CN110885776B - 一种纤维素链霉菌发酵提取物及其应用 - Google Patents

一种纤维素链霉菌发酵提取物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种纤维素链霉菌发酵提取物及其应用，将保藏号为CCTCC NO：M2017188的纤维素链霉菌YIM PH20352（Streptomyces cellulosae YIM PH20352）菌株，通过1）培养菌株试管种、2）培养菌株液体种子、3）菌株发酵并提取浓缩后获得菌株发酵提取物，该发酵提取物对三七根腐病病原真菌具有较好的离体抑制活性，可应用于制备抗三七根腐病剂。

Description

一种纤维素链霉菌发酵提取物及其应用
技术领域
本发明涉及一种纤维素链霉菌YIM PH20352发酵提取物及其应用，属于微生物农药技术领域。
背景技术
三七（Panax notoginseng）是我国传统名贵中药材，其喜好在温暖阴湿环境生长的特性，非常容易诱发各种土传微生物病害，根腐病是导致三七连作障碍的重要因素之一。目前主要依赖代森锰锌、多抗霉素等杀真菌农药对三七根腐病进行防治，但长期施用化学农药易导致病害产生抗药性及农田微生态平衡被破坏，且农药的大量使用所带来的重金属污染和农药残留严重地影响着三七的品质和药用价值，严重制约着三七种植业的发展。生物防治以其无污染，无残留，无生态毒性和安全性好等优点在植物病害的防治中起着主导作用，近年来人们通过利用拮抗三七根腐病的有益微生物进行三七根腐病害的生物防治，为三七根腐病的防治提供了一条重要而有效的途径。本发明筛选得到一株对三七根腐病病原真菌有较好抑制活性的纤维素链霉菌菌株，其发酵产物在三七根腐病的生物防治中具有潜在和实际的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纤维素链霉菌YIM PH20352发酵提取物及其应用。
本发明是这样实现的：
发明人在前期研究中，筛选得到一株对三七根腐病病原真菌具有较好抑制活性的纤维素链霉菌YIM PH20352（Streptomyces cellulosae YIM PH20352），该菌株已于2017年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2017188。
本发明的纤维素链霉菌YIM PH20352发酵提取物经过如下步骤得到：
（1）试管种培养：将保藏号为CCTCC NO：M2017188的纤维素链霉菌YIM PH20352（Streptomyces cellulosae YIM PH20352）菌株接种到试管固体培养基的斜面上，于28°C的温度下培养6天，获得菌株试管种。
其中，固体培养基配方为：酵母粉4.0 g；葡萄糖4.0 g；麦芽膏5.0 g；复合维生素3.5 mg；琼脂粉12.0 g；水1000 mL；pH 7.2。
（2）培养液体种子：采用500 mL三角瓶摇瓶培养，先配制液体种子培养基，在每个三角瓶中装入100 mL液体培养基，于120°C的温度下灭菌30分钟，冷却后接入1cm2大的菌株试管种，于28°C的温度下于转速为220 rpm的摇床上培养3天，获得液体种子。
其中，液体种子培养基配方为酵母粉4.0 g；葡萄糖4.0 g；麦芽膏5.0 g；复合维生素3.5 mg；水1000 mL；pH 7.2。
（3）制备菌株发酵提取物：采用1000 mL三角瓶摇瓶培养，先配制液体发酵培养基，在每个三角瓶中装入200mL液体发酵培养基，于120°C的温度下灭菌30分钟，冷却后接入20mL上述方法（2）中获得的液体种子，在28°C的温度下于转速为220 rpm的摇床上培养6天后获得菌株发酵液，在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡6小时后滤去菌丝体并蒸去上清液中的乙醇，即得到菌株发酵提取物。
其中，液体发酵培养基配方为：葡萄糖20.0 g，淀粉5.0 g，蛋白胨2.0 g，酵母膏2.0 g，NaCl 4.0 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，CaCO3 2.0 g，水1000 mL；pH 7.0。
本发明的纤维素链霉菌YIM PH20352发酵提取物在制备抗三七根腐病剂中的应用。
本发明提供了一种纤维素链霉菌YIM PH20352发酵提取物及其在制备抗三七根腐病剂中的应用，室内毒力测定试验结果表明：利用本发明制备的菌株发酵提取物对三七根腐病病原真菌具有较好的离体抑制活性，可用于三七根腐病的防治。本发明具有高效、低毒，易重复生产，绿色环保的优点，在生物防治中具有潜在和实际的应用价值。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：纤维素链霉菌YIM PH20352发酵提取物的制备
本发明使用的菌株是纤维素链霉菌YIM PH20352(Streptomyces cellulosae YIMPH20352)，该菌株已于2017年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2017188。
本发明的纤维素链霉菌YIM PH20352发酵提取物经过如下步骤得到：
（1）试管种培养：将保藏号为CCTCC NO：M2017188的纤维素链霉菌YIM PH20352（Streptomyces cellulosae YIM PH20352）菌株接种到试管固体培养基的斜面上，于28°C的温度下培养6天，获得菌株试管种。
其中，固体培养基配方为：酵母粉4.0 g；葡萄糖4.0 g；麦芽膏5.0 g；复合维生素3.5 mg；琼脂粉12.0 g；水1000 mL；pH 7.2。
（2）培养液体种子：采用500 mL三角瓶摇瓶培养，先配制液体种子培养基，在每个三角瓶中装入100 mL液体培养基，在120°C的温度下灭菌30分钟，冷却后接入1cm2大的菌株试管种，于28°C的温度下于转速为220 rpm的摇床上培养3天，获得液体种子。
其中，液体种子培养基配方为酵母粉4.0 g；葡萄糖4.0 g；麦芽膏5.0 g；复合维生素3.5 mg；水1000 mL；pH 7.2。
（3）制备菌株发酵提取物：采用1000 mL三角瓶摇瓶培养，先配制液体发酵培养基，在每个三角瓶中装入200mL液体发酵培养基，于120°C的温度下灭菌30分钟，冷却后接入20mL上述方法（2）中获得的液体种子，在28℃的温度下于转速为220 rpm的摇床上培养6天后获得菌株发酵液，在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡6小时后滤去菌丝体并蒸去上清液中的乙醇，即得到菌株发酵提取物。
其中，液体发酵培养基配方为：葡萄糖20.0 g，淀粉5.0 g，蛋白胨2.0 g，酵母膏2.0 g，NaCl 4.0 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，CaCO3 2.0 g，水1000 mL；pH 7.0。
实施例2：纤维素链霉菌YIM PH20352发酵提取物在制备抗三七根腐病剂中的应用
采用室内毒力测定（抑制孢子萌发法、平板抑菌试验法）试验，测定上述方法制备得到的纤维素链霉菌YIM PH20352发酵提取物抗三七根腐病病原真菌活性。
A. 抑制孢子萌发法试验
1、制备试验用抗三七根腐病剂：将上述方法获得的纤维素链霉菌YIM PH20352发酵提取物用清水稀释到原发酵液浓度，即为试验用抗三七根腐病剂。
2、制备三七根腐病病原真菌孢子悬浮液：将三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌分别接种到试管固体培养基斜面上，于25℃的温度下培养6－8天，培养基配方为常用的PDA培养基，方法是取马铃薯200 g去皮后切成小块，加水1000 ml煮沸20分钟，过滤后得到1000 ml滤液，然后加入葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g，pH自然，待菌丝长满培养基后用自来水洗去气生菌丝，在400 nm日光灯照射下培养产孢，2－3天后用蒸馏水洗下孢子，并加入1%磷酸二氢钾和葡萄糖混合溶液配制成浓度为在10×10低倍显微镜下，每个视野30－40个孢子的病原真菌孢子悬浮液备用。
3、抑制孢子萌发试验方法：将抗三七根腐病剂供试样品与配制好的三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌孢子悬浮液分别等体积混合，取一滴滴加在凹玻片上，每处理3个重复，同时设清水为空白对照。在25℃下保湿培养24小时后察看空白对照孢子的萌发情况，以芽管长度超过分生孢子小端直径一半时为萌发。当空白对照孢子的萌发率达到95%后，察看抗三七根腐病剂供试样品对病原真菌孢子萌发的抑制情况。
按以下公式计算孢子萌发抑制率：
孢子萌发抑制率（%）=（对照孢子萌发率－处理孢子萌发率）/（对照孢子萌发率）×100
实验结果表明，菌株YIM PH20352抗三七根腐病剂供试样品对尖孢镰刀菌孢子的萌发抑制率为100%，对腐皮镰刀菌孢子萌发的抑制率为95%。
B. 平板抑菌试验
试验用抗三七根腐病剂的制备方法同抑制孢子萌发法试验中的方法。
平板抑菌试验：将培养好的三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌及腐皮镰刀菌分别取0.5cm2大的试管种斜面与10 ml PDA培养基（制法同抑制孢子萌发法试验中的方法）混合均匀，倒入内径为9 cm的已灭菌培养皿中制成带菌平板，平板抑菌实验采用常规的杯碟法，即在每个带菌平板上放置牛津杯，在牛津杯内加入制备好的抗三七根腐病剂0.2 ml，以无菌水为空白对照，每处理3个重复，置25°C恒温箱中培养48小时后，用十字交叉法测量抑菌圈直径。
表1. 菌株YIM PH20352抗三七根腐病剂对病原真菌的抑菌结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
平板抑菌试验结果表明：菌株YIM PH20352抗三七根腐病剂对三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌的抑菌圈直径分别平均为17.6mm、9.8mm（各为3次重复）。
以上室内毒力测定试验表明：菌株YIM PH20352抗三七根腐病剂对三七根腐病病原真菌具有较好的离体抑制活性。

Claims (2)

1.一种纤维素链霉菌YIM PH20352发酵提取物，其特征在于，该纤维素链霉菌YIMPH20352发酵提取物经过如下步骤得到：
（1）试管种培养：将保藏号为CCTCC NO：M2017188的纤维素链霉菌YIM PH20352（Streptomycescellulosae YIM PH20352）菌株接种到试管固体培养基的斜面上，于28℃下培养6天，获得菌株试管种；
其中，固体培养基配方为：酵母粉4.0 g；葡萄糖4.0 g；麦芽膏5.0 g；复合维生素3.5mg；琼脂粉12.0 g；水1000 mL；pH 7.2；
（2）培养液体种子：采用500 mL三角瓶摇瓶培养，先配制液体种子培养基，在每个三角瓶中装入100 mL液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2大的菌株试管种，于28℃的温度下于转速为220 rpm的摇床上培养3天，获得液体种子；
其中，液体种子培养基配方为酵母粉4.0 g；葡萄糖4.0 g；麦芽膏5.0 g；复合维生素3.5 mg；水1000 mL；pH 7.2；
（3）制备菌株发酵提取物：采用1000 mL三角瓶摇瓶培养，先配制液体发酵培养基，在每个三角瓶中装入200mL液体发酵培养基，于120℃的温度下灭菌30分钟，冷却后接入20 mL上述步骤（2）中获得的液体种子，在28℃的温度下于转速为220 rpm的摇床上培养6天后获得菌株发酵液，在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡6小时后滤去菌丝体并蒸去上清液中的乙醇，即得到菌株发酵提取物；
其中，液体发酵培养基配方为：葡萄糖20.0 g，淀粉5.0 g，蛋白胨2.0 g，酵母膏2.0 g，NaCl 4.0 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，CaCO3 2.0 g，水1000 mL；pH 7.0。
2.权利要求1所述的纤维素链霉菌YIM PH20352发酵提取物在制备抗三七根腐病剂中的应用。
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