CN105143439B - L-精氨酸生产能力提高的棒状杆菌属微生物以及利用其的l-精氨酸的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及棒状杆菌属微生物以及利用上述棒状杆菌属微生物生产L‑精氨酸的方法，所述棒状杆菌属微生物的天冬氨酸氨裂解酶和/或天冬氨酸氨基转移酶的活性增强，从而L‑精氨酸生产能力提高。

Description

L-精氨酸生产能力提高的棒状杆菌属微生物以及利用其的L- 精氨酸的生产方法
技术领域
本发明涉及L-精氨酸生产能力提高的重组棒状杆菌属微生物以及利用该微生物生产L-精氨酸的方法。
背景技术
L-精氨酸以游离状态包含于植物种子或大蒜，其被用作氨基酸类增强剂，也广泛被利用于药品、食品等。其作为医药用，用于肝功能促进剂、脑功能促进剂、男性不孕治疗剂、综合氨基酸制剂等，作为食品用，用于生鲜冻
Figure BDA0000828773860000011
添加剂、健康饮料添加剂、高血压患者的食盐代替用，从而成为最近受到注目的物质。
棒状杆菌(Corynebacterium)属微生物通过环形步骤途径实现L-精氨酸的生物合成，L-精氨酸从L-谷氨酸经由N-乙酰谷氨酸(N-acetylglutamate)、N-乙酰谷氨酰磷酸(N-acetylglutamyl phosphate)、N-乙酰谷氨酸半醛(N-acetylglutamate semialdehyde)、N-乙酰鸟氨酸(N-acetylornithine)、鸟氨酸(ornithine)、瓜氨酸(citrulline)以及精氨琥珀酸(argininosuccinate)而合成。
此外，已知谷氨酸棒状杆菌受到细胞内精氨酸的反馈抑制(feedbackinhibition)(Vehary Sakanyan et al，Microbiology，142:9-108，1996)，从而已知在生产高收率的L-精氨酸方面存在局限。
池田等报告了在精氨酸发酵时瓜氨酸蓄积于发酵培养基上(Appl EnvironMicrobiol.2009Mar；75(6):1635-41.Epub 2009 Jan 9)。
在上述生物合成过程中，瓜氨酸与天冬氨酸(aspartate)结合而成为精氨琥珀酸，释放富马酸(fumarate)而成为精氨酸。在此，天冬氨酸氨裂解酶(aspartate ammonia-lyase，aspA)是由富马酸和氨合成天冬氨酸的酶(图1)，天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase，aspB)是具有通过从天冬氨酸、谷氨酸、氨基丁酸等多种L-氨基酸将氨基转移到α-酮戊二酸、α-酮异戊酸等酮酸来合成多种L-氨基酸的催化剂功能的酶。
Menkel等报告了将大肠杆菌的aspA导入棒状杆菌型微生物时增加天冬氨酸的可用性，从而增加L-赖氨酸的生产(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Mar.1989，p.684-688)。
因此，本发明人等确认了，通过使天冬氨酸氨裂解酶和/或天冬氨酸氨基转移酶的表达增强来增加与瓜氨酸结合的天冬氨酸的流入，能够提供L-精氨酸的生产能力提高的棒状杆菌属微生物，从而完成本发明。
发明内容
本发明的目的在于，提供L-精氨酸的生产能力提高的棒状杆菌属微生物。
本发明的另一目的在于，提供利用上述棒状杆菌属微生物生产L-精氨酸的方法。
为了实现上述目的，本发明提供因天冬氨酸氨裂解酶的活性增强而L-精氨酸生产能力提高的棒状杆菌属微生物。
本发明还提供通过培养上述棒状杆菌属微生物生产L-精氨酸的方法。
本发明提供因天冬氨酸氨裂解酶活性增强或在此基础上进一步地天冬氨酸氨基转移酶的活性增强而L-精氨酸生产能力提高的重组棒状杆菌属微生物，上述重组棒状杆菌属微生物由于能够以高收率生产L-精氨酸，因此可以在工业上有效利用。
附图说明
图1表示由瓜氨酸合成精氨酸的途径以及由富马酸合成天冬氨酸的途径。
具体实施方式
下面，详细说明本发明。
本发明提供L-精氨酸的生产能力提高的棒状杆菌属微生物。
本发明中，上述用语“L-精氨酸生产能力(L-arginine productivity)”是指，在培养基中培养本发明的棒状杆菌属微生物时，使L-精氨酸蓄积于培养基的能力。这样的L-精氨酸生产能力可以是棒状杆菌属微生物的野生型菌株的特性、或者通过人工突变而添加或增强的特性。
例如，为了赋予L-精氨酸的生产能力，可以将棒状杆菌属微生物育种成对精氨酸羟肟酸具有耐性；可以育种成对琥珀酸具有营养要求性或者对核酸碱基
Figure BDA0000828773860000031
同系物具有耐性；可以育种成无法使精氨酸进行物质代谢，对精氨酸拮抗剂和刀豆氨酸具有耐性，且对赖氨酸具有营养要求性；可以育种成对精氨酸、精氨酸羟肟酸、高精氨酸、D-精氨酸和刀豆氨酸具有耐性，或者对精氨酸羟肟酸和6-氮尿嘧啶具有耐性；可以育种成对刀豆氨酸具有耐性。
此外，通过按照使编码L-精氨酸生物合成酶的基因的表达增强的方式对棒状杆菌属微生物进行变形，可以赋予L-精氨酸的生产能力。L-精氨酸生物合成酶的例子包括：N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(argF)、精氨琥珀酸合成酶(argG)、精氨琥珀酸裂解酶(argH)和氨基甲酰磷酸合成酶。这些精氨酸生物合成酶存在于Arg操纵子(argCJBDFRGH)上，由被argR编码的精氨酸阻抑物调节(J Bacteriol.2002 Dec；184(23):6602-14.)。由此，通过精氨酸阻抑物的弱化(US2002-0045223)、或者使上述生物合成相关基因中的一个以上基因过表达，可以赋予L-精氨酸生产能力。
在本发明中，具有L-精氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物只要具有生产L-精氨酸的能力就没有特别限制。优选地，可以为能够生产L-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌，更优选地，可以为谷氨酸棒状杆菌KCCM10741(韩国专利注册号0791659)以及谷氨酸棒状杆菌ATCC21831。
作为用于实现上述目的的一个方案，本发明提供因天冬氨酸氨裂解酶的活性增强而L-精氨酸生产能力提高的棒状杆菌属微生物。
天冬氨酸氨裂解酶(aspartate ammonia-lyase，aspA)是由富马酸和氨合成天冬氨酸的酶，因此可以通过使上述天冬氨酸氨裂解酶的表达增强而增加天冬氨酸的合成，借助于增加的天冬氨酸而提高L-精氨酸的生产率。
在本发明中,上述天冬氨酸氨裂解酶只要是具有上述活性的酶，就可以使用来源于任何微生物的酶，优选地，可以使用来源于埃希氏菌属微生物或棒状杆菌型微生物的酶，更优选地，可以使用来源于大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌的酶。具体地说，上述天冬氨酸氨裂解酶可以具有以序列号21或序列号22记载的氨基酸序列。具有上述序列号21的氨基酸序列的来源于棒状杆菌属微生物的天冬氨酸氨裂解酶由具有以序列号23记载的碱基序列的aspA(NCgl1446)编码，具有上述序列号22的氨基酸序列的来源于埃希氏菌属微生物的天冬氨酸氨裂解酶由具有以序列号24记载的碱基序列的aspA(NCBI GENE ID：12933698)编码。
只要是本发明中公开的具有天冬氨酸氨裂解酶的活性的蛋白质，则相对于上述蛋白质的氨基酸序列具有80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、特别优选为97％以上的同源性的天冬氨酸氨裂解酶也包含于本发明。相对于上述氨基酸序列的同源性例如可以使用根据文献的算法BLAST[参考：Karlin和Altschul，Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]或利用皮尔逊(Pearson)的FASTA[参考：Methods Enzymol.,183,63(1990)]来确定。基于这样的算法BLAST，开发出被称为BLASTN或BLASTX的程序[参考：http://www.ncbi.nlm.nih.gov]。
作为用于实现上述目的的另一个方案，本发明提供进一步地天冬氨酸氨基转移酶的活性增强的棒状杆菌属微生物。
在本发明中，上述天冬氨酸氨基转移酶来源于棒状杆菌属微生物，具有序列号25的氨基酸序列，由具有序列号26的碱基序列的aspB(NCgl0237)编码。
只要是本发明中公开的具有天冬氨酸氨基转移酶的活性的蛋白质，则相对于上述蛋白质的氨基酸序列具有80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、特别优选为97％以上的同源性的天冬氨酸氨基转移酶也包含于本发明。如上所述，相对于上述氨基酸序列的同源性例如可以使用根据文献的算法BLAST[参考：Karlin和Altschul，Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]或利用皮尔逊(Pearson)的FASTA[参考：MethodsEnzymol.,183,63(1990)]来确定。基于这样的算法BLAST，开发出被称为BLASTN或BLASTX的程序[参考：http://www.ncbi.nlm.nih.gov]。
作为用于实现上述目的的再另一个方案，本发明提供天冬氨酸氨裂解酶和天冬氨酸氨基转移酶的活性均增强的棒状杆菌属微生物。
本发明的特征在于，具有L-精氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，天冬氨酸氨裂解酶和/或天冬氨酸氨基转移酶的活性比本来的活性增强(或增加)。
上述用语“本来的活性”是指，没有任何用于调节上述酶的活性的基因操作或变形的具有L-精氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物所具有的活性。此外，上述“增强”或“增加”是指，L-精氨酸生产能力比具有L-精氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物本来的活性提高。
本发明的活性增强(或增加)可以使用本领域中公知的多种方法。作为该方法的例子，有如下方法：利用编码天冬氨酸氨裂解酶和/或天冬氨酸氨基转移酶的多核苷酸导入载体系统的方法等，增加编码天冬氨酸氨裂解酶和/或天冬氨酸氨基转移酶的碱基序列的拷贝数的方法；用强启动子更换的方法；向启动子导入突变的方法；以及借助于基因突变的方法等，但并不限于此。
在一个具体实施中，为了增强具有L-精氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物的天冬氨酸氨裂解酶和/或天冬氨酸氨基转移酶的活性，可以使用如下方法：将编码天冬氨酸氨裂解酶和/或天冬氨酸氨基转移酶的基因导入载体，使棒状杆菌属微生物转化，增加上述基因的拷贝数。
本发明中，上述用语“转化”是指，通过将包含编码目标蛋白质的多核苷酸的载体导入宿主细胞内，能够使上述由多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞内表达。导入的多核苷酸只要能够在宿主细胞内表达，就可以插入并配置于宿主细胞的染色体内或者配置于染色体外。上述多核苷酸只要能够导入宿主细胞内进行表达，则可以以任何形态导入。
在本发明的实施例中，将包含上述基因的重组载体导入宿主微生物来制造转化的微生物，经由2次交叉过程，分离在染色体内包含2个拷贝(2copy)上述基因的L-精氨酸生产菌株。
在本发明中，上述用语“载体”是指含有如下多核苷酸的碱基序列的DNA制品，所述多核苷酸以能够使目标蛋白质在合适的宿主内表达的方式可启动地连接于合适的调节序列，且编码上述目标蛋白质。上述调节序列包含能够开始转录的启动子、用于调节这样的转录的任意操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及调节转录和译码的终止的序列。载体在转化至适当的宿主内后，可以与宿主基因组无关地进行复制或者发挥功能，可以整合到基因组其本身。
本发明中使用的载体只要能够在宿主中复制，则没有特别限定，可以利用本领域中已知的任意载体。作为通常使用的载体的例子，可以举出天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。
由本发明的方法转化的谷氨酸棒状杆菌(KCCM11351P)菌株是如下的转化的微生物：通过PCR，从作为L-精氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌ATCC21831的染色体获得编码天冬氨酸氨裂解酶的aspA，将该aspA插入载体后，导入作为L-精氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P，从而增加aspA的表达。确认到，利用本发明的方法转化的上述菌株KCCM11351P可以通过aspA的过表达以高收率生产L-精氨酸。
作为用于实现上述目的的一个方案，本发明还提供培养上述转化的棒状杆菌属微生物来生产L-精氨酸的方法。
在本发明的制造L-精氨酸的方法中，上述转化的L-精氨酸过表达微生物的培养过程可以利用本领域中已知的适当的培养基和培养条件来实现。只要是本领域技术人员，则可以根据被选择的菌株容易地调整这样的培养过程来使用。上述培养方法的例子，包括分批式培养(batch culture)、连续式培养(continuous culture)和流加式培养(fed-batchculture)，但并不限于此。这样的多种培养方法例如记载于“Biochemical Engineering”(James M.Lee，Prentice-Hall International Editions，pp138-176,1991)等。
本发明中使用的培养基使用原糖或葡萄糖作为主要碳源，也可以利用包含大量原糖的糖蜜作为碳源，可以多样地利用此外的适量的碳源，优选使用精制葡萄糖。可使用的氮源的例子包括：胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆和豆粕
Figure BDA0000828773860000071
之类的有机氮源；以及尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵之类的无机氮源，优选使用胨。这些氮源可以单独或组合使用。在上述培养基中，可以包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾以及对应的含有钠的盐作为磷源。此外，可以包含硫酸镁或硫酸铁之类的金属盐。除此之外，可以包含氨基酸、维生素和适当的前体等。这些培养基或前体可以以分批式或连续式添加于培养物。
在培养中，可以将氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸之类的化合物以适当的方式添加于培养物，来调节培养物的pH。此外，在培养中，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯之类的消泡剂来抑制气泡生成。此外，为了维持培养物的好氧状态(aerobic condition)，向培养物内注入氧或含氧气体(例如，空气)。培养物的温度通常为20℃至45℃，优选为25℃至40℃。培养时间可以持续至获得所期望的L-精氨酸生产量为止，优选为10至160小时。
L-精氨酸从培养物的分离可以利用本领域中已知的常规方法来分离。这样的分离方法可以利用离心分离、过滤、离子交换色谱和结晶化等方法。例如，可以将培养物以低速进行离心分离，去除生物质，对所获得的上清液通过离子交换色谱进行离心分离。
下面，基于实施例更详细说明本发明。但这些实施例用于示例性说明本发明，本发明的范围并不限于这些实施例。
[实施例]
实施例1：确认aspA基因在L-精氨酸生产中的影响
为了确认aspA是否在L-精氨酸生产中为主要基因，制作aspA缺失载体，转化至作为L-精氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P(韩国专利注册第0791659号)，对L-精氨酸生产率进行评价。
(1)aspA缺失载体的制作
为了使染色体缺失作为编码天冬氨酸氨裂解酶的基因的aspA(Ncgl1446)基因，利用凯杰公司的基因组尖系统(QIAGEN Genomic-tip system)，提取购自美国生物资源中心(American Type Culture Collection：ATCC)的谷氨酸棒状杆菌ATCC21831的染色体，将该染色体作为模板(template)进行了交叉PCR。
具体地说，利用序列号1和2的引物，通过如下PCR方法，扩增了在5′区域具有XmaI限制酶位点的约798bp的片段，所述PCR方法利用Pfu聚合酶将在94℃变性1分钟、在58℃退火30秒、在72℃聚合60秒的条件反复30次。然后，利用序列号3和4的引物，通过上述记载的PCR方法，扩增了在3′区域具有XbaI限制酶位点的约829bp碱基对的片段。利用GeneAllRExpinTM GEL SV试剂盒(韩国首尔)，将所得到的DNA片段分离后，用作用于进行交叉PCR的模板。
为了确保包含上述aspA缺失的DNA片段，利用序列号1和4的引物，将得到的两个DNA片段作为模板进行了交叉PCR。具体地说，通过上述记载的PCR方法，扩增了约1583bp的片段。对扩增的片段用限制酶XmaI和XbaI进行处理后，通过与用相同酶处理的pD载体连接，制作了载体pDKO1446。
(2)重组菌株的制造
将上述制作的pDKO1446载体转化至作为L-精氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P，经由2次交叉过程，获得在染色体上缺失aspA的L-精氨酸生产菌株。将筛选出的菌株命名为KCCM10741ΔaspA。
(3)重组菌株的L-精氨酸生产能力确认
为了利用上述制造的作为重组L-精氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741ΔaspA来掌握aspA的缺失对L-精氨酸生产能力造成的影响，利用如下方法进行培养。
此时，作为对照组，将作为宿主细胞的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P培养后使用，将1铂环的菌株接种于含有生产培养基25ml的250ml角带挡板(corner-baffle)的烧瓶，在30℃、以200rpm培养48小时。培养结束后，用HPLC测定L-精氨酸的生产量，将其结果示于下述表1。
<生产培养基>
葡萄糖6％、硫酸铵3％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.2％、CSL(玉米浆)1.5％、NaCl 1％、酵母提取物0.5％、生物素100mg/L、pH7.2
表1
[表1]
L-精氨酸生产能力的比较
菌株 OD 精氨酸浓度(g/L)
KCCM10741P 91 3.0
KCCM10741PΔaspA 101 2.4
如上述表1所示，确认到aspA缺失的菌株的L-精氨酸的生产能力下降，且确认到在L-精氨酸的生产中aspA是主要基因。
实施例2：导入来源于棒状杆菌的aspA的载体的制作
为了制作作为编码来源于棒状杆菌的天冬氨酸氨裂解酶的基因的aspA(Ncgl1446)的2个拷贝载体，将谷氨酸棒状杆菌ATCC21831染色体作为模板(template)，利用序列号5和6的引物、序列号7和8的引物，进行PCR，确保了分别包含aspA的DNA片段。
具体地说，利用序列号5和6的引物，通过如下PCR方法，扩增了在5′区域具有XmaI且在3′区域具有BamHI限制酶位点的约1893bp的片段，所述PCR方法利用Pfu聚合酶将在94℃变性1分钟、在58℃退火30秒、在72℃聚合2分钟的条件反复30次。其次，利用序列号7和8的引物，通过上述记载的PCR方法，扩增了在5′区域具有BamHI且在3′区域具有XbaI限制酶位点的约1885bp碱基对的片段。
利用GeneAllR ExpinTM GEL SV试剂盒(韩国首尔)，将所得到的DNA片段分离后，对第一个片段用XmaI和BamHI进行处理，对第二个片段用BamHI和XbaI进行处理，并对pD载体用XmaI和XbaI进行处理。将经限制酶处理的pD载体与两个DNA片段连接，制作了pD1446-2X载体。
实施例3：aspA的表达增强的重组菌株的制造
将上述实施例2中制作的pD1446-2X载体分别转化至作为L-精氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P和谷氨酸棒状杆菌ATCC21831，经由2次交叉过程，获得在染色体上包含2个拷贝aspA的L-精氨酸生产菌株。将所得到的菌株分别命名为KCCM10741P::aspA_2X和ATCC21831::aspA_2X。
实施例4：导入来源于棒状杆菌的aspB的载体的制作
为了制作作为编码天冬氨酸氨基转移酶的基因的aspB(Ncgl0237)2个拷贝载体，将谷氨酸棒状杆菌ATCC21831染色体作为模板(template)，利用序列号9和10的引物、序列号11和12的引物，进行PCR，确保了分别包含aspB的DNA片段。
具体地说，利用序列号9和10的引物，通过如下PCR方法，扩增了在5′区域具有XmaI且在3′区域具有NdeI限制酶位点的约1692bp的片段，所述PCR方法利用Pfu聚合酶将在94℃变性1分钟、在58℃退火30秒、在72℃聚合2分钟的条件反复30次。其次，利用序列号11和12的引物，通过上述记载的PCR方法，扩增了在5′区域具有NdeI且在3′区域具有SpeI限制酶位点的约1643的片段。
利用GeneAllR ExpinTM GEL SV试剂盒(韩国首尔)，将所得到的DNA片段分离后，对第一个片段用XmaI和NdeI进行处理，对第二个片段用NdeI和SpeI进行处理，并对pD载体用XmaI和XbaI进行处理。通过经限制酶处理的pD载体与2个DNA片段的3片段连接(3pieceligation)，制作了pD0237-2X载体。
实施例5：aspB的表达增强的菌株的制造
将上述实施例4中制作的pD0237-2X载体分别转化至作为L-精氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P、谷氨酸棒状杆菌ATCC21831，经由2次交叉过程，获得在染色体上包含2个拷贝aspB的L-精氨酸生产菌株。将所得到的菌株分别命名为KCCM10741P::aspB_2X和ATCC21831::aspB_2X。
实施例6：aspA和aspB的表达增强的菌株的制造
将上述实施例4中制作的pD0237-2X载体分别转化至作为上述实施例3中制造的重组微生物的KCCM10741P::aspA_2X和ATCC21831::aspA_2X，经由2次交叉过程，获得在染色体上包含aspA和aspB 2个拷贝的L-精氨酸生产菌株。将所得到的菌株分别命名为KCCM10741P：：aspA_2X：：aspB_2X和ATCC21831：：aspA_2X：：aspB_2X。
实施例7：L-精氨酸生产能力的评价
为了利用上述实施例3、5和6中制造的L-精氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P：：aspA_2X、ATCC21831：：aspA_2X、KCCM10741P：：aspB_2X、ATCC21831：：aspB_2X、KCCM10741P：：aspA_2X：：aspB_2X和ATCC21831：：aspA_2X：：aspB_2X来掌握aspA增强、aspB增强或aspA和aspB同时增强对L-精氨酸的生产能力造成的影响，利用如下方法进行培养。
此时，作为对照组，将作为宿主细胞的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P和ATCC21831培养后使用，将1铂环的菌株接种于与实施例1相同的含有生产培养基25ml的250ml角带挡板的烧瓶，在30℃、以200rpm培养48小时。培养结束后，用HPLC测定L-精氨酸的生产量，将其结果示于下述表2。
表2
[表2]
各菌株的精氨酸生产能力的比较
菌株 OD 精氨酸浓度(g/L)
KCCM10741P 91 3.0
KCCM10741P：：aspA_2X 90 3.9
KCCM10741P：：aspB_2X 93 3.4
KCCM10741P：：aspA_2X：：aspB_2X 93 3.7
ATCC21831 102 4.2
ATCC21831：：aspA_2X 102 5.0
ATCC21831：：aspB_2X 105 4.7
ATCC21831：：aspA_2X：：aspB_2X 104 5.1
如上述表2所示，导入2个拷贝aspA时，两种来源的谷氨酸棒状杆菌中均显示出L-精氨酸生产能力提高的结果。特别是，在KCCM10741P：：aspA_2X的情况下，与对照组相比，L-精氨酸生产能力大幅提高至30％，将其于2013年01月21日以保藏号KCCM11351P保藏在位于韩国首尔特别市西大门区弘济1栋361-221号的国际保藏单位、即韩国菌种协会附设的韩国微生物保藏中心。
实施例8：导入来源于埃希氏菌属的aspA的载体的制作
为了将作为编码来源于埃希氏菌属的天冬氨酸氨裂解酶的基因的aspA(NCBI-GeneID：12933698)导入具有L-精氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌的染色体内部，利用被已知为谷氨酸输出蛋白(glutamate exporter)的Ncgl1221位点(site)(yggB：Appl EnvironMicrobiol.2007Jul；73(14):4491-8)。
为了在Ncgl1221位点导入来源于埃希氏菌属的aspA的载体，首先制作了包含Ncgl1221的位点特异性基因缺失(site specific gene disruption)的pDKO1221载体。
为了确保Ncgl1221的位点特异性基因缺失的DNA片段，提取谷氨酸棒状杆菌ATCC21831的染色体，将该染色体作为模板(template)进行交叉PCR。具体地说，利用序列号13和14的引物，通过如下PCR方法，扩增了在5′区域具有EcoRI限制酶位点的约789bp的片段，所述PCR方法利用Pfu聚合酶将在94℃变性1分钟、在58℃退火30秒、在72℃聚合60秒的条件反复30次。其次，利用序列号15和16的引物，通过上述记载的PCR方法，扩增了在3′区域具有PstI限制酶位点的约835bp碱基对的片段。利用GeneAllR ExpinTM GEL SV试剂盒(韩国首尔)，将所得到的DNA片段分离后，用作用于进行交叉PCR的模板。
为了确保上述包含内部Ncgl1221的内部基因缺失的DNA片段，利用序列号13和16的引物，将上述得到的两个DNA片段作为模板，进行了交叉PCR。具体地说，通过上述记载的PCR方法，扩增了约1602bp的片段。对扩增的片段用限制酶EcoRI和PstI进行处理后，通过与用相同限制酶处理的pD载体连接，制作了pDKO1221载体。
利用上述制作的pDKO1221载体，制作了导入埃希氏菌属aspA的载体。关于谷氨酸棒状杆菌中启动的cj7启动子(cj7promoter)，将p117pcj7-gfp(韩国专利申请第10-2004-0107215号)作为模板，利用序列号17和18的引物，通过如下PCR方法，扩增了在5′区域具有BamHI限制酶位点的约524bp的片段，所述PCR方法利用Pfu聚合酶将在94℃变性1分钟、在58℃退火30秒、在72℃聚合30秒的条件反复30次。关于埃希氏菌属aspA，利用凯杰公司的基因组尖系统(QIAGEN Genomic-tip system)，提取大肠埃希氏菌W3110染色体，将该染色体作为模板，利用序列号19和20的引物，通过上述记载的PCR方法，扩增了在3′区域具有XbaI限制酶位点的约1607bp的片段。利用GeneAllR ExpinTM GEL SV试剂盒(韩国首尔)，将所得到的DNA片段分离后，用作用于进行交叉PCR的模板。
为了确保上述来源于埃希氏菌属的aspA的DNA片段，利用序列号17和20的引物，将上述得到的两个DNA片段作为模板，进行了交叉PCR。具体地说，通过上述记载的PCR方法，扩增了约2095bp的片段。对扩增的片段用限制酶BamHI和XbaI进行处理后，通过与用相同酶处理的pDKO1221载体连接，制作了pDKO1221-EC_aspA载体。
实施例9：来源于埃希氏菌属的aspA的表达增强的重组菌株的制造
将上述制作的pDKO1221-EC_aspA载体转化至L-精氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P和ATCC21831，经由2次交叉过程，获得在染色体上包含来源于埃希氏菌属的aspA基因的L-精氨酸生产菌株。将所得到的菌株分别命名为KCCM10741PΔNcgl1221-EC_aspA和ATCC21831ΔNcgl1221-EC_aspA。此外，将上述制作的pDKO1221载体转化至L-精氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P和ATCC21831，经由2次交叉过程，获得在染色体上缺失NCgl1221的KCCM10741PΔNcgl1221和ATCC21831ΔNcgl1221菌株。
实施例10：来源于埃希氏菌属的aspA的表达增强的重组菌株的L-精氨酸生产能力评价
为了利用作为上述实施例9中制造的L-精氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741PΔNcgl1221-EC_aspA和ATCC21831ΔNcgl1221-EC_aspA来掌握来源于大肠杆菌的aspA的导入对L-精氨酸生产能力造成的影响，利用如下方法进行培养。
此时，作为对照组，将作为宿主细胞的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P、ATCC21831、KCCM10741PΔNcgl1221和ATCC21831ΔNcgl1221培养后使用，将1铂环的菌株接种于含有生产培养基(周1)25ml的250ml角带挡板的烧瓶，在30℃、以200rpm培养48小时。培养结束后，用HPLC测定L-精氨酸的生产量，将其结果示于下述表3。
表3
[表3]
精氨酸生产能力的比较
菌株 OD 精氨酸浓度(g/L)
KCCM10741P 91 3.0
KCCM10741PΔNcgl1221 90 3.0
KCCM10741PΔNcgl1221-EC_aspA 94 3.6
ATCC21831 102 4.2
ATCC21831ΔNcgl1221 103 4.1
ATCC21831ΔNcgl1221-EC_aspA 107 4.7
如上述表3所示可以确认到，即使在导入来源于埃希氏菌属的aspA的情况下，两种来源的谷氨酸棒状杆菌中L-精氨酸生产能力也提高。
通过以上说明，本发明所属技术领域的技术人员可以理解，本发明可以在不变更其技术思想或必要特征的情况下以其他具体形式实施。与此关联，应理解，以上描述的实施例在所有方面上是例示性的，并非是限定性的。本发明的范围应解释为，从上述的权利要求范围的意思和范围及其等同概念导出的所有变更或变形的形态包含在本发明的范围内，而不应由上述详细说明解释。
[保藏号]
保藏单位名称：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏号：KCCM11351P
保藏日期：20130121
Figure BDA0000828773860000151
关于已保藏的微生物或其他生物材料的说明
(专利合作条约细则13之2)
Figure BDA0000828773860000152
Figure BDA0000828773860000153
PCT/R0/134表(1998年7月；2004年1月再版)
Figure IDA0000828773950000011
Figure IDA0000828773950000021
Figure IDA0000828773950000031
Figure IDA0000828773950000041
Figure IDA0000828773950000051
Figure IDA0000828773950000061
Figure IDA0000828773950000071
Figure IDA0000828773950000081
Figure IDA0000828773950000091
Figure IDA0000828773950000101

Claims (10)

1.一种L-精氨酸生产能力提高的棒状杆菌属微生物，其来源于棒状杆菌属微生物的天冬氨酸氨裂解酶和天冬氨酸氨基转移酶的活性增强，与天冬氨酸氨裂解酶和天冬氨酸氨基转移酶的活性增强前的棒状杆菌属微生物相比L-精氨酸生产能力提高。
2.根据权利要求1所述的L-精氨酸生产能力提高的棒状杆菌属微生物，其中，所述天冬氨酸氨裂解酶具有以序列号21记载的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的L-精氨酸生产能力提高的棒状杆菌属微生物，其中，所述天冬氨酸氨基转移酶具有以序列号25记载的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的L-精氨酸生产能力提高的棒状杆菌属微生物，其中，所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌。
5.一种生产L-精氨酸的方法，其中，包括：
将天冬氨酸氨裂解酶的活性增强且L-精氨酸生产能力提高的棒状杆菌属微生物在培养基中进行培养的步骤，以及
从所述培养而得到的培养基中分离L-精氨酸的步骤，
所述活性增强利用选自增加编码天冬氨酸氨裂解酶的碱基序列的拷贝数的方法、用强启动子更换的方法、以及向启动子导入突变的方法中的一种以上的方法。
6.根据权利要求5所述的生产L-精氨酸的方法，其中，所述天冬氨酸氨裂解酶来源于棒状杆菌属微生物或埃希氏菌属微生物。
7.根据权利要求5所述的生产L-精氨酸的方法，其中，所述天冬氨酸氨裂解酶具有以序列号21或序列号22记载的氨基酸序列。
8.根据权利要求5所述的生产L-精氨酸的方法，其中，进一步地使天冬氨酸氨基转移酶的活性增强。
9.根据权利要求5所述的生产L-精氨酸的方法，其中，所述天冬氨酸氨基转移酶具有以序列号25记载的氨基酸序列。
10.根据权利要求5所述的生产L-精氨酸的方法，其中，所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108866028B (zh) * 2017-05-09 2020-04-10 中国科学院微生物研究所 一种氨基裂解酶突变体蛋白及其编码基因与应用
KR101999454B1 (ko) * 2017-12-19 2019-07-11 씨제이제일제당 (주) L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산방법
CN116445387A (zh) 2019-04-12 2023-07-18 绿色地球研究所株式会社 生产目标物质的方法、转基因微生物及核酸的应用
CN114349831B (zh) * 2021-12-14 2024-02-06 宁夏伊品生物科技股份有限公司 aspA基因突变体、重组菌及制备L-缬氨酸的方法
CN114908027B (zh) * 2022-01-20 2023-12-26 天津科技大学 泛酸生产相关菌株及其构建方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0318663A1 (de) * 1987-11-06 1989-06-07 Degussa Aktiengesellschaft Pendelvektor pZ1, rekombinantes, ein Aspartasegen enthaltendes Plasmid, seine Verwendung zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat-Familie aus Fumarat-haltigem Nährmedium und es enthaltende Mikroorganismen
WO2008088148A1 (en) * 2007-01-18 2008-07-24 Cj Cheiljedang Corporation Corynebacterium glutamicum variety producing l-arginine and method for fabricating the same

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06102028B2 (ja) 1985-10-04 1994-12-14 協和醗酵工業株式会社 アミノ酸の製造法
JP3009257B2 (ja) * 1991-07-25 2000-02-14 三菱化学株式会社 アスパルターゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用
JP4178720B2 (ja) 1999-06-03 2008-11-12 味の素株式会社 Ｌ−アルギニンの製造法
US7160705B2 (en) 2000-04-28 2007-01-09 Ajinomoto Co., Inc. Arginine repressor deficient strain of coryneform bacterium and method for producing L-arginine
EP1201758B1 (en) * 2000-10-27 2008-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Microorganisms and method for L-arginine production by fermentation
DE10361268A1 (de) * 2003-12-24 2005-07-28 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
ES2331956T3 (es) * 2004-01-30 2010-01-21 Ajinomoto Co., Inc. Microorganismo que produce l-aminoacidos y procedimiento para producir l-aminoacidos.
DE102004037572A1 (de) * 2004-08-03 2006-02-23 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
CA2598792A1 (en) * 2005-03-02 2006-09-08 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
KR100791659B1 (ko) 2006-07-13 2008-01-03 씨제이 주식회사 알지닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 엘-알지닌의제조방법
JP2010110217A (ja) * 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP5574400B2 (ja) * 2008-12-26 2014-08-20 独立行政法人酒類総合研究所 変異型リパーゼとその応用
KR101226384B1 (ko) 2010-03-05 2013-01-25 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
WO2012061653A2 (en) 2010-11-03 2012-05-10 The Regents Of The University Of California Biofuel and chemical production by recombinant microorganisms via fermentation of proteinacious biomass

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0318663A1 (de) * 1987-11-06 1989-06-07 Degussa Aktiengesellschaft Pendelvektor pZ1, rekombinantes, ein Aspartasegen enthaltendes Plasmid, seine Verwendung zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat-Familie aus Fumarat-haltigem Nährmedium und es enthaltende Mikroorganismen
WO2008088148A1 (en) * 2007-01-18 2008-07-24 Cj Cheiljedang Corporation Corynebacterium glutamicum variety producing l-arginine and method for fabricating the same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Influence of increased aspartate availability on lysine ofrmation by a recombinant strain of corynebacterium glutamicum and utilization of fumarate;MENKEL,ET AL;《American Society For Microbiology》;19890301;第55卷(第3期);摘要部分、图1 *

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