CN113322192A - 一种黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂及其制备方法和应用，所述黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂的生产菌株为黄精内生糙刺篮状菌(Talaromyces sp.)HJF 23，该菌株已于2021年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCCNO：M2021344。利用本发明生产的抗大肠杆菌剂对大肠杆菌具有较好的防治效果，可用于大肠杆菌的生物防治。本发明具有原料成本低，生产工艺简单，防治效果好的优点，具有潜在和实际的应用前景。

Description

一种黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于应用微生物学技术领域，具体涉及一种黄精内生真菌抗大肠杆菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
植物内生真菌是一类普遍寄生在健康植物的组织器官内和细胞间隙中、但不会对植物组织形成病害的微生物。在和植物共生的环境中，内生真菌一方面从植物寄主中吸收供自己发育所需的营养物质，另一方面在其生长代谢过程中会产生一系列具有生物活性的次生代谢产物来促进植物寄主的生长，以及帮助植物提高抵抗病原细菌和病毒浸染的能力。植物内生真菌次生代谢产物具有化学结构复杂且生物活性独特的特点，能产生萜类、聚酮类、生物碱类、杂萜类、酯类、甾醇类、肽类等化学结构类型的次生代谢产物，且这些产物具有抑菌、抗病毒、细胞毒、酶抑制和抗炎等多种生物活性，因此，植物内生真菌是当今开发新型抗菌、抗病毒和抗肿瘤生防制剂的重要微生物资源。
发明内容
本发明的目的是通过对筛选得到的一株具有抗大肠杆菌活性的黄精内生糙刺篮状菌(Talaromyces sp.)HJF 23菌进行研究，开发一种微生物抗大肠杆菌剂。本发明还提供这种微生物抗大肠杆菌剂的制备方法及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂，所述黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂的生产菌株为黄精内生糙刺篮状菌(Talaromyces sp.)HJF 23，该菌株已于2021年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2021344。
本发明所述黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂的制备方法如下：
(1)试管种培养：将菌株HJF 23接种到试管固体培养基斜面上，于28℃下培养7天，获得试管种；所述固体培养基为PDA培养基，培养基制备方法是马铃薯200g去皮后切块，加水1000ml煮沸20分钟后过滤，得到的滤液中加入葡萄糖20g，琼脂20g，加水定容至1000ml，121℃灭菌40分钟；
(2)液体种子培养：先配制液体种子培养基，液体种子培养基为PDB培养基，PDB培养基制备方法是：马铃薯200g去皮后切块，加水1000ml煮沸20分钟后过滤，得到的滤液中加入葡萄糖20g，加水定容至1000ml，在每个500ml三角瓶中装入100ml液体种子培养基，121℃灭菌40分钟，冷却后接入1cm2大的试管种，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养3天得到种子液；
(3)制备微生物抗大肠杆菌剂：先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基为PDB培养基，PDB培养基制备方法同步骤(2)；在每个1000ml三角瓶中装入200ml液体发酵培养基，121℃灭菌40分钟，冷却后接入20ml步骤(2)得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养9天得菌株发酵液；在菌株发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡6小时后滤去菌丝体，蒸去发酵液中的乙醇得到菌株发酵提取物，将发酵提取物用水稀释到原发酵液体积，即成为所述微生物抗大肠杆菌剂。
本发明所述的黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂应用于抑制大肠杆菌。
本发明提供了一种黄精内生糙刺篮状菌HJF 23以及利用该菌株制备的微生物抗大肠杆菌剂，并将其应用于对大肠杆菌的抑制。利用本发明生产的抗大肠杆菌剂对大肠杆菌具有较好的抑制活性，可用于大肠杆菌的生物防治。平板抑菌试验结果表明，用本发明方法制备得到的菌株HJF 23抗大肠杆菌剂对大肠杆菌的抑菌圈直径平均为16.0mm。平板抑菌试验表明该制剂对大肠杆菌具有较强的抑制效果。
本发明具有原料成本低，生产工艺简单的优点，在医药领域中具有潜在和实际的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1.糙刺篮状菌HJF 23(Talaromyces sp.HJF 23)的鉴定
筛选得到一株黄精内生真菌，采用常规CTAB法提取菌株的DNA，采用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增ITS序列，PCR产物送由北京擎科(昆明)新业生物科技有限公司进行测序，将测序得到的DNA序列在NCBI数据库中进行BLAST搜索比对，菌株的ITS序列与篮状菌有效发表种Talaromyces pinophilus(CBS:631.66、ATCC:36839、CECT:2809)相似性为100％，因此，将菌株命名为糙刺篮状菌HJF 23(Talaromyces sp.HJF 23)。
实施例2.微生物抗大肠杆菌剂
采用实施例1所述的黄精内生糙刺篮状菌(Talaromyces sp.)HJF 23菌进行研究，开发一种微生物抗大肠杆菌剂，该微生物抗大肠杆菌剂的生产菌株为黄精内生糙刺篮状菌(Talaromyces sp.)HJF 23，该菌株已于2021年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2021344。该菌株已于2021年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2021344。
实施例3.黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂的制备
黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂的制备方法如下：
1、试管种培养
将菌株HJF 23接种到试管固体培养基斜面上，于28℃下培养7天，获得试管种。固体培养基为常用的PDA培养基，PDA培养基的制备方法是马铃薯200g去皮后切成小块，加水1000ml煮沸20分钟后过滤，得到的滤液中加入葡萄糖20g，琼脂20g，加水定容至1000ml，121℃灭菌40分钟。
2、液体种子培养
采用500ml三角瓶摇瓶培养液体种子，方法是先配制液体种子培养基，液体种子培养基为常用的PDB培养基，PDB培养基制备方法是：马铃薯200g去皮后切成小块，加水1000ml煮沸20分钟后过滤，得到的滤液中加入葡萄糖20g，加水定容至1000ml，在每个三角瓶中装入100ml液体种子培养基，121℃灭菌40分钟。冷却后接入1cm2大的试管种，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养3天得到种子液。
3、制备微生物抗大肠杆菌剂
采用1000ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基为常用的PDB培养基，PDB培养基制备方法同上述步骤2的方法，在每个三角瓶中装入200ml液体发酵培养基，121℃灭菌40分钟，冷却后接入20ml上述步骤2制备得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养9天得菌株发酵液。在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡6小时后滤去菌丝体，蒸去发酵液中的乙醇得到菌株发酵提取物，将发酵提取物用水稀释到原发酵液体积，即成为可供使用的抗大肠杆菌剂。
实施例4.平板抑菌试验
1、制备试验用黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂
本发明的微生物抗大肠杆菌剂，由糙刺篮状菌HJF 23(Talaromyces sp.HJF 23)菌株通过液体发酵方法制备。具体制备过程及条件与实施例3相同。
2、大肠杆菌的培养
将大肠杆菌接种到试管斜面培养基上25℃下培养5天，待菌体生长好备用。培养基为常规ISP2培养基，其配方为：酵母粉4g；葡萄糖4g；麦芽膏10g；水1000ml，在该培养基中加入琼脂粉15g，121℃灭菌40分钟。
3、平板抑菌试验方法
将培养好的大肠杆菌取0.5cm2大的试管种斜面与20ml ISP2培养基混合均匀，倒入内径为9cm的已灭菌培养皿中制成带菌平板，平板抑菌实验采用常规的杯碟法，即在每个带菌平板上放置牛津杯，在牛津杯内加入制备好的抗大肠杆菌剂0.2ml，以无菌清水为空白对照，每处理3个重复，置25℃恒温箱中培养24小时后，用十字交叉法测量抑菌圈直径。结果见表1。
表1.黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂对大肠杆菌的抑菌结果
Figure BDA0003165135040000041
Figure BDA0003165135040000051
实验结果表明：菌株HJF 23抗大肠杆菌剂对大肠杆菌的抑菌圈直径平均为16.0mm。

Claims (3)

1.一种黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂，其特征在于，所述黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂的生产菌株为黄精内生糙刺篮状菌(Talaromyces sp.)HJF 23，该菌株已于2021年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2021344。
2.权利要求1所述黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂的制备方法，其特征在于，方法如下：
(1)试管种培养：将菌株HJF 23接种到试管固体培养基斜面上，于28℃下培养7天，获得试管种；所述固体培养基为PDA培养基，培养基制备方法是马铃薯200g去皮后切块，加水1000ml煮沸20分钟后过滤，得到的滤液中加入葡萄糖20g，琼脂20g，加水定容至1000ml，121℃灭菌40分钟；
(2)液体种子培养：先配制液体种子培养基，液体种子培养基为PDB培养基，PDB培养基制备方法是：马铃薯200g去皮后切块，加水1000ml煮沸20分钟后过滤，得到的滤液中加入葡萄糖20g，加水定容至1000ml，在每个500ml三角瓶中装入100ml液体种子培养基，121℃灭菌40分钟，冷却后接入1cm2大的试管种，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养3天得到种子液；
(3)制备微生物抗大肠杆菌剂：先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基为PDB培养基，PDB培养基制备方法同步骤(2)；在每个1000ml三角瓶中装入200ml液体发酵培养基，121℃灭菌40分钟，冷却后接入20ml步骤(2)得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养9天得菌株发酵液；在菌株发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡6小时后滤去菌丝体，蒸去发酵液中的乙醇得到菌株发酵提取物，将发酵提取物用水稀释到原发酵液体积，即成为所述微生物抗大肠杆菌剂。
3.权利要求1或2所述黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂应用于抑制大肠杆菌。
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