and polymerizing for 60 seconds at 72 ° C. through PCR method of repeating 30 times with Pfu polymerase 5 About 789 bp fragments with EcoRI restriction sites in the region were amplified.
  • primers of SEQ ID NOs: 15 and 16 were used to amplify fragments of about 835 bp base pairs having Pst I restriction sites in the 3 'region by the PCR method described above.
  • the obtained DNA fragments were separated by GeneAll R Expin TM GEL SV kit (Seoul, Korea) and used as a template for cross PCR.
  • cross PCR was performed using the two DNA fragments obtained as a template using the primers of SEQ ID NOs: 13 and 16. Specifically, about 1602 bp fragment was amplified by the PCR method described above. The amplified fragment was treated with the restriction enzymes Eco RI and Pst I, and then pDKO1221 vector was prepared by ligation with the pD vector treated with the same restriction enzyme.
  • the pDKO1221 vector was used to prepare a vector into which Escherichia spp. AspA was introduced.
  • the cj7 promoter operating on Corynebacterium glutamicum is p117 pcj7-gfp (Korean Patent Application No. 10-2004-0107215) using a primer of SEQ ID NOs: 17 and 18 as a template at 1 Amplification of the fragment of about 524 bp with Bam HI restriction enzyme site in the 5 'region by PCR method of denaturation for 30 minutes, annealing for 30 seconds at 58 ° C, and polymerization for 30 seconds at 72 ° C with Pfu polymerase. It was.
  • the Escherichia genus aspA was extracted using the Escherichia coli W3110 chromosome using the QIAGEN Genomic-tip system of Kaizen, which was described above using the primers of SEQ ID NOs: 19 and 20 as templates.
  • PCR a fragment of about 1607 bp having an Xba I restriction site in the 3 'region was amplified.
  • the obtained DNA fragments were separated by GeneAll R Expin TM GEL SV kit (Seoul, Korea) and used as a template for cross PCR.
  • cross PCR was performed using the two DNA fragments obtained as a template using the primers of SEQ ID NOs: 17 and 20. Specifically, about 2095 bp fragment was amplified by the PCR method described above. The amplified fragment was prepared for restriction enzyme Bam HI and then treated with Xba I, pDKO1221-EC_ aspA vector through a treatment with such enzymes pDKO1221 vector and ligated.
  • Example 9 derived from the genus Escherichia aspA Preparation of recombinant strains with enhanced expression
  • the prepared pDKO1221 vector was transformed into L-arginine producing strains Corynebacterium glutamicum KCCM10741P and ATCC21831, and through the second crossover process, KCCM10741P ⁇ Ncgl1221 and ATCC21831 ⁇ Ncgl1221 strains having NCgl1221 deleted on chromosomes were obtained.
  • Corynebacterium glutamicum KCCM10741P, ATCC21831, KCCM10741P ⁇ Ncgl1221 and ATCC21831 ⁇ Ncgl1221 were used as a control group, and a strain of 1 platinum was used in a 250 ml corner-full flask containing 25 ml of production medium (Note 1). Inoculation was incubated at 200 rpm for 48 hours at 30 ° C. After completion of the culture, the production amount of L-arginine was measured by HPLC, and the results are shown in Table 3 below.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성이 강화되어 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 상기 코리네박테리움속 미생물을 이용하여 L-아르기닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 L-아르기닌의 생산 방법
본 발명은 L-아르기닌 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움속 미생물 및 이 미생물을 이용하여 L-아르기닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-아르기닌은 식물 종자나 마늘 중에 유리 상태로 함유되어 있으며, 아미노산류 강화제로도 사용되고, 의약품, 식품 등에도 널리 이용된다. 의약용으로는 간 기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 남성 불임 치료제, 종합 아미노산 제제 등에 사용되고 있으며, 식품용으로는 생선묵 첨가제, 건강 음료 첨가제, 고혈압 환자의 식염 대체용으로 최근 각광받고 있는 물질이다.
코리네박테리움(Corynebacterium)속 미생물은 고리형 단계 경로를 통해 L-아르기닌의 생합성이 이루어지며, L-아르기닌은 L-글루타메이트로부터 N-아세틸글루타메이트(N-acetylglutamate), N-아세틸글루타밀포스페이트(N-acetylglutamyl phosphate), N-아세틸글루타메이트 세미알데히드(N-acetylglutamate semialdehyde), N-아세틸오르니틴(N-acetylornithine), 오르니틴(ornithine), 시트룰린(citrulline), 및 아르기니노숙시네이트(argininosuccinate)를 거쳐서 합성된다.
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰은 세포 내 아르기닌에 의해서 피드백 저해(feedback inhibition)를 받는 것으로 알려져 있어(Vehary Sakanyan, et al, Microbiology, 142:9-108, 1996), 고수율의 L-아르기닌을 생산하는 데에는 한계가 있는 것으로 알려져 있다.
이케다 등은 아르기닌 발효시 발효 배지상에 시트룰린이 축적됨을 보고하였다(Appl Environ Microbiol. 2009 Mar;75(6):1635-41. Epub 2009 Jan 9).
상기 생합성 과정에서, 시트룰린은 아스파테이트(aspartate)와 결합하여 아르기노숙시네이트로 되고, 푸마레이트(fumarate)를 방출하여 아르기닌이 된다. 여기에서, 아스파테이트 암모니아 리아제(aspartate ammonia-lyase, aspA)는 푸마레이트와 암모니아로부터 아스파테이트를 합성하는 효소이고(도 1), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase, aspB)는 아스파르트산, 글루탐산, 아미노부티르산 등의 다양한 L-아미노산으로부터 아미노기를 α-케토글루타르산, α-케토이소발레르산 등의 케토산에 전이시킴으로써 다양한 L-아미노산을 합성하는 촉매 기능을 가진 효소이다.
멘켈 등은 대장균의 aspA를 코리네형 미생물에 도입한 경우 아스파테이트의 이용성이 증가되어 L-라이신의 생산이 증가하였음을 보고하였다(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Mar. 1989, p. 684-688).
이에 본 발명자들은 아스파테이트 암모니아 리아제 효소 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 효소의 발현을 강화시켜 시트룰린과 결합하는 아스파테이트의 유입을 늘림으로써 L-아르기닌의 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물을 제공할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 L-아르기닌의 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 코리네박테리움속 미생물을 이용하여 L-아르기닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아스파테이트 암모니아 리아제의 활성이 강화되어 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 코리네박테리움속 미생물을 배양하여 L-아르기닌을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 아스파테이트 암모니아 리아제 활성이 강화되거나 여기에 추가로 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성이 강화되어 L-아르기닌 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움속 미생물을 제공하며, 상기 재조합 코리네박테리움속 미생물은 L-아르기닌을 고수율로 생산할 수 있으므로 산업상 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 시트룰린으로부터 아르기닌을 합성하는 경로 및 푸마레이트로부터 아스파테이트를 합성하는 경로를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명은 L-아르기닌의 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명에서, 상기 용어 'L-아르기닌 생산능(L-arginine productivity)'은 본 발명의 코리네박테리움속 미생물을 배지 속에서 배양할 시에 배지 속에 L-아르기닌을 축적시키는 능력을 의미한다. 이러한 L-아르기닌 생산 능력은 코리네박테리움속 미생물의 야생형 균주의 특성, 또는 인위적인 변이에 의해 첨가 또는 증강된 특성일 수 있다.
예를 들어, L-아르기닌의 생산 능력 부여를 위하여 코리네박테리움속 미생물은 아르기닌 하이드록사메이트에 내성을 갖도록 육종될 수 있고; 숙신산에 대해 영양요구성을 갖거나 핵산 염기 동족체에 대해 내성을 갖도록 육종될 수 있고; 아르기닌을 물질 대사시킬 수 없고 아르기닌 길항제 및 카나바닌에 내성을 가지며 리신에 영양요구성을 갖도록 육종될 수 있고; 아르기닌, 아르기닌 하이드록사메이트, 호모아르기닌, D-아르기닌 및 카나바닌에 내성을 갖도록 또는 아르기닌 하이드록사메이트 및 6-아자우라실에 내성을 갖도록 육종될 수 있으며; 카나바닌에 내성을 갖도록 육종될 수 있다.
또한, L-아르기닌의 생산 능력은 L-아르기닌 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증진되도록 코리네박테리움속 미생물을 변형시켜 부여될 수 있다. L-아르기닌 생합성 효소의 예는 N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제 (argC), 오르니틴 아세틸 트랜스퍼라제 (argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제 (argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제 (argD), 오르니틴 카바모일 트랜스퍼라제 (argF), 아르기니노숙신산 신테타제 (argG), 아르기니노숙신산 리아제 (argH), 및 카바모일 포스페이트 신테타제를 포함한다. 이들 아르기닌 생합성 효소는 Arg 오페론 (argCJBDFRGH)상에 존재하고 argR에 의해 암호화된 아르기닌 리프레서에 의해 조절된다(J Bacteriol. 2002 Dec;184(23):6602-14.). 따라서, 아르기닌 리프레서의 약화(US2002-0045223), 또는 상기 생합성 관련 유전자들 중 하나 이상의 유전자를 과발현시킴으로써 L-아르기닌 생산 능력을 부여할 수 있다.
본 발명에서, L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 L-아르기닌을 생산하는 능력을 가지고 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, L-아르기닌을 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741(대한민국 특허등록번호 0791659) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831일 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 아스파테이트 암모니아 리아제의 활성이 강화되어 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.
아스파테이트 암모니아 리아제(aspartate ammonia-lyase, aspA)는 푸마레이트와 암모니아로부터 아스파테이트를 합성하는 효소이므로, 상기 아스파테이트 암모니아 리아제의 발현강화를 통해 아스파테이트의 합성이 증가되며, 증가된 아스파테이트에 의해 L-아르기닌의 생산성이 높아질 수 있다.
본 발명에서, 상기 아스파테이트 암모니아 리아제는 상기 활성을 가지는 효소라면 어떤 미생물 유래의 효소라도 상관없이 활용할 수 있으며, 바람직하게는 에스케리키아속 미생물 또는 코리네형 미생물 유래의 효소, 더욱 바람직하게는 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 효소를 활용할 수 있다. 상기 아스파테이트 암모니아 리아제는 구체적으로 서열번호 21 또는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 코리네박테리움속 미생물 유래의 아스파테이트 암모니아 리아제는 서열번호 23으로 기재되는 염기서열을 가지는 aspA (NCgl1446)에 의해 암호화되며, 상기 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 에스케리키아 속 미생물 유래의 아스파테이트 암모니아 리아제는 서열번호 24로 기재되는 염기서열을 가지는 aspA (NCBI GENE ID: 12933698)에 의해 암호화된다.
본 발명에서 제시한 아스파테이트 암모니아 리아제의 활성을 가지는 단백질인 한, 상기 단백질의 아미노산 서열에 대해서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 아스파테이트 암모니아 리아제 또한 본 발명에 포함된다. 상기 아미노산 서열에 대한 상동성은 예를 들면 문헌에 의한 알고리즘 BLAST [참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]이나 Pearson에 의한 FASTA [참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다[참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov].
상기의 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 추가로 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제는 코리네박테리움속 미생물로부터 유래된 것으로 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 26의 염기서열을 가지는 aspB (NCgl0237)에 의해 암호화된다.
본 발명에서 제시한 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성을 가지는 단백질인 한, 상기 단백질의 아미노산 서열에 대해서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 또한 본 발명에 포함된다. 위에서 언급한 바와 같이 상기 아미노산 서열에 대한 상동성은 예를 들면 문헌에 의한 알고리즘 BLAST [참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]이나 Pearson에 의한 FASTA [참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다[참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov].
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 아스파테이트 암모니아 리아제 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성이 모두 강화된 코리네박테리움속 미생물을 제공한다.
본 발명은 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성이 본래의 활성보다 강화(또는 증가)된 것을 특징으로 한다.
상기 용어 "본래의 활성"이란 상기 효소들의 활성을 조절하기 위한 어떠한 유전적 조작이나 변형이 없는 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움속 미생물이 가지고 있는 활성을 의미한다. 또한, 상기 "강화" 또는 "증가"는 L-아르기닌 생산능이 L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움속 미생물의 본래의 활성보다 향상된 것을 의미한다.
본 발명의 활성 강화(또는 증가)는 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 그 방법의 예로는 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하는 방법 등에 의하여 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 염기서열의 카피수를 증가시키는 방법, 강한 프로모터로 교체하는 방법, 프로모터에 변이를 도입하는 방법, 및 유전자 변이에 의한 방법 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
하나의 구체적 실시에서, L-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움속 미생물의 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성을 강화시키기 위해 아스파테이트 암모니아 리아제 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 암호화하는 유전자를 벡터에 도입하고 코리네박테리움속 미생물을 형질전환시킴으로써 상기 유전자의 카피수를 증가시키는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 용어 "형질전환"은 목적 단백질을 암호화하는 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다.
본 발명의 실시예에서는, 상기 유전자들을 포함하는 재조합 벡터를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물을 제조하였으며, 2차 교차 과정을 거쳐 상기 유전자를 염색체 내에 2copy 포함하는 L-아르기닌 생산 균주를 분리하였다.
본 발명에서, 상기 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다.
본 발명의 방법으로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 (KCCM11351P) 균주는 L-아르기닌의 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831의 염색체로부터 PCR을 통해 수득한 아스파테이트 암모니아 리아제를 코딩하는 aspA를 벡터에 삽입한 후, L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P에 도입함으로써 aspA의 발현을 증가시킨 형질전환된 미생물이다. 본 발명에 의한 방법으로 형질전환된 상기 균주 KCCM11351P는 aspA의 과발현을 통해 L-아르기닌을 고수율로 생산할 수 있음을 확인하였다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 또한 상기 형질전환된 코리네박테리움속 미생물을 배양하여 L-아르기닌을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 L-아르기닌을 제조하는 방법에서, 상기 형질전환된 L-아르기닌 과발현 미생물의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuousculture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은, 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176, 1991) 등에 개시되어 있다.
본 발명에서 사용되는 배지는 원당 혹은 포도당을 주탄소원으로 사용하고, 원당을 다량으로 포함한 당밀 또한 탄소원으로 이용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있으며, 바람직하게는 정제 포도당을 사용한다. 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함되며, 바람직하게는 펩톤을 사용한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태(aerobic condition)를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양기간은 원하는 L-아르기닌 생산량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.
배양물로부터의 L-아르기닌의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: L-아르기닌 생산에서 aspA 유전자의 영향 확인
aspA 가 L-아르기닌 생산에 주요한 유전자인지를 확인하기 위하여, aspA 결손 벡터를 제작하고 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P(대한민국 특허등록 제0791659호)에 형질전환하여 L-아르기닌 생산성을 평가하였다.
(1) aspA 결손 벡터의 제작
염색체에서 아스파테이트 암모니아 리아제를 코딩하는 유전자인 aspA(Ncgl1446) 유전자를 결실하기 위해서, 카이젠사의 게노믹-팁 시스템(QIAGEN Genomic-tip system)을 이용하여 미국생물자원센터(American Type Culture Collection: ATCC)로부터 구매한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831의 염색체를 추출하였고, 이 염색체를 주형(template)으로 교차 PCR을 수행하였다.
구체적으로, 서열번호 1과 2의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 60초간 중합하는 조건을 Pfu 폴리머라아제로 30회 반복하는 PCR 법을 통하여 5' 영역에 XmaI 제한효소 자리를 가진 약 798bp의 단편을 증폭하였다. 그 후, 서열번호 3과 4의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR 법을 통하여 3' 영역에 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 829bp 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편들은 GeneAllR ExpinTM GEL SV키트(Seoul, Korea)로 분리한 후, 교차 PCR을 위한 주형으로 사용하였다.
상기 aspA의 결실을 포함하는 DNA 단편을 확보하기 위해 서열번호 1과 4의 프라이머를 이용해 위에서 얻어진 두 DNA 단편을 주형으로 하여 교차 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 상기 기재된 PCR 법을 통하여 약 1583 bp 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 XmaI 과 XbaI으로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pD 벡터와의 라이게이션을 통해 벡터 pDKO1446를 제작하였다.
(2) 재조합 균주의 제조
상기 제작된 pDKO1446 벡터를 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 aspA가 결실된 L-아르기닌 생산균주를 얻었다. 선별된 균주를 KCCM10741ΔaspA로 명명하였다.
(3) 재조합 균주의 L-아르기닌 생산능 확인
상기 제조된 재조합 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741ΔaspA를 이용하여 aspA의 결실이 L-아르기닌 생산능에 미치는 영향을 파악하기 위하여 하기와 같은 방법으로 배양하였다.
이때, 대조군으로는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P를 배양하여 사용하였으며, 생산 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1백금이의 균주를 접종하고 30℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 배양하였다. 배양종료 후, HPLC로 L-아르기닌의 생산량을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
< 생산배지 >
포도당 6%, 황산암모늄 3%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.2%, CSL(옥수수 침지액) 1.5%, NaCl 1%, 효모 추출물 0.5%, 비오틴 100 mg/L, pH7.2
[규칙 제91조에 의한 정정 17.09.2014]
표 1　
Figure WO-DOC-TABLE-1
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, aspA가 결손된 균주는 L-아르기닌의 생산능이 하락됨을 확인하였으며, aspA가 L-아르기닌의 생산에 있어 주요 유전자임을 확인하였다.
실시예 2: 코리네박테리움 유래 aspA 도입 벡터의 제작
코리네박테리움 유래의 아스파테이트 암모니아 리아제를 코딩하는 유전자인 aspA(Ncgl1446)의 2copy 벡터를 제작하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831 염색체를 주형(template)으로 서열번호 5와 6의 프라이머, 서열번호 7과 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 aspA가 각각 포함된 DNA 단편을 확보하였다.
구체적으로, 서열번호 5와 6의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 2분간 중합하는 조건을 Pfu 폴리머라아제로 30회 반복하는 PCR 법을 통하여 5' 영역에 XmaI와 3' 영역에 BamHI 제한효소 자리를 가진 약 1893 bp의 단편을 증폭하였다. 두 번째로 서열번호 7과 8의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR 법을 통하여 5' 영역에 BamHI와 3' 영역에 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 1885 bp 염기쌍의 단편을 증폭하였다.
얻어진 DNA 단편들은 GeneAllR ExpinTM GEL SV키트(Seoul, Korea)로 분리한 후, 첫 번째 단편은 XmaI 및 BamHI으로 처리하였고, 두 번째 단편은 BamHI 및 XbaI으로 처리하였으며, pD 벡터는 XmaI 및 XbaI으로 처리하였다. 제한효소가 처리된 pD 벡터와 두 DNA 단편을 라이게이션하여 pD1446-2X 벡터를 제작하였다.
실시예 3: aspA 의 발현이 강화된 재조합 균주의 제조
상기 실시예 2에서 제작된 pD1446-2X 벡터를 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831에 각각 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체상에서 aspA 2copy가 포함된 L-아르기닌 생산 균주를 얻었다. 얻어진 균주들을 각각 KCCM10741P::aspA_2X 및 ATCC21831::aspA_2X로 명명하였다.
실시예 4: 코리네박테리움 유래 aspB 도입 벡터의 제작
아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 aspB(Ncgl0237) 2copy 벡터를 제작하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831 염색체를 주형(template)으로 서열번호 9와 10의 프라이머, 서열번호 11과 12의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 aspB가 각각 포함된 DNA 단편을 확보하였다.
구체적으로, 서열번호 9와 10의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 2분간 중합하는 조건을 Pfu polymerase로 30회 반복하는 PCR 법을 통하여 5' 영역에 XmaI과 3' 영역에 NdeI 제한효소 자리를 가진 약 1692 bp의 단편을 증폭하였다. 두 번째로 서열번호 11과 12의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR 법을 통하여 5' 영역에 NdeI과 3' 영역에 SpeI 제한효소 자리를 가진 약 1643 bp의 단편을 증폭하였다.
얻어진 DNA 단편들은 GeneAllR ExpinTM GEL SV키트(Seoul, Korea)로 분리한 후, 첫 번째 단편은 XmaI 및 NdeI으로 처리하였고, 두 번째 단편은 NdeI 및 SpeI으로 처리하였으며, pD 벡터는 XmaI 및 XbaI으로 처리하였다. 제한효소가 처리된 pD 벡터와 두 DNA 단편의 3조각 라이게이션(3 piece ligation)을 통하여 pD0237-2X 벡터를 제작하였다.
실시예 5: aspB 의 발현이 강화된 균주의 제조
상기 실시예 4에서 제작된 pD0237-2X 벡터를 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831에 각각 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 aspB 2copy가 포함된 L-아르기닌 생산균주를 얻었다. 얻어진 균주들을 각각 KCCM10741P::aspB_2X 및 ATCC21831::aspB_2X로 명명하였다.
실시예 6: aspA 및 aspB 의 발현이 강화된 균주의 제조
상기 실시예 4에서 제작된 pD0237-2X 벡터를 상기 실시예 3에서 제조된 재조합 미생물인 KCCM10741P::aspA_2X 및 ATCC21831::aspA_2X에 각각 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 aspA 및 aspB 2copy가 포함된 L-아르기닌 생산균주를 얻었다. 얻어진 균주들을 각각 KCCM10741P::aspA_2X::aspB_2X 및 ATCC21831:: aspA_2X::aspB_2X로 명명하였다.
실시예 7: L-아르기닌 생산능의 평가
상기 실시예 3, 5 및 6에서 제조된 L-아르기닌 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P::aspA_2X, ATCC21831::aspA_2X, KCCM10741P::aspB_2X, ATCC21831::aspB_2X, KCCM10741P::aspA_2X::aspB_2X 및 ATCC21831::aspA_2X::aspB_2X를 이용하여 aspA 강화 또는 aspB 강화 또는 aspA 및 aspB 동시 강화가 L-아르기닌의 생산능에 미치는 영향을 파악하기 위하여 하기와 같은 방법으로 배양하였다.
이때, 대조군으로서는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 및 ATCC21831을 배양하여 사용하였으며, 실시예 1에서와 같은 생산 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 백금이의 균주를 접종하고, 30℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 배양하였다. 배양종료 후, HPLC로 L-아르기닌의 생산량을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 17.09.2014]　
표 2
Figure WO-DOC-TABLE-2
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, aspA 2copy가 도입된 경우 두 가지 유래 코리네박테리움 글루타미쿰에서 모두 L-아르기닌 생산능이 향상되는 결과를 보였다. 특히 KCCM10741P::aspA_2X의 경우 대조군 대비 L-아르기닌 생산능이 30%로 크게 향상되었으며, 이를 2013년 01월 21일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM11351P로 기탁하였다.
실시예 8: 에스케리키아 속 유래 aspA 도입 벡터의 제작
에스케리키아 속 유래의 아스파테이트 암모니아 리아제를 코딩하는 유전자인 aspA(NCBI-GeneID: 12933698)를 L-아르기닌 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 내부에 도입하기 위하여 글루타메이트 엑스포터(glutamate exporter)로 알려져 있는 Ncgl1221 부위(site)를 이용하였다(yggB: Appl Environ Microbiol. 2007 Jul;73(14):4491-8).
Ncgl1221 부위에 에스케리키아 속 유래의 aspA가 도입된 벡터를 제작하기 위하여 우선, Ncgl1221의 부위 특이적 유전자 결실(site specific gene disruption)을 포함하는 pDKO1221 벡터를 제작하였다.
Ncgl1221의 부위 특이적 유전자가 소실된 DNA 단편을 확보하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831의 염색체를 추출하였고, 이 염색체를 주형(template)으로 교차 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 서열번호 13과 14의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 60초간 중합하는 조건을 Pfu 폴리머라아제로 30회 반복하는 PCR 법을 통하여 5' 영역에 EcoRI 제한효소 자리를 가진 약 789 bp의 단편을 증폭하였다. 두 번째로 서열번호 15와 16의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR 법을 통하여 3' 영역에 PstI 제한효소 자리를 가진 약 835 bp 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편들은 GeneAllR ExpinTM GEL SV키트(Seoul, Korea)로 분리한 후, 교차 PCR을 위한 주형으로 사용되었다.
상기 내부적 Ncgl1221의 내부적 유전자 소실을 포함하는 DNA 단편을 확보하기 위해 서열번호 13과 16의 프라이머를 이용해 위에서 얻어진 두 DNA 단편을 주형으로 하여 교차 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 상기 기재된 PCR 법을 통하여 약 1602 bp 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 EcoRI 과 PstI으로 처리한 후, 같은 제한 효소로 처리된 pD 벡터와 라이게이션을 통해 pDKO1221 벡터를 제작하였다.
상기 제작된 pDKO1221 벡터를 이용하여 에스케리키아 속 aspA 가 도입된 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 작동하는 cj7 프로모터(cj7 promoter)는 p117 pcj7-gfp(대한민국 특허출원 제10-2004-0107215호)를 주형으로 서열번호 17과 18의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 중합하는 조건을 Pfu 폴리머라아제로 30회 반복하는 PCR 법을 통하여 5' 영역에 BamHI 제한효소 자리를 가진 약 524 bp의 단편을 증폭하였다. 에스케리키아 속 aspA는 에스케리키아 콜리 W3110 염색체를 카이젠 사의 게노믹-팁 시스템(QIAGEN Genomic-tip system)을 이용하여 추출하였고, 이 염색체를 주형으로 서열번호 19와 20의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR법을 통하여 3' 영역에 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 1607 bp의 단편을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편들은 GeneAllR ExpinTM GEL SV키트(Seoul, Korea)로 분리한 후, 교차 PCR을 위한 주형으로 사용되었다.
상기 에스케리키아 속 유래 aspA 의 DNA 단편을 확보하기 위해 서열번호 17과 20의 프라이머를 이용해 위에서 얻어진 두 DNA 단편을 주형으로 하여 교차 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 상기 기재된 PCR 법을 통하여 약 2095 bp 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 BamHI 과 XbaI으로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pDKO1221 벡터와 라이게이션을 통해 pDKO1221-EC_aspA 벡터를 제작하였다.
실시예 9: 에스케리키아 속 유래 aspA 의 발현이 강화된 재조합 균주의 제조
상기 제작된 pDKO1221-EC_aspA 벡터를 L-아르기닌 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 및 ATCC21831에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체상에서 에스케리키아 속 유래 aspA 유전자가 포함된 L-아르기닌 생산균주를 얻었다. 얻어진 균주 각각을 KCCM10741PΔNcgl1221-EC_aspA 및 ATCC21831ΔNcgl1221-EC_aspA로 명명하였다. 또한, 상기 제작된 pDKO1221 벡터를 L-아르기닌 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 및 ATCC21831에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체상에서 NCgl1221이 결실된 KCCM10741PΔNcgl1221 및 ATCC21831ΔNcgl1221 균주를 얻었다.
실시예 10: 에스케리키아 속 유래 aspA 의 발현이 강화된 재조합 균주의 L- 아르기닌 생산능 평가
상기 실시예 9에서 제조된 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741PΔNcgl1221-EC_aspA 및 ATCC21831ΔNcgl1221-EC_aspA를 이용하여 대장균 유래 aspA의 도입이 L-아르기닌 생산능에 미치는 영향을 파악하기 위하여 하기와 같은 방법으로 배양하였다.
이때 대조군으로서는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P, ATCC21831, KCCM10741PΔNcgl1221 및 ATCC21831ΔNcgl1221을 배양하여 사용하였으며, 생산 배지(주1) 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바풀 플라스크에 1백금이의 균주를 접종하고, 30℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 배양하였다. 배양종료 후 HPLC로 L-아르기닌의 생산량을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 17.09.2014]　
표 3
Figure WO-DOC-TABLE-3
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 에스케리키아 속 유래 aspA가 도입된 경우에도 두 가지 유래의 코리네박테리움 글루타미쿰에서 L-아르기닌 생산능이 향상됨을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11351P
수탁일자 : 20130121
Figure PCTKR2014003570-appb-I000001

Claims (7)

  1. 아스파테이트 암모니아 리아제(asprtate ammonia-lyase)의 활성이 강화된 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아스파테이트 암모니아 리아제는 코리네박테리움 속 미생물 또는 에스케리키아 속 미생물 유래인 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 아스파테이트 암모니아 리아제는 서열번호 21 또는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  4. 제1항에 있어서,
    아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase)의 활성이 추가로 강화된 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제는 서열번호 25로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 미생물을 접종하여 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 L-아르기닌을 분리하는 단계
    를 포함하는 L-아르기닌을 생산하는 방법.
PCT/KR2014/003570 2013-04-23 2014-04-23 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법 WO2014175663A1 (ko)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES14788335T ES2761590T3 (es) 2013-04-23 2014-04-23 Microorganismo de Corynebacterium sp. que tiene una productividad mejorada de L-arginina y procedimiento de producción de L-arginina mediante el uso del mismo
BR112015026761-0A BR112015026761B1 (pt) 2013-04-23 2014-04-23 Micro-organismo do gênero corynebacterium que tem capacidade aprimorada para produzir l-arginina e método de produção de l-arginina
JP2016510620A JP6218929B2 (ja) 2013-04-23 2014-04-23 Ｌ−アルギニン産生能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ−アルギニンの産生方法
US14/785,759 US10266858B2 (en) 2013-04-23 2014-04-23 Microorganism of the genus Corynebacterium with enhanced ability to produce L-arginine and method for producing L-arginine using the same
CN201480023370.5A CN105143439B (zh) 2013-04-23 2014-04-23 L-精氨酸生产能力提高的棒状杆菌属微生物以及利用其的l-精氨酸的生产方法
EP14788335.9A EP2990475B1 (en) 2013-04-23 2014-04-23 Corynebacterium sp. microorganism having improved l-arginine productivity and method for producing l-arginine using same
PL14788335T PL2990475T3 (pl) 2013-04-23 2014-04-23 Mikroorganizm corynebacterium sp. o zwiększonej produktywności l-argininy oraz sposób wytwarzania l-argininy z jego wykorzystaniem

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2013-0044723 2013-04-23
KR1020130044723A KR101500073B1 (ko) 2013-04-23 2013-04-23 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014175663A1 true WO2014175663A1 (ko) 2014-10-30

Family

ID=51792140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2014/003570 WO2014175663A1 (ko) 2013-04-23 2014-04-23 L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법

Country Status (10)

Country Link
US (1) US10266858B2 (ko)
EP (1) EP2990475B1 (ko)
JP (2) JP6218929B2 (ko)
KR (1) KR101500073B1 (ko)
CN (1) CN105143439B (ko)
ES (1) ES2761590T3 (ko)
HU (1) HUE046457T2 (ko)
PL (1) PL2990475T3 (ko)
TW (1) TWI519645B (ko)
WO (1) WO2014175663A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108866028B (zh) * 2017-05-09 2020-04-10 中国科学院微生物研究所 一种氨基裂解酶突变体蛋白及其编码基因与应用
KR101999454B1 (ko) * 2017-12-19 2019-07-11 씨제이제일제당 (주) L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산방법
CN112888776B (zh) 2019-04-12 2023-05-26 绿色地球研究所株式会社 生产目标物质的方法
CN114349831B (zh) * 2021-12-14 2024-02-06 宁夏伊品生物科技股份有限公司 aspA基因突变体、重组菌及制备L-缬氨酸的方法
CN114908027B (zh) * 2022-01-20 2023-12-26 天津科技大学 泛酸生产相关菌株及其构建方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020045223A1 (en) 2000-04-28 2002-04-18 Ajinomoto Co., Inc. Arginine repressor deficient strain of coryneform bacterium and method for producing L-arginine
WO2005064000A1 (en) * 2003-12-24 2005-07-14 Degussa Ag Process for preparing l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR100791659B1 (ko) 2006-07-13 2008-01-03 씨제이 주식회사 알지닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 엘-알지닌의제조방법
US7759094B2 (en) * 2004-08-03 2010-07-20 Degussa Gmbh Method for the production of L-amino acids using strains from the Enterobacteriaceae family which contain an enhanced lamb gene

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06102028B2 (ja) 1985-10-04 1994-12-14 協和醗酵工業株式会社 アミノ酸の製造法
DE3737729A1 (de) 1987-11-06 1989-05-18 Degussa Pendelvektor pz1, rekombinantes, ein aspartasegen enthaltendes plasmid, seine verwendung zur herstellung von aminosaeuren der aspartat-familie aus fumarat-haltigem naehrmedium und es enthaltende mikroorganismen
JP3009257B2 (ja) * 1991-07-25 2000-02-14 三菱化学株式会社 アスパルターゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用
JP4178720B2 (ja) 1999-06-03 2008-11-12 味の素株式会社 Ｌ−アルギニンの製造法
EP1201758B1 (en) * 2000-10-27 2008-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Microorganisms and method for L-arginine production by fermentation
EP1664318B1 (en) * 2004-01-30 2009-09-23 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing microorganism and method for producing l-amino acid
CA2598792A1 (en) 2005-03-02 2006-09-08 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
KR100830289B1 (ko) * 2007-01-18 2008-05-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ－아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법
JP2010110217A (ja) * 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP5574400B2 (ja) 2008-12-26 2014-08-20 独立行政法人酒類総合研究所 変異型リパーゼとその応用
KR101226384B1 (ko) 2010-03-05 2013-01-25 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
CN103314101B (zh) * 2010-11-03 2016-05-18 加利福尼亚大学董事会 通过蛋白质生物质发酵的重组微生物的生物燃料和化学生产

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020045223A1 (en) 2000-04-28 2002-04-18 Ajinomoto Co., Inc. Arginine repressor deficient strain of coryneform bacterium and method for producing L-arginine
WO2005064000A1 (en) * 2003-12-24 2005-07-14 Degussa Ag Process for preparing l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
US7759094B2 (en) * 2004-08-03 2010-07-20 Degussa Gmbh Method for the production of L-amino acids using strains from the Enterobacteriaceae family which contain an enhanced lamb gene
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR100791659B1 (ko) 2006-07-13 2008-01-03 씨제이 주식회사 알지닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 엘-알지닌의제조방법

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APPL ENVIRON MICROBIOL, vol. 75, no. 6, March 2009 (2009-03-01), pages 1635 - 41
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, March 1989 (1989-03-01), pages 684 - 688
DOU, WENFANG ET AL.: "Improvement of L-arginine production by overexpression of a bifunctional ornithine acetyltransferase in Corynebacterium crenatum", APPL. BIOCHEM. BIOTECHNOL., vol. 165, no. 3-4, 23 July 2011 (2011-07-23), pages 845 - 855, XP019973333 *
IKEDA, MASATO ET AL.: "Reengineering of a Corynebacterium glutamicum L-arginine and L-citrulline producer", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 75, no. 6, 9 January 2009 (2009-01-09), pages 1635 - 1641, XP008160501 *
J BACTERIOL, vol. 184, no. 23, December 2002 (2002-12-01), pages 6602 - 14
JAMES M. LEE: "Biochemical Engineering", 1991, PRENTICE-HALL INTERNATIONAL EDITIONS, pages: 138 - 176
KARLIN; ALTSCHUL, PRO. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873
MENKEL, ELKE ET AL.: "Influence of increased aspartate availability on lysine formation by a recombinant strain of Corynebacterium glutamicum and utilization of fumarate", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 55, no. 3, March 1989 (1989-03-01), pages 684 - 688, XP008017685 *
PEARSON, METHODS ENZYMOL., vol. 183, 1990, pages 63
See also references of EP2990475A4
VEHARY SAKANYAN ET AL., MICROBIOLOGY, vol. 142, 1996, pages 9 - 108
YGGB: APPL ENVIRON MICROBIOL, vol. 73, no. 14, July 2007 (2007-07-01), pages 4491 - 8

Also Published As

Publication number Publication date
JP6463806B2 (ja) 2019-02-06
EP2990475A1 (en) 2016-03-02
EP2990475B1 (en) 2019-10-30
ES2761590T3 (es) 2020-05-20
JP2016516435A (ja) 2016-06-09
TW201506159A (zh) 2015-02-16
CN105143439A (zh) 2015-12-09
CN105143439B (zh) 2020-09-08
KR101500073B1 (ko) 2015-03-06
PL2990475T3 (pl) 2020-05-18
JP2017169595A (ja) 2017-09-28
TWI519645B (zh) 2016-02-01
HUE046457T2 (hu) 2020-03-30
JP6218929B2 (ja) 2017-10-25
EP2990475A4 (en) 2016-10-12
BR112015026761A2 (pt) 2017-09-05
US20160145661A1 (en) 2016-05-26
US10266858B2 (en) 2019-04-23
KR20140126495A (ko) 2014-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019027267A2 (ko) Atp 포스포리보실 전이효소 변이체 및 이를 이용한 l-히스티딘 생산방법
WO2013105827A2 (ko) 퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법
WO2019117398A1 (ko) 5&#39;-이노신산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 5&#39;-이노신산의 생산 방법
WO2014175663A1 (ko) L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법
WO2013105802A2 (ko) 자일로즈 이용능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산방법
EP2665809A2 (en) A microorganism having enhanced l-amino acids productivity and process for producing l-amino acids using the same
WO2012077994A2 (ko) 오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 오르니틴을 생산하는 방법
WO2019190193A1 (ko) 글라이신 생산능이 증가된 미생물 및 이를 이용한 발효 조성물 생산 방법
WO2015163718A1 (ko) 퓨트레신 생산 변이주 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
WO2015064917A1 (ko) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
WO2016171392A1 (ko) 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법
WO2017034165A1 (ko) L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법
WO2014126384A1 (ko) L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법
WO2015122569A1 (ko) L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법
WO2017034164A1 (ko) L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법
WO2015199406A1 (ko) L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법
WO2014171747A1 (ko) L-트립토판 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 l-트립토판을 생산하는 방법
EP3119875A1 (en) Microorganisms producing l-amino acids and process for producing l-amino acids using the same
WO2013109121A1 (ko) 퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법
WO2022225320A1 (ko) 신규한 포스포글리세린산 디하이드로게나제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
KR101687474B1 (ko) L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법
WO2023063547A1 (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
WO2022231054A1 (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
WO2022191358A1 (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
WO2022231056A1 (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201480023370.5

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14788335

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14785759

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016510620

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: IDP00201506855

Country of ref document: ID

Ref document number: 2014788335

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112015026761

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112015026761

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20151021