TW201506159A - 具有增進的ｌ－精胺酸生產率之棒狀桿菌屬微生物以及使用彼生產ｌ－精胺酸之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種棒狀桿菌屬微生物，該微生物具有增進的天冬胺酸鹽氨解離酶及/或天冬胺酸鹽胺基轉移酶之活性，且因此具有增進的L-精胺酸生產能力，及係關於一種使用該棒狀桿菌屬微生物生產L-精胺酸之方法。

Description

具有增進的L-精胺酸生產率之棒狀桿菌屬微生物以及使用彼生產L-精胺酸之方法
本發明係關於具有增進的L-精胺酸生產能力之棒狀桿菌屬之重組微生物及使用彼重組微生物生產L-精胺酸之方法。
L-精胺酸以遊離形式含於大蒜或植物種子中。L-精胺酸被廣泛用於藥劑、食品及類似者中且亦用作胺基酸強化膳食補充劑。
棒狀桿菌屬微生物經由環狀路徑生物合成L-精胺酸。L-精胺酸係自L-麩胺酸經由N-乙醯基麩胺酸鹽、N-乙醯基麩胺醯基磷酸鹽、N-乙醯基麩胺酸半醛、N-乙醯鳥胺酸、鳥胺酸、瓜胺酸及精胺基琥珀酸鹽合成。
進一步地，眾所周知，藉由因細胞內精胺酸的反饋抑制調節麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum) (Vehary Sakanyan等人，Microbiology,142：9-108,1996)，表明限制了生產L-精胺酸的高產出率。
Ikeda等人報告稱，在精胺酸發酵期間，瓜胺酸在發酵培養基上累積(Appl Environ Microbiol.2009年3月；75(6)：1635-41.Epub 2009年1月9日)。
在生物合成製程中，瓜胺酸鍵合至天冬胺酸鹽以產生精胺基琥珀酸鹽，精胺基琥珀酸鹽隨後釋放反丁烯二酸酯以產生精胺酸。在此製程中，天冬胺酸鹽氨解離酶(aspartate ammonia-lyase；AspA)為一種自反丁烯二酸酯及氨合成天冬胺酸鹽的酶(第1圖)，及天冬胺酸鹽胺基轉移酶(aspartate aminotransferase；AspB)為一種催化各種L-胺基酸合成的酶，該酶藉由將各種L-胺基酸(諸如天冬胺酸鹽、麩胺酸鹽及胺基丁酸鹽)之胺基轉移至酮酸(諸如α-酮戊二酸及α-酮異戊酸)上催化該合成。
Menkel等人報告稱，當將大腸桿菌aspA引入棒狀桿菌屬之微生物中時，棒狀桿菌屬之微生物增加了天冬胺酸鹽之可用性及隨後增加離胺酸生產(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,1989年3月，第684-688頁)。
因此，本發明提供一種具有增進的L-精胺酸生產能力之棒狀桿菌屬微生物，該增進生產能力係藉由經由天冬胺酸鹽氨解離酶及/或天冬胺酸鹽胺基轉移酶之表現增進來增加鍵合至瓜胺酸的天冬胺酸鹽之流入來實現。
本發明之目的在於提供一種具有增進的L-精胺酸生產能力之棒狀桿菌屬微生物。
本發明之另一目的在於提供一種使用上述棒狀桿菌屬微生物生產L-精胺酸之方法。
為實現上述目的，本發明藉由增進天冬胺酸鹽氨解離酶活性提供一種具有增進的L-精胺酸生產能力之棒狀桿菌屬微生物。
本發明亦藉由培養上述棒狀桿菌屬微生物提供一種生產L-精胺酸之方法。
第1圖圖示自瓜胺酸合成精胺酸的路徑及自反丁烯二酸酯合成天冬胺酸鹽的路徑。
在下文中，將詳細描述本發明。
本發明提供一種具有增進的L-精胺酸生產能力之棒狀桿菌屬微生物。
如本文所使用，術語「L-精胺酸生產能力(L-精胺酸生產率)」係指在培養期間於培養棒狀桿菌屬微生物之培養基中累積L-精胺酸之能力。此L-精胺酸生產能力可為野生型之特性或人工誘變棒狀桿菌屬微生物所賦予或增進之特性中的任一者。
舉例而言，為賦予L-精胺酸生產能力，可將棒狀桿菌屬微生物繁殖為：對精胺酸異羥肟酸鹽具有抗性之變異體；具有琥珀酸之營養缺陷或對核酸鹼類似物具有抗性之變 異體；缺乏代謝精胺酸的能力及對精胺酸拮抗劑及刀豆胺酸具有抗性及具有離胺酸之營養缺陷之變異體；對精胺酸、精胺酸異羥肟酸鹽、高精胺酸、D-精胺酸及刀豆胺酸具有抗性或對精胺酸異羥肟酸鹽及6-氮脲嘧啶具有抗性之變異體；或對刀豆胺酸具有抗性之變異體。
另外，可藉由修改棒狀桿菌屬微生物以便增加生物合成L-精胺酸的基因編碼酶之表現水平來賦予L-精胺酸生產能力。生物合成L-精胺酸的酶之實例可包括N-乙醯基麩胺醯基磷酸鹽還原酶(ArgC)、鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)、N-乙醯基麩胺酸鹽激酶(ArgB)、乙醯鳥胺酸轉胺酶(ArgD)、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)、精胺基琥珀酸合成酶(ArgG)、精胺基琥珀酸解離酶(ArgH)及羰基磷酸鹽合成酶。在Arg操縱子(argCJBDFRGH)中放置該等酶及藉由由argR編碼的精胺酸抑制子調節該等酶(J Bacteriol.2002年12月；184(23)：6602-14)。因此，可藉由衰減精胺酸抑制子(US2002-0045223)或過度表現生物合成相關基因之至少一者賦予L-精胺酸生產能力。
在本發明中，未特定限制具有L-精胺酸生產能力之棒狀桿菌屬微生物，只要該微生物可生產L-精胺酸即可。特定而言，該微生物可為具有L-精胺酸生產能力的麩胺酸棒狀桿菌。更特定而言，該微生物可為麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741(韓國專利註冊案第10-0791659號)或麩胺酸棒狀桿菌ATCC21831，但並不受限於此。
在一態樣中，本發明藉由增進天冬胺酸鹽氨解離酶 活性提供一種具有增進的L-精胺酸生產能力之棒狀桿菌屬微生物。
如本文所使用，術語「增進的L-精胺酸生產能力」係指與棒狀桿菌屬之野生型或未修改母微生物相比在培養本發明之棒狀桿菌屬微生物的培養基中累積L-精胺酸之改良的能力。此增進的L-精胺酸生產能力生產率可為藉由人工操縱所賦予之特性，該等人工操縱諸如增進棒狀桿菌屬微生物之天冬胺酸鹽氨解離酶活性。
如本文所使用，術語「天冬胺酸鹽氨解離酶(AspA)」係指一種用以自反丁烯二酸酯及氨合成天冬胺酸鹽的酶，且可藉由增進天冬胺酸鹽氨解離酶之表現增加天冬胺酸鹽之合成，及從而可藉由所增加的天冬胺酸鹽來增加L-精胺酸生產率。
在本發明中，天冬胺酸鹽氨解離酶可為衍生自任何微生物的酶，只要該酶具有天冬胺酸鹽氨解離酶活性即可。具體而言，天冬胺酸鹽氨解離酶可為衍生自埃希氏桿菌屬或棒狀桿菌屬之微生物的酶。更具體而言，其可為衍生自大腸桿菌或麩胺酸棒狀桿菌的酶。具體而言，天冬胺酸鹽氨解離酶可具有由序列ID編號21或22表示的胺基酸序列。具有由序列ID編號21表示的胺基酸序列之棒狀桿菌屬衍生天冬胺酸鹽氨解離酶由aspA(NCgl1446)編碼，該aspA(NCgl1446)具有由序列ID編號23表示的核苷酸序列，及具有由序列ID編號22表示的胺基酸序列之埃希氏桿菌屬衍生天冬胺酸鹽氨解離酶由aspA(NCBI基因ID：12933698)編碼，該aspA(NCBI 基因ID：12933698)具有由序列ID編號24表示的核苷酸序列。
與上文所描述之天冬胺酸鹽氨解離酶之胺基酸序列具有至少80%、特定地至少90%、更特定地至少95%及甚至更特定地至少97%之同源性的蛋白質亦包括在本發明之範疇內，只要該蛋白質具有本發明中所描述之天冬胺酸鹽氨解離酶活性即可。
如本文所使用，術語「同源性」係指兩個胺基酸序列之間的同一性及可由熟習此項技術者所熟知的方法使用演算法BLAST(請參閱Karlin及Altschul，Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或FASTA(請參閱Pearson，Methods Enzymol.,183,63(1990))計算諸如計分、同一性及相似性之參數決定。基於演算法BLAST，已開發稱為BLASTN或BLASTX的程式(請參閱http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
在另一態樣中，本發明提供一種棒狀桿菌屬微生物，其中進一步增進天冬胺酸鹽胺基轉移酶之活性。
如本文所使用，術語「天冬胺酸鹽胺基轉移酶」係指一種催化各種L-胺基酸合成的酶，該酶藉由將各種L-胺基酸(諸如天冬胺酸鹽、麩胺酸鹽及胺基丁酸鹽)之胺基轉移至酮酸(諸如α-酮戊二酸及α-酮異戊酸)上催化該合成。特定而言，天冬胺酸鹽胺基轉移酶可衍生自棒狀桿菌屬微生物，該天冬胺酸鹽胺基轉移酶具有由序列ID編號25表示的胺基酸序列且由aspB(NCgl0237)編碼，該aspB(NCgl0237)具有由序列ID編號26表示的核苷酸序列，但並不受限於此。
與上文所描述之天冬胺酸鹽胺基轉移酶之胺基酸序列具有至少80%、特定地至少90%、更特定地至少95%及甚至更特定地至少97%之同源性的蛋白質亦包括在本發明之範疇內，只要該蛋白質具有本發明中所描述之天冬胺酸鹽胺基轉移酶活性即可。
在又一態樣中，本發明提供一種棒狀桿菌屬微生物，其中天冬胺酸鹽氨解離酶及天冬胺酸鹽胺基轉移酶兩者之活性被增進。
本發明之具有L-精胺酸生產能力的棒狀桿菌屬微生物特徵在於藉由將天冬胺酸鹽氨解離酶及/或天冬胺酸鹽胺基轉移酶之活性增進(或增加)至內源活性來修改該微生物。
如本文所使用，術語「內源活性」係指具有L-精胺酸生產能力之棒狀桿菌屬微生物之活性，該活性不經歷調節上文所描述酶之活性的任何基因操作或修改。另外，術語「增進」或「增加」意謂與具有L-精胺酸生產能力之棒狀桿菌屬微生物之內源活性相比改良L-精胺酸生產率。
可使用此項技術中所熟知的各種方法執行增進(或增加)本發明中的酶之活性。該等方法之實例包括：藉由將編碼天冬胺酸鹽氨解離酶及/或天冬胺酸鹽胺基轉移酶的聚核苷酸引入載體系統中增加編碼天冬胺酸鹽氨解離酶及/或天冬胺酸鹽胺基轉移酶的核苷酸序列之複本數目之方法；用強啟動子(promoter)替換啟動子之方法；將突變引入啟動子中之方法；及基於基因突變之方法，但並不受限於此。
在本發明之一特定實施例中，為增進具有L-精胺酸 生產能力之棒狀桿菌屬微生物中的天冬胺酸鹽氨解離酶及/或天冬胺酸鹽胺基轉移酶之活性，可使用一方法，在該方法中藉由將編碼天冬胺酸鹽之天冬胺酸鹽氨解離酶及/或天冬胺酸鹽胺基轉移酶的基因引入載體中及用載體轉形(transforming)使棒狀桿菌屬微生物增加編碼天冬胺酸鹽氨解離酶及/或天冬胺酸鹽胺基轉移酶的基因之複本數目。
如本文所使用，術語「轉形」意謂將含有編碼目標蛋白質的聚核苷酸之載體引入宿主細胞中使得在宿主細胞中表現該目標蛋白質。可在宿主細胞之染色體內部或外部安置所引入的聚核苷酸，只要可在宿主細胞中表現即可。可以任何形式引入聚核苷酸，只要可在宿主細胞中表現即可。
在本發明之一實施例中，藉由引入含有上文所描述之基因的重組載體，然後分離出染色體中經由第二次互換(second crossover)而含有2個複本的各個以上基因之L-精胺酸生產菌株來製備轉形微生物。
如本文所使用，術語「載體」係指含有目標蛋白質編碼聚核苷酸之核苷酸序列的DNA構造，該核苷酸序列可操作連接至適宜調節序列以能夠在適宜宿主中表現目標蛋白質。調節序列可包括啟動轉錄的啟動子、調節此轉錄的任何操縱子(operator)序列、編碼適宜mRNA核糖體結合位點的序列及調節轉錄及轉譯之終點的序列。在經轉形至適宜宿主後，可複製載體或執行無關於宿主基因組的載體功能，或可經整合至基因組本身中。
並未特定限制本發明中所使用之載體，只要該載體 可在宿主中複製即可。載體可為技術中已知的任何載體。常用載體之實例可包括天然或重組質體、黏質體、病毒及噬菌體。
藉由本發明之方法轉形的麩胺酸棒狀桿菌(KCCM11351P)菌株藉由以下步驟生產：藉由PCR自生產L-精胺酸的麩胺酸棒狀桿菌ATCC21831的染色體獲得編碼天冬胺酸鹽氨解離酶的aspA；將所獲得aspA插入載體中；及隨後將載體引入生產L-精胺酸的麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P中，及隨後變成具有aspA之增加表現的轉形微生物。已發現，菌株KCCM11351P可藉由aspA之過度表現以高產出率生產L-精胺酸。
在又一態樣中，本發明亦提供一種藉由培養轉形棒狀桿菌屬微生物生產L-精胺酸之方法。
在本發明之生產L-精胺酸之方法中，可在技術中已知的適宜培養基及培養條件中執行培養過度表現L-精胺酸的轉形微生物之製程。此培養製程可取決於選定菌株由任何熟習此項技術者輕易調整。培養製程之實例包括(但不限於)分批培養、連續培養及饋料分批培養。舉例而言，在「Biochemical Engineering」(James M.Lee,Prentice-Hall國際版，第138-176頁，1991)中揭示此類培養製程。
本發明中所使用之培養基含有粗糖或葡萄糖作為主要碳源。進一步地，含有大量粗糖的糖蜜亦可用作碳源。另外，可使用適宜量之各種碳源，且特定而言可使用純化葡萄糖。本發明中可使用之氮源之實例包括：有機氮源，諸如腖、 酵母提取物、牛肉汁、麥芽提取物、玉米漿及大豆粉；及無機氮源，諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨。特定而言，可使用腖。可單獨或組合使用該等氮源。培養基可含有磷酸二氫鉀、二磷酸氫二鉀及對應含鈉鹽作為磷源。進一步地，培養基可含有金屬鹽，諸如硫酸鎂或硫酸鐵。另外，培養基可含有胺基酸、維他命及適宜前驅物。在培養中，可以分批或連續方式添加該等培養基或前驅物。然而，培養基組合物之實例並不受限於此。
在培養期間，可將諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸及硫酸之化合物以適宜方式添加至培養基中以調整培養基之pH。此外，可在培養期間添加消泡劑(諸如脂肪酸聚二醇酯)禁止起泡。另外，為維持培養基之好氧條件，可將氧氣或含氧氣體(例如，空氣)注入培養基中。培養基之溫度可大體介於20℃與45℃之間，且特定而言介於25℃與40℃之間。可一直執行培養直至生產所欲量之L-精胺酸。特定而言，培養時間可為10-160小時。
可藉由技術中已知的習知方法執行L-精胺酸與培養基之分離。該方法可包括離心、過濾、離子交換層析及結晶。舉例而言，可藉由在低速下離心分離培養基以移除生物質及隨後藉由離子交換層析分離殘留上澄液來分離L-精胺酸。
在下文中，將參考實例進一步詳細地描述本發明。然而，應將理解，該等實例出於說明性目的且不欲限制本發明之範疇。
實例 實例1：檢驗aspA對生產L-精胺酸之效果
為了檢驗aspA是否為生產L-精胺酸中的重要基因，刪除aspA的載體經建構並轉形至L-精胺酸生產菌株麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P(韓國專利註冊案第0791659號)中，及隨後評估轉形菌株之L-精胺酸生產率。
(1)建構aspA缺乏載體
為了自染色體刪除編碼天冬胺酸鹽氨解離酶(Ncgl1446)的aspA基因，使用基因組尖端系統(Genomic-tip；QIAGEN)萃取購自美國典型菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)的麩胺酸棒狀桿菌ATCC21831之染色體及使用染色體作為模板執行交越PCR(crossover PCR)。
特定而言，使用序列ID編號1及2之引子以Pfu聚合酶進行PCR30個循環來擴增5'區域中具有XmaI限制酶位點之約798-bp片段，各個循環由在94℃下變性1分鐘、在58℃下黏合30秒及在72℃下聚合60秒構成。隨後，使用序列ID編號3及4之引子以上文所描述相同的方法來PCR擴增3'區域中具有XbaI限制酶位點之約829-bp片段。使用GeneAllR ExpinTM GEL SV試劑盒(韓國，首爾)分離出所得DNA片段及隨後將該等片段用作交越PCR的模板。
為獲得含有刪除aspA的DNA片段，使用上文製備的兩個DNA片段作為模板及序列ID編號1及4之引子執行交越PCR。特定而言，藉由上文所描述之PCR方法擴增約 1583-bp片段。用限制酶XmaI及XbaI處理擴增片段，及隨後與經相同酶處理之pD載體接合，從而建構載體pDKO1446。
(2)製備重組菌株
如上文所描述建構之pDKO1446經轉形至L-精胺酸生產菌株麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P及經歷第二次互換，從而獲得染色體中含有刪除aspA的L-精胺酸生產菌株。所獲得菌株被命名為「KCCM10741△aspA」。
(3)檢驗重組菌株之L-精胺酸生產率
為檢驗aspA之刪除對L-精胺酸生產率之影響，用以下方式培養係L-精胺酸生產菌株的上文所生產之重組麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741△aspA。
作為對照組，使用宿主細胞麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P。特定而言，將菌株之環接種至含有25ml之以下生產培養基的250ml角板燒瓶中，並在30℃下以200rpm培養48小時。在培養完成後，藉由HPLC量測L-精胺酸之產量，且結果展示於下文表1中。
生產培養基
6%葡萄糖、3%硫酸銨、0.1%磷酸二氫鉀、0.2%硫酸鎂七水合物、1.5%玉米漿(CSL)、1% NaCl、0.5%酵母提取物、100mg/L生物素，pH 7.2。
如上文表1可看出，含有刪除aspA的菌株具有減小的L-精胺酸生產能力，且aspA係L-精胺酸之生產中的重要基因。
實例2：建構引入衍生自棒狀桿菌屬的aspA之載體
為建構含有衍生自棒狀桿菌屬編碼天冬胺酸鹽氨解離酶的aspA(Ncgl1446)之兩個複本的載體，使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC21831之染色體作為模板及序列ID編號5及6之引子組及序列ID編號7及8之引子組中之各者執行PCR，從而獲得DNA片段，各個片段含有aspA。
具體而言，使用序列ID編號5及6之引子以Pfu聚合酶進行PCR來擴增5'區域中具有XmaI限制酶位點及3'區域中具有BamHI限制酶位點之約1893-bp片段。執行PCR達30個循環，各個循環由在94℃下變性1分鐘、在58℃下黏合30秒及在72℃下聚合2分鐘構成。同時，使用序列ID編號7及8之引子用與上文所描述相同的方法擴增5'區域中具有BamHI限制酶位點及3'區域中具有XbaI限制酶位點之約1885-bp片段。
使用GeneAllR ExpinTM GEL SV試劑盒(韓國，首爾)分離出所得之DNA片段。隨後，用XmaI及BamHI處理上文兩個片段之第一片段，及用BamHI及XbaI處理第二片段。另外，用XmaI及XbaI處理pD載體。接合用限制酶所處理之兩個DNA片段及pD載體，且從而建構pD1446-2X載體。
實例3：製備具有增加之aspA表現的重組菌株
實例2中所建構的pD1446-2X載體經轉形至L-精胺酸生產菌株麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P及ATCC21831中之 各者，及隨後經歷第二次互換，從而獲得染色體中含有2個複本aspA之L-精胺酸生產菌株。所獲得菌株分別被命名為「KCCM10741P：：aspA_2X」及「ATCC21831：：aspA_2X」。
實例4：建構引入衍生自棒狀桿菌屬的aspB之載體
為建構含有編碼天冬胺酸鹽胺基轉移酶的aspB(Ncgl0237)之2個複本的載體，使用麩胺酸棒狀桿菌ATCC21831之染色體作為模板及序列ID編號9及10之引子組及序列ID編號11及12之引子組中之各者執行PCR，從而獲得DNA片段，各個片段含有aspB。
具體而言，使用序列ID編號9及10之引子以Pfu聚合酶進行PCR來擴增5'區域中具有XmaI限制酶位點及3'區域中具有NdeI限制酶位點之約1692-bp片段。執行PCR達30個循環，各個循環由在94℃下變性1分鐘、在58℃下黏合30秒及在72℃下聚合2分鐘構成。同時，藉由與上文所描述相同的PCR方法擴增5'區域中具有NdeI限制酶位點及3'區域中具有SpeI限制酶位點之約1643-bp第二片段。
使用GeneAllR ExpinTM GEL SV試劑盒(韓國，首爾)分離出所得之DNA片段。隨後，用XmaI及NdeI處理上文兩個片段之第一片段，及用NdeI及SpeI處理第二片段。另外，用XmaI及XbaI處理pD載體。用限制酶處理之pD載體及兩個DNA片段經歷3片接合，從而建構pD0237-2X載體。
實例5：製備具有增加之aspB表現的菌株
實例4中所建構的pD0237-2X載體經轉形至L-精胺酸生產菌株麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P及ATCC21831中之 各者，及隨後經歷第二次互換，從而獲得染色體中含有2個複本aspB之L-精胺酸生產菌株。所獲得菌株分別被命名為「KCCM10741P：：aspB_2X」及「ATCC21831：：aspB_2X」。
實例6：製備具有增加之aspA及aspB表現的菌株
實例4中所建構的pD0237-2X載體經轉形至實例3中所製備的重組菌株(KCCM10741P：：aspA_2X及ATCC21831：：aspA_2X)中之各者，及隨後經歷第二次互換，從而獲得染色體中含有2個複本aspA及aspB之L-精胺酸生產菌株。所獲得菌株被命名為「KCCM10741P：：aspA_2X：：aspB_2X」及「ATCC21831：：aspA_2X：：aspB_2X」。
實例7：評估L-精胺酸生產率
為檢驗aspA、aspB或aspA與aspB兩者的增加對L-精胺酸生產率之影響，用以下方式培養實例3、5及6中所製備的L-精胺酸生產菌株麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P：：aspA_2X、ATCC21831：：aspA_2X、KCCM10741P：：aspB_2X、ATCC21831：：aspB_2X、KCCM10741P：：aspA_2X：：aspB_2X及ATCC21831：：aspA_2X：：aspB_2X中之各者。
使用麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P及ATCC21831之各者之宿主細胞作為對照組。具體而言，將菌株之各者之環接種至含有25ml之實例1中所描述之生產培養基的250ml角板燒瓶中，並在30℃下以200rpm培養該等接種菌株48小時。在培養完成後，量測L-精胺酸之產量，且量測之結果展 示於下文表2中。
如上文表2中可看出，當將2個複本之aspA引入菌株中時，兩個類型之麩胺酸棒狀桿菌菌株中的L-精胺酸之產量增加。詳言之，與對照組之彼生產率相比較，KCCM10741P：：aspA_2X之L-精胺酸生產率顯著增加30%。將KCCM10741P：：aspA_2X於2013年1月21日寄存於韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganism；KCCM)，登錄號碼為KCCM11351P，該微生物培養中心為國際寄存機構，位於韓國首爾西大門區弘濟1洞361-221號。
實例8：建構引入衍生自大腸桿菌屬的aspA之載體
為將衍生自大腸桿菌屬編碼天冬胺酸鹽氨解離酶之基因aspA(NCBI-基因ID：12933698)引入具有L-精胺酸生產能力之麩胺酸棒狀桿菌之染色體中，使用稱為麩胺酸輸出者的Ncgl1221位點(yggB：Appl Environ Microbiol.2007年7月；73(14)：4491-8)。
為建構引入Ncgl1221位點中具有大腸桿菌aspA之 載體，建構含有Ncgl1221特定基因中斷位點的pDKO1221載體。
為獲得含有Ncgl1221特定基因中斷位點的DNA片段，萃取麩胺酸棒狀桿菌ATCC21831之染色體及使用染色體作為模板執行交越PCR。
特定而言，使用序列ID編號13及14之引子以Pfu聚合酶進行PCR來擴增5'區域中具有EcoRI限制酶位點之約789-bp片段。執行PCR達30個循環，各個循環由在94℃下變性1分鐘、在58℃下黏合30秒及在72℃下聚合60秒構成。同時，使用序列ID編號15及16之引子用與上文所描述相同的方法以PCR擴增3'區域中具有PstI限制酶位點之約835-bp片段。使用GeneAllR ExpinTM GEL SV試劑盒(韓國，首爾)分離出所得之DNA片段及隨後用作交越PCR的模板。
為獲得含有Ncgl1221特定基因中斷位點的DNA片段，使用上文所獲得兩個DNA片段作為模板及序列ID編號13及16之引子執行交越PCR。具體而言，藉由上文所描述之PCR方法擴增約1602-bp片段。用限制酶EcoRI及PstI處理所擴增片段，及隨後與用相同限制酶處理的pD載體接合，從而建構pDKO1221載體。
使用所建構pDKO1221載體，建構引入有大腸桿菌aspA之載體。為獲得作用於麩胺酸棒狀桿菌中的cj7啟動子(韓國專利案第10-0620092號)，使用p117 pcj7-gfp作為模板及序列ID編號17及18之引子以Pfu聚合酶進行PCR來擴增5'區域中具有BamRI限制酶位點之約524-bp片段。執行 PCR達30個循環，各個循環由在94℃下變性1分鐘、在58℃下黏合30秒及在72℃下聚合30秒構成。使用Genomic-tip系統(QIAGEN)自大腸桿菌W3110之染色體萃取大腸桿菌衍生之aspA，及使用染色體作為模板及序列ID編號19及20之引子擴增3'區域中具有XbaI限制酶之約1607-bp片段。使用GeneAllR ExpinTM GEL SV試劑盒(韓國，首爾)分離出所得之DNA片段及隨後用作交越PCR的模板。
為獲得大腸桿菌衍生之aspA的DNA片段，使用上文所獲得兩個DNA片段作為模板及序列ID編號17及20之引子執行交越PCR。特定而言，藉由上文所描述之PCR方法擴增約2095-bp片段。用限制酶BamHI及XbaI處理所擴增片段，及隨後與用相同限制酶處理的pDKO1221載體接合，從而建構pDKO1221-EC_aspA載體。
實例9：製備具有增加之大腸桿菌aspA表現的重組菌株
如上文所描述建構的pDKO1221-EC_aspA載體經轉形至L-精胺酸生產菌株麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P及ATCC21831中之各者，及經歷第二次互換，從而獲得L-精胺酸生產菌株，各個菌株在染色體中含有大腸桿菌衍生之aspA基因。所獲得菌株分別被命名為「KCCM10741P△Ncgl1221-EC_aspA」及「ATCC21831△Ncgl1221-EC_aspA」。另外，如上文所描述建構的pDKO1221載體經轉形至L-精胺酸生產菌株麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P及ATCC21831之各者，及經歷第二次互換，從而獲得KCCM10741P△Ncgl1221及 ATCC21831△Ncgl1221菌株，各個菌株在染色體中刪除Ncgl1221。
實例10：評估具有增加之大腸桿菌aspA表現的重組菌株之L-精胺酸生產率
為評估引入大腸桿菌aspA對L-精胺酸生產率之影響，用以下方式培養實例9中所製備的L-精胺酸生產菌株KCCM10741P△Ncgl1221-EC_aspA及ATCC21831△Ncgl1221-EC_aspA。
作為對照組，培養麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P、ATCC21831、KCCM10741P△Ncgl1221及ATCC21831△Ncgl1221中之各者之宿主細胞。具體而言，將各個菌株之環接種至含有25ml之上文所描述之生產培養基的250ml角板燒瓶中，並在30℃下以200rpm培養48小時。在培養完成後，量測L-精胺酸之產量，且結果展示於下文表3中。
如上文表3可看出，當將大腸桿菌之aspA引入菌株中時，兩個類型之麩胺酸棒狀桿菌中的L-精胺酸之生產增加。
如上文所描述，本發明提供棒狀桿菌屬之重組微生物，該重組微生物具有增進的天冬胺酸鹽氨解離酶活性及/或增進的天冬胺酸鹽胺基轉移酶活性，且因此具有增進的L-精胺酸生產能力。棒狀桿菌屬之重組微生物可以高產出率生產L-精胺酸，且因此在工業中是有益的。從前文中，熟習此項技術者將瞭解，可在不脫離本發明之技術精神或基本特徵的情況下以其他具體形式實施本發明。因此，應理解，上文所描述之實施例在所有方面為說明性，而非限制性。應藉由隨附申請專利範圍而非詳細描述界定本發明之範疇，且應瞭解，所有衍生自申請專利範圍之含義及範疇的修改或變化及等效物皆屬於本發明之範疇內。
【生物材料寄存】
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Claims (7)

  1. 一種具有增進的L-精胺酸生產能力之棒狀桿菌屬微生物，該微生物具有一增進的天冬胺酸鹽氨解離酶之活性。
  2. 如請求項1所述之微生物，其中該天冬胺酸鹽氨解離酶衍生自麩胺酸棒狀桿菌屬微生物或大腸桿菌屬微生物。
  3. 如請求項1所述之微生物，其中該天冬胺酸鹽氨解離酶具有由序列ID編號21或22所表示的胺基酸序列。
  4. 如請求項1所述之微生物，其中進一步增進天冬胺酸鹽胺基轉移酶之活性。
  5. 如請求項4所述之微生物，其中該天冬胺酸鹽胺基轉移酶具有由序列ID編號25所表示的胺基酸序列。
  6. 如請求項1所述之微生物，其中該棒狀桿菌屬微生物為麩胺酸棒狀桿菌。
  7. 一種生產L-精胺酸之方法，該方法包含以下步驟：將請求項1至6中任一項所述之微生物接種至一培養基中，並培養該經接種之微生物；以及自該培養基分離出L-精胺酸。
TW103114718A 2013-04-23 2014-04-23 具有增進的ｌ－精胺酸生產率之棒狀桿菌屬微生物以及使用彼生產ｌ－精胺酸之方法 TWI519645B (zh)

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