KR20150105600A

KR20150105600A - L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 l-쓰레오닌의 생산방법

Info

Publication number: KR20150105600A
Application number: KR1020147030960A
Authority: KR
Inventors: 김형준; 권수연; 고은성; 이지선; 이근철; 황영빈; 홍형표
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2014-02-12
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2015-09-17
Also published as: EP3106516B1; EP3106516A1; WO2015122569A1; CN106029869B; UA118213C2; KR101689451B1; EP3106516A4; CN106029869A

Abstract

본 발명은 코리네형 세균 유래의 퍼미아제가 도입되어 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 대장균 변이주 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 L-쓰레오닌의 생산방법{RECOMBINANT MICROORGANISMS OF ESCHERICHIA WITH L-THREONINE PRODUCTIVITY AND METHOD OF PRODUCING L-THREONINE USING THE SAME}

본 발명은 코리네형 세균 유래의 퍼미아제를 발현하도록 변형되어 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 재조합 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다.

L-쓰레오닌은 주로 인공변이법 또는 유전자 재조합 방법에 의해 개발된 에스케리키아속, 세타티아속, 프로덴시아속 또는 코리네형 세균(Corynebacterium) 또는 이의 인공변이주를 이용한 발효법으로 생산된다. 쓰레오닌의 생합성에 관련된 유전자 및 이들의 발현을 증가시키는 방법이 다양하게 개발되었으나, 보다 경제적으로 높은 수율의 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 방법에 대한 요구가 여전히 존재한다.

대장균에서 galP 유전자에 의해 코딩되는 GalP 단백질은 갈락토스 및 포도당을 포함한 여러 종의 당을 세포 내부로 수송하는 갈락토스 퍼미아제(galactose permease)인 것으로 알려져 있으며(V. Hernandez-Montalvo F. Valle F. Bolivar G. Gosset, Appl Microbiol Biotechnol (2001) 57:186-191), 이것은 글루코스 퍼미아제(glucose permease)로도 작용한다는 것이 알려져 있다(Venter, Henrietta et al., Biochemical Journal (2002) 363:243-252). 대장균에서 카피 수 증가 등을 통해 galP 유전자의 발현을 증가시키면 쓰레오닌의 생산능이 증가된다는 보고가 있다(WO 2004/087937).

코리네박테리움 글루타미쿰에서는 iolT1 및 iolT2 유전자에 의해 암호화되는 이노시톨 퍼미아제가 글루코스 퍼미아제로도 작용할 수 있다는 것이 보고되어 있으며(Ikeda et al ., Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90:1443-1451), 상기 유전자들이 대장균의 galP 유전자와 상동성이 높다는 것 또한 보고되어 있으나, 상기 이노시톨 퍼미아제와 쓰레오닌 생산과의 관계를 나타낸 보고는 없었다.

본 발명자들은 코리네박테리움 속 미생물에서 이노시톨 퍼미아제를 코딩하는 iolT1 유전자 및/또는 iolT2 유전자를 대장균에 도입할 경우 에스케리키아 속 미생물이 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가짐을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 코리네형 세균 유래의 퍼미아제를 발현하도록 변형되어 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 재조합 에스케리키아 속 미생물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 퍼미아제가 발현되도록 형질전환된 재조합 에스케리키아 속 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 재조합 미생물을 이용하여 L-쓰레오닌을 고수율로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의하면 균주의 생장 속도가 기존의 균주 대비 큰 폭으로 향상되어 L-쓰레오닌을 높은 수율로 생산할 수 있다. 이에 따라 산업적으로 큰 의미가 있는 L-쓰레오닌 생산성이 크게 향상될 수 있다.

도 1은 대장균 유래의 galP와 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 및 iolT2의 아미노산 서열의 상동성 정렬을 나타낸 것이다.
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pCC1BAC-iolT1의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pCC1BAC-iolT2의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 4는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 및 iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pCC1BAC-iolT1-iolT2의 개열지도를 나타낸 것이다.

본 발명은 코리네형 세균 유래의 퍼미아제를 발현하도록 형질전환된, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 에스케리키아 속 미생물을 제공하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 코리네형 세균 유래의 퍼미아제는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032으로부터 유래될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

가장 바람직하게는, 상기 코리네형 세균 유래의 퍼미아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 코리네형 세균 유래의 퍼미아제는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지는 iolT1 유전자에 의해 암호화되며, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 코리네형 세균 유래의 퍼미아제는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지는 iolT2 유전자에 의해 암호화된다.

또한, 본 발명에서 제시한 퍼미아제의 활성을 가지는 단백질인 한, 상기 단백질의 아미노산 서열 상에 일부 변이가 있는 변이체 또는 상기 단백질의 아미노산 서열에 대해서 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 특히 바람직하게는 97％ 이상의 상동성을 가지는 퍼미아제 또한 본 발명에 포함된다.

본원에서, 상기 용어 "상동성"은 두 아미노산 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0을 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법 등으로 결정될 수 있다.

본 발명의 일 구현에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 대장균에서 글루코스 퍼미아제를 코딩하는 galP 유전자와 상동성을 가진 유전자를 탐색하였으며, 그 결과 대장균의 galP가 코딩하는 아미노산 서열과 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래의 iolT1(NCBI Reference Sequence: NC_006958.1, cg0223)이 코딩하는 아미노산 서열은 34％의 상동성을 나타내었으며, iolT2(NCBI Reference Sequence: NC_006958.1, cg3387)가 코딩하는 아미노산 서열은 31％의 상동성을 나타내었다(도 1을 참조).

상기 대장균의 galP 유전자는 공지되어 있으며, Blattner 등 (Science 277: 1453-1462 (1997))에 의하여 공개된 대장균의 게놈 서열로부터도 얻을 수 있으며(Accession no. AAC75876), 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터도 얻을 수 있다.

본 발명의 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물은 대장균 및 L-쓰레오닌 생산용 대장균 변이주일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물은 메티오닌 요구성, 쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 라이신 유사체에 대한 내성, 이소루이신 유사체에 대한 내성 및 메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 포스포에놀 피루베이트 카르복실레이즈 유전자(phosphoenol pyruvate carboxylase gene, ppc 유전자)와 쓰레오닌 오페론이 2-카피 이상 염색체 내로 도입된 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌 생산용 균주인 대장균 KFCC 10718 (대한민국특허 등록번호 제10-0058286호)로부터 유래된 대장균 KCCM 10541(대한민국특허 등록번호 제10-0576342호)이다.

본 발명의 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 에스케리키아 속 미생물에서 퍼미아제를 코딩하는 유전자를 발현하도록 하기 위한 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 퍼미아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 형질전환하거나, 퍼미아제를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키거나, 퍼미아제를 코딩하는 유전자의 발현조절서열을 조절할 수 있으며, 둘 이상의 방법을 함께 사용할 수도 있다. 일반적으로, 쓰레오닌 생합성 관련 유전자의 발현량을 높이기 위한 방법으로 1개의 미생물이 가지는 유전자의 수를 높여주는 방법이 있으며, 이를 위해 통상 카피 수가 높게 유지되는 플라스미드를 사용한다(Sambrook et al, Molecular cloning, 2판, 1989, 1.3~1.5). 즉 카피수가 높게 유지되는 플라스미드에 원하는 유전자를 삽입하고 이러한 재조합 플라스미드를 다시 미생물에 형질 전환시킴으로써 1개의 미생물당 그 플라스미드의 카피 수만큼 유전자의 카피수를 늘려주는 효과를 기대할 수 있다. 또한, 쓰레오닌 생합성 관련 유전자를 염색체 DNA 중에 삽입하는 방법이 이용되기도 한다.

본 발명의 일 구현에서, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 유전자 및/또는 iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 재조합 에스케리키아 속 미생물을 제공한다.

본원에서, 상기 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다.

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 pCC1BAC-iolT1인 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 도 2의 개열지도를 가진다.

본 발명은 또한 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 pCC1BAC-iolT2인 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 도 3의 개열지도를 가진다.

본 발명은 또한 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 및 iolT2 유전자를 동시에 발현시키기 위한 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 pCC1BAC-iolT1-iolT2인 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 도 4의 개열지도를 가진다.

본원에서, 상기 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

일 양상에서, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 유전자 또는 iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 재조합 에스케리키아 속 미생물을 제공한다.

다른 양상에서, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 iolT1 유전자 및 iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 재조합 에스케리키아 속 미생물을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 상기 형질전환된 재조합 에스케리키아 속 미생물은 대장균일 수 있고, 바람직하게는 상기 미생물은 대장균 CA03-0230(KCCM11370P), 대장균 CA03-0260(KCCM11369P) 또는 대장균 CA03-0231(KCCM11371P)일 수 있다.

상기와 같은 본 발명의 재조합 쓰레오닌 생산 균주들은 대장균 내에 코리네형 세균 유래의 iolT1 및/또는 iolT2 유전자를 도입하여 대장균 내 퍼미아제의 발현을 증가시켜 균주의 당소모 속도 및 생장속도가 크게 향상됨으로써 L-쓰레오닌을 고농도로 생산할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 재조합 에스케리키아 속 미생물을 배양하는 단계 및 상기 미생물의 배양액으로부터 L-쓰레오닌을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 에스케리키아 속 미생물의 배양은 통상적인 방법을 통해 수행될 수 있다. 구체적으로, 탄소원으로 원당 또는 포도당의 일부 혹은 전부가 포함된 배양 배지에 상기 미생물을 접종하여 배양할 수 있다. 상기 배양과정은 당 업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다.

구체적으로, 본 발명에서 사용되는 배지는 원당 혹은 포도당을 주 탄소원으로 사용하고, 원당을 다량으로 포함한 당밀 또한 탄소원으로 이용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있으며, 바람직하게는 정제 포도당을 사용한다. 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함되며, 바람직하게는 펩톤을 사용한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

구체적으로, 배양의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 37℃이다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 발현이 계속 할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[ 실시예 ]

비교예 : 대장균 유래 galP 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재 조합 균주의 제조 및 L-쓰레오닌 생산성 비교

대장균에서 갈락토즈 퍼미아제는 글루코즈 퍼미아제의 역할을 수행하며 카피수 증가 등을 통해 발현을 증가시키면 쓰레오닌 생산능이 증가된다는 보고(WO 2004/087937)의 확인을 위하여, L-쓰레오닌 생산균주인 대장균 KCCM 10541에 galP 유전자의 카피 수 증가를 통한 재조합 균주를 제작하여 L-쓰레오닌 생산성을 평가하였다.

(1) 대장균 유래 galP 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

대장균 유래 galP 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하는 1.4kb 단편을 얻기 위해, 퀴아젠사(Qiagen)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 대장균 야생형 균주 W3110의 genomic DNA를 추출하였다.

상기 gDNA를 주형으로 하여 연쇄종합반응 (polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 약칭함)을 실시하였다. 이때 사용한 프라이머는 서열번호 9와 10이며, PCR 반응 조건은 변성(denaturation) 94℃ 30초, 어닐링(annealing) 56℃ 30초, 신장(elongation) 72℃ 50초이며, 이를 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물 (이하, "galP 단편"이라 명명함)을 0.8％ 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.

상기 얻어진 galP 단편을 제한효소 HindIII로 처리한 후, 동일한 제한효소인 HindIII로 처리된 선형 pCC1BAC 벡터 (EPICENTRE사 제품, 이하 동일함)와 벡터 상의 lac 프로모터와 방향이 일치하도록 라이게이션하였다.

상기 제작된 벡터로 대장균 DH5a 세포를 형질전환시킨 후, 이를 클로람페니콜 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 클로람페니콜 함유 LB 액체 배지 3㎖에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트 (QIAGEN사 제품, 이하 동일함)를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 크기는 제한효소 HindIII로 처리하여 확인하였으며 (데이터는 나타내지 않음), 서열번호 11과 12의 프라이머로 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 60초의 반응 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합 벡터를 pCC1BAC-galP라 명명하였다 (데이터는 도시하지 않음).

또한, 상기 galP 단편을 동일한 제한효소인 HindIII로 처리된 선형 pCL1920 벡터와 벡터상의 lac 프로모터와 방향이 일치하도록 라이게이션하였다. 상기 제작된 벡터로 대장균 DH5a 세포를 형질전환시킨 후, 이를 스펙티노마이신 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 스펙티노마이신 함유 LB 액체 배지 3 ㎖에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 크기는 제한효소 HindIII로 처리하여 확인하였으며 (데이터는 나타내지 않음), 서열번호 13과 14의 프라이머로 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 60초의 반응 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합 벡터를 pCL1920-galP라 명명하였다 (데이터는 나타내지 않음).

(2) 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주의 제조

모균주로서 L-쓰레오닌 생산균주인 대장균 KCCM10541에 상기 재조합벡터 pCC1BAC-galP를 전기천공법으로 도입하여 클로람페니콜 15 ㎍/㎖이 포함된 고체배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다. 위와 동일한 방법으로 상기 재조합벡터 pCL1920-galP를 L-쓰레오닌 생산균주인 대장균 KCCM10541에 전기천공법으로 도입하여 스펙티노마이신 50 ㎍/㎖이 포함된 고체배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다.

선별된 균주를 각각 KCCM10541/pCC1BAC-galP 및 KCCM10541/pCL1920-galP로 명명하였다.

(3) 재조합 균주의 L- 쓰레오닌 생산성 비교

상기 (2)에서 제조된 재조합 균주들을 하기 표 1의 쓰레오닌 역가 배지를 이용하여 삼각플라스크에서 아래 기술한 방법과 같이 배양하여 L-쓰레오닌 생산성을 확인하였다.

모균주인 대장균 KCCM10541, KCCM10541/pCC1BAC-galP 및 KCCM10541/pCL1920-galP 균주를 사용하여 역가 평가를 진행하였다. 각 균주에 도입하였을 때, 상기 재조합벡터 pCC1BAC-galP는 1카피, pCL1920-galP는 5카피 발현되는 벡터로써, 카피 수 증가에 따른 효과를 확인하고자 하였다.

각기 다른 유전적 형질을 가진 상기 재조합 균주들을 33℃ 배양기에서 LB 고체 배지에서 밤새 배양한 후, 상기 표 1의 조성과 같이 포도당이 함유된 25 ㎖의 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 배양하였으며, 이의 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

그 결과, 상기 표 2에 기재된 바와 같이, 모균주인 대장균 KCCM10541 균주는 48시간 배양하였을 경우 32.0 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였으나, 본 비교예에서 수득한 재조합 균주인 대장균 KCCM10541/pCC1BAC-galP는 31.1 g/L, KCCM10541/pCL1920-galP는 30.8 g/L로 모균주보다 각각 0.9 g/L, 1.2 g/L으로 L-쓰레오닌 생산이 하락되었다. 표 2에서 보는 바와 같이, 모균주인 대장균 KCCM10541 균주는 0.753 g/L/hr의 당소모 속도를 나타내었으나, KCCM 10541/pCC1BAC-galP는 0.793 g/L/hr, KCCM 10541/pCL1920-galP는 0.816 g/L/hr를 나타내었고 이는 모균주 대비 각각 5.3％, 8.4％ 향상된 당소모 속도이다.

실시예 1: 코리네형 세균 유래의 iolT1 , iolT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

(1) 대장균 글루코스 퍼미아제 ( galP )와의 상동성 비교

코리네박테리움 글루타미쿰에서 이노시톨 퍼미아제를 코딩하는 iolT1, iolT2 유전자가 대장균의 글루코스 퍼미아제를 코딩하는 galP 유전자와 상동성이 유사하다고 보고되어 있다. 대장균 유래 galP 유전자와 상동성을 지닌 유전자를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)의 게놈으로부터 찾아내어 비교하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

대장균 유래 galP가 코딩하는 아미노산 서열과 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 iolT1이 코딩하는 아미노산 서열은 34％, iolT2가 코딩하는 아미노산 서열은 31％의 상동성을 나타내었다.

(2) iolT1 유전자 단편의 준비

서열번호 3의 iolT1 유전자의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 1.5kb 단편을 얻기 위해, 퀴아젠사(Qiagen)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)의 genomic DNA를 추출하였다.

상기 gDNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. 이 때 사용한 프라이머는 서열번호 5와 6이며, PCR 반응 조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 60초이며, 이를 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물 (이하, "iolT1 단편"이라 명명함)은 0.8％ 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.

(3) 재조합 벡터 pCC1BAC - iolT1 제작

상기 (2)에서 준비한 iolT1 단편을 제한효소 HindIII로 처리한 후, 동일한 제한효소인 HindIII로 처리된 선형 pCC1BAC 벡터와 벡터상의 lac 프로모터와 방향이 일치하도록 라이게이션하였다.

상기 제작된 재조합 벡터로 대장균 DH5a 세포를 형질전환시켰고, 이를 클로람페니콜 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 클로람페니콜 함유 LB 액체 배지 3㎖에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 크기는 제한효소 HindIII로 처리하여 확인하였으며 (데이터는 나타내지 않음), 서열번호 11과 12의 프라이머로 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 90초의 반응 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합 벡터를 pCC1BAC-iolT1이라 명명하였다.

(4) iolT2 유전자 단편의 준비

서열번호 4의 iolT2 유전자의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 1.6kb 단편을 얻기 위해, 퀴아젠(Qiagen)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)의 genomic DNA를 추출하였다.

상기 gDNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. 이 때 사용한 프라이머는 서열번호 7과 8이며, PCR 반응 조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 60초이며, 이를 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물 (이하, "iolT2 단편"이라 명명함)은 0.8％ 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.

(5) 재조합 벡터 pCC1BAC - iolT2 제작

상기 (4)에서 준비한 iolT2 단편을 제한효소 EcoRI으로 처리한 후, 동일한 제한효소인 EcoRI으로 처리된 선형 pCC1BAC 벡터와 벡터상의 lac 프로모터와 방향이 일치하도록 라이게이션하였다.

상기 제작된 재조합 벡터로 대장균 DH5a 세포를 형질 전환시켰고 이를 클로람페니콜 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 클로람페니콜 함유 LB 액체 배지 3㎖에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 크기는 제한효소 EcoRI으로 처리하여 확인하였으며 (데이터는 나타내지 않음), 서열번호 11과 12의 프라이머로 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 90초의 반응 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합 벡터를 pCC1BAC-iolT2라 명명하였다.

(6) 재조합 벡터 pCC1BAC - iolT1-iolT2 제작

상기 (5)에서 제작된 pCC1BAC-iolT2 벡터를 제한효소 HindIII로 처리한 후, 상기 (2)에서 준비한 iolT1 단편과 벡터상의 lac 프로모터와 방향이 일치하도록 라이게이션하였다.

상기 제작된 벡터로 대장균 DH5a 세포를 형질 전환시켰고, 이를 클로람페니콜 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 클로람페니콜 함유 LB 액체 배지 3㎖에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 크기는 제한효소 HindIII로 처리하여 확인하였으며 (데이터는 나타내지 않음), 서열번호 11과 12의 프라이머로 변성 94℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 120초의 반응 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합 벡터를 pCC1BAC-iolT1-iolT2라 명명하였다.

실시예 2: 형질전환된 재조합 균주의 제조 및 L- 쓰레오닌 생산성 비교

(1) 야생형 대장균을 이용한 재조합 균주의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 재조합벡터 pCC1BAC-iolT1, pCC1BAC-iolT2 및 pCC1BAC-iolT1-iolT2를 각각 쓰레오닌 오페론 과발현 벡터 pBRThrABCR3 (Lee KH et al., Molecular Systems Biology (2007) 3:149)를 포함한 야생형 대장균 MG1655에 전기천공법으로 도입하여 암피실린 100 ㎍/㎖와 클로람페니콜 15 ㎍/㎖이 포함된 고체배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다.

선별된 균주를 각각 MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT1, MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT2 및 MG1655/pBRThrABCR3/pCC1BAC-iolT1-iolT2으로 명명하였다.

이들 균주들을 상기 표 1의 조성으로 만들어진 쓰레오닌 역가배지를 사용하여 비교예 1의 (3)과 동일한 방법으로 L-쓰레오닌 생산성을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 기재하였다.

그 결과, 상기 표 3에 기재된 바와 같이, 모균주인 대장균 MG1655 균주는 48시간 배양하였을 경우 3.86 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였고, 본 실시예에서 수득한 재조합 균주 MG1655/pCC1BAC-iolT1은 3.88 g/L, MG1655/pCC1BAC-iolT2와 MG1655/pCC1BAC-iolT1-iolT2는 각각 3.92 g/L, 3.85 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다. 즉, 모균주와 유사한 수준의 L-쓰레오닌을 생산하였다.

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 야생형 모균주인 대장균 MG1655 균주는 0.877 g/L/hr의 당소모 속도를 나타내었으나, MG1655/pCC1BAC-iolT2는 1.035 g/L/hr, MG1655/pCC1BAC-iolT1은 1.109 g/L/hr, MG1655/pCC1BAC-iolT1-iolT2는 1.123 g/L/hr를 나타내었다. 이는 모균주 대비 각각 18.0％, 26.5％, 그리고 28.1％ 향상된 당소모 속도이다.

(2) 대장균 KCCM 10541을 이용한 재조합 균주의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 재조합벡터 pCC1BAC-iolT1, pCC1BAC-iolT2 및 pCC1BAC-iolT1-iolT2를 각각 모균주로서 L-쓰레오닌 생산균주인 대장균 KCCM10541에 전기천공법으로 도입하여 클로람페니콜 15 ㎍/㎖이 포함된 고체배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다.

상기 선별된 균주를 각각 KCCM10541/pCC1BAC-iolT1, KCCM10541/pCC1BAC-iolT2 및 KCCM10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2로 명명하였다.

이들 균주들을 상기 비교예 1의 (2)에서 수득한 재조합 미생물과 함께, 상기 표 1의 조성으로 만들어진 쓰레오닌 역가배지를 사용하여 비교예 1의 (3)과 동일한 방법으로 L-쓰레오닌 생산성을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 기재하였다.

그 결과, 상기 표 4에 기재된 바와 같이, 모균주인 대장균 KCCM 10541 균주는 48시간 배양하였을 경우 30.3 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였고, 본 발명의 상기 실시예 2-(2)에서 수득한 재조합 균주 KCCM 10541/pCC1BAC-iolT2는 모균주보다 2.2 g/L 향상된 L-쓰레오닌 생산성을 나타내었고, KCCM10541/pCC1BAC-iolT1과 KCCM10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2는 각각 29.5 g/L, 29.9 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다. 즉, 모균주와 유사한 수준의 L-쓰레오닌을 생산하였다.

대장균 유래 galP 유전자의 발현이 강화된 균주 KCCM 10541/pCC1BAC-galP와 KCCM 10541/pCL1920-galP는 각각 29.8 g/L와 29.3 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였다.

표 4에서 보는 바와 같이, 모균주인 대장균 KCCM 10541 균주는 0.823 g/L/hr의 당소모 속도를 나타내었으나, KCCM 10541/pCC1BAC-iolT2는 1.093 g/L/hr, KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2는 1.200 g/L/hr, KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1은 1.213 g/L/hr를 나타내었고, 이는 모균주 대비 각각 32.8％, 45.8％, 그리고 47.4％ 향상된 당소모 속도이다. 또한 이는 KCCM 10541/pCC1BAC-galP와 KCCM 10541/pCL1920-galP의 당소모 속도가 모균주 대비 각각 4.7％, 7.4％ 증가한 것과 비교했을 때, 코리네박테리움 iolT1, iolT2 유전자 도입 균주의 당소모 속도가 월등히 큰 폭으로 향상된 것임을 확인할 수 있다.

상기 형질전환된 대장균 KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1을 CA03-0230, KCCM 10541/pCC1BAC-iolT2를 CA03-0260, KCCM 10541/pCC1BAC-iolT1-iolT2를 CA03-0231로 명명하고 2013년 02월 05일에 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 이하 'KCCM' 이라 약칭함)에 각각 수탁번호 KCCM11370P, KCCM11369P 및 KCCM11371P로 기탁하였다.

상기의 결과들은 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 대장균에 대장균 유래 글루코스 퍼미아제의 발현을 강화한 경우보다, 코리네형 미생물 유래의 퍼미아제의 발현을 강화, 즉 iolT1, iolT2 유전자를 하나이상 도입한 경우에 당소모 속도가 증가하고, 동일 농도의 쓰레오닌을 생산하는 데 소요되는 시간이 단축되어, 즉 쓰레오닌 생산성이 증가하는 것을 뒷받침한다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11370P

20130205

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11369P

20130205

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11371P

20130205

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> Recombinant microorganisms of Escherichia with L-threonine poductivity and method of producing L-threonine using the same <130> PP14-0115 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 491 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Met Ala Ser Thr Phe Ile Gln Ala Asp Ser Pro Glu Lys Ser Lys Lys 1 5 10 15 Leu Pro Pro Leu Thr Glu Gly Pro Tyr Arg Lys Arg Leu Phe Tyr Val 20 25 30 Ala Leu Val Ala Thr Phe Gly Gly Leu Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Gly 35 40 45 Val Ile Asn Gly Ala Leu Asn Pro Met Thr Arg Glu Leu Gly Leu Thr 50 55 60 Ala Phe Thr Glu Gly Val Val Thr Ser Ser Leu Leu Phe Gly Ala Ala 65 70 75 80 Ala Gly Ala Met Phe Phe Gly Arg Ile Ser Asp Asn Trp Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Thr Ile Ile Ser Leu Ala Val Ala Phe Phe Val Gly Thr Met Ile 100 105 110 Cys Val Phe Ala Pro Ser Phe Ala Val Met Val Val Gly Arg Val Leu 115 120 125 Leu Gly Leu Ala Val Gly Gly Ala Ser Thr Val Val Pro Val Tyr Leu 130 135 140 Ala Glu Leu Ala Pro Phe Glu Ile Arg Gly Ser Leu Ala Gly Arg Asn 145 150 155 160 Glu Leu Met Ile Val Val Gly Gln Leu Ala Ala Phe Val Ile Asn Ala 165 170 175 Ile Ile Gly Asn Val Phe Gly His His Asp Gly Val Trp Arg Tyr Met 180 185 190 Leu Ala Ile Ala Ala Ile Pro Ala Ile Ala Leu Phe Phe Gly Met Leu 195 200 205 Arg Val Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val Glu Arg Gly Arg Ile Asp 210 215 220 Glu Ala Arg Ala Val Leu Glu Thr Ile Arg Pro Leu Glu Arg Ala His 225 230 235 240 Ala Glu Val Ala Asp Val Glu His Leu Ala Arg Glu Glu His Ala Val 245 250 255 Ser Glu Lys Ser Met Gly Leu Arg Glu Ile Leu Ser Ser Lys Trp Leu 260 265 270 Val Arg Ile Leu Leu Val Gly Ile Gly Leu Gly Val Ala Gln Gln Leu 275 280 285 Thr Gly Ile Asn Ser Ile Met Tyr Tyr Gly Gln Val Val Leu Ile Glu 290 295 300 Ala Gly Phe Ser Glu Asn Ala Ala Leu Ile Ala Asn Val Ala Pro Gly 305 310 315 320 Val Ile Ala Val Val Gly Ala Phe Ile Ala Leu Trp Met Met Asp Arg 325 330 335 Ile Asn Arg Arg Thr Thr Leu Ile Thr Gly Tyr Ser Leu Thr Thr Ile 340 345 350 Ser His Val Leu Ile Gly Ile Ala Ser Val Ala Phe Pro Val Gly Asp 355 360 365 Pro Leu Arg Pro Tyr Val Ile Leu Thr Leu Val Val Val Phe Val Gly 370 375 380 Ser Met Gln Thr Phe Leu Asn Val Ala Thr Trp Val Met Leu Ser Glu 385 390 395 400 Leu Phe Pro Leu Ala Met Arg Gly Phe Ala Ile Gly Ile Ser Val Phe 405 410 415 Phe Leu Trp Ile Ala Asn Ala Phe Leu Gly Leu Phe Phe Pro Thr Ile 420 425 430 Met Glu Ala Val Gly Leu Thr Gly Thr Phe Phe Met Phe Ala Gly Ile 435 440 445 Gly Val Val Ala Leu Ile Phe Ile Tyr Thr Gln Val Pro Glu Thr Arg 450 455 460 Gly Arg Thr Leu Glu Glu Ile Asp Glu Asp Val Thr Ser Gly Val Ile 465 470 475 480 Phe Asn Lys Asp Ile Arg Lys Gly Lys Val His 485 490 <210> 2 <211> 508 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Thr Asp Ile Lys Ala Thr Ser Ser Thr Ser Ala Thr Thr Ala Pro 1 5 10 15 Thr Ala Gly Arg Pro Ala Arg Arg Leu Gly Gln Ile Ser Leu Val Ala 20 25 30 Cys Leu Gly Gly Leu Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Gly Val Ala Asn Gly 35 40 45 Ala Glu Gly His Met Ala Gln Glu Leu Gly Leu Asn Val Leu Gln Leu 50 55 60 Gly Val Val Ile Ser Ser Leu Val Phe Ala Ala Ala Phe Gly Ala Leu 65 70 75 80 Phe Ala Gly Arg Ile Ser Asp Glu Ile Gly Arg Arg Lys Ala Ile Ile 85 90 95 Thr Leu Ser Val Leu Phe Phe Leu Gly Ser Ile Leu Val Val Phe Ser 100 105 110 Pro Ala Gly Glu Leu Gly Gln Phe Tyr Gly Pro Gly Phe Ala Thr Leu 115 120 125 Val Thr Gly Arg Ile Met Leu Gly Leu Ala Val Gly Gly Ala Ser Thr 130 135 140 Val Val Pro Val Tyr Leu Ala Glu Leu Ala Pro Leu Glu Ile Arg Gly 145 150 155 160 Ser Leu Thr Gly Arg Asn Glu Leu Ala Ile Val Thr Gly Gln Leu Leu 165 170 175 Ala Phe Val Ile Asn Ala Leu Ile Ala Val Thr Leu His Gly Val Ile 180 185 190 Asp Gly Ile Trp Arg Ile Met Phe Ala Val Cys Ala Leu Pro Ala Val 195 200 205 Ala Leu Phe Leu Gly Met Leu Arg Met Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu 210 215 220 Val Asn Gln Gly Arg Tyr Asp Asp Ala Arg Arg Val Met Glu Thr Val 225 230 235 240 Arg Thr Pro Glu Arg Ala Lys Ala Glu Met Asp Glu Ile Ile Ala Val 245 250 255 His Ser Glu Asn Asn Ala Ala Leu Pro Gly Val Lys Gln Ser Ser Gly 260 265 270 Gln Ala Ser Gly Gln Val Ser Ser Lys His Thr His Met Ser Ile Gly 275 280 285 Glu Val Leu Ser Asn Lys Trp Leu Val Arg Leu Leu Ile Ala Gly Ile 290 295 300 Gly Val Ala Val Ala Gln Gln Leu Thr Gly Ile Asn Ala Ile Met Tyr 305 310 315 320 Tyr Gly Thr Arg Val Leu Glu Glu Ser Gly Met Ser Ala Glu Met Ala 325 330 335 Val Val Ala Asn Ile Ala Phe Gly Ala Val Ala Val Ile Gly Gly Leu 340 345 350 Ile Ala Leu Arg Asn Met Asp Arg Leu Asp Arg Arg Thr Thr Phe Ile 355 360 365 Ile Gly Leu Ser Leu Thr Thr Thr Phe His Leu Leu Ile Ala Ala Ala 370 375 380 Gly Thr Leu Leu Pro Glu Gly Asn Ser Ile Arg Pro Phe Ala Ile Met 385 390 395 400 Ile Leu Val Val Gly Phe Val Leu Ser Met Gln Thr Phe Leu Asn Val 405 410 415 Ala Val Trp Val Trp Leu Ala Glu Ile Phe Pro Val Arg Met Lys Gly 420 425 430 Ile Gly Thr Gly Ile Ser Val Phe Cys Gly Trp Gly Ile Asn Gly Val 435 440 445 Leu Ala Leu Phe Phe Pro Ala Leu Val Ser Gly Val Gly Ile Thr Phe 450 455 460 Ser Phe Leu Ile Phe Ala Val Val Gly Val Ile Ala Leu Ala Phe Val 465 470 475 480 Thr Lys Phe Val Pro Glu Thr Arg Gly Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asp 485 490 495 His Ala Ala Phe Thr Gly Gln Ile Phe Lys Lys Ala 500 505 <210> 3 <211> 1476 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 atggctagta ccttcattca ggccgacagc cctgaaaaaa gtaagaagct gcccccactc 60 acagaaggtc cgtatagaaa gcggctattc tacgttgcac tagttgcgac gtttggtggg 120 ctgctcttcg gatatgacac cggagtaatc aacggtgcac tcaacccaat gacacgtgag 180 ctcggactaa ccgcgttcac cgagggtgtt gtaacttctt ccctgctgtt tggtgcagca 240 gctggtgcga tgtttttcgg tcgcatttcc gacaactggg gtcgccggaa aacaatcatc 300 tcacttgcag tagctttctt tgtcggcacc atgatctgcg tgtttgctcc atcttttgca 360 gtaatggttg tcggacgtgt gcttcttgga ctcgcagttg gtggcgcttc cactgttgtc 420 cctgtctacc tggctgaact tgctcctttt gaaatccgtg gctcactggc tggccgtaat 480 gagttgatga ttgttgttgg tcagctcgca gcttttgtca tcaatgcgat tattggaaat 540 gtttttggac accacgatgg tgtgtggcgc tacatgctgg caattgccgc aatcccagca 600 attgccctct tctttggaat gctccgagtt ccagaatccc cacgctggct tgttgagcga 660 ggacgcattg atgaggctcg cgcagttctt gaaaccattc gccctctaga acgtgcccat 720 gcagaagttg ctgatgttga acacctagca agagaagagc acgccgtttc cgagaagtcc 780 atgggcttaa gggaaatttt gtccagcaag tggcttgtgc gcatcctcct ggtaggtatc 840 ggattgggtg tcgcacagca gctgaccggc atcaactcca tcatgtacta cggccaggtt 900 gttctcattg aggctggttt ctccgagaat gcagctctga tcgccaacgt ggcgccagga 960 gtgatcgcag ttgtcggtgc attcatcgca ctgtggatga tggatcgtat caaccgccgt 1020 accaccctca ttaccggtta ttctctcacc accattagcc acgtattgat cggtatcgca 1080 tccgtagcat tcccagtcgg cgatcctctt cgcccctacg ttatcttgac tctggttgtg 1140 gtcttcgtgg gatccatgca gaccttcctc aacgtagcta cctgggttat gctctctgag 1200 ctcttcccgc tggcaatgcg cggtttcgca atcggtatct cagtgttctt cctctggatc 1260 gcaaacgcgt tcctcggatt gttcttccca accatcatgg aagcagtagg actaaccgga 1320 accttcttca tgttcgccgg aatcggtgtg gttgccttga tcttcatcta cacccaggtt 1380 cctgaaactc gtggacgtac cttggaggag attgatgagg atgttacttc cggtgtcatt 1440 ttcaacaagg acatccgaaa aggaaaggtg cactaa 1476 <210> 4 <211> 1527 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 atgacggaca tcaaggccac atcaagtaca tcggccacta cagcaccaac agcaggccga 60 ccagcgcgtc gacttggaca aatttccctc gtcgcctgtc tcggcggact tctcttcggc 120 tatgacaccg gtgtcgccaa cggcgccgaa ggccacatgg cacaagaact cggactcaac 180 gtgctgcagc tcggcgttgt catcagttca ctggttttcg ctgcagcctt tggcgcgctg 240 ttcgctgggc gtatctcgga cgaaatcggg cgtcgaaaag caattatcac tttgtccgtg 300 ctgttcttcc tcggatcaat cctcgtcgta ttctcccccg ccggtgagct ggggcagttc 360 tacggaccag gatttgccac cttggtcacc gggcgcatca tgttgggtct cgcggttggc 420 ggcgcctcca cagtagttcc ggtgtacctc gctgaactcg caccactaga aatccgcggc 480 tccctgaccg gccgaaacga gcttgctatc gtcaccggcc agctgcttgc cttcgtgatc 540 aacgcgctta tcgccgtcac cctacacgga gttattgatg gaatctggcg catcatgttc 600 gccgtctgtg ccctccctgc cgtcgccctc ttcctcggca tgctgcggat gccggaatca 660 ccacgctggc tggtcaacca ggggcgttac gacgacgccc gccgcgtcat ggagaccgtc 720 cgtacccctg agcgtgcgaa agccgaaatg gatgaaatca tcgcggtgca ctctgaaaac 780 aatgcggcac ttcctggtgt taagcagtct tcgggccagg cttcaggcca ggtttctagc 840 aagcacaccc acatgtccat cggcgaagtc ctcagcaaca aatggctggt tcgtctgctc 900 atcgccggca tcggtgttgc agttgcccag cagctcaccg gcatcaacgc catcatgtac 960 tacggaaccc gcgtcctcga ggaatccggc atgagcgcag aaatggctgt ggttgccaac 1020 attgctttcg gtgccgttgc cgtcatcggt ggactgatcg cactgcgcaa catggaccgc 1080 ctggatcgcc gcaccacctt catcatcggc ctgtcactga ccaccacctt ccaccttttg 1140 atcgcagctg ccggcactct ccttccagaa ggtaactcca ttcgaccatt cgccatcatg 1200 atccttgttg ttgggttcgt gctctccatg cagactttcc tcaacgttgc agtgtgggtg 1260 tggctggcgg aaatcttccc agtccgaatg aagggtatcg gcaccggtat ttcggtattc 1320 tgcggttggg gcatcaatgg cgtcctagcg ttgttcttcc cagcactggt ctccggcgtg 1380 ggtatcacct tctccttcct tatcttcgca gtcgtcggag tcattgccct ggcgttcgtc 1440 accaagtttg ttcctgaaac ccgtggccgc tcacttgaag aactcgatca cgcagcattc 1500 accggccaga tcttcaagaa ggcttaa 1527 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer iolT1-5-HindIII <400> 5 tagcaagctt actgaccccg accgctgta 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer iolT1-3-HindIII <400> 6 tagcaagctt ggtgatttgg aatccaaac 29 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer iolT2-5-EcoRI <400> 7 gatcgaattc tggtttgcat atttgatc 28 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer iolT2-5-EcoRI <400> 8 gatcgaattc tgtgggaggg tgtcg 25 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer galP-5-HindIII <400> 9 taactaagct tataaatgtt agtgtaagc 29 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer galP-3 <400> 10 aagaggtggc ttcctccgcg 20 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pIB-FP <400> 11 ggatgtgctg caaggcgatt aagttgg 27 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pIB-RP <400> 12 ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagc 26 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer FTR135 <400> 13 cgggcctctt cgctattacg c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer FTR136 <400> 14 aggcttaccc gtcttactgt c 21

Claims

코리네형 세균 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 퍼미아제(permease)를 포함하도록 형질전환된, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 재조합 에스케리키아 속 미생물.
제1항에 있어서,
상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 재조합 에스케리키아 속 미생물.
제1항에 있어서,
서열번호 1 및 서열번호 2의 코리네형 유래의 퍼미아제가 모두 포함되도록 형질전환된, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 재조합 에스케리키아 속 미생물.
제1항에 있어서,
미생물이 대장균인 재조합 에스케리키아 속 미생물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 미생물을 접종하여 배양하는 단계; 및
상기 배양물로부터 L-아미노산을 분리하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법.