JPH0339086A - シュードモナスｋｗｉ―４菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はリパーゼを生産するシュードモナス属の細菌に
間するものである。

（従来技術） リパーゼはトリグリセリドを基質とし、脂肪酸とグリセ
リンに加水分解する酵素である。また、反応水中の水分
含量を減少させると脂肪酸とアルコールよりエステルを
合成する反応も知られている。

現在、リパーゼの工業的利用が盛んに試みられており特
に脂肪酸生産プロセスへのリパーゼの導入が期待されて
いる。

すなわち、工業的に油脂を分解し、脂肪酸を生産させる
プロセスは、現在、高温、高圧下での化学的加水分解法
によって行われている。しかし、酵素反応を導入する事
により、常温、常圧下で・反応を進ませることができる
ため、化学的加水分解法では分解されることが多かった
不飽和脂肪酸も分解することなく得ることができるとと
もに大量のエネルギー消費を節約できる。

また、酵素反応の基質特異性を利用し、エステル交換反
応を用いて、価格の安価な油脂を原料とし、付加価値の
高い油脂に改良することも可能である。

しかし、脂肪酸生産の主な原料である牛脂、豚脂は、主
に長鎖の飽和脂肪酸より構成されており、常温では固体
である。このために油脂を融点以上の温度で反応させる
か、有機溶剤の添加により液状化したのち反応させなけ
ればならない、よって脂肪酸生産用に使用されるリパー
ゼは、耐熱性を持ち、しかも高温下で最適反応性を持つ
ものか、または、有機溶剤に対し耐性を持ち、その存在
下で反応を進められるものでなくてはならない。このよ
うなリパーゼの検索は盛んに行われてきたが、工業的レ
ベルでその需要に適した酵素は、現在まで得られていな
い。

耐熱性リパーゼという点においては、特にシュードモナ
ス属！Ｉ菌がこれらのリパーゼを生産しうろことが報告
されている。

すなわち、シュードモナスＫＷＩ−５６（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ｓｐ　　Ｋ　Ｗ　ｒ　−５６）が生産する
、作用最適温度７０〜８０℃、６０℃２４時間の熱処理
においてもほとんど失活しないリパーゼ（特願昭６２−
２６９９８５）シュードモナス・メフィティカ・バリュ
タス・リボリティ力（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｐ
ｈｉｔｃａ　ｖａｒ、　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａ）が生産
する、作用最適温度７０℃、６０℃１４時間の熱処理に
おいても失活をおこさないリパーゼ（特公昭５Ｏ−２５
５５３）　、シュードモナス・フラジ−（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ　）が生産する、作用最適温度
７５〜８０℃、７０℃２０分間の熱処理によっても９５
％以上の活性を保持するリパーゼ（Ａｇｒｉｃ、　Ｒｉ
ａｌ　ｃｈｅｒｇ、　１９７７年４１巻１３５３〜１３
５８）、シュードモナス、フルオレセンス、バイオタイ
プＩ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆ　Ｉｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｓ）が生産する、作用最適温度６７℃、６０℃２０時
間の熱処理によっても８６．９％の活性を保持するリパ
ーゼ（特開昭５７−５８８８５）などの報告が知られて
いる。

また、作用最１！ＩｐＨの点については、多くのリパー
ゼは中性付近に作用最１！ＩｐＨを有しており、アルカ
リ性領域に作用最適ｐＨを持つものとして、シュードモ
ナス・フラジ−（Ｐｓｅｕｄｏｌｗｏ　−ｎａｓ　ｆｒ
ａｇｉ　：　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｎ＋、
　１９７７年。

４１巻、１３５３〜１３５Ｂ）、アクロモバクタ−（Ａ
ｃｈｒｏｇｇｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ、　：特ＷＩ昭４８
−６８７９２）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ　ｓｐ。

：特開昭５２−２１３８７）　、フミコーラ・ラヌギノ
ーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　Ｉａｎｕｇｉｎｏｓａ　：特
開昭４８−６２９９０）　、ムコール・リボリティクス
（Ｍｕｃｏｒ　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃｕｓ　：　Ａｇｒｉ
ｃ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

１９７３年、３７巻、２７９１〜２７９６）などが知ら
れている。ｍ性領域に作用最適ｐＨをもつものとしてカ
ビの生産するリパーゼがいくつか知られているが、ｐＨ
５以下のものは知られていない。

（発明が解決しようとする問題点） 工業利用の面から見ると、リパーゼを利用する反応のｐ
Ｈは必ずしも中性とは限らず、酸性またはアルカリ性領
域に作用最１！ｉｐＨを持つリパーゼが求められている
。また、そのリパーゼが耐熱性をも有していれば、更に
有利であると言える。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、耐熱性を持つリパーゼを生産する微生物
を広く自然界より探索しに結果、神奈川県厚木市の土壌
より分離したシュードモナス属に属するＫＷＩ−４菌株
がｐＨ４およびｐＨ８に作用最適ｐＨを有するリパーゼ
を生産すること、また、それらが共に７０〜８０℃に作
用最適ｐＨを有する耐熱性リパーゼであることを見い出
した。

本発明の菌株の蘭学的性質を以下に示す。この菌学的性
質の検討には、「微生物の分類と同定Ｊ　（長谷用武治
著、学会出版センター）、「医学細菌同定の手びきＪ　
　（Ｓ、Ｔ、Ｃｏｗａｎ著、坂崎利−訳、近代出版）、
「新細菌培地学講座」（坂崎利−著、近代出版）に記載
された方法、培地組成を用いた。

ａ）形態 ■　細胞の形及び大きさ：長さ２ミクロン、幅１ミクロ
ンの桿菌 ■　細胞の双形性：単独または短連銀 ■　運動性：あり、１本の極鞭毛を持つ■　胞子：なし ■　ダラム染色：陰性 ■　抗酸性：なし ｂ）生育状態 ■　肉汁寒天平板培養：円形、とつ円状、表面は滑らか
で光沢がある。わずかに黄色を帯びた褐色。

■　肉汁寒天斜面培養：糸状、生育は普通、表面は滑ら
かで光沢がある。色素生成せず。わずかに黄色を帯びた
褐色。

■　肉汁液体培養：生育は普通、混濁、色素生成せず。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化せず。

■　リドマスミルク：変化なし。

Ｃ）生理学的性質 ■　硝酸塩の還元：陰性。

■　脱窒反応：陰性。

■　ＭＲテスト：陰性。

■　ＶＰテスト：陰性。

■　インドールの生成：陰性。

■　硫化水素の生成：陰性。

■　デンプンの加水分解：陰性。

■　クエン酸の利用：コーザーの培地；陰性。

クリステンセンの培地；陽性。

■　無機窒素源の利用：硝酸ナトリウムおよび硫酸アン
モニウムを利用する。

［相］　色素の生成：シュードモナスＦアガーシュード
モナスＰアガー（デイフコ社 製）、色素の生成はみられない。

■　ウレアーゼ：陽性。

■　オキシダーゼ：陽性。

■　タカラーゼ：陽性。

［相］　生育の範囲 ｐＨ：４．５〜８．５で生育。

温度：３７℃以下で生育。

３８℃で生育はみられない。

＠　酸素に対する態度：好気性。

＠　　０−Ｆテスト：好気的に酸を生成。

０　糖類からの酸およびガスの生成の有無。

Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ法による。

Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、
Ｄ−ガラクトース、乳糖、グリセリンからガスは発生し
ないが酸を生成する。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロー
ス、麦芽糖、ショ糖、トレハロース、Ｄ−ソルビット、
Ｄ−マンニット、イノジット、デンプンからはガスも糖
も生成しない。

［相］　ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積：陰性。

［株］　プロトカテキン酸の分解：オルト型。

［相］　グルコン酸の酸化：陽性。

２１　　アルギニンジヒドラーゼテスト：陰性。

２２　　リジン脱炭ｗＩ：陰性。

２３　　リパーゼの生産：陽性。

２４　７Ｆ２１！ｉｆ化合物の利用：　５ｔａｎｉｅｒ
らの方法による。

グルコース、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラ
ニン、イヌリン、ＤＬ−β−ヒドロキシ酪酸で生育する
が、グリシン、イタコン酸、メタコン酸アラビノース、
マルトース、ソルビトール、Ｌ−スレオニンでは生育せ
ず。

以上の菌学的性質からバーシイのマニュアル・オブ・シ
ステマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙｓ’
ｇ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　５ｙｓｔｅ＋ｗａｔｉｃ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏ。

Ｉｏｇｙ）に基づき検索した結果、シュードモナス・プ
チダ・バイオバーＢにほぼ一致した。

しかし、従来のシュードモナス・プチダ・バイオバーＢ
は、グリシンやイスリンＤＬ−β−ハイ−ドロキシブチ
レートを資化できるのに対し、本菌株はこれを資化でき
ない。

また、従来のシュードモナス・プチダ・バイオバーＢは
アルギニンジヒドラーゼテスト陽性であるのに対し本菌
株は陰性である。

さらに、既知の耐熱性リパーゼを生産するシュードモナ
ス属１１Ｍ、すなわち前記のシュードモナス・メフィテ
ィカ・バリエタス・リボリティ力、シュードモナス・フ
ラジ−、シュードモナス・フルオレセンス・バイオタイ
プｉと比較しても、少なくとも以下の菌学的性質に間し
て差異がみられる。

以上の知見より、本菌株はシュードモナス・プチダバイ
オパーＢと極めて近い分類学的間係にありながらも新菌
株であると判断し、シュードモナス・ＫＷＩ−４株と命
名した０本菌株は平成元年６月１６日に通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託した。微生物受託番
号は、微工研菌寄第１０７８４号（ＦＥＲＭＰ−１０７
８４）である。

（作用及び効果） 本菌株を用いて耐熱性リパーゼを生産することができる
。培養条件は次のとおりである。

まず培地組成であるが、本菌株はオリーブ油等の油脂が
培地中に存在する時にのみ誘導的にリパーゼを生産する
。このため、炭素源としてはオリーブ油などの油脂を用
いるか、もしくはグリセリン、各種糖類などの本菌株が
責化しろる物質に、適当な量の油脂を添加させたものを
使用すればよい。窒素源には、硫酸アンモニウム、肉エ
キス、ポリペプトン、大豆粉などが利用できる。さらに
無機塩として、カリウム、ナトリウム、リン酸、マグネ
シウム、カルシウムなどの各塩類を添加する必要がある
。

以上述べた培地組成でｐＨを７．０に調整し、３０℃に
おいて、好気的に培養をおこなえば、培ＩＩ間始後１日
〜２日間で培地中のリパーゼ生産量は最大となる。得ら
れた培養液は遠心分離によって菌体を除去した後、その
上澄液を酵素液として使用できる。また、上澄液を部分
精製の後に使用してもさしつかえない。すなわち、低温
下において上澄液に、冷却したアセトンを最終濃度８０
％（Ｖ／Ｖ）となるよう加え、その沈殿物を遠心分離な
どで回収する。さらにこの沈殿物を適当な緩衝液で溶解
し酵素液として使用すればよい。

次に菌株が生産する耐熱性リパーゼの若干の性質を以下
に述べる。なお、リパーゼ活性の測定は山田−町田法（
日本農芸化学会誌、３６゜８６０〜８６４．１９６２）
を用いた。すなわち、２％オリーブ油／ポリビニルアル
コールエマルジョンを基質として、３７℃において１分
問に１マイクロモルの脂肪酸を遊離せしめる酵素量を１
単位（以下Ｕと表示。）とした。

■作用 トリグリセリドを基質として脂肪酸とグリセリンにまで
加水分解する。

■作用最適温度。

第１図に示す様に、作用最適温度は８０℃である。

■耐熱性 第２図は酵素液を各温度下で１２時間熱処理したもので
ある。第３図は酵素液を６０℃の温度下で各時間熱処理
したものである。６０℃１２時間の熱処理で残存活性は
５８％以上、６０℃２４時間の熱処理で３６％の残存活
性を示す。

■作用最適ｐＨ 第４図に示す様に、作用最適ｐＨは８であるが、ｐＨ４
にもピークが見られる。

次に実施例によって本発明の詳細な説明する。

（実施例） 肉エキス１％（Ｗ／Ｗ）、ポリペプトン１％（Ｗ／Ｗ）
、塩化ナトリウム０．５％（Ｗ／Ｗ）、オリーブ油１％
（Ｗ／Ｗ）よりなる液体培地を水酸化ナトリウム水溶液
を用いてｐＨ７，０に調節し、その５０１１Ｉｌを５０
０１１Ｉ容の坂ロフラスコに加え、オートクレーブによ
って加圧滅菌した。この培地にシュードモナスＫＷＩ−
４株を植菌し、ロータリーシューカーを用いて３０℃毎
分１５０回転の条件下で５０ＦＲ間の振盪培養をおこな
った。培養終了後の培養液のリパーゼ活性は１８．４Ｕ
／−であった。さらに、この培！Ｉ液から遠心分離によ
って菌体を除去しその上澄液を得た。上澄液のリパーゼ
活性は８．　　ＩＵ／−であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はシュードモナスＫＷＩ−４株が生産するリパー
ゼの作用最適温度を示す図である。 各温度条件で２０分間の活性測定反応をおこなった。第
２図は同リパーゼの耐熱性を示す図である。酵素液を各
温度で１２時間熱処理し、残存活性を求めた。第３図も
同リパーゼの耐熱性を示す図である。酵素液を６０℃の
温度下で各時間熱処理し、残存活性を求めた。第４図は
同リパーゼの作用最適ＰＨを示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し、
   かつリパーゼ生産能を有するシュードモナスＫＷＩ−４
   菌株。