KR101634582B1 - 니코틴산 또는 ｎａｄ에 대한 피드백 조절이 해제된 ｌ-아스파르테이트 옥시다제 변이체 및 이를 이용한 퀴놀리네이트 또는 니코틴산 생산 방법 - Google Patents

니코틴산 또는 ｎａｄ에 대한 피드백 조절이 해제된 ｌ-아스파르테이트 옥시다제 변이체 및 이를 이용한 퀴놀리네이트 또는 니코틴산 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미생물을 이용하여 퀴놀리네이트를 효과적으로 생산하기 위해 니코틴산 또는 NAD의 피드백 조절을 받지 않는 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체 및 당해 변이체를 포함하는 미생물에 대한 것이다. 이러한 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체를 포함한 미생물을 배양할 경우 효과적으로 퀴놀리네이트를 생산할 수 있다.

Description

니코틴산 또는 ＮＡＤ에 대한 피드백 조절이 해제된 Ｌ-아스파르테이트 옥시다제 변이체 및 이를 이용한 퀴놀리네이트 또는 니코틴산 생산 방법{L-aspartate oxidase variant resistant to nicotinic acid or NAD and a method for producing quinolinate or nicotinic acid}
본 발명은 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체, 그를 코딩하는 유전자를 포함한 퀴놀리네이트 생산능을 갖는 미생물 및 이를 배양하여 퀴놀리네이트 또는 니코틴산을 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
니코틴산은 니코틴의 산화물이며, 비타민 B 복합체이다. 니아신(niacin) 또는 비타민 B3로도 불리는 수용성 비타민으로 동·식물체에 널리 존재한다. 니코틴산이 결핍되면 펠라그라병에 걸리거나 신경 장애를 일으킬 수 있다. 니코틴산은 생체내에서 주로 니코틴산아미드 보조효소(NAD, NADP)의 형태로 존재하며 산화환원반응에 관여한다.
또한, 퀴놀리네이트(quinolinate)는 퀴놀린 산(quinolinic acid)이라고도 불리우며, 퀴놀린의 산화에 의해 생성된다. 퀴놀린 산은 신경 독성이 있는 것으로 알려져 있으며, 다양한 신경 질환을 야기하는 것으로 알려져 있다. 또한, 퀴놀리네이트는 니코틴산의 전구물질로 알려져 있다.
한편, 식품 및 의약품에서 유용하게 이용되는 니코틴산은 화학적 합성 방법 및 생물학적 생산 방법을 통하여 생산될 수 있다. 니코틴산의 화학적 합성은 촉매를 포함한 다량의 유독한 폐기물이 발생하기 때문에 이에 대한 철저한 관리가 필요하며, 폐기물 처리에 많은 비용이 소요된다. 또한 전구물질로 사용되는 피리미딘은 다양한 유도체를 가지고 있어, 공급량 및 가격의 변동이 크기 때문에 니코틴산 가격의 불안정을 초래한다.
이와 같은 화학적 합성 방법의 문제를 해소하기 위해, 재생가능한 탄수화물 유래의 재료를 이용하여 생물학적으로 니코틴산을 생산하는 방법이 연구되었다. 니코틴산의 생물학적 생산은 크게 두가지 경로를 통하여 이루어진다. 일반적으로 진핵생물의 경우 트립토판을 출발물질로 하여 니코틴산을 합성하는 경로를 통해 니코틴산을 생합성하며, 원핵생물의 경우 아스파르트산을 출발물질로 하여 니코틴산을 합성하는 경로가 주경로로 사용된다. 두 경로 모두 퀴놀리네이트를 중간체로 포함하며, 퀴놀리네이트으로부터 퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라아제 (quinolinate phosphoribosyltransferase - nadC), 니코틴산-모노뉴클레오티드 아데닐트랜스퍼라아제 (nicotinate-mononucleotide adenyl transferase - nadD), NAD 신타제 (NAD synthetase - nadE), NMN 아데닐트랜스퍼라아제 (NMN adenyl transferase nadR), 및 니코틴 아미다아제 (nicotinamidase - pncA)의 작용에 의하여 니코틴산을 합성한다.
니코틴산의 생물학적 생산방법 중 아스파르트산 경로를 통하여 니코틴산을 생산하는 재조합 대장균이나 코리네박테리아 글루타미쿰을 이용한 방법이 보고된 바 있다(대한민국 등록특허 10-1223904). 본 발명자들은 니코틴산의 생물학적 생산 방법이 갖는 문제점을 해소하고 퀴놀리네이트 또는 니코틴산의 생산 수율을 향상시키기 위한 연구를 수행하는 과정에서 높은 수율로 퀴놀리네이트를 생산하는데 관여하는 효소 변이체를 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 니코틴산 또는 NAD의 피드백 조절을 받지 않는 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체를 포함한 퀴놀리네이트 생산능이 향상된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 퀴놀리네이트를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물의 배양과 퀴놀리네이트의 탈탄산 반응을 통해 니코틴산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 제302번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체를 제공한다.
L-아스파르테이트 옥시다제는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 L-아스파르테이트를 이미노숙시네이트로 산화시키는 반응을 촉매하는 활성을 갖는다.
<반응식 1>
L-아스파르테이트 + 푸마레이트 <=> α-이미노숙시네이트 + 숙시네이트 + H +
L-아스파르테이트 + 산소 <=> 과산화수소 + α-이미노숙시네이트 + H +
상기 다른 아미노산은 아르기닌, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 루이신, 이소루신, 메치오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산을 가질 수 있다. 바람직하게는 아르기닌, 발린, 루이신, 이소루신, 메치오닌, 트립토판 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 상기 다른 아미노산은 아르기닌 일 수 있다.
일반적으로 L-아스파르트 옥시다제는 미생물내에 축적된 니코틴산 또는 NAD에 의해 활성이 조절, 즉 피드백 조절이 된다. 그러나, 상기 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체는 니코틴산 또는 NAD에 의한 피드백 조절이 해제된 것이다.
또 다른 양상은 상기 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대한 것이다.
일 구체예는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열에서 제302번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 제302번 아미노산은 아르기닌, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 루이신, 이소루신, 메치오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산을 가질 수 있으며, 이에 따라 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 적절히 치환될 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열이 치환됨에 따라서 적절히 바뀔 수 있다. 일 구체예로는 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열중 제904번 내지 제906번의 핵산이 적절히 치환될 수 있다.
또 다른 양상은 조절 서열과 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터에 대한 것이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24의 제904번 내지 제906번의 핵산이 적절히 치환된 것일 수 있다. 일 구체예는 서열번호 24의 폴리뉴클레오티드 서열 중 제904번 내지 제906번의 핵산이 AAG, AAA, TAA, TAG 또는 TGA를 제외한 핵산의 조합을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 서열은 L-아스파르테이트를 옥시다제의 발현을 조절하는 서열로 프로모터, 터미네이터 또는 인핸서 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으나, 당업계에서 알려진 임의의 벡터가 될 수 있다. 사용될 수 있는 벡터는 예를 들어, pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen사, 미국) 및 pECCG117(KFCC-10673)가 될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 프로모터는 람다 PL 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, pPro 프로모터, pCJ1 또는 pCJ7 프로모터 일 수 있다(대한민국 등록특허 10-0620092). 일 구체예에서, 상기 프로모터는 pCJ1 일 수 있다.
또한, 상기 프로모터는 유전자를 코딩하는 서열과 작동적으로 결합되어 있다. 본 명세서에서 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 전사조절인자 결합 위치의 어레이, 터미네이터 또는 인핸서)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
또 다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 제302번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 제공한다.
일 구체예로 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열의 제302번 아미노산의 치환에 따라서, 서열번호 24의 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열 중 일부가 치환될 수 있다. 일 구체예로는 서열번호 24의 제904번 내지 제906번 핵산이 다른 핵산으로 치환된 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 무작위적인 돌연변이를 통해 수득할 수도 있으나, 유전공학적인 조작을 통해 수득할 수 있다. 또한, 이렇게 수득한 폴리뉴클레오티드를 미생물에 형질전환시켜 서열번호 1의 아미노산 서열의 일부가 치환된 미생물을 제작할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, '형질전환'이란 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 것이든 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 어느 것이든지 포함된다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette) 의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주 세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "퀴놀리네이트 생산능을 갖는 미생물"은 배지 중의 탄소원으로부터 퀴놀리네이트를 생산하여 축적시킬 수 있는 미생물을 의미한다.
퀴놀리네이트의 생산능을 향상시키기 위해서 미생물이 다량의 퀴놀리네이트를 생성하게 하고, 생성한 퀴놀리네이트가 다른 경로에서 이용되지 않고 축적될 수 있도록 해야 한다. 따라서, 퀴놀리네이트의 생산능이 향상된 미생물은 퀴놀리네이트의 분해 경로에서 작용하는 퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성을 제거 또는 약화시키는 방법, 퀴놀리산의 합성 경로에 작용하는 퀴놀리네이트 신타제의 발현을 강화 또는 활성을 증가시키는 방법 또는 이들의 조합에 의해 생산될 수 있다.
일 구체예서는 퀴놀리네이트 생산능이 향상된 미생물은 퀴놀리네이트 신타제의 활성이 강화되어 있는 미생물일 수 있다. 상기 퀴놀리네이트 신타제의 활성의 강화는 퀴놀리네이트 신타제를 추가적으로 도입하여 미생물내에 퀴놀리네이트 신타제의 발현량이 증가한 것일 수 있다. 또한, 미생물내의 퀴놀리네이트 신타제와 연결된 프로모터를 보다 강하게 발현하는 프로모터로 치환하여 퀴놀리네이트 신타제의 발현량이 증가한 것일 수 있다. 또한, 퀴놀리네이트 신타제 자체의 활성이 증가된 것일 수 있다.
또한, 외부에서 퀴놀리네이트 신타제를 도입하는 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 미생물에 도입하여 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 퀴놀리네이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티디는 미생물내에서 플라스미드 상에서 발현이 될 수 있으며, 미생물의 크로모좀에 삽입되어 발현될 수도 있다.
상기 퀴놀리네이트 신타제는 서열번호 29 또는 그와 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 효소를 코딩하는 유전자 nadA의 서열은 문헌(Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.)에 공개된 대장균의 게놈 서열(gi: GI:89109380)이나 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.
퀴놀리네이트 신타제는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 이미노숙신산으로부터 퀴놀리네이트를 합성하는 활성을 갖는다.
<반응식 2>
α-이미노숙시네이트 + 디히드록시아세톤 포스페이트 <=> 퀴놀리네이트 + 포스페이트 + 2H 2 O
따라서, 퀴놀리네이트 신타제를 코딩하는 유전자의 발현이나 이 효소의 활성을 강화할 경우, 세포 내에 퀴놀리네이트의 생산을 증가시킬 수 있다.
퀴놀리네이트 생산능을 갖는 미생물에서 아스파르트산 옥시다제 및 퀴놀리네이트 신타제 활성을 강화하기 위하여, 아스파르트산 옥시다제 및 퀴놀리네이트 신타제를 코딩하는 유전자의 내재적 프로모터의 강력한 프로모터로의 치환, 프로모터의 변이 유발 또는 유전자 카피수 증가를 수행할 수 있다. 상기 강력한 프로모터로 치환하기 위하여, 일반적으로 강력한 프로모터로 알려진 pTac, pTrc, pPro, pR, pL, pCJ1, pCysK 등의 프로모터가 사용될 수 있다.
또한 일 구체예서는 퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라제의 활성이 감쇄되거나 제거된 것인 미생물을 제공한다.
퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라제의 활성이 감쇄 또는 제거는 퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 변형이나, 전사를 억제하는 마이크로 RNA에 의한 것일 수 있다.
상기 퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라아제는 서열번호 30 또는 그와 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라아제는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 퀴놀리네이트를 니코틴산 모노뉴클레오티드로 합성하는 활성을 갖는다. 따라서 이 활성을 갖는 유전자를 제거하거나 또는 그의 발현을 약화시킬 경우 세포 내에 퀴놀리네이트의 생산을 증가시킬 수 있다.
<반응식 3>
5-포스포-α-D-리보오스 1-디포스페이트 + 퀴놀리네이트 + 2H + <=> CO 2 + 디포스페이트 + 니코틴네이트 리보뉴클레오티드
상기 퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성의 약화 또는 결실은 퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라아제를 코딩하는 내재적 유전자를 효소 활성이 약화 또는 결실되도록 변형된 유전자로 대체하는 방법, 상기 유전자의 프로모터를 내재적 프로모터보다 약한 프로모터로 교체하는 방법 또는 상기 유전자를 염색체로부터 결실시키는 방법에 의해 수행될 수 있다.
일 구체예에서는 퀴놀리네이트 생산능을 갖는 미생물의 게놈 상에 위치한 퀴놀리네이트를 니코틴산 모노뉴클레오티드로 전환시키는 효소인 퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라아제의 활성을 제거할 수 있다. 이를 위해, 상동성 재조합(Homologous recombination)에 의해 퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자 nadC를 미생물의 유전체로부터 제거할 수 있다. nadC의 서열은 문헌(Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.)에 공개된 대장균의 게놈 서열(GI:89106990) 또는 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 퀴놀리네이트 생산능을 갖는 미생물은 체내에서 퀴놀리네이트를 생산할 수 있는 원핵 및 진핵 미생물 균주일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀리네이트 생산능을 갖는 미생물은 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀리네이트 생산능을 갖는 미생물은 에스케리치아 속에 속하는 미생물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 퀴놀리네이트 생산능을 갖는 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 제302번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 L-아스파르테이트 옥시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배양하는 단계; 및 배양물에서 퀴놀리네이트를 수득하는 단계를 포함하는 퀴놀리네이트를 생산하는 방법을 제공한다.
퀴놀리네이트 생산능을 갖는 미생물의의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 미생물의 다양한 배양 방법이 예를 들어 "Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176"에 개시되어 있다.
배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 다양한 미생물의 배지는 예를 들어 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981)에 개시되어 있다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.
미생물 배양용 배지에 이용가능한 탄소원은, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 탄소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
미생물 배양용 배지에 이용가능한 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 질소원은 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다.
미생물 배양용 배지는 인의 공급원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염을 포함할 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 이 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 미생물 배양용 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양액의 온도는 통상 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이다. 배양기간은 원하는 퀴놀리네이트의 생성량이 얻어질 때까지 지속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.
또 다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 제302번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 L-아스파르테이트 옥시다제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배양하는 단계; 및 배양물에 산을 첨가하여 탈탄산 반응을 수행하는 단계를 포함하는 니코틴산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "탈탄산 반응"은 반응물, 즉, 퀴놀린의 탈탄산에 의해 니코틴산을 생성하는 반응을 의미한다.
보다 구체적으로 퀴놀리네이트 생산능을 갖는 미생물의 배양 후 수득된 퀴놀리네이트 함유 배양액에서 원심분리 또는 막 여과 방법을 통하여 미생물을 제거한다. 그 후, 탈탄산반응을 촉진하기 위해 퀴놀리네이트를 포함하는 배양액에 수소기를 제공하는 산을 첨가한다. 배양액에 수소기를 제공할 수 있으면 첨가되는 산의 종류는 제한되지 않는다.
상기 퀴놀리네이트가 포함된 배양액은 정제 없이 이용될 수 있다.
상기 배양액에 첨가되는 산은 염산 또는 황산일 수 있다.
상기 산의 첨가 후 배양액의 pH는 5 이하일 수 있다.
상기 산의 첨가 후 배양액의 pH는 2 내지 3일 수 있다.
상기 배양액의 탈탄산 반응시 온도는 100 ℃ 내지 150 ℃일 수 있다. 또한, 상기 배양액의 탈탄산 반응시 온도는 135 ℃일 수 있다.
상기 배양액의 탈탄산 반응시 압력은 0.1 MPa 내지 0.5 MPa일 수 있다. 또한, 배양액의 탈탄산 반응시 압력은 0.3 MPa일 수 있다.
퀴놀리네이트를 포함하는 발효액에 산을 첨가한 후 1시간 내지 3시간 동안 고온 및 고압 조건 하에 탈탄산 반응을 수행하면, 하기식에 표시된 바와 같이 배양액 내의 퀴놀리네이트가 니코틴산으로 변환된다.
<반응식 4>
퀴놀리네이트 + 2H + <=> CO 2 + 니코틴산
본 발명의 니코틴산을 생산하는 방법은 니코틴산을 회수하고 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 니코틴산의 회수는 배양액의 여과 및 결정화 과정을 포함하는 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 퀴놀리네이트를 효과적으로 생산하기 위해 니코틴산 또는 NAD의 피드백 조절을 받지 않는 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체를 포함한 미생물을 배양할 경우 효과적으로 퀴놀리네이트를 생산할 수 있다. 또한, 상기 미생물을 이용하여 효과적으로 니코틴산을 생산할 수 있다. 이러한 방법을 이용함으로서, 기존에 문제가 되었던 화학적 합성법의 촉매 부산물, 고에너지, 재사용 불가능한 자원 이용에 따른 환경적인 문제와 생물학적 생산에서의 낮은 수율을 해소하고, 보다 친환경적이고 효율적으로 퀴놀리네이트 및 니코틴산을 생산할 수 있게 한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 니코틴산의 생산 방법에서 니코틴산의 생산 경로를 보여준다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. NAD 피드백 저항성 L-아스파르테이트 옥시다제 획득
<1-1> 대장균 L-아스파르테이트 옥시다제 발현 벡터 제작
변이형 L-아스파르테이트 옥시다제를 제작하기 위하여, 우선 대장균 유래의 야생형 L-아스파르테이트 옥시다제를 코딩하는 nadB 유전자를 발현 벡터에 cloning 하였다. 이를 위하여 주형으로는 대장균 K12 W3110 균주의 크로모좀을 이용하였다. 균주는 ATCC No 23257 번을 구매하여 사용하였다. 유전자 서열은 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)의 유전자의 염기서열 (NCBI 등록번호 "GI:89109380")의 서열을 활용하였으며, 이는 서열번호 24와 같다. 유전자 cloning을 위하여 nadB 유전자의 ORF 부분을 증폭할 수 있고, 제한효소 인식부위 NdeI과 BamHI를 갖는 서열번호 2 및 3의 프라이머를 합성하였다.
염기서열 서열번호
5' AATTCATATGAATACTCTCCCTGAACATT 3' 2
5' AATTGGATCCCTATACCACTACGCTTGATCAC 3' 3
상기 대장균 K12 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 2과 3의 올리고뉴클레오티드를 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene사, 미국)를 사용하였고, PCR은 96 ℃에서 30초 변성, 50 ℃에서 30초 어닐링 및 72 ℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. PCR을 통하여, nadB ORF 유전자와 제한효소 NdeI 및 BamHI의 인식부위를 함유한 약 1.9 kb의 증폭된 유전자를 수득하였다.
상기 PCR을 통하여 수득된 nadB 유전자는, 아가로즈 겔 용출(agarose gel elution)을 통하여 회수한 후, 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 처리하였다. 이후 제한효소 NdeI 및 BamHI로 처리한 pProLar (CloneTech사, 미국) 벡터에 접합(ligation)하였다. 이를 통하여, pPro 프로모터에 연결된 nadB 유전자로부터 L-아스파르테이트 옥시다제가 발현되도록 하였다. 상기의 방법으로 제작된 벡터를 pPro-nadB 벡터라 명명하였다.
<1-2> 변이형 L-아스파르테이트 옥시다제 플라스미드의 라이브러리 제작
변이형 L-아스파르테이트 옥시다제를 획득하기 위하여, 상기 <1-1>에서 제작된 pPro-nadB를 주형으로 하여 변이형 nadB 유전자 라이브러리를 제작하였다. 변이 유전자 라이브러리는 dGTP 와 MnSO4를 활용한 error-prone PCR 방법을 이용하였다.
pPro-nadB 벡터를 주형으로 하여 프라이머 4 및 5를 이용하여 error-prone PCR을 수행하였다. PCR반응은 dGTP와 MnSO4를 이용하여 GC rate 및 error rate을 조절하였는데, PCR mix 내에 사용된 dGTP의 농도는 2 mM, MnSO4의 농도는 8mM을 사용하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene사, 미국)를 사용하였고, PCR은 96 ℃에서 30초 변성, 50 ℃에서 30초 어닐링 및 72 ℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였고 PCR 후 1.9 kb의 DNA 절편을 획득하였으며, 이를 아가로즈 겔 용출을 통하여 정제한 후, 제한효소 DpnI(NEB사, 미국)을 1시간 처리한 후, E.coli DH5α균주(invitrogen사, 미국)에 CaCl2 방법을 통하여 형질전환 하였다. 형질 전환된 E.coli DH5a 균주는 LB-Km (효모 추출물 10 g/L, NaCl 5 g/L, 트립톤 10 g/L, 카나마이신 25 ㎍/L) 평판 배지에 도말하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 카나마이신 내성을 갖는 콜로니를 선발하여, 무작위로 10개의 클론을 골라 시퀀싱을 확인한 결과 nadB 유전자의 변이 보유율은 4.5 nucleotide/1 kb 수준이었다. 상기 방법을 통하여 nadB 유전자의 변이 유전자를 보유한 균주를 3X105 개 이상 확보하였다.
염기서열 서열번호
5' CTCGAGCATAGCATTTTTATCC 3' 4
5' CAGTGAGCGAGGAAGCGG 3' 5
<1-3> NAD 피드백 저항성 L- 아스파르테이트 옥시다제의 선별
<1-3-1> L-아스파르테이트 옥시다제 결손 균주 제작
nadB 유전자는 NAD에 의해 피드백을 받고 있으며, 이는 퀴놀리네이트 생산에 있어서 부정적인 영향을 미친다 (J Biol Chem. 1982 Jan 25;257(2):626-32.). 이로 인해 NAD 피드백에 저항성을 갖는 nadB의 발굴은 중요하다. 보다 명확한 선별을 위하여 균주내 nadB유전자를 제거하였고 이 균주로부터 변이 nadB의 선별을 수행하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)으로부터 서열번호 24의 nadB 유전자의 염기서열 (NCBI 등록번호 "GI:89109380")을 수득하고, 이에 근거하여 nadB 유전자의 하류(downstream) 부분을 증폭하는 서열번호 6 및 7의 프라이머, nadB의 상류 부분을 증폭하는 서열번호 8 및 9, loxpCm을 증폭하는 서열번호 10 및 11의 프라이머를 합성하였다.
염기서열 서열번호
5' CATTATACGAACGGTACCCCAAAGCCTGGGTCAGCGCCGT 3' 6
5' GGCGGATATTCAGCAGTGG 3' 7
5' CCCAAACCAAATTTCCACG 3' 8
5' CGGTAGGTACCGAGCTCGAATTTCTTTGTTTAATTTACTA 3' 9
5' TAGTAAATTAAACAAAGAAATTCGAGCTCGGTACCTACCG 3' 10
5' ACGGCGCTGACCCAGGCTTTGGGGTACCGTTCGTATAATG 3' 11
대장균 K12 W3110의 크로모좀의 ATCC no. 23257 를 서열번호 6과 7 및 8과 9의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여 각각 0.4 kb 및 0.4 kb의 nadB 유전자의 상류 부분 및 하류 부분을 증폭하였다. 또한, loxpCm을 함유하고 있는 플라스미드 벡터 pLoxpCat2 벡터를 주형으로 하여 서열번호 10 및 11의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여 1.0 kb의 양말단에 nadB유전자와 상동 서열을 갖는 loxpCm 유전자를 증폭하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene사, 미국)를 사용하고, PCR은 96 ℃에서 30초의 변성, 53 ℃에서 30초의 어닐링, 및 72 ℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 이후 아가로즈 겔 용출을 통하여 상기의 PCR 반응을 통하여 얻어진 nadB-상류 절편, nadB-하류 절편, loxpCm 절편을 획득 하였다. 획득된 절편을 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 96 ℃에서의 60초의 변성, 50 ℃에서의 60초의 변성, 및 72 ℃에서의 1분의 신장으로 구성된 사이클의 10회 반복 후 서열번호 7 및 8의 프라이머 첨가 후 사이클의 20회 반복하였다. 그 결과 1.8 kb의 nadB 유전자 상류-loxpCm-하류를 함유한 nadB 제거 카세트를 획득하였다.
람다 레드 재조합효소(lambda red recombinase) 발현 벡터인 pKD46을 함유한 대장균 K12 W3110 균주에 전기천공을 통하여 nadB 제거카세트를 형질전환시키고 선별마커인 클로람페니콜이 함유된 LB(Luria-Bertani) 평판배지(트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g, NaCl 10 g, 클로람페니콜 15 ㎍/L 및 아가 1.5 %) 상에 도말하여 37 ℃에서 밤새 배양한 후, 클로람페니콜에 대한 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주를 직접 주형으로 하여 PCR을 수행 하였다. 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR을 수행한 후, 1.0% 아가로오스 겔 상에서 유전자의 크기가 야생주의 경우 2.4 kb, nadB 제거 균주의 경우 0.8 kb인 것을 확인함으로써 nadB 유전자의 결실을 확인하였다. 이로서 W3110-△nadB를 완성하였다.
<1-3-2> 변이 L- 아스파르테이트 옥시다제의 선별
NAD 피드백에 저항성을 갖는 nadB를 찾기 위하여 니코틴산 유사체(nicotinic acid analogue)인 6-아미노피리딘-3-카르복실산, 6-NA (Aldrich사, 미국)와 니코틴아미드 유사체(nicotinamide analogue)인 6-아미노니코틴아미드(aminonicotinamide), 6-Nm (Aldrich사, 미국)를 이용하였다. 정확하게는 6-NAD 유사체를 사용해야 하나, NAD의 구조상 니코틴산과 니코틴아미드와 구조적 유사성이 존재하므로 니코틴산 유사체와 니코틴아미드 유사체를 사용하여 내성을 가지는 nadB를 1차 선별하고 선별된 nadB 변이주에 대해서 2차적으로 NAD 피드백 저항성(Feedback resistance)을 확인하였다 (ref. Journal of bacteriology, june 1983, p.1126-1136). 실시예 <1-2>에서 제작된 L-아스파르테이트 옥시다제 플라스미드 라이브러리를 W3110-△nadB 균주에 도입하였다.
도입방법은 CaCl2 방법을 이용하여 형질전환하였고 M9-6, NA-6, Nm(NaHPO4-7H2O 12.8 g, KH2PO4 3 g, NaCl 0.5 g, NH4Cl 1 g, MgSO4 2 mM, CaCl2 0.1 mM, casamino acid 1 g, 6-Aminopyridine-3-carboxylic acid 0.3 g/L, 6-aminonicotinamide 0.3 g/L)평판 배지에 도말하여 야생형 nadB와 비교하여 생육이 빠른 콜로니를 선별 하였다. 총 1 x 107개의 콜로니를 스크린하여 최종 3종을 선별하였으며 선별된 3종은 pPro-nadB64, pPro-nadB67, pPro-nadB110이라 명명하였다. 선별된 3종을 기반으로 M9-6,NA-6, Nm(NaHPO4-7H2O 12.8 g, KH2PO4 3 g, NaCl 0.5 g, NH4Cl 1 g, MgSO4 2 mM, CaCl2 0.1 mM, casamino acid 1 g, 6-Aminopyridine-3-carboxylic acid 0.3 g/L, 6-aminonicotinamide 0.3 g/L) 액체배지에 접종하여 배양한 후 OD를 비교하였다. 그 결과 pPro nadB67이 nadB64와 nadB72에 대비해 6-NA와 6-Nm이 포함된 배지에서 생육이 빠름을 확인 할 수 있었고(표 4), 이에 pPro nadB67번을 선정하였다. 선별된 변이형 nadB67번에 대해 sequencing 확인을 수행한 결과 시작 메치오닌으로부터 제302번 아미노산인 라이신이 아르기닌으로 바뀐 변이체임을 확인하였다.
상기 발현벡터로 pProlar vector를 이용하고, W3110의 nadC가 제거되었으며, 플라스미드로 pPro-nadB67(Lys302Arg)-pCJ nadA 를 가지는 E.coli 를 CV01-0518로 명명하고 2013년 6월 20일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture center of Microorganisms, 이하 "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM11434P로 기탁하였다. 즉, 상기 기탁은 부다페스트 조약 하에 국제기탁기관에 기탁된 것이다.
변이형 nadB3종의 6-NA와 6-Nm에 따른 생육 비교
nadB 명칭 OD(4hr) OD(12hr)
pPro nadB 0.24 1.06
pPro nadB64 0.44 1.12
pPro nadB67 0.62 1.30
pPro nadB72 0.46 1.18
실시예 2. 변이형 nadB 를 적용하여 QA 생산량 비교
<2-1> 퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라아제 결손 균주 제작
본 실시예에서는 대장균 K12 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 퀴놀리네이트 분해경로의 nadC 유전자를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 nadC 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 "GI:89106990")를 수득하고, nadC 서열정보 25 에 근거하여 nadC 유전자의 하류(downstream) 부분을 증폭하는 서열번호 12 및 13의 프라이머, nadC의 상류 및 하류 부분과 loxpCm을 증폭하는 서열번호 14 및 15의 프라이머, 상류 부분을 증폭하는 서열번호 16 및 17의 프라이머를 합성하였다.
염기서열 서열번호
5' CATTATACGAACGGTACCCCCAGTTGAATAAACACCTCTTCA 3' 12
5' TGGCGGCAGGCTAATATT 3' 13
5' GTTCTTCCAGATTCTCTACTTTTCGAGCTCGGTACCTACCG 3' 14
5' TGAAGAGGTGTTTATTCAACTGGGGGTACCGTTCGTATAATG 3' 15
5' ATAACCACCATCAGTTCGATA 3' 16
5' CGGTAGGTACCGAGCTCGAAAAGTAGAGAATCTGGAAGAAC 3' 17
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 12과 13 및 16과 17의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여 각각 0.5 kb 및 0.3 kb의 nadC 유전자의 상류 부분 및 하류 부분을 증폭하였다. 또한, loxpCm을 함유하고 있는 플라스미드 벡터 pLoxpCat2 벡터를 주형으로 하여 서열번호 14 및 15의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하여 1.0 kb의 양말단에 nadC 유전자와 상동 서열을 갖는 loxpCm 유전자를 증폭하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제(Stratagene사, 미국)를 사용하고, PCR은 96 ℃에서 30초의 변성, 53 ℃에서 30초의 어닐링, 및 72 ℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 이후 상기의 PCR 반응을 통하여 얻어진 nadC-상류 절편, nadC-하류 절편, loxpCm 절편을 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 96 ℃에서의 60초의 변성, 50 ℃에서의 60초의 변성, 및 72 ℃에서의 1분의 신장으로 구성된 사이클의 10회 반복 및 서열번호 12 및 17의 프라이머 첨가 후 사이클의 20회 반복이었다. 그 결과 1.8 kb의 nadC 유전자 상류-loxpCm-하류를 함유한 nadC 결손 카세트를 획득하였다.
제작된 nadC 결손 카세트를 람다 레드 재조합효소(lambda red recombinase) 발현 벡터인 pKD46을 함유한 대장균 K12 W3110 상에 전기천공을 통하여 형질전환시키고 선별마커인 클로람페니콜이 함유된 LB(Luria-Bertani) 평판배지(트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g, NaCl 10 g, 및 아가 1.5 %) 상에 도말하여 37 ℃에서 밤새 배양한 후, 클로람페니콜에 대한 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 13 및 16의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR을 수행한 후, 1.0 % 아가로오스 겔 상에서 유전자의 크기가 야생주의 경우 1.6 kb, nadC 제거 균주의 경우 1.3 kb인 것을 확인함으로써 nadC 유전자의 결실을 확인하였다. 이를 W3110-△nadC라 명명하였다.
<2-2> 아스파르테이트 옥시다제 및 퀴놀리네이트 신타제 발현용 플라스미드 제작
퀴놀리네이트를 생산하기 위해서는 아스파르테이트 옥시다제와 퀴놀리네이트 신타제의 두 효소가 필요하다. 따라서 이 두효소를 코딩하는 nadB와 nadA의 유전자가 함께 발현될 수 있는 플라스미드를 만들었다. 먼저 대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 퀴놀리네이트 신타제를 코딩하는 유전자 nadA를 수득하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)으로부터 서열번호 26의 nadA 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 "GI:89107601")를 수득하고 이에 근거하여 nadA 유전자의 ATG 부분과 TAA를 함유하는 ORF부분을 증폭할 수 있고 제한효소 ApaI 및 NotI의 인식부위를 갖는 서열번호 18 및 19의 프라이머를 합성하였다.
염기서열 서열번호
5' AATTGGGCCCATGAGCGTAATGTTTGATCCA 3' 18
5' AATTGCGGCCGCTCGTGCCTACCGCTTCG 3' 19
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 18 및 19의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene사, 미국)를 사용하고, PCR은 96 ℃에서의 30초의 변성, 50 ℃에서의 30초의 어닐링, 및 72 ℃에서의 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 그 결과, nadA 유전자와 제한효소 ApaI과 NotI의 인식부위를 함유한 약 1.0 kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.
또한 대한민국 공개특허 10-2006-0068505를 바탕으로 pCJ1 프로모터를 포함한 플라스미드를 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, pCJ1 프로모터를 수득하였다. pCJ1 프로모터와 상기에 증폭된 nadA유전자를 접합시키기 위해 제한효소 BamHI과 ApaI의 인식부위를 갖는 서열번호 20 및 21의 프라이머를 합성하였다.
염기서열 서열번호
5' CCGCGGATCCCACCGCGGGCTTATTCCATTAC 3' 20
5' GATGGGCCCATCTTAATCTCCTAGATTGGGTTTC 3' 21
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 20 및 21의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제(Stratagene사, 미국)를 사용하였으며, PCR 조건은 96 ℃에서의 30초의 변성, 50 ℃에서의 30초의 어닐링, 및 72 ℃에서의 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하였다. 그 결과, pCJ1 프로모터와 제한효소 BamHI과 ApaI를 함유한 약 0.3 kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.
상기 PCR을 통하여 획득한 nadA 유전자를 제한효소 ApaI 및 NotI으로 처리하고, 증폭된 pCJ1 프로모터 절편을 ApaI 및 BamHI으로 처리하였다. 제한효소로 처리한 nadA 및 pCJ1프로모터 절편을 제한효소 NotI 및 BamHI으로 처리한 상기 1-1에서 수득된 pPro-nadB 벡터에 접합을 통하여 클로닝하고 최종적으로 구성적 프로모터인 pPro 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadB 유전자와 pCJ1 유전자 프로모터에 의해 발현 조절을 받는 nadA 유전자가 클로닝된 5.9 Kb의 pPro-nadB- pCJ1-nadA 재조합 벡터를 제작하였다. 제작된 pPro-nadB-pCJ1-nadA 는 서열번호 27의 서열을 갖는다. 또한 상기와 같은 방법으로 변이형 nadB와 야생형 nadA가 재조합 된 벡터 pPro-nadB67-pCJ1-nadA 를 제작하였다. pPro-nadB67-pCJ1-nadA의 서열번호는 28과 같다.
<2-2-1> pPro- nadB67-pCJ1-nadA 의 nadB 변이형 자리인 제302번째 아미노산을 라이신, 아르기닌을 제외한 18종의 아미노산으로 바꾸는 벡터 제작
L-아스파르테이트 옥시다제의 시작인 메치오닌으로부터 제302번 아미노산인 라이신이 아르기닌으로 바뀐 변이형 nadB67에 대하여 제302번에 대한 NAD feedback 해제를 확인 하기 위하여 <2-2>에서 제작된 pPro-nadB67-pCJ1-nadA를 주형으로 하여 nadB 제302번의 아미노산을 라이신과 아르기닌을 제외한 아미노산 18종으로 치환하였다. 치환방법은 pPro-nadB67-pCJ-nadA을 주형으로 하여 quick mutagenesis를 수행하였고, 수행 방법으로 중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene사, 미국)를 사용하였으며, PCR 조건은 96 ℃에서의 30초의 변성, 55 ℃에서의 30초의 어닐링, 및 68 ℃에서의 15분의 신장으로 구성된 사이클을 18회 반복하였다. PCR 산물은 DpnI(NEB사, 미국)을 처리한 후 E.coli DH5α균주(invitrogen사, 미국)에 CaCl2 방법을 통하여 형질전환 하였다. 형질 전환된 E.coli DH5a 균주는 LB-Km (효모 추출물 10 g/L, NaCl 5 g/L, 트립톤 10 g/L, 카나마이신 25 ㎍/L) 평판 배지에 도말하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 카나마이신 내성을 갖는 콜로니를 선발하여, 플라스미드를 추출하고 sequencing을 확인하여 18종의 아미노산으로 바뀐 것을 확인 할 수 있었다. 그 결과 18종의 아미노산으로 바뀐 nadB 변이체를 획득할 수 있었고 각 플라스미드에 대한 명명은 표 2와 같다
L-아스파르테이트 옥시다제의 제302번 변이체
명명 nadB 제302번 바뀐 아미노산
pPro nadB67 pCJ1 nadA Lysine Arginine
pPro nadB67(G) pCJ1 nadA Glycine
pPro nadB67(A) pCJ1 nadA Alanine
pPro nadB67(S) pCJ1 nadA Serine
pPro nadB67(T) pCJ1 nadA Threonine
pPro nadB67(C) pCJ1 nadA Cysteine
pPro nadB67(V) pCJ1 nadA Valine
pPro nadB67(L) pCJ1 nadA Leucine
pPro nadB67(I) pCJ1 nadA Isoleucine
pPro nadB67(M) pCJ1 nadA Methionine
pPro nadB67(P) pCJ1 nadA proline
pPro nadB67(F) pCJ1 nadA Phenylalanine
pPro nadB67(Y) pCJ1 nadA Tyrosine
pPro nadB67(W) pCJ1 nadA Tryptophan
pPro nadB67(D) pCJ1 nadA Aspartic acid
pPro nadB67(E) pCJ1 nadA Glutamic acid
pPro nadB67(N) pCJ1 nadA Asparagine
pPro nadB67(Q) pCJ1 nadA Glutamine
pPro nadB67(H) pCJ nadA Histidine
<2-3> NAD 농도에 따른 퀴놀리네이트 생산 평가
야생형 nadB와 변이형 nadB67의 NAD농도별 퀴놀리네이트의 생산하는 능력을 비교하기 위하여 하기의 퀴놀리네이트 역가 확인 실험을 진행하였다. 상기 <실시예 2-1>에서 제작된 퀴놀리네이트 생산 균주(W3110-△nadC)에 실시예 <2-2>에서 제작한 플라스미드 pPro-nadB67-pCJq1-nadA를 도입하고 실시예 <2-2-1>에서 제작한 18종의 nadB67 변이체를 형질전환 하였다. 형질 전환법은 CaCl2방법을 이용하였고 37 ℃의 배양기에서 LB-Km 평판배지 중에 밤새 배양하여 수득한 단일 콜로니를 25 ㎖의 퀴놀리네이트 역가 배지에 1 백금이(platinum pool)씩 접종하여 37 ℃에서 250 rpm으로 24 내지 72 시간 동안 배양하였다. 표 9는 퀴놀리네이트 생산용 배지의 조성을 나타낸다. nadB67을 포함한 변이체의 NAD 피드백 저항성을 확인하기 위하여 배지에 NA를 농도별로 첨가하여 퀴놀리네이트의 생산양을 비교하였다.
퀴놀리네이트 역가 배지 조성
조성 농도(리터당)
포도당 70 g
황산암모늄 17 g
KH2PO4 1.0 g
MgSO4·7H2O 0.5 g
FeSO4·7H2O 5 mg
MnSO4·8H2O 5 mg
ZnSO4 5 mg
탄산칼슘 30 g
효모 추출물 2 g
배양액 중의 퀴놀리네이트를 HPLC에 의하여 분석하여 결과를 표 10에 나타내었으며, 이는 NAD 농도에 따른 퀴놀리네이트를 생산하는 생산능을 나타낸다.
NAD 농도별 퀴놀리산 생산량
QA (mg/L)
균주 plasmid NA 0uM NA 5uM NA 10uM
W3110-△nadC pPro-nadB-pCJ nadA 3500 1600 700
pPro-nadB67-pCJ nadA 4553 3860 3251
pPro nadB67(G) -pCJ nadA 4560 3830 3058
pPro nadB67(A) -pCJ nadA 4560 3830 3058
pPro nadB67(S) -pCJ nadA 4560 3830 3058
pPro nadB67(T) -pCJ nadA 4560 3830 3058
pPro nadB67(C) -pCJ nadA 4560 3830 3058
pPro nadB67(V) -pCJ nadA 4425 3937 3280
pPro nadB67(L) -pCJ nadA 4425 3937 3280
pPro nadB67(I) -pCJ nadA 4425 3937 3280
pPro nadB67(M) -pCJ nadA 4425 3937 3280
pPro nadB67(P) -pCJ nadA 2223 1879 1975
pPro nadB67(F) -pCJ nadA 4241 3795 3141
pPro nadB67(Y) -pCJ nadA 4241 3795 3141
pPro nadB67(W) -pCJ nadA 4707 3715 3186
pPro nadB67(D) -pCJ nadA 100 100 100
pPro nadB67(E) -pCJ nadA 100 100 100
pPro nadB67(N) -pCJ nadA 4552 3939 3171
pPro nadB67(Q) -pCJ nadA 4552 3939 3171
pPro nadB67(H) -pCJ nadA 4891 3751 3255
NAD 농도에 따른 퀴놀리네이트의 잔존 생산률
relative(%)
균주 plasmid NA 0uM NA 5uM NA 10uM
W3110-△nadC pPro-nadB-pCJ nadA 100 46 20
pPro-nadB67-pCJ nadA 100 85 71
pPro nadB67(G) -pCJ nadA 100 84 67
pPro nadB67(A) -pCJ nadA 100 84 67
pPro nadB67(S) -pCJ nadA 100 84 67
pPro nadB67(T) -pCJ nadA 100 84 67
pPro nadB67(C) -pCJ nadA 100 84 67
pPro nadB67(V) -pCJ nadA 100 89 74
pPro nadB67(L) -pCJ nadA 100 89 74
pPro nadB67(I) -pCJ nadA 100 89 74
pPro nadB67(M) -pCJ nadA 100 89 74
pPro nadB67(P) -pCJ nadA 100 85 89
pPro nadB67(F) -pCJ nadA 100 89 74
pPro nadB67(Y) -pCJ nadA 100 89 74
pPro nadB67(W) -pCJ nadA 100 79 68
pPro nadB67(D) -pCJ nadA 100 100 100
pPro nadB67(E) -pCJ nadA 100 100 100
pPro nadB67(N) -pCJ nadA 100 87 70
pPro nadB67(Q) -pCJ nadA 100 87 70
pPro nadB67(H) -pCJ nadA 100 77 67
변이주들(pPro nadB67(D)-pCJ nadA, pPro nadB67(E)-pCJ nadA)은 nadB가 망가져서 활성이 없어진 경우이다. 따라서 QA값 자체가 매우 낮아, 그 낮은값을 잔존 relative로 환산하여 100 %로 계산하였다. 여기서 잔존 relative는 NA 0 uM 일때의 QA 생산량을 100 %로 보고 환산한 값을 나타내었다.
표 11에서 보듯이 야생형 nadB를 포함하는 pPro-nadB-pCJnadA는 배지내 니코틴산(nicotinic acid:NA)가 5 uM이상일 때 퀴놀리네이트 생산량이 50 %미만인데 비해 변이형 nadB를 포함하는 pPro nadB67-pCJ nadA와 NadB의 제302번 변이체들은 NA 5uM 이상일때도 생산량이 70 %이상을 유지한다. W3110 -△nadC균주는 NAD를 외부에서 공급해야 생육이 가능한 NAD auxotroph인 균주이다. W3110-△nadC는 NAD를 직접적으로 받아들이지 못하고 외부의 니코틴산(NA) 또는 니코틴아미드(nicotinamide:Nm)를 이용해 NAD를 생성한다. 그러나 NAD의 함량이 intracellular 1 mM이상이 되면 nadB를 피드백하여 셀 내 NAD의 함량을 일정하게 유지한다. 이에 피드백 조절을 받는 nadB에 의해 QA 생산에 한계가 있을 수 있다. 배지내 NA 농도첨가는 사실상 균주내 NAD증가로 볼 수 있으며, 이에 따라 배지내 NA를 첨가하여 QA 생산량을 비교함은 NAD농도에 따른 nadB의 피드백 정도를 확인 할 수 있다. 그러므로, NadB의 제302번 변이체들은 NAD에 의한 피드백이 해제되었다고 볼 수 있다.
<2-4> 탈탄산 반응을 통한 니코틴산 생산
변이형 nadB를 도입한 퀴놀리네이트 생산균주의 니코틴산 생산능을 확인하기 위하여 표 10에서 생산된 퀴놀리네이트를 이용하여 니코틴산 생산을 확인 하였다. 니코틴산 생산 방법은 대한민국 공개특허 10-2012-0082673을 바탕으로 하여 배양액에서 퀴놀리네이트를 함유한 배양액 중 퀴놀리네이트를 니코틴산으로 전환하기 위하여 고온, 고압 조건에서 탈탄산 반응을 수행하였다. 먼저 퀴놀리네이트 배양액 중의 세포를 제거하기 위해 3000 내지 4000 rpm으로 10 내지 30분 동안 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 수득된 퀴놀리네이트 함유 상등액을 분리하여 탈탄산 반응의 시료로 사용하였다.
탈탄산 반응은 135 ℃ 및 0.2 MPa의 조건 하에 3시간 동안 수행하였고, 사용된 시료의 조건은 하기의 표 12와 같았다. 대조군 실험으로 수행된 탈이온수에 사용된 퀴놀리네이트는 Sigma-Aldrich사의 표준품을 사용하였으며 퀴놀리네이트 수용액의 pH는 수산화나트륨, 암모니아수, 염산, 또는 황산 등을 이용하여 적정하였는데 본 실시예에서는 pH 2에서 전환 반응을 수행하였다. 하기의 표 12는 표 10에 기재된 퀴놀리네이트를 고온고압 반응에 의한 니코틴산으로의 전환된 생산량을 표시한다.
균주 plasmid 퀴놀리네이트(mg/L) 니코틴산(mg/L)
W3110-△nadC pPro-nadB-pCJ nadA 3500 2555
pPro-nadB67-pCJ nadA 4553 3324
pPro nadB67(G) -pCJ nadA 4560 3329
pPro nadB67(A) -pCJ nadA 4560 3329
pPro nadB67(S) -pCJ nadA 4560 3329
pPro nadB67(T) -pCJ nadA 4560 3329
pPro nadB67(C) -pCJ nadA 4560 3329
pPro nadB67(V) -pCJ nadA 4425 3230
pPro nadB67(L) -pCJ nadA 4425 3230
pPro nadB67(I) -pCJ nadA 4425 3230
pPro nadB67(M) -pCJ nadA 4425 3230
pPro nadB67(P) -pCJ nadA 2223 1623
pPro nadB67(F) -pCJ nadA 4241 3096
pPro nadB67(Y) -pCJ nadA 4241 3096
pPro nadB67(W) -pCJ nadA 4707 3436
pPro nadB67(D) -pCJ nadA 100 73
pPro nadB67(E) -pCJ nadA 100 73
pPro nadB67(N) -pCJ nadA 4552 3323
pPro nadB67(Q) -pCJ nadA 4552 3323
pPro nadB67(H) -pCJ nadA 4891 3570
선행문헌인 중국 공개특허 101353322에서 개시된 탈이온수를 수용액으로 하여 150 ℃ 내지 250 ℃ 및 2 MPa보다 낮은 온도 및 압력 조건인 135 ℃ 및 0.2 MPa에서 퀴놀리네이트를 니코틴산으로 전환하는 실험을 3시간 동안 수행하여 상기 표 12의 결과를 수득하였다.
실시예 3. L-아스파르테이트 옥시다제의 NAD 피드백 저항성 활성 확인
<3-1> L-아스파르테이트 옥시다제 과발현 플라스미드 제작
변이형 L- 아스파르테이트 옥시다제의 NAD에 대한 피드백 저항성 활성을 좀 더 명확하게 하기 위하여 <실시예 1-3-2>에서 확인 되었던 변이형 nadB67가 코딩하는 변이형 L-아스파르테이트 옥시다제를 이용하여 NAD에 대한 피드백 저항성을 확인 하였다. 이에 His tag을 포함하는 pCDF-duet 벡터에 야생형 및 변이형 nadB를 클로닝하기 위하여 야생형 pPro-nadB 플라스미드와 pPro-nadB67을 각각의 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 야생형 nadB와 변이형 nadB67 유전자의 ATG 부분과 TAA를 함유하는 ORF 부분을 증폭할 수 있고 제한효소 인식부위 BamHI과 NdeI를 갖는 서열번호 22 및 23의 프라이머를 합성하였다.
염기서열 서열번호
5' AATTGGATCCGATGAATACTCTCCCTGAACATT 3' 22
5' AATTCATATGTTATCTGTTTATGTAATGATTGC 3' 23
중합효소는 PfuUltraTM DNA 폴리머라제 (Stratagene사, 미국)를 사용하였고, PCR은 96 ℃에서 30초 변성, 50 ℃에서 30초 어닐링 및 72 ℃에서 2분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하여 수행하였다. 이에 의하여, 제한효소 BamHI 및 NdeI 의 인식부위를 함유한 야생형 nadB와 변이형 nadB67의 1.9 kb의 증폭된 유전자를 수득하였다.
상기 PCR을 통하여 수득된 야생형 nadB와 변이형 nadB67의 유전자를 제한효소 BamHI 및 NdeI 으로 처리하고, 제한효소 BamHI 및 NdeI 로 처리한 pCDF-duet 벡터에 접합 (ligation)을 통하여 클로닝하였다. 최종적으로 항시 발현 프로모터인 T7 프로모터에 의해 발현 조절을 받고 단백질 정제가 가능한 His tag이 있는 야생형 nadB와 변이형 nadB67의 유전자를 포함하는 벡터를 제작하였고, 벡터의 명칭은 pT7-nadB, pT7-nadB67이라 명명하였다. 같은 방법으로 nadB 302번이 발린, 루이신,이소루신,히스티딘으로 치환된 벡터도 제작 하였으며, pT7-nadB67(V), pT7-nadB67(L), pT7-nadB67(I), pT7-nadB67(H)이라 하였다.
<3-2> L-아스파르테이트 옥시다제의 정제
pT7-nadB, pT7-nadB67, pT7-nadB67(V), pT7-nadB67(L), pT7-nadB67(I) 또는 pT7-nadB67(H)의 벡터를 과발현 시킬 수 있는 tunner 균주에 CaCl2 방법을 통하여 형질전환시킨 후, LB-SP (효모 추출물 10 g/L, NaCl 5 g/L, 트립톤 10 g/L, 스펙티노마이신 50 ㎍/L) 평판 배지에 도말하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 이후, 스펙티노마이신 내성을 갖는 콜로니를 선발하였다. 이 중 콜로니 한 개를 선별하여 LB-SP (효모 추출물 10 g/L, NaCl 5 g/L, 트립톤 10 g/L, 스펙티노마이신 50 ㎍/L) 액체 배지에 배양하였고, 생육 OD가 0.4가 되었을 때 IPTG 유도체를 첨가하여 18 ℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 사용하여 과발현된 야생형 L-아스파르테이트 옥시다제와 변이형 L-아스파르테이트 옥시다제를 포함하는 cell을 회수하고 Ni-NTA spin kit(Quiagen사, 미국)를 이용하여 회수된 cell내 L-아스파르테이트 옥시다제의 정제를 수행하였고, 이때 회수된 단백질은 total 단백질의 50 %이며, 이중 2 %의 L-아스파르테이트 옥시다제를 회수하였다.
<3-3> 변이형 L-아스파르테이트 옥시다제 활성 테스트
nadB는 아스파테이트를 기질로 하여 FAD를 cofactor로 사용하고 이미노아스파르테이트를 생성하고 이는 옥살로아세테이트를 생성한다. 이 반응을 거치면서 nadB에 의해 H2O2가 생성되는데 이때 생성되는 H2O2를 이용하여 nadB의 활성을 확인하였다. 생성되는 H2O2를 Amplex Red (invitrogen 사, 한국)와 반응하여 생성되는 물질을 흡광도 560 nm에서 측정하여 nadB의 활성을 측정하였다. 이때 NAD를 농도별로 첨가하여 FAD와 경쟁적 저해 조건을 만들어 L-아스파르테이트 옥시다제의 NAD에 대한 피드백 저항성 정도를 확인하였다. NAD농도 1mM에서 야생형 L-아스파르테이트 옥시다제의 잔존활성율은 50 %미만이었으나 변이형 L-아스파르테이트 옥시다제의 경우 70 %이상의 잔존활성율을 보유하고 있었다 (표 14). 이에 변이형 L-아스파르테이트 옥시다제는 야생형 L-아스파르테이트 옥시다제와 비교하여 NAD에 대해 피드백이 해제되었음을 확인 하였다.
NAD 농도에 따른 L- 아스파르테이트 옥시다제의 활성 비교
잔존 활성율
relative (%)
NAD 농도(mM) 야생형-nadB 변이형-nadB67 변이형-nadB67(V) 변이형-nadB67(L) 변이형-nadB67(I) 변이형-nadB67(H)
0 100 100 100 100 100 100
0.05 95 102 100 100 100 100
0.3 82 96 95 95 95 95
0.5 65 75 77 76 76 77
1 22 74 75 74 75 74
본 발명은 퀴놀리네이트를 효과적으로 생산하기 위해 니코틴산 또는 NAD의 피드백 조절을 받지 않는 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체에 대한 것이다. 이러한 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체를 포함한 미생물을 배양할 경우 효과적으로 퀴놀리네이트를 생산할 수 있다. 또한, 추가적으로 퀴놀리네이트 신타제의 활성을 강화하거나 또는 퀴놀리네이트 포스포리보실트랜스퍼라제의 활성이 약화된 미생물을 제공함으로서 효과적으로 퀴놀리네이트를 생산할 수 있다. 이와같은 형질전환을 통하여 퀴놀리네이트 또는 니코틴산의 생산 수율을 향상시킬 수 있으므로 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11434 20130620
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> L-aspartate oxidase derivatives resistant to nicotinic acid or NAD and a method for the preparation of nicotinic acid <130> PN099326 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 540 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acids sequence of nadB <400> 1 Met Asn Thr Leu Pro Glu His Ser Cys Asp Val Leu Ile Ile Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ala Ala Gly Leu Ser Leu Ala Leu Arg Leu Ala Asp Gln His Gln 20 25 30 Val Ile Val Leu Ser Lys Gly Pro Val Thr Glu Gly Ser Thr Phe Tyr 35 40 45 Ala Gln Gly Gly Ile Ala Ala Val Phe Asp Glu Thr Asp Ser Ile Asp 50 55 60 Ser His Val Glu Asp Thr Leu Ile Ala Gly Ala Gly Ile Cys Asp Arg 65 70 75 80 His Ala Val Glu Phe Val Ala Ser Asn Ala Arg Ser Cys Val Gln Trp 85 90 95 Leu Ile Asp Gln Gly Val Leu Phe Asp Thr His Ile Gln Pro Asn Gly 100 105 110 Glu Glu Ser Tyr His Leu Thr Arg Glu Gly Gly His Ser His Arg Arg 115 120 125 Ile Leu His Ala Ala Asp Ala Thr Gly Arg Glu Val Glu Thr Thr Leu 130 135 140 Val Ser Lys Ala Leu Asn His Pro Asn Ile Arg Val Leu Glu Arg Ser 145 150 155 160 Asn Ala Val Asp Leu Ile Val Ser Asp Lys Ile Gly Leu Pro Gly Thr 165 170 175 Arg Arg Val Val Gly Ala Trp Val Trp Asn Arg Asn Lys Glu Thr Val 180 185 190 Glu Thr Cys His Ala Lys Ala Val Val Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser 195 200 205 Lys Val Tyr Gln Tyr Thr Thr Asn Pro Asp Ile Ser Ser Gly Asp Gly 210 215 220 Ile Ala Met Ala Trp Arg Ala Gly Cys Arg Val Ala Asn Leu Glu Phe 225 230 235 240 Asn Gln Phe His Pro Thr Ala Leu Tyr His Pro Gln Ala Arg Asn Phe 245 250 255 Leu Leu Thr Glu Ala Leu Arg Gly Glu Gly Ala Tyr Leu Lys Arg Pro 260 265 270 Asp Gly Thr Arg Phe Met Pro Asp Phe Asp Glu Arg Gly Glu Leu Ala 275 280 285 Pro Arg Asp Ile Val Ala Arg Ala Ile Asp His Glu Met Lys Arg Leu 290 295 300 Gly Ala Asp Cys Met Phe Leu Asp Ile Ser His Lys Pro Ala Asp Phe 305 310 315 320 Ile Arg Gln His Phe Pro Met Ile Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Leu Gly 325 330 335 Ile Asp Leu Thr Gln Glu Pro Val Pro Ile Val Pro Ala Ala His Tyr 340 345 350 Thr Cys Gly Gly Val Met Val Asp Asp His Gly Arg Thr Asp Val Glu 355 360 365 Gly Leu Tyr Ala Ile Gly Glu Val Ser Tyr Thr Gly Leu His Gly Ala 370 375 380 Asn Arg Met Ala Ser Asn Ser Leu Leu Glu Cys Leu Val Tyr Gly Trp 385 390 395 400 Ser Ala Ala Glu Asp Ile Thr Arg Arg Met Pro Tyr Ala His Asp Ile 405 410 415 Ser Thr Leu Pro Pro Trp Asp Glu Ser Arg Val Glu Asn Pro Asp Glu 420 425 430 Arg Val Val Ile Gln His Asn Trp His Glu Leu Arg Leu Phe Met Trp 435 440 445 Asp Tyr Val Gly Ile Val Arg Thr Thr Lys Arg Leu Glu Arg Ala Leu 450 455 460 Arg Arg Ile Thr Met Leu Gln Gln Glu Ile Asp Glu Tyr Tyr Ala His 465 470 475 480 Phe Arg Val Ser Asn Asn Leu Leu Glu Leu Arg Asn Leu Val Gln Val 485 490 495 Ala Glu Leu Ile Val Arg Cys Ala Met Met Arg Lys Glu Ser Arg Gly 500 505 510 Leu His Phe Thr Leu Asp Tyr Pro Glu Leu Leu Thr His Ser Gly Pro 515 520 525 Ser Ile Leu Ser Pro Gly Asn His Tyr Ile Asn Arg 530 535 540 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadB <400> 2 aattcatatg aatactctcc ctgaacatt 29 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadB <400> 3 aattggatcc ctataccact acgcttgatc ac 32 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadB <400> 4 ctcgagcata gcatttttat cc 22 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadB <400> 5 cagtgagcga ggaagcgg 18 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadB's downstream <400> 6 cattatacga acggtacccc aaagcctggg tcagcgccgt 40 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadB's downstream <400> 7 ggcggatatt cagcagtgg 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadB's upstream <400> 8 cccaaaccaa atttccacg 19 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadB's upstream <400> 9 cggtaggtac cgagctcgaa tttctttgtt taatttacta 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for loxpCm <400> 10 tagtaaatta aacaaagaaa ttcgagctcg gtacctaccg 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for loxpCm <400> 11 acggcgctga cccaggcttt ggggtaccgt tcgtataatg 40 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadC's downstream <400> 12 cattatacga acggtacccc cagttgaata aacacctctt ca 42 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadC's downstream <400> 13 tggcggcagg ctaatatt 18 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadC's upstream <400> 14 gttcttccag attctctact tttcgagctc ggtacctacc g 41 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadC's upstream <400> 15 tgaagaggtg tttattcaac tgggggtacc gttcgtataa tg 42 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for loxpCm <400> 16 ataaccacca tcagttcgat a 21 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for loxpCm <400> 17 cggtaggtac cgagctcgaa aagtagagaa tctggaagaa c 41 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadA <400> 18 aattgggccc atgagcgtaa tgtttgatcc a 31 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for nadA <400> 19 aattgcggcc gctcgtgcct accgcttcg 29 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ccgcggatcc caccgcgggc ttattccatt ac 32 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gatgggccca tcttaatctc ctagattggg tttc 34 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 aattggatcc gatgaatact ctccctgaac att 33 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 aattcatatg ttatctgttt atgtaatgat tgc 33 <210> 24 <211> 1623 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nadB gene <400> 24 atgaatactc tccctgaaca ttcatgtgac gtgttgatta tcggtagcgg cgcagccgga 60 ctttcactgg cgctacgcct ggctgaccag catcaggtca tcgttctaag taaaggcccg 120 gtaacggaag gttcaacatt ttatgcccag ggcggtattg ccgccgtgtt tgatgaaact 180 gacagcattg actcgcatgt ggaagacaca ttgattgccg gggctggtat ttgcgatcgc 240 catgcagttg aatttgtcgc cagcaatgca cgatcctgtg tgcaatggct aatcgaccag 300 ggggtgttgt ttgataccca cattcaaccg aatggcgaag aaagttacca tctgacccgt 360 gaaggtggac atagtcaccg tcgtattctt catgccgccg acgccaccgg tagagaagta 420 gaaaccacgc tggtgagcaa ggcgctgaac catccgaata ttcgcgtgct ggagcgcagc 480 aacgcggttg atctgattgt ttctgacaaa attggcctgc cgggcacgcg acgggttgtt 540 ggcgcgtggg tatggaaccg taataaagaa acggtggaaa cctgccacgc aaaagcggtg 600 gtgctggcaa ccggcggtgc gtcgaaggtt tatcagtaca ccaccaatcc ggatatttct 660 tctggcgatg gcattgctat ggcgtggcgc gcaggctgcc gggttgccaa tctcgaattt 720 aatcagttcc accctaccgc gctatatcac ccacaggcac gcaatttcct gttaacagaa 780 gcactgcgcg gcgaaggcgc ttatctcaag cgcccggatg gtacgcgttt tatgcccgat 840 tttgatgagc gcggcgaact ggccccgcgc gatattgtcg cccgcgccat tgaccatgaa 900 atgaaacgcc tcggcgcaga ttgtatgttc cttgatatca gccataagcc cgccgatttt 960 attcgccagc atttcccgat gatttatgaa aagctgctcg ggctggggat tgatctcaca 1020 caagaaccgg taccgattgt gcctgctgca cattatacct gcggtggtgt aatggttgat 1080 gatcatgggc gtacggacgt cgagggcttg tatgccattg gcgaggtgag ttataccggc 1140 ttacacggcg ctaaccgcat ggcctcgaat tcattgctgg agtgtctggt ctatggctgg 1200 tcggcggcgg aagatatcac cagacgtatg ccttatgccc acgacatcag tacgttaccg 1260 ccgtgggatg aaagccgcgt tgagaaccct gacgaacggg tagtaattca gcataactgg 1320 cacgagctac gtctgtttat gtgggattac gttggcattg tgcgcacaac gaagcgcctg 1380 gaacgcgccc tgcggcggat aaccatgctc caacaagaaa tagacgaata ttacgcccat 1440 ttccgcgtct caaataattt gctggagctg cgtaatctgg tacaggttgc cgagttgatt 1500 gttcgctgtg caatgatgcg taaagagagt cgggggttgc atttcacgct ggattatccg 1560 gaactgctca cccattccgg tccgtcgatc ctttcccccg gcaatcatta cataaacaga 1620 taa 1623 <210> 25 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nadC gene <400> 25 atgccgcctc gccgctataa ccctgacacc cgacgtgacg agctgctgga acgcattaat 60 ctcgatatcc ccggcgcggt ggcccaggcg ctgcgggaag atttaggcgg aacagtcgat 120 gccaacaatg atattacggc aaaactttta ccggaaaatt ctcgctctca tgccacggtg 180 atcacccgcg agaatggcgt cttttgcggc aaacgctggg ttgaagaggt gtttattcaa 240 ctggcaggcg acgatgtcac cataatctgg catgtggatg acggcgatgt catcaatgcc 300 aatcaatcct tgttcgaact tgaaggccca tcccgcgtgc tgttaacggg cgaacgcact 360 gcgcttaatt ttgtgcaaac cctttcagga gttgccagta aggtacgcca ctatgtcgaa 420 ttgctggaag gcaccaacac gcagttgttg gatacgcgca aaaccttacc cggcctgcgt 480 tcagctctga aatacgcggt actttgcggc ggcggagcga atcaccgtct ggggctttct 540 gatgccttcc tgatcaaaga aaaccatatt attgcctccg gctcagtgcg ccaggcggtc 600 gaaaaagcgt cctggctgca cccggatgcg ccagtagaag tcgaagtaga gaatctggaa 660 gaacttgatg aagccctgaa agcaggagcc gatatcatca tgctggataa cttcgaaaca 720 gaacagatgc gcgaagccgt caaacgcacc aacggcaagg cgctactgga agtgtctggc 780 aacgtcactg acaaaacact gcgtgaattt gccgaaacgg gcgtggactt tatctccgtc 840 ggtgcgctaa ctaaacacgt acaagcactc gacctttcaa tgcgttttcg ctaa 894 <210> 26 <211> 1044 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nadA gene <400> 26 atgagcgtaa tgtttgatcc agacacggcg atttatcctt tccccccgaa gccgacgccg 60 ttaagcattg atgaaaaagc gtattaccgc gagaagataa aacgtctgct aaaagaacgt 120 aatgcggtga tggttgccca ctactatacc gatcccgaaa ttcaacaact ggcagaagaa 180 accggtggct gtatttctga ttctctggaa atggcgcgct tcggtgcaaa gcatcccgct 240 tctactttgt tagtcgctgg ggtgagattt atgggagaaa ccgccaaaat tctcagtccg 300 gaaaaaacaa ttctgatgcc gacacttcag gctgaatgtt cactggatct cggctgccct 360 gttgaagaat ttaacgcatt ttgcgatgcc catcccgatc gtactgtcgt cgtctacgcc 420 aacacttctg ctgcggtaaa agcgcgcgca gattgggtgg taacttcaag cattgccgtc 480 gaacttattg atcatcttga tagtttgggt gaaaaaatca tctgggcacc cgacaaacat 540 ctggggcgtt acgtgcaaaa acagacgggt ggagacattc tatgctggca gggtgcctgt 600 attgtgcatg atgaatttaa gactcaggcg ttaacccgct tgcaagaaga atacccggat 660 gctgccatac tggtgcatcc agaatcacca caagctattg tcgatatggc ggatgcggtc 720 ggttccacca gtcaactgat cgctgctgcg aaaacattgc cacatcagag gcttattgtg 780 gcaaccgatc ggggtatttt ctacaaaatg cagcaggcgg tgccagataa agagttactg 840 gaagcaccaa ccgcaggtga gggtgcaacc tgccgcagct gcgcgcattg tccgtggatg 900 gccatgaatg gccttcaggc catcgcagag gcattagaac aggaaggaag caatcacgag 960 gttcatgttg atgaaaggct gcgagagagg gcgctggtgc cgctcaatcg tatgctggat 1020 tttgcggcta cactacgtgg ataa 1044 <210> 27 <211> 1 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPro nadBpCJnadA <400> 27 a 1 <210> 28 <211> 1 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPro nadB67pCJnadA <400> 28 a 1 <210> 29 <211> 347 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nadA-quinolinate synthase <400> 29 Met Ser Val Met Phe Asp Pro Asp Thr Ala Ile Tyr Pro Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Thr Pro Leu Ser Ile Asp Glu Lys Ala Tyr Tyr Arg Glu Lys 20 25 30 Ile Lys Arg Leu Leu Lys Glu Arg Asn Ala Val Met Val Ala His Tyr 35 40 45 Tyr Thr Asp Pro Glu Ile Gln Gln Leu Ala Glu Glu Thr Gly Gly Cys 50 55 60 Ile Ser Asp Ser Leu Glu Met Ala Arg Phe Gly Ala Lys His Pro Ala 65 70 75 80 Ser Thr Leu Leu Val Ala Gly Val Arg Phe Met Gly Glu Thr Ala Lys 85 90 95 Ile Leu Ser Pro Glu Lys Thr Ile Leu Met Pro Thr Leu Gln Ala Glu 100 105 110 Cys Ser Leu Asp Leu Gly Cys Pro Val Glu Glu Phe Asn Ala Phe Cys 115 120 125 Asp Ala His Pro Asp Arg Thr Val Val Val Tyr Ala Asn Thr Ser Ala 130 135 140 Ala Val Lys Ala Arg Ala Asp Trp Val Val Thr Ser Ser Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Leu Ile Asp His Leu Asp Ser Leu Gly Glu Lys Ile Ile Trp Ala 165 170 175 Pro Asp Lys His Leu Gly Arg Tyr Val Gln Lys Gln Thr Gly Gly Asp 180 185 190 Ile Leu Cys Trp Gln Gly Ala Cys Ile Val His Asp Glu Phe Lys Thr 195 200 205 Gln Ala Leu Thr Arg Leu Gln Glu Glu Tyr Pro Asp Ala Ala Ile Leu 210 215 220 Val His Pro Glu Ser Pro Gln Ala Ile Val Asp Met Ala Asp Ala Val 225 230 235 240 Gly Ser Thr Ser Gln Leu Ile Ala Ala Ala Lys Thr Leu Pro His Gln 245 250 255 Arg Leu Ile Val Ala Thr Asp Arg Gly Ile Phe Tyr Lys Met Gln Gln 260 265 270 Ala Val Pro Asp Lys Glu Leu Leu Glu Ala Pro Thr Ala Gly Glu Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Arg Ser Cys Ala His Cys Pro Trp Met Ala Met Asn Gly 290 295 300 Leu Gln Ala Ile Ala Glu Ala Leu Glu Gln Glu Gly Ser Asn His Glu 305 310 315 320 Val His Val Asp Glu Arg Leu Arg Glu Arg Ala Leu Val Pro Leu Asn 325 330 335 Arg Met Leu Asp Phe Ala Ala Thr Leu Arg Gly 340 345 <210> 30 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NadC - quinolinate phosphoribosyltransferase <400> 30 Met Pro Pro Arg Arg Tyr Asn Pro Asp Thr Arg Arg Asp Glu Leu Leu 1 5 10 15 Glu Arg Ile Asn Leu Asp Ile Pro Gly Ala Val Ala Gln Ala Leu Arg 20 25 30 Glu Asp Leu Gly Gly Thr Val Asp Ala Asn Asn Asp Ile Thr Ala Lys 35 40 45 Leu Leu Pro Glu Asn Ser Arg Ser His Ala Thr Val Ile Thr Arg Glu 50 55 60 Asn Gly Val Phe Cys Gly Lys Arg Trp Val Glu Glu Val Phe Ile Gln 65 70 75 80 Leu Ala Gly Asp Asp Val Thr Ile Ile Trp His Val Asp Asp Gly Asp 85 90 95 Val Ile Asn Ala Asn Gln Ser Leu Phe Glu Leu Glu Gly Pro Ser Arg 100 105 110 Val Leu Leu Thr Gly Glu Arg Thr Ala Leu Asn Phe Val Gln Thr Leu 115 120 125 Ser Gly Val Ala Ser Lys Val Arg His Tyr Val Glu Leu Leu Glu Gly 130 135 140 Thr Asn Thr Gln Leu Leu Asp Thr Arg Lys Thr Leu Pro Gly Leu Arg 145 150 155 160 Ser Ala Leu Lys Tyr Ala Val Leu Cys Gly Gly Gly Ala Asn His Arg 165 170 175 Leu Gly Leu Ser Asp Ala Phe Leu Ile Lys Glu Asn His Ile Ile Ala 180 185 190 Ser Gly Ser Val Arg Gln Ala Val Glu Lys Ala Ser Trp Leu His Pro 195 200 205 Asp Ala Pro Val Glu Val Glu Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Asp Glu 210 215 220 Ala Leu Lys Ala Gly Ala Asp Ile Ile Met Leu Asp Asn Phe Glu Thr 225 230 235 240 Glu Gln Met Arg Glu Ala Val Lys Arg Thr Asn Gly Lys Ala Leu Leu 245 250 255 Glu Val Ser Gly Asn Val Thr Asp Lys Thr Leu Arg Glu Phe Ala Glu 260 265 270 Thr Gly Val Asp Phe Ile Ser Val Gly Ala Leu Thr Lys His Val Gln 275 280 285 Ala Leu Asp Leu Ser Met Arg Phe Arg 290 295

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 제302번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체로서, 상기 다른 아미노산은 아르기닌, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 루이신, 이소루신, 메치오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 글루타민 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 다른 아미노산은 아르기닌, 발린, 루이신, 이소루신, 메치오닌, 트립토판, 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체.
  3. 청구항 1에 있어서, 니코틴산 또는 NAD에 의한 피드백 저해에 저항성을 갖는 것인 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체.
  4. 청구항 1의 L-아스파르테이트 옥시다제 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
  5. 조절 서열과 작동가능하게 연결된 청구항 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  6. 청구항 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 미생물은 에스케리치아 속 미생물인 것인 미생물.
  8. 청구항 6에 있어서, 퀴놀리네이트 신타제의 활성이 강화된 것인 미생물.
  9. 청구항 6에 있어서, 내재적 퀴놀리네이트 포스포리보실트란스퍼라제의 활성이 감쇄된 것인 미생물.
  10. 청구항 6의 미생물을 배양하는 단계; 및
    배양물에서 퀴놀리네이트를 수득하는 단계를 포함하는 퀴놀리네이트를 생산하는 방법.
  11. 청구항 6의 미생물을 배양하는 단계; 및
    배양물에 산을 첨가하여 탈탄산 반응을 수행하는 단계;를 포함하는 니코틴산을 생산하는 방법.
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