JP6412147B2 - Ｌ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物およびこれを用いたｌ−スレオニンの産生方法 - Google Patents

Description

本発明は、コリネ型細菌由来のパーミアーゼを発現するように変形されて向上したＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物およびこれを用いてＬ−スレオニンを産生する方法に関する。

Ｌ−スレオニンは、必須アミノ酸の一種であり、飼料および食品添加剤として広く用いられ、医薬用に輸液剤、医薬品の合成原料としても用いられる。

Ｌ−スレオニンは、主として人工変異法または遺伝子組み換え方法により開発されたエシェリキア属、セタチア属、プロデンシア属またはコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはこの人工変異株を用いた発酵法により産生される。スレオニンの生合成に関連する遺伝子およびこれらの発現を増加させる様々な方法が開発されたが、より経済的に且つより高い歩留まりにてＬ−スレオニンを産生し得る方法へのニーズが依然として存在する。

大腸菌においてｇａｌＰ遺伝子によりコーディングされるＧａｌＰタンパク質は、ガラクトースおよび葡萄糖をはじめとする各種の糖を細胞の内部に輸送するガラクトースパーミアーゼであることが知られており（Ｖ． Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｎｔａｌｖｏ Ｆ． Ｖａｌｌｅ Ｆ． Ｂｏｌｉｖａｒ Ｇ． Ｇｏｓｓｅｔ， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２００１） ５７：１８６−１９１）、これは、グルコースパーミアーゼとしても作用することが知られている（Ｖｅｎｔｅｒ， Ｈｅｎｒｉｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ （２００２） ３６３：２４３−２５２）。大腸菌においてコピー数の増加などを通してｇａｌＰ遺伝子の発現を増加させると、スレオニンの産生能が増加されるという報告がある（ＷＯ２００４／０８７９３７）。

コリネバクテリウムグルタミクムにおいては、ｉｏｌＴ１およびｉｏｌＴ２遺伝子により暗号化されるイノシトールパーミアーゼがグルコースパーミアーゼとしても作用するということが報告されており（Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２０１１） ９０：１４４３−１４５１）、これらの遺伝子が大腸菌のｇａｌＰ遺伝子との高い相同性を有するということも報告されているが、前記イノシトールパーミアーゼとスレオニン産生との間の関係を示す報告は未だに報告されていない。

本発明者らは、コリネバクテリウム属微生物においてイノシトールパーミアーゼをコーディングするｉｏｌＴ１遺伝子および／またはｉｏｌＴ２遺伝子を大腸菌に取り込む場合、エシェリキア属微生物が向上したＬ−スレオニン産生能を有するということを見出し、本発明を完成するに至った。

Ｖ． Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｎｔａｌｖｏ Ｆ． Ｖａｌｌｅ Ｆ． Ｂｏｌｉｖａｒ Ｇ． Ｇｏｓｓｅｔ， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２００１） ５７：１８６−１９１ Ｖｅｎｔｅｒ， Ｈｅｎｒｉｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ （２００２） ３６３：２４３−２５２ Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２０１１） ９０：１４４３−１４５１

したがって、本発明の目的は、コリネ型細菌由来のパーミアーゼを発現するように変形されてＬ−スレオニン産生能が向上した組み換えエシェリキア属微生物を提供することである。

また、本発明の目的は、前記組み換え微生物を用いてＬ−スレオニンを高い歩留まりにて産生する方法を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明は、コリネバクテリウムグルタミクム由来のパーミアーゼが発現されるように形質転換された組み換えエシェリキア属微生物を提供する。

また、本発明は、前記組み換え微生物を用いてＬ−スレオニンを高い歩留まりにて産生する方法を提供する。

本発明によれば、菌株の生長速度が既存の菌株に比べて大幅に向上してＬ−スレオニンを高い歩留まりにて産生することができる。これにより、産業的に大きな意味を有するＬ−スレオニン産生性が大幅に向上する。

図１は、大腸菌由来のｇａｌＰと、コリネバクテリウムグルタミクム由来のｉｏｌＴ１およびｉｏｌＴ２のアミノ酸配列の相同性整列を示すものである。 図２は、コリネバクテリウムグルタミクム由来のｉｏｌＴ１遺伝子を含む組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１の開裂地図を示すものである。 図３は、コリネバクテリウムグルタミクム由来のｉｏｌＴ２遺伝子を含む組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２の開裂地図を示すものである。 図４は、コリネバクテリウムグルタミクム由来のｉｏｌＴ１およびｉｏｌＴ２遺伝子を含む組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２の開裂地図を示すものである。

本発明は、コリネ型細菌由来のパーミアーゼを発現するように形質転換された、向上したＬ−スレオニン産生能を有することを特徴とする組み換えエシェリキア属微生物を提供することを特徴とする。

本発明において、前記コリネ型細菌由来のパーミアーゼは、コリネバクテリウムグルタミクム由来のものであってもよく、好ましくは、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に由来するものであってもよいが、これに何ら限定されない。

最も好ましくは、前記コリネ型細菌由来のパーミアーゼは、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有していてもよい。前記配列番号１のアミノ酸配列を有するコリネ型細菌由来のパーミアーゼは、配列番号３に記載の塩基配列を有するｉｏｌＴ１遺伝子により暗号化され、前記配列番号２のアミノ酸配列を有するコリネ型細菌由来のパーミアーゼは、配列番号４に記載の塩基配列を有するｉｏｌＴ２遺伝子により暗号化される。

また、本発明において提示したパーミアーゼの活性を有するタンパク質である限り、前記タンパク質のアミノ酸配列の上に一部の変異がある変異体または前記タンパク質のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９７％以上の相同性を有するパーミアーゼもまた本発明に含まれる。

本願において、前記用語「相同性」は、二つのアミノ酸配列間の同一性を示すものであり、点数、同一性、類似度などの媒介変数（パラメータ）を計算するＢＬＡＳＴ２．０を用いる、当業者にとって周知の方法により決定され得る。

本発明の一実施形態においては、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２から大腸菌においてグルコースパーミアーゼをコーディングするｇａｌＰ遺伝子と相同性を有する遺伝子を探索し、その結果、大腸菌のｇａｌＰがコーディングするアミノ酸配列およびコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２由来のｉｏｌＴ１（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００６９５８．１， ｃｇ０２２３）がコーディングするアミノ酸配列は３４％の相同性を示し、ｉｏｌＴ２（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００６９５８．１， ｃｇ３３８７）がコーディングするアミノ酸配列は３１％の相同性を示す（図１を参照）。

前記大腸菌のｇａｌＰ遺伝子は公知のものであり、Ｂｌａｔｔｎｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５３−１４６２（１９９７））により公開された大腸菌のゲノム配列からも得られ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＡＣ７５８７６）、米国生物工学情報センターＮＣＢＩおよび日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースからも得られる。

本発明のＬ−スレオニン産生能を有するエシェリキア属微生物は、大腸菌およびＬ−スレオニン産生用大腸菌変異株であってもよい。より好ましくは、前記Ｌ−スレオニン産生能を有するエシェリキア属微生物は、メチオニン要求性、スレオニン類似体に対する耐性、リシン類似体に対する耐性、イソロイシン類似体に対する耐性およびメチオニン類似体に対する耐性を有し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ、ｐｐｃ遺伝子）およびスレオニンオペロンが２コピー以上染色体内に取り込まれたことを特徴とするＬ−スレオニン産生用菌株である大腸菌ＫＦＣＣ １０７１８（大韓民国特許登録番号第１０−００５８２８６号）に由来する大腸菌ＫＣＣＭ １０５４１（大韓民国特許登録番号第１０−０５７６３４２号）である。

本発明のＬ−スレオニン産生能を有するエシェリキア属微生物においてパーミアーゼをコーディングする遺伝子を発現させるための方法は特に制限されない。例えば、パーミアーゼをコーディングする遺伝子を含む組み換えベクターを微生物に形質転換してもよく、パーミアーゼをコーディングする遺伝子のコピー数を増加させてもよく、パーミアーゼをコーディングする遺伝子の発現調節配列を調節してもよく、二種類以上の方法を併用してもよい。一般に、スレオニン生合成に関連する遺伝子の発現量を高めるための方法として、一つの微生物が有する遺伝子の数を高める方法が挙げられ、このために、通常、コピー数が高く保たれるプラスミドを用いる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ２版， １９８９， １．３〜１．５）。すなわち、コピー数が高く保たれるプラスミドに所望の遺伝子を挿入し、このような組み換えプラスミドを再び微生物に形質転換させることにより、一つの微生物当たりにそのプラスミドのコピー数に見合う分だけ遺伝子のコピー数を増やす効果を期待することができる。なお、スレオニン生合成に関連する遺伝子を染色体ＤＮＡ中に挿入する方法が用いられることもある。

本発明の一実施形態において、本発明は、コリネバクテリウムグルタミクム由来のｉｏｌＴ１遺伝子および／またはｉｏｌＴ２遺伝子を含む組み換えベクターおよび前記組み換えベクターに形質転換された、向上したＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物を提供する。

本願において、前記用語「ベクター」とは、好適な宿主中において目的タンパク質を発現させるように好適な調節配列に作動可能なように連結されている前記目的タンパク質を暗号化させるポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物のことをいう。前記調節配列は、転写を開始し得るプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列および転写および解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適当な宿主内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能してもよく、ゲノムそのものに取り込まれてもよい。

本発明において用いられるベクターは、宿主中において複製可能なものであれば、特に制限がなく、当業界において周知の任意のベクターが使用可能である。通常的に用いられるベクターの例としては、天然状態あるいは組み換え状態のプラスミド、コスミド、ウィルスおよびバクテリオファージが挙げられる。

本発明は、コリネバクテリウムグルタミクム由来のｉｏｌＴ１遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。好ましくは、前記組み換えベクターは、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１であることを特徴とし、さらに好ましくは、図２の開裂地図を有する。

また、本発明は、コリネバクテリウムグルタミクム由来のｉｏｌＴ２遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。好ましくは、前記組み換えベクターは、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２であることを特徴とし、さらに好ましくは、図３の開裂地図を有する。

さらに、本発明は、コリネバクテリウムグルタミクム由来のｉｏｌＴ１およびｉｏｌＴ２遺伝子を同時に発現させるための組み換えベクターを提供する。好ましくは、前記組み換えベクターは、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２であることを特徴とし、さらに好ましくは、図４の開裂地図を有する。

本願において、前記用語「形質転換」とは、目的タンパク質を暗号化させるポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に取り込んで宿主細胞内において前記ポリヌクレオチドが暗号化させるタンパク質が発現できるようにすることをいう。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内において発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置してもよく、染色体外に位置してもよい。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に取り込まれて発現可能なものである限り、いかなる形で取り込まれても構わない。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質を暗号化させるＤＮＡおよびＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に取り込まれて発現できるものであれば、いかなる形で取り込まれても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体的に発現されるのに必要なあらゆる要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセットの形で宿主細胞に取り込まれてもよい。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能なように連結されているプロモーター、転写終結信号、リボソーム結合部位および翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは、自体的に複製可能な発現ベクターの形であってもよい。なお、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形で宿主細胞に取り込まれて、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能なように連結されているものであってもよい。

一態様において、本発明は、コリネバクテリウムグルタミクム由来のｉｏｌＴ１遺伝子またはｉｏｌＴ２遺伝子を含む組み換えベクターに形質転換された、向上したＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物を提供する。

他の態様において、本発明は、コリネバクテリウムグルタミクム由来のｉｏｌＴ１遺伝子およびｉｏｌＴ２遺伝子を含む組み換えベクターに形質転換された、向上したＬ−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物を提供する。

好ましくは、本発明の前記形質転換された組み換えエシェリキア属微生物は、大腸菌であってもよく、好ましくは、前記微生物は、大腸菌ＣＡ０３−０２３０（ＫＣＣＭ１１３７０Ｐ）、大腸菌ＣＡ０３−０２６０（ＫＣＣＭ１１３６９Ｐ）または大腸菌ＣＡ０３−０２３１（ＫＣＣＭ１１３７１Ｐ）であってもよい。

上述した本発明の組み換えスレオニン産生菌株は、大腸菌内にコリネ型細菌由来のｉｏｌＴ１および／またはｉｏｌＴ２遺伝子を取り込んで大腸菌内のパーミアーゼの発現を増加させて菌株の糖消耗速度および生長速度を大幅に向上させることにより、Ｌ−スレオニンを高濃度にて産生することができる。

また、本発明は、前記形質転換された組み換えエシェリキア属微生物を培養するステップおよび前記微生物の培養液からＬ−スレオニンを分離するステップを含むことを特徴とするＬ−スレオニンの製造方法を提供する。

本発明の組み換えエシェリキア属微生物の培養は、通常の方法により行われる。具体的に、炭素源として原糖または葡萄糖の一部または全部が含まれている培養培地に前記微生物を接種して培養することができる。前記培養過程は、当業界において周知の適当な培地および培養条件により行われる。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて手軽に調整して用いることができる。前記培養方法の例には、回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）および流加式培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。培養に用いられる培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満たさなければならない。

具体的に、本発明において用いられる培地は、原糖若しくは葡萄糖を主な炭素源として用い、原糖を多量含む糖蜜もまた炭素源として使用可能であり、その他の適正量の炭素源は様々に利用可能であり、好ましくは、精製葡萄糖を用いる。使用可能な窒素源の例としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液および大豆麦などの有機窒素源およびヨウ素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が挙げられ、好ましくは、ペプトンを用いる。これらの窒素源は、単独でまたは組み合わせて使用可能である。前記培地には、リン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムおよび対応するナトリウム含有塩が含まれ得る。なお、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩を含み得る。これらに加えて、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体などが含まれ得る。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式により添加可能である。

具体的に、培養の温度は、普通、２７℃〜３７℃、好ましくは、３０℃〜３７℃である。培養期間は、所望の有用物質の発現が行われ続け、好ましくは、１０〜１００時間である。

以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されることはない。

［比較例：大腸菌由来ｇａｌＰ遺伝子を含む組み換えベクターに形質転換された組み換え菌株の製造およびＬ−スレオニン産生性の比較］
大腸菌においてガラクトースパーミアーゼはグルコースパーミアーゼの役割を果たし、コピー数を増加させて発現を増加させると、スレオニン産生能が増加されるという報告（ＷＯ２００４／０８７９３７）を確認するために、Ｌ−スレオニン産生菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１にｇａｌＰ遺伝子のコピー数の増加による組み換え菌株を製作してＬ−スレオニン産生性を評価した。

（１）大腸菌由来のｇａｌＰ遺伝子を含む組み換えベクターの製作
大腸菌由来ｇａｌＰ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を含む１．４ｋｂ断片を得るために、キアゲン社製のゲノミック−ティップシステムを用いて大腸菌野生型菌株Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを抽出した。

前記ｇＤＮＡを鋳型として用いて連鎖重合反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、「ＰＣＲ」と略称する。）を行った。このときに用いたプライマーは、配列番号９および１０であり、ＰＣＲ反応条件は、変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）は９４℃で３０秒間、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）は５６℃で３０秒間、伸張（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）は７２℃で５０秒間であり、これを３０回繰り返し行った。前記ＰＣＲ結果物（以下、「ｇａｌＰ断片」と命名する。）は、０．８％アガロースゲルにおいて電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して得た。

前記得られたｇａｌＰ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理した後、同じ制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩで処理された線形ｐＣＣ１ＢＡＣベクター（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製、以下、同じ。）とベクター上のｌａｃプロモーターと方向が一致するように結さつした。

前記製作されたベクターに大腸菌ＤＨ５ａ細胞を形質転換させた後、これをクロラムフェニコール含有ＬＢ固体培地に塗抹して３７℃で一晩中培養した。前記培養したコロニー一白金耳をクロラムフェニコール含有ＬＢ液体培地３ｍｌに接種して一晩中培養した後、プラスミドミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ社製、以下、同じ。）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。組み換えベクターの大きさは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理して確認し（データは図示せず）、配列番号１１および１２のプライマーで変性９４℃で３０秒間、アニーリング５６℃で３０秒間、伸張７２℃で６０秒間の反応条件下でＰＣＲを行ってクローンを確認した。前記組み換えベクターをｐＣＣ１ＢＡＣ−ｇａｌＰと命名した（データは図示せず）。

また、前記ｇａｌＰ断片を同じ制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩで処理された線形ｐＣＬ１９２０ベクターとベクター上のｌａｃプロモーターと方向が一致するように結さつした。前記製作されたベクターに大腸菌ＤＨ５ａ細胞を形質転換させた後、これをスペクチノマイシン含有ＬＢ固体培地に塗抹して３７℃で一晩中培養した。前記培養したコロニー一白金耳をスペクチノマイシン含有ＬＢ液体培地３ｍｌに接種して一晩中培養した後、プラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを回収した。組み換えベクターの大きさは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理して確認し（データは図示せず）、配列番号１３および１４のプライマーで変性９４℃で３０秒間、アニーリング５６℃で３０秒間、伸張７２℃で６０秒間の反応条件下でＰＣＲを行ってクローンを確認した。前記組み換えベクターをｐＣＬ１９２０−ｇａｌＰと命名した（データは図示せず）。

（２）前記組み換えベクターに形質転換された組み換え菌株の製造
母菌株としてＬ−スレオニン産生菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１に前記組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｇａｌＰを電気穿孔法を用いて取り込んでクロラムフェニコール１５μｇ／ｍｌが含まれている固体培地に塗抹して単一コロニーを選別した。この方法と同様にして前記組み換えベクターｐＣＬ１９２０−ｇａｌＰをＬ−スレオニン産生菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１に電気穿孔法を用いて取り込んでスペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌが含まれている固体培地に塗抹して単一コロニーを選別した。

選別された菌株をそれぞれＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｇａｌＰおよびＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＬ１９２０−ｇａｌＰと命名した。

（３）組み換え菌株のＬ−スレオニン産生性の比較
前記（２）において製造された組み換え菌株を下記表１のスレオニン力価培地を用いて三角フラスコにおいて後述する方法と同様にして培養してＬ−スレオニン産生性を確認した。

母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１、ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｇａｌＰおよびＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＬ１９２０−ｇａｌＰ菌株を用いて力価の評価を行った。各菌株に取り込んだとき、前記組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｇａｌＰは１コピー、ｐＣＬ１９２０−ｇａｌＰは５コピー発現されるベクターであり、コピー数の増加に伴う効果を確認しようとした。

異なる遺伝的形質を有する前記組み換え菌株を３３℃の培養器を用いてＬＢ固体培地において一晩中培養した後、前記表１の組成のように葡萄糖が含有されている２５ｍｌの力価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍの培養器を用いて４８時間培養し、その結果を下記表２に示す。

その結果、前記表２に示すように、母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１菌株は、４８時間培養した場合に３２．０ｇ／ＬのＬ−スレオニンを産生したが、この比較例において得られた組み換え菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｇａｌＰは３１．１ｇ／Ｌ、ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＬ１９２０−ｇａｌＰは３０．８ｇ／Ｌと母菌株よりもそれぞれ０．９ｇ／Ｌ、１．２ｇ／ＬにＬ−スレオニン産生が低下した。表２に示すように、母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１菌株は０．７５３ｇ／Ｌ／ｈｒの糖消耗速度を示したが、ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｇａｌＰは０．７９３ｇ／Ｌ／ｈｒ、ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＬ１９２０−ｇａｌＰは０．８１６ｇ／Ｌ／ｈｒを示し、これは母菌株に比べてそれぞれ５．３％、８．４％向上した糖消耗速度である。

［実施例１：コリネ型細菌由来のｉｏｌＴ１、ｉｏｌＴ２遺伝子を含む組み換えベクターの製作］
（１）大腸菌グルコースパーミアーゼｇａｌＰとの相同性の比較
コリネバクテリウムグルタミクムにおいてイノシトールパーミアーゼをコーディングするｉｏｌＴ１、ｉｏｌＴ２遺伝子が大腸菌のグルコースパーミアーゼをコーディングするｇａｌＰ遺伝子とほとんど同じ相同性を有することが報告されてきた。大腸菌由来のｇａｌＰ遺伝子と相同性を有する遺伝子を野生型コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２）のゲノムから見出して比較し、その結果を図１に示す。

大腸菌由来のｇａｌＰがコーディングするアミノ酸配列およびコリネバクテリウムグルタミクム由来のｉｏｌＴ１がコーディングするアミノ酸配列は３４％、ｉｏｌＴ２がコーディングするアミノ酸配列は３１％の相同性を示した。

（２）ｉｏｌＴ１遺伝子断片の準備
配列番号３のｉｏｌＴ１遺伝子のオープンリーディングフレームを含む１．５ｋｂ断片を得るために、キアゲン社製のゲノミック−ティップシステムを用いてコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２）のゲノムＤＮＡを抽出した。

前記ｇＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。このときに用いたプライマーは、配列番号５および６であり、ＰＣＲ反応条件は、変性は９４℃で３０秒間、アニーリングは５６℃で３０秒間、伸張は７２℃で６０秒間であり、これを３０回繰り返し行った。前記ＰＣＲ結果物（以下、「ｉｏｌＴ１断片」と命名する。）は、０．８％アガロースゲルにおいて電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して得た。

（３）組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１の製作
前記（２）において準備したｉｏｌＴ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理した後、同じ制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩで処理された線形ｐＣＣ１ＢＡＣベクターとベクター上のｌａｃプロモーターと方向が一致するように結さつした。

前記製作された組み換えベクターに大腸菌ＤＨ５ａ細胞を形質転換させ、これをクロラムフェニコール含有ＬＢ固体培地に塗抹して３７℃で一晩中培養した。前記培養したコロニー一白金耳をクロラムフェニコール含有ＬＢ液体培地３ｍｌに接種して一晩中培養した後、プラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを回収した。組み換えベクターの大きさは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理して確認し（データは図示せず）、配列番号１１および１２のプライマーで変性９４℃で３０秒間、アニーリング５６℃で３０秒間、伸張７２℃で９０秒間の反応条件下でＰＣＲを行ってクローンを確認した。前記組み換えベクターをｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１と命名した。

（４）ｉｏｌＴ２遺伝子断片の準備
配列番号４のｉｏｌＴ２遺伝子のオープンリーディングフレームを含む１．６ｋｂ断片を得るために、キアゲン社製のゲノミック−ティップシステムを用いてコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２）のゲノムＤＮＡを抽出した。

前記ｇＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。このときに用いたプライマーは、配列番号７および８であり、ＰＣＲ反応条件は、変性は９４℃で３０秒間、アニーリングは５６℃で３０秒間、伸張は７２℃で６０秒間であり、これを３０回繰り返し行った。前記ＰＣＲ結果物（以下、「ｉｏｌＴ１断片」と命名する。）は、０．８％アガロースゲルにおいて電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して得た。

（５）組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２製作
前記（４）において準備したｉｏｌＴ２断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した後、同じ制限酵素であるＥｃｏＲＩで処理された線形ｐＣＣ１ＢＡＣベクターとベクター上のｌａｃプロモーターと方向が一致するように結さつした。

前記製作された組み換えベクターに大腸菌ＤＨ５ａ細胞を形質転換させ、これをクロラムフェニコール含有ＬＢ固体培地に塗抹して３７℃で一晩中培養した。前記培養したコロニー一白金耳をクロラムフェニコール含有ＬＢ液体培地３ｍｌに接種して一晩中培養した後、プラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを回収した。組み換えベクターの大きさは制限酵素ＥｃｏＲＩで処理して確認し（データは図示せず）、配列番号１１および１２のプライマーで変性９４℃で３０秒間、アニーリング５６℃で３０秒間、伸張７２℃で９０秒間の反応条件下でＰＣＲを行ってクローンを確認した。前記組み換えベクターをｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２と命名した。

（６）組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２の製作
前記（５）において製作されたｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２ベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理した後、前記（２）において準備したｉｏｌＴ１断片とベクター上のｌａｃプロモーターと方向が一致するように結さつした。

前記製作されたベクターに大腸菌ＤＨ５ａ細胞を形質転換させ、これをクロラムフェニコール含有ＬＢ固体培地に塗抹して３７℃で一晩中培養した。前記培養したコロニー一白金耳をクロラムフェニコール含有ＬＢ液体培地３ｍｌに接種して一晩中培養した後、プラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを回収した。組み換えベクターの大きさは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理して確認し（データは図示せず）、配列番号１１および１２のプライマーで変性９４℃で３０秒間、アニーリング５６℃で３０秒間、伸張７２℃で１２０秒間の反応条件下でＰＣＲを行ってクローンを確認した。前記組み換えベクターをｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２と命名した。

［実施例２：形質転換された組み換え菌株の製造およびＬ−スレオニン産生性の比較］
（１）野生型大腸菌を用いた組み換え菌株の製造
前記実施例１において製造した組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２およびｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２をそれぞれスレオニンオペロンおよび発現ベクターｐＢＲＴｈｒＡＢＣＲ３（Ｌｅｅ ＫＨ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２００７） ３：１４９）を含む野生型大腸菌ＭＧ１６５５に電気穿孔法を用いて取り込んでアンピシリン１００μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍｌが含まれている固体培地に塗抹して単一コロニーを選別した。

選別された菌株をそれぞれＭＧ１６５５／ｐＢＲＴｈｒＡＢＣＲ３／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１、ＭＧ１６５５／ｐＢＲＴｈｒＡＢＣＲ３／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２およびＭＧ１６５５／ｐＢＲＴｈｒＡＢＣＲ３／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２と命名した。

これらの菌株を前記表１の組成を有するスレオニン力価培地を用いて比較例１３の方法と同様にしてＬ−スレオニン産生性を確認し、その結果を下記表３に示す。

その結果、前記表３に示すように、母菌株である大腸菌ＭＧ１６５５菌株は、４８時間培養した場合に３．８６ｇ／ＬのＬ−スレオニンを産生し、この実施例において得られた組み換え菌株ＭＧ１６５５／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１は３．８８ｇ／Ｌ、ＭＧ１６５５／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２およびＭＧ１６５５／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２はそれぞれ３．９２ｇ／Ｌ、３．８５ｇ／ＬのＬ−スレオニンを産生した。すなわち、母菌株と略同じレベルのＬ−スレオニンを産生した。

前記表３に示すように、野生型母菌株である大腸菌ＭＧ１６５５菌株は０．８７７ｇ／Ｌ／ｈｒの糖消耗速度を示したが、ＭＧ１６５５／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２は１．０３５ｇ／Ｌ／ｈｒ、ＭＧ１６５５／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１は１．１０９ｇ／Ｌ／ｈｒ、ＭＧ１６５５／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２は１．１２３ｇ／Ｌ／ｈｒを示した。これは、母菌株に比べてそれぞれ１８．０％、２６．５％および２８．１％向上した糖消耗速度である。

（２）大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１を用いた組み換え菌株の製造
前記実施例１において製造した組み換えベクターｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２およびｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２をそれぞれ母菌株としてＬ−スレオニン産生菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１に電気穿孔法を用いて取り込んでクロラムフェニコール１５μｇ／ｍｌが含まれている固体培地に塗抹して単一コロニーを選別した。

前記選別された菌株をそれぞれＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１、ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２およびＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２と命名した。

これらの菌株を前記比較例１２において得られた組み換え微生物と共に、前記表１の組成を有するスレオニン力価培地を用いて比較例１３の方法と同様にしてＬ−スレオニン産生性を確認し、その結果を下記表４に示す。

その結果、前記表４に示すように、母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１菌株は、４８時間培養した場合に３０．３ｇ／ＬのＬ−スレオニンを産生し、本発明の前記実施例２−２において得られた組み換え菌株ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２は母菌株よりも２．２ｇ／Ｌ向上したＬ−スレオニン産生性を示し、ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１およびＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２はそれぞれ２９．５ｇ／Ｌ、２９．９ｇ／ＬのＬ−スレオニンを産生した。すなわち、母菌株と略同じレベルのＬ−スレオニンを産生した。

大腸菌由来のｇａｌＰ遺伝子の発現が強化された菌株ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｇａｌＰおよびＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＬ１９２０−ｇａｌＰは、それぞれ２９．８ｇ／Ｌおよび２９．３ｇ／ＬのＬ−スレオニンを産生した。

表４に示すように、母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１菌株は０．８２３ｇ／Ｌ／ｈｒの糖消耗速度を示したが、ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２は１．０９３ｇ／Ｌ／ｈｒ、ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２は１．２００ｇ／Ｌ／ｈｒ、ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１は１．２１３ｇ／Ｌ／ｈｒを示し、これは、母菌株に比べてそれぞれ３２．８％、４５．８％および４７．４％向上した糖消耗速度である。また、これは、ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｇａｌＰおよびＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＬ１９２０−ｇａｌＰの糖消耗速度が母菌株に比べてそれぞれ４．７％、７．４％増加したことと比較したとき、コリネバクテリウムｉｏｌＴ１、ｉｏｌＴ２遺伝子取り込み菌株の糖消耗速度が遥かに大幅に向上したことを確認することができる。

前記形質転換された大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１をＣＡ０３−０２３０、ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ２をＣＡ０３−０２６０、ＫＣＣＭ１０５４１／ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｉｏｌＴ１−ｉｏｌＴ２をＣＡ０３−０２３１と命名し、２０１３年０２月０５日付けで韓国微生物保存センサー（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、以下、「ＫＣＣＭ」と略称する。）にそれぞれ受託番号ＫＣＣＭ１１３７０Ｐ、ＫＣＣＭ１１３６９ＰおよびＫＣＣＭ１１３７１Ｐで寄託した。

上記の結果は、Ｌ−スレオニン産生能を有する大腸菌に大腸菌由来グルコースパーミアーゼの発現を強化した場合よりも、コリネ型微生物由来のパーミアーゼの発現を強化、すなわち、ｉｏｌＴ１、ｉｏｌＴ２遺伝子を一つ以上取り込んだ場合に糖消耗速度が増加し、同じ濃度のスレオニンを産生するのにかかる時間が短縮されて、すなわち、スレオニン産生性が増加することを裏付ける。

以上の説明から、本発明が属する技術分野における当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更することなく他の具体的な形態にて実施可能であるということが理解できる筈である。これと関連して、上述した実施形態はあらゆる面において例示的なものであり、限定的なものではないと理解されるべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味および範囲並びにその等価概念から導き出されるあらゆる変更例または変形例が本発明の範囲に含まれるものと解釈さるべきである。

［受託番号］
寄託機関名：韓国微生物保存センター（海外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１３７０Ｐ
受託日：２０１３年０２月０５日

寄託機関名：韓国微生物保存センター（海外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１３６９Ｐ
受託日：２０１３年０２月０５日

寄託機関名：韓国微生物保存センター（海外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１３７１Ｐ
受託日：２０１３年０２月０５日

Claims (5)

1. コリネ型細菌由来の配列番号１または配列番号２に記載のパーミアーゼを含むように形質転換された、向上したＬ−スレオニン産生速度を有する組み換えエシェリキア属微生物。
2. 前記組み換えエシェリキア属微生物は、大腸菌である、請求項１に記載の向上したＬ−スレオニン産生速度を有する組み換えエシェリキア属微生物。
3. 配列番号１および配列番号２のコリネ型由来のパーミアーゼが両方とも含まれるように形質転換された、請求項１に記載の組み換えエシェリキア属微生物。
4. 前記組み換えエシェリキア属微生物が大腸菌である、請求項３に記載の組み換えエシェリキア属微生物。
5. 請求項１から請求項３のうちのいずれか一項に記載の微生物を接種して培養するステップと、
   前記培養物からＬ−アミノ酸を分離するステップと、
   を含む、Ｌ−スレオニンを産生する方法。

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