CN108611283B - 一种获得嗜热属真菌阳性转化子的方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种获得嗜热属(Thermomyces)真菌阳性转化子的方法，其包括如下步骤：1)制备嗜热属真菌的原生质体溶液；2)将所述原生质体溶液与同源重组片段混合，得到第一混合物；3)将所述第一混合物进行第一次冰浴，然后加PTC转化液，培养，然后再进行第二次冰浴，得到第二混合物；4)将所述第二混合物涂布在固体培养基上培养，得到至少一个待鉴定的转化子；5)将所述至少一个待鉴定的转化子进行传代培养，获得传代培养产物，并对所述传代培养产物进行DNA水平上的鉴定，以筛选出所述嗜热属真菌的阳性转化子。

Description

一种获得嗜热属真菌阳性转化子的方法

技术领域

本申请提供了一种获得嗜热属真菌阳性转化子的方法。

背景技术

嗜热属(Thermomyces)真菌是一群适宜在40℃至50℃温度下生长的真菌类群，其最低生长温度为20℃，最高生长温度可达60℃。目前国内外围绕嗜热真菌研究较多集中在其产生的热稳定性木聚糖酶、热稳定性几丁质酶和脂肪酶等，而真菌作为产生新型活性化合物的重要资源，生长在极端环境中的真菌代表嗜热真菌中的次生代谢产物的相关研究却极少。2012年，郭继鹏等人从嗜热杜邦菌(Thermomyces dupontii)NRRL 2155中分离得到六个新骨架PKS-NRPS杂合生源十三元大环内酯类化合物Thermolides A-F，而且其中两个化合物表现出极强的毒杀线虫作用，与杀线虫生物农药阿维菌素相当，具有毒杀线虫药物开发前景。

虽然真菌具有产生新型活性化合物的巨大潜力。然而，由于嗜热属真菌的遗传转化一直以来是本领域的一项技术难题，目前尚未有采用原生质体转化法应用于嗜热真菌生物合成基因研究的报道。受遗传操作、培养条件、检测手段等限制，使目标化合物的发掘、生物合成途径的深入研究、进行理性设计和定向合成变得较为困难。真菌遗传转化技术的建立和应用将对其次生代谢产物的研究与开发提供重要支持。

因此，建立一种简单、高效、稳定的遗传转化方法将对嗜热属真菌的分子生物学研究，如重要生物合成基因、次生代谢产物的研究与开发提供重要基础。

发明内容

本申请提供了一种获得嗜热属(Thermomyces)真菌阳性转化子的方法，其包括如下步骤：

1)制备嗜热属真菌的原生质体溶液；

2)将所述原生质体溶液与同源重组片段混合，得到第一混合物；

3)将所述第一混合物进行第一次冰浴，然后加PTC转化液，培养，然后再进行第二次冰浴，得到第二混合物；

4)将所述第二混合物涂布在原生质体再生固体培养基上培养，得到至少一个待鉴定的转化子；

5)将所述至少一个待鉴定的转化子在用于菌丝生长的培养基(例如富营养培养基)上进行传代培养，获得传代培养产物，并对所述传代培养产物进行DNA水平上的鉴定，以筛选出所述嗜热属真菌的阳性转化子。

在一个具体实施方式中，嗜热属真菌为嗜热杜邦菌(Thermomyces dupontii)和/或嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)。

在一个具体实施方式中，嗜热属真菌为嗜热杜邦菌(Thermomyces dupontii)NRRL2155和/或嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)ATCC 200065。

在一个具体实施方式中，所述同源重组片段中含有报告基因表达盒，并且在此情况下，在步骤4)中，将所述第二混合物涂布在原生质体再生固体培养基上培养15至20h后，在所述原生质体再生固体培养基上覆盖一层含有所述报告基因选择压的所述原生质体再生固体培养基，继续培养，得到至少一个待鉴定的转化子；在步骤5)中，将所述至少一个待鉴定的转化子在含有所述报告基因选择压的用于菌丝生长的培养基(例如富营养培养基)上进行传代培养，获得传代培养产物，并对所述传代培养产物进行DNA水平上的鉴定，以筛选出所述嗜热属真菌的阳性转化子。

在一个具体实施方式中，所述同源重组片段中含有潮霉素抗性基因表达盒，并且在此情况下，在步骤4)中，将所述第二混合物涂布在原生质体再生固体培养基上培养15至20h后，在所述原生质体再生固体培养基上覆盖一层含有潮霉素的所述原生质体再生固体培养基，继续培养，得到至少一个待鉴定的转化子；在步骤5)中，将所述至少一个待鉴定的转化子在含有潮霉素的用于菌丝生长的培养基(例如富营养培养基)上进行传代培养，获得传代培养产物，并对所述传代培养产物进行DNA水平上的鉴定，以筛选出所述嗜热属真菌的阳性转化子。

在一个具体实施方式中，在所述步骤2)中，原生质体的浓度为1×10⁷个/mL至1×10⁹个/mL。

在一个具体实施方式中，所述原生质体溶液的制备方法包括以下步骤：

1-1)将所述嗜热属真菌接种于用于菌丝生长的固体培养基(例如PDA培养基或TYGA培养基)上，培养6至8天，获得5×10⁷个/mL至5×10⁸个/mL的孢子悬浮液(例如其可以是孢子水悬浮液，还可以是含有0.05％吐温20的生理盐水孢子悬浮液)；

1-2)以0.5‰至10‰的量将所述孢子悬浮液接种至YPS液体培养基中，在180rpm至200rpm下震荡培养18h至24h，获得菌丝培养物；

1-3)将所述菌丝培养物过滤后，收集菌丝体；

1-4)将所述菌丝体用P缓冲液洗涤至少一次；

1-5)将所述菌丝体置于酵母破壁酶渗透液中，得到酶解体系，所述酶解体系在28℃至30℃以及80rpm至100rpm的条件下酶解5h至5.5h，得到裂解产物；其中，酵母破壁酶渗透液中含有酵母破壁酶、N缓冲液和P缓冲液，且N缓冲液和P缓冲液的体积比为(2.5-3.5)：(16.5-17.5)；在所述酶解体系中的菌丝体的浓度为75mg/mL至125mg/mL，在所述酶解体系中的酵母破壁酶的浓度为15mg/mL至20mg/mL；

1-6)将所述裂解产物过滤，收集形成的原生质体并用酶终止液终止酶解反应，得到裂解物溶液；

1-7)将所述裂解物溶液在4℃至6℃以及4000rpm至6000rpm下离心8min至10min，弃去第一上清液，之后用STC溶液悬浮第一离心沉淀物，得到第一STC悬浮液；将所述第一STC悬浮液再在4℃至6℃以及4000rpm至6000rpm下离心8min至10min，弃去第二上清液，再次用STC溶液悬浮第二离心沉淀物，得到第二STC悬浮液；将所述第二STC悬浮液在4℃至6℃以及4000rpm至6000rpm下离心8min至10min，弃去第三上清液之后，用STC溶液将第三离心沉淀物调至终浓度为5×10⁷个/mL至5×10⁸个/mL的原生质体溶液。

在一个具体实施方式中，在所述步骤2)中，每200μL的所述原生质体溶液使用所述同源重组片段的量为9μg至15μg。

在一个具体实施方式中，在所述步骤3)中，培养的时间为30min至60min。

在一个具体实施方式中，在所述步骤3)中，第一次冰浴的时间为30min至50min；第二次冰浴的时间为8min至10min。

在一个具体实施方式中，在所述步骤4)中，所述固体培养基为TB3固体培养基；和/或在所述步骤5)中，进行传代培养的培养基为TYGA培养基。

在一个具体实施方式中，在所述步骤3)、4)、5)、1-1)和1-2)中，培养温度各自独立地为42℃至48℃，优选地，在所述步骤3)、4)、5)、1-1)和1-2)中，培养温度各自独立地为44℃至46℃。

在一个具体实施方式中，获得嗜热属真菌阳性转化子的方法步骤在无菌条件下操作完成。

在一个具体实施方式中，获得嗜热属真菌阳性转化子包括如下步骤：在无菌条件下，

1-1)将所述嗜热属真菌接种于PDA固体培养基上，在44℃至46℃下培养7天至8天，用含有0.05％的吐温20的水将培养物刮净，然后用四层至六层的擦镜纸过滤，富集并洗涤至少两次(可以用水或含有0.05％吐温20的生理盐水洗涤)，获得1×10⁸个/mL的孢子悬浮液；

1-2)以1‰的量将所述孢子悬浮液接种至YPS液体培养基中，在44℃至46℃以及180rpm的条件下震荡培养20h至24h，获得菌丝培养物；

1-3)将所述菌丝培养物用四层至六层擦镜纸(例如内含四层擦镜纸的漏斗)过滤后，收集菌丝体；

1-4)将所述菌丝体用P缓冲液洗涤两次；

1-5)将所述菌丝体置于酵母破壁酶渗透液中，得到酶解体系，所述酶解体系在28℃至30℃以及80rpm至100rpm的条件下酶解5h至5.5h，得到裂解产物；其中，酵母破壁酶渗透液中含有酵母破壁酶、N缓冲液和P缓冲液，N缓冲液和P缓冲液的体积比为3：17；在所述酶解体系中的菌丝体的浓度为100mg/mL，在所述酶解体系中的酵母破壁酶的浓度为15mg/mL；

1-6)将所述裂解产物用六至八层擦镜纸(例如内含六层擦镜纸的漏斗)过滤，收集形成的原生质体并用酶终止液(例如0.6M的KCl)终止酶解反应，得到裂解物溶液；优选所述裂解产物与所述酶终止液的体积比约为1：1；

1-7)将所述裂解物溶液在4℃以及5000rpm下离心10min，弃去第一上清液，之后用STC溶液富集第一离心沉淀物，得到第一STC悬浮液；将所述第一STC悬浮液在4℃以及5000rpm下离心10min，弃去第二上清液，再次用STC溶液悬浮第二离心沉淀物，得到第二STC悬浮液；将所述第二STC悬浮液在4℃以及5000rpm下离心10min，弃去第三上清液之后，用STC溶液将第三离心沉淀物调至终浓度为5×10⁷个/mL至5×10⁸个/mL的原生质体溶液；

2)将所述原生质体溶液与含有潮霉素表达盒的同源重组片段混合，得到第一混合物；

3)将所述第一混合物进行第一次冰浴，然后加PTC转化液，培养，然后再进行第二次冰浴，得到第二混合物；

4)将所述第二混合物涂布在TB3固体培养基上于44℃至46℃下培养16h至18h后，再在涂布有所述第二混合物的TB3固体培养基上覆盖一层含有潮霉素B的TB3培养基，继续于44℃至46℃下培养5至7天，得到至少一个待鉴定的转化子；

5)将所述至少一个待鉴定的转化子在含有潮霉素B的TYGA固体培养基进行传代培养，获得传代培养产物，对所述传代培养产物进行基因组的提取，然后以所述基因组为模板进行PCR鉴定，以筛选出所述嗜热属真菌的阳性转化子。

在本申请中，术语“同源重组片段”为含有与靶基因组中序列一致性的上游同源臂序列和下游同源臂序列的线性的非质粒片段。

本申请的有益效果：

本申请首次建立了高转化效率嗜热属真菌的原生质体转化方法，利用本申请的方法进行同源重组，转化子的同源重组率可到达20.5％，从而为嗜热属真菌中的目标化合物的发掘、生物合成途径的深入研究、进行理性设计和定向合成(如重要生物合成基因、次生代谢产物的研究与开发)奠定基础。并且，该方法有利于嗜热属真菌相关研究的规模化以及高通量筛选工作的展开。

特别需要指出的是，在本申请前，发明人使用其他方法虽然也能获得转化子，但是同源重组率都无一例外地低下，只有不到0.5％(数据未展示)。为了提高同源重组率，发明人不断的探索，但长久以来未能找到限制同源重组效率低的真正原因，因此在很长一段时间中，嗜热属真菌的同源重组效率一直处于低水平，严重限制了相关的分子生物学的研究。然而功夫不负有心人，在历时5年后，首次发现原生质体的浓度是制约转化效率的一个非常关键的因素，通过使用高浓度的原生体溶液，可以大大改善转化效率。而对于现有技术来讲，如何获得高活力且高浓度的原生质体是一个技术挑战，因为众所周知，在酶解后收集原生质体的过程中，由于原生质体为去除了细胞壁的细胞，因此其十分脆弱，通常认为在较高的离心力下会导致原生质之间相互压迫，从而导致活力不佳，甚至是死亡，因此导致在传统制备真菌原生质体的方法中，裂解物溶液的离心转速一般在3000rpm，并且即使在需要富集的情况下，离心的次数也一般仅为两次。但因此也带来了一个问题，就是如此以来获得的原生质体浓度数量级一般仅为10⁶个/mL，即使如本申请多次离心，例如离心三次(离心更多次，会导致原生质体的活力下降)，在3000rpm的离心转速下获得的原生质体的浓度最高也仅为10⁷个/mL，因而难以获得更高浓度的原生质体，更不用说获得兼具高浓度和高活力的原生质体了。而发明人突破了现有技术的偏见，大胆尝试改变离心转速这一限制因素，将离心转速提高到4000rpm至6000rpm，获得了不但具有高活力且具有高浓度原生质体。此外，发明人还发现菌丝体的酶解体系中的酶浓度和酶解时间也同样制约着嗜热属真菌的原生质的活力和产量，通过几个条件的配合，克服了相应的技术难题。并且发明人还意外地发现，在转化过程中，将线性的同源重组片段代替质粒载体，有利于同源重组率的提高，可高达20.45％，而在相同品质的原生质体下，使用质粒载体转化时，同源重组率只有4.76％，这虽然与使用现有技术方法制备得到的原生质体得到的同源重组率0.5％相比有了飞跃式的提高，但是与本申请的方法相比，仍然有着巨大的差距。因此，本申请建立了一种简单、高效、稳定的遗传转化方法，其特别对嗜热属真菌的分子生物学研究，如重要生物合成基因、次生代谢产物的研究与开发提供重要基础。

附图说明

图1为实施例1提供的嗜热杜邦菌NRRL 2155中Talth1_006666_t1中的关键功能域KS基因敲除原理示意图。

图2为实施例2提供的嗜热杜邦菌NRRL 2155中Talth1_002859_t1中的关键功能域KS基因敲除原理示意图。

图3为敲除嗜热杜邦菌NRRL 2155中Talth1_002859_t1中的关键功能域KS基因敲除菌株PCR电泳验证结果。转化元件为敲除片段。转化元件为含有潮霉素表达盒的敲除片段。“M”为5kb DNA marker，“C”为阳性对照(以敲除质粒为模板的PCR扩增结果)，“WT”为阴性对照(以野生型基因组为模板的PCR扩增结果)；3、12、15、22、25、30、36、39、43为阳性转化子的PCR扩增结果，其余为阴性转化子的PCR扩增结果。

图4为敲除嗜热杜邦菌NRRL 2155中Talth1_006666_t1中的关键功能域KS基因敲除菌株PCR电泳验证结果。转化元件为含有潮霉素表达盒的敲除片段。其中，泳道13、15、16为阳性转化子的PCR扩增结果，泳道21为Marker-5000bp，泳道22为阳性对照(以敲除质粒pPK2KOKS31为模板的PCR扩增结果)敲除质粒扩增结果，泳道1为阴性对照(以野生型基因组为模板的PCR扩增结果)，其余为阴性转化子的PCR扩增结果。

图5为敲除嗜热杜邦菌NRRL 2155中Talth1_002859_t1中的关键功能域KS基因敲除菌株PCR电泳验证结果。转化元件为敲除质粒PK2KOKS12。“M”为5kb DNA marker，“C”为阳性对照(以敲除质粒为模板的PCR扩增结果)，“WT”为阴性对照(以野生型基因组为模板的PCR扩增结果)，2为阳性转化子的PCR扩增结果，其余为阴性转化子的PCR扩增结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明实施例仅为示例性的说明，该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本申请使用的试剂均可常规商业获得。

嗜热属真菌嗜热杜邦菌hermomyces dupontii NRRL 2155可以购买获得。

P缓冲液：MgSO₄·7H₂O 39.435g，柠檬酸钠11.764g，加入150mL蒸馏水溶解后，调pH值＝5.5，定容至200mL。常规高压灭菌。

N缓冲液：山梨醇9.105g，柠檬酸钠0.735g，加入30mL蒸馏水，溶解后，调至pH值＝5.8，定容至50mL。常规高压灭菌。

STC溶液：山梨醇18.21g，CaCl₂·2H₂O 0.735g，加入60mL蒸馏水，溶解后加入1MTris-HCl缓冲液(pH＝8.0)5mL，然后定容至100mL。过滤除菌。

60％PEG4000溶液：12g PEG4000于10mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入蒸馏水定容到20mL。常规高压灭菌。

KTC溶液：6.710g KCl溶解于30mL蒸馏水中，然后加入7.5mL 1M Tris-HCl缓冲液(pH调至8.0)；1.104g CaCl₂·2H₂O溶解于4mL蒸馏水中，再将CaCl₂·2H₂O溶液倒入KCl+1MTris-HCl(pH调至8.0)溶液中，最后加入蒸馏水定容至50mL。常规高压灭菌。

PTC转化液：无菌的60％PEG4000溶液和无菌的KTC溶液以体积比2：1混匀。

酶终止液可以为0.6M的KCl，即2.684g KCl溶解于40mL蒸馏水中，定容到60mL。常规高压灭菌。

PDA固体培养基：去皮马铃薯200g，切小块煮沸20min至30min，四层纱布过滤，葡萄糖20g，琼脂18-20g，定容至1L，自然pH。

TB3液体培养基：蔗糖200g，酵母浸粉3g，水解酪蛋白3g，用蒸馏水定容至1L。固体培养基则需要再加入0.75％的琼脂粉。常规高压灭菌。

YPS液体培养基：酵母浸粉4g，可溶性淀粉1.5g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，溶解后加蒸馏水定容到1L。常规高压灭菌。

TYGA固体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，糖蜜5g，葡萄糖10g，琼脂18-20g，加水定容至1L。常规高压灭菌。

实施例1

敲除质粒的构建

通过构建同源重组敲除片段全长(SEQ ID No.1)，以失活嗜热杜邦菌NRRL 2155基因组中编码PKS的基因Talth1_006666_t1中的关键功能域KS。

以嗜热杜邦菌NRRL 2155基因组为模板，用PCR的方法获得Talth1_006666_t1中KS基因的上游同源臂片段和下游同源臂片段，其中，以KS31up-F(SEQ ID No.2，5’端含有SbfI酶切位点，酶切位点及其上游(5’端方向)的25bp与用Sbf I酶切后的pPK2.SUR.eGFP载体(获赠于云南生物资源利用与保护国家重点实验室梁连铭副研究员)一端的序列重叠)和KS31up-R(SEQ ID No.3，5’端含有与抗潮霉素基因表达盒片段重叠的20bpDNA序列)为引物对进行PCR获得Talth1_006666_t1中KS基因的上游同源臂片段，以KS31down-F(SEQ IDNo.4，5’端含有与抗潮霉素基因表达盒片段重叠的25bpDNA序列)和KS31down-R(SEQ IDNo.5，5’端含有Xho I酶切位点，酶切位点及其上游(5’端方向)的24bp与用Xho I酶切后的pPK2.SUR.eGFP载体上一端的序列重叠)为引物对进行PCR获得Talth1_006666_t1中KS基因的下游同源臂片段；以质粒pAg1-H3(获赠于美国德克萨斯医疗研究所An Zhiqiang教授)为模板，用Hyg-KS31F(SEQ ID No.6，5’端含有与上述上游同源臂片段重叠的25bp的DNA序列)和Hyg-KS31R(SEQ ID No.7，5’端分别含有与上述下游同源臂片段重叠的25bp的DNA序列)为引物对扩增抗潮霉素基因表达盒片段(hyg片段)，用限制性内切酶Sbf I和Xho I对质粒pPK2.SUR.eGFP进行酶切，通过In-Fusion克隆技术连接方法，将Talth1_006666_t1中KS基因的上下游同源臂片段连同抗潮霉素基因表达盒连接至质粒pPK2.SUR.eGFP上，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。挑取转化子，提取质粒。经PCR验证及测序比对正确后，得到含有“上游同源臂-抗潮霉素基因片段-下游同源臂”的敲除质粒pPK2KOKS31。以敲除质粒为模板，以KS31full-F(SEQ ID No.8)和KS31full-R(SEQ ID No.9)为引物对用PCR方法扩增获得同源重组敲除片段全长，即上游同源臂-抗潮霉素基因片段-下游同源臂(SEQ IDNo.1)。

实施例2

通过构建同源重组敲除片段全长(SEQ ID No.10)，失活嗜热杜邦菌NRRL 2155基因组中编码PKS的基因Talth1_002859_t1中的关键功能域KS。

以嗜热杜邦菌NRRL 2155基因组为模板，用PCR的方法获得Talth1_002859_t1中KS基因的上下游同源臂片段，其中，以KS12up-F(SEQ ID No.11，5’端含有Sbf I酶切位点，酶切位点及其上游(5’端方向)的25bp与用Sbf I酶切后的pPK2.SUR.eGFP载体一端的25bp序列重叠)和KS12up-R(SEQ ID No.12，5’端含有与抗潮霉素基因表达盒片段重叠的25bpDNA序列)为引物对进行PCR获得Talth1_002859_t1中KS基因的上游同源臂片段，以KS12down-F(SEQ ID No.13，5’端含有与抗潮霉素基因表达盒片段重叠的25bpDNA序列)和KS12down-R(SEQ ID No.14，5’端含有Xho I酶切位点，酶切位点及其上游(5’端方向)的25bp与用Xho I酶切后的pPK2.SUR.eGFP载体一端的25bp序列重叠)为引物对进行PCR获得Talth1_002859_t1中KS基因的下游同源臂片段；以质粒pAg1-H3(获赠于美国德克萨斯医疗研究所AnZhiqiang教授)为模板，用Hyg-KS12F(SEQ ID No.15，5’端含有与上述上游同源臂片段重叠的25bp的DNA序列)和Hyg-KS12R(SEQ ID No.16，5’端分别含有与上述下游同源臂片段重叠的25bp的DNA序列)为引物对扩增抗潮霉素基因表达盒片段(hyg片段)，用限制性内切酶SbfI和Xho I对质粒pPK2.SUR.eGFP进行酶切，通过In-Fusion克隆技术连接方法，将Talth1_002859_t1中KS基因的上下游片段与抗潮霉素基因片段连接至质粒pPK2.SUR.eGFP上，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。挑取阳性转化子，提取质粒。经PCR验证及测序比对正确后，得到含有“上游同源臂-抗潮霉素基因片段-下游同源臂”的敲除质粒pPK2KOKS12。以敲除质粒为模板，以KS12full-F(SEQ ID No.17)和KS12full-R(SEQ ID No.18)为引物对用PCR方法扩增获得同源重组敲除片段全长，即上游同源臂-抗潮霉素基因片段-下游同源臂(SEQ ID No.10)。

实施例3

嗜热杜邦菌NRRL 2155原生质体的制备

(1)取嗜热杜邦菌NRRL 2155的菌丝块接种于PDA培养基中心处，放置于45℃培养箱中培养7天。用1mL枪头及无菌水(加0.05％的吐温20)将培养物从上述平板上刮净，用四层擦镜纸过滤，将含有孢子的液体分装至1.5mL离心管中，10000rpm，室温5min离心富集孢子，弃上清，富集至10⁸个/mL后用无菌水清洗两次。

(2)吸取200μL孢子悬浮液转移至100mL YPS液体培养基中，45℃，180rpm震荡培养20h。

(3)将步骤(2)培养的菌丝倒入无菌漏斗(内含四层擦镜纸)中过滤收集菌丝体。

(4)用P缓冲液溶液洗涤菌丝体两次。

(5)挑取适量菌丝转移至100mL的无菌三角瓶内，加入20mL经过滤除菌的酵母破壁酶渗透液(渗透液为含有酵母破壁酶(Lysing酶)的3mL N缓冲液+17mL P缓冲液)。

(6)28℃90rpm摇床中酶解，直到菌丝被全部裂解完全。

(7)用无菌漏斗(内含六层擦镜纸)过滤菌丝残片，收集酶解完全的原生质体，得到原生质体滤液，之后加入20mL 0.6M的KCl(酶终止液)终止酶解反应，得到裂解物溶液。其中，在加入酶终止液之前，从收集的酶解完全的原生质体中取样，进行镜检并用血球计数板计数，根据血球计数板细胞计数法计算出原生质体滤液中的原生质体的浓度(在表格中简写为“原生质体产量”)，结果见表2、表3和表6。

(8)将裂解物溶液转移至50mL离心管中，4℃离心10min，缓缓倒掉上清液，向含有沉淀物的离心管中加入20mL STC溶液，悬浮沉淀物(即原生质体)，得到第一STC悬浮液，从第一STC悬浮液中取样进行镜检并用血球计数板计数，根据血球计数板细胞计数法计算出STC悬浮液中的原生质体的浓度(在表格中简写为“原生质体产量”)，结果见表4。

(9)将第一STC悬浮液在4℃下离心10min，缓缓倒掉上清液，向含有沉淀物的离心管中加入20mL STC溶液，悬浮沉淀物，得到第二STC悬浮液。

(10)将第二STC悬浮液在4℃下离心10min，缓缓倒掉上清液，向含有沉淀物的离心管中加入400μL STC溶液，悬浮沉淀物，得到第三STC悬浮液，从第三STC悬浮液中取样进行镜检并用血球计数板计数，根据血球计数板细胞计数法计算出STC悬浮液中的原生质体的浓度(在表格中简写为“原生质体产量”)，结果见表5。之后加入适量STC溶液将原生质体浓度调至所需的终浓度。

其中原生质体的计数方法如下：使用血球计数板计数(25×16型的计数板)，计数重复三次取平均值(原生质体个数/mL＝80个小方格细胞总数/80×400×10000×稀释倍数)。

(11)将制备好的原生质体分装到2mL的无菌EP管中，每管200μL，置于冰上待用。根据表1设置步骤(5)中的酶解过程菌丝体的不同用量、酶解体系中酵母破壁酶的酶浓度、步骤(6)中的不同的酶解时间以及步骤(8)至步骤(10)的离心转速。在表1中，酶解体系中酵母破壁酶的酶浓度简写为酶浓度；酶解时间简写为时间；酶解所用菌丝体浓度写为菌体浓度。

表1

样品编号1#至4#为不同浓度的酵母破壁酶处理，在步骤(7)中对原生质体数量计数后得到酵母破壁酶的浓度与原生质体的产量关系如表2所示，结果显示，酵母破壁酶浓度为15mg/mL至20mg/mL时，去壁效果最佳，原生质体的产量较高。

表2酵母破壁酶浓度对原生质体产量的影响

注：采用Duncan法分析了数据间差异显著性(P<0.05)

样品编号10#至14#为不同菌丝体用量处理，在步骤(7)中对原生质体数量计数后得到菌丝体用量与原生质体产量关系如表3所示，结果显示，酶解液中菌丝体浓度为75-125mg/mL)时原生质体产量较高，能够达到后续转化实验的用量要求。

表3菌丝体浓度对原生质体产量的影响

注：采用Duncan法分析了数据间差异显著性(P<0.05)

实施例4

转化

(I)将实施例2中纯化回收的同源重组敲除全长片段加入至原生质体悬浮液中，轻柔混匀，迅速放置冰上40min。

(II)向冰浴后的溶液中加入1mL PTC液体，放置于45℃培养箱中静置培养，然后放置于冰上10min。

(III)吸取上述混匀液均匀涂布于TB3固体培养基表面，每皿涂布150μL，放置于45℃培养箱中培养16h。

(IV)16h后，在上一步骤涂布有原生质体混合液的平板表面覆上一层含有200μg/mL潮霉素B的TB3培养基。

(V)待固体平板上长出转化子后，转接到含有200μg/mL潮霉素B的TYGA固体平板上；转化子在潮霉素B浓度为200μg/mL的TYGA固体平板上传代培养。

(VI)提取转化子基因组，进行PCR确定敲除全长片段是否对嗜热杜邦菌NRRL 2155目标基因进行正确替换，使用的引物为KS12F(SEQ ID No.19)和KS12R(SEQ ID No.20)，扩增出的阳性片段大小应为2938bp，鉴定正确后保存菌株。

其中：

(A)在步骤(8)-(10)中，将离心速率分别设为3000rpm，4000rpm，5000rpm，6000rpm，并且每个步骤中的离心速度保持相同。

在步骤(8)中对原生质体的数量计数，得到第一次离心后原生质体产量与离心速率的关系，如表4所示，离心速率大于4000rpm后可获得高产量的原生质体。

表4离心速度与原生质体产量的影响

注：采用Duncan法分析了数据间差异显著性(P<0.05)

在步骤(10)中对原生质体的数量计数，得到第三次离心后原生质体产量与离心速率的关系，如表5所示。

表5离心速度对原生质体产量的影响

由表5可知，当离心速率为3000rpm时，由于离心力不够，一方面导致原生质体沉淀中含有残留溶液，另一方面导致原生质体不能得到充分的沉淀及收集而留在上清液中，从而致使在第三次离心、浓缩后不能使原生质体浓度到达10⁸个/mL；而在4000rpm、5000rpm、6000rpm的离心转速下，能使原生质体在离心过程中较为充分的沉淀，一方面降低了沉淀物中的溶液残留，另一方面也减少倾倒上清液中的损失，经过离心后浓缩，能得到高达10⁹个/mL数量级的原生质体的浓度，从而可以通过加入适当STC溶液稀释后获得转化所需的合适原生质体浓度，最重要的是为使用高浓度的原生质体进行转化提供了基础。

(B)样品编号5#至9#处理时间不同，在步骤(7)中对原生质体数量计数后得到酶解时间与原生质体的产量关系如表6所示，结果显示，随着酶解时间的延长，原生质体的产量在逐渐增加。

表6酶解时间对原生质体产量的影响

注：采用Duncan法分析了数据间差异显著性(P<0.05)

进一步地，转化实验结果发现，酶解时间在5.5h及以下时所获得的平均转化子数在约30个/每个平板以上；而酶解6h后获得的转化子数平均约为10个/每个平板，明显低于酶解5.5h及以下所获得的转化子数，即酶解6h所得到的原生质体同源重组效率不如酶解5h至5.5h所得的原生质体同源重组效率高，随着酶解时间的延长，虽然原生质体的数量在逐渐增加，但原生质体的活力却会逐渐降低。因此综合考虑原生质体产量与同源重组效率，得出酶解时间5h至5.5h为较优的条件。

(C)将样品3#根据实施例3的步骤(10)，用STC溶液将原生质体依次调至1×10⁷个/mL、5×10⁷个/mL、1×10⁸个/mL、5×10⁸个/mL、1×10⁹个/mL；在步骤(I)中，同源重组敲除全长片段的使用量为10μg；在步骤(II)中，在45℃培养箱中的静置时间为30min，进行转化。原生质体的浓度与同源重组率-的关系如表7所示，从表7中可以看出，原生质体浓度在5×10⁷个/mL至5×10⁸个/mL范围内有较高的转化效率，其中浓度为1×10⁸个/mL为最佳条件。其中，原生质体浓度调至1×10⁸个/mL时的PCR鉴定结果见图3。

表7原生质体浓度对同源重组率的影响

(D)将样品3#根据实施例3的步骤(10)，用STC溶液将原生质体分别调至1×10⁸个/mL；在步骤(I)中，敲除全长片段的使用量依次为1μg、5μg、10μg、15μg；在步骤(II)中，在45℃培养箱中的静置培养的时间为30min，进行转化。敲除全长片段用量与同源重组率的关系如表8所示，从表8中可以看出，敲除全长片段的用量在10μg至15μg时有较高的转化效率。

表8DNA片段浓度对同源重组率的影响

(E)将样品3#根据实施例3的步骤(10)用STC溶液将原生质体分别调至1×10⁸个/mL；敲除全长片段的使用量依次为10μg；在步骤(II)中，在45℃培养箱中的静置培养的时间依次为10min、30min、50min、70min；进行转化。静置时间与同源重组率-的关系如表9所示，静置时间大于30min后有较高的转化效率，综合考虑转化效率与时间成本因素，将静置时间设置为30min至70min最佳条件。

表9转化过程静置时间对同源重组率的影响

实施例5

使用的同源重组敲除片段为实施例1的上游同源臂-抗潮霉素基因片段-下游同源臂。

将样品3#根据实施例3的步骤(10)，用STC溶液将原生质体调至1×10⁸个/mL；根据实施例4的步骤(I)，敲除全长片段的使用量为10μg；在步骤(II)中，在45℃培养箱中的静置时间为30min进行转化。步骤(III)至(V)的操作同实施例4的步骤(III)至(V)。在步骤(VI)中，提取转化子基因组，进行PCR确定敲除全长片段是否对嗜热杜邦菌NRRL2155目标基因进行正确替换，使用的引物为KS31full-F(SEQ ID No.8)和KS31full-R(SEQ ID No.9)，扩增出的阳性片段大小应为4185bp，鉴定正确后保存菌株。结果见图4。根据图4，可以计算出同源重组率为15.79％。

对比例1

将样品3#根据实施例3的步骤(10)，用STC溶液将原生质体调至1×10⁸个/mL；根据实施例4的步骤(I)，转化所用DNA为实施例2的敲除质粒PK2KOKS12，其使用量为10μg；在步骤(II)中，在45℃培养箱中的静置时间为30min，进行转化。步骤(III)至(VI)的操作同实施例4的步骤(III)至(VI)。结果见图5。根据图5，可以计算出同源重组率4.76％。

虽然本申请已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本申请的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本申请的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的这些改变均包括在本申请的权利要求的范围内。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一种获得嗜热属真菌阳性转化子的方法

<130> LHA1860266

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4185

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 1

accatgctac agctactatg gagacagagg ccatgactac ccacagagct ccaacagcta 60

tgtcgttggg ctgtgcacgg gtctacttgc atccgctgcg gtggcatcat cacaaaatgt 120

tggccaactt cttccgctcg ctgtggaggc agtagtcgtt tctctgcgtt taggcctctg 180

cagtcttaaa ttcagagatc ttgtgggacc gggtgacagt caatccccca gttggtcagc 240

tgtggtcact ggcgtccaag aagacgaggc cgaagccgca atctgcgact tctctaggaa 300

aaaggcaagc ttgctattta tcatcaagca actccggctt aaagctaact tctcgcaggg 360

tctctctcct tcaactcggc catatattag cgctgtcagt cccaattgtt tgactatcag 420

tggcccacct tcaacattgg aagaatttat cgataaccac atcaacaatg cgaaaccgtt 480

tcgagtggcc gtgcacgccc ctttccatgc ccctcatctt tatggaatgg ccgacattga 540

ctggattctc gatactcggt acagcgacac aaacagtctt tgtgaatctc gcattccctt 600

gctgtcgagc gccactggaa atcaaattat ggcgacctcc tttagggatc tcttgagaat 660

tgcgctcgag gagattctcc ttcggaagct gcgttgggac aaggtccttc ataaatgcgg 720

atccgttttg gggcgtgcct ctacctccaa atgcatcgtt attcctgttg ccacagccac 780

ggcctccggt ctcctatcga cactgaaacg tgcaggcctt gaggatgtca gcctgggcaa 840

cgatttgatg gagtttccca gtgagaacgg aaacatcaac tgtactggtc ggcccgacat 900

cgatgatcag gcctcgacag aagatgatat tgaaggagca ctttttgggc ttggctggag 960

ctagtggagg tcaacaatga atgcctattt tggtttagtc gtccaggcgg tgagcacaaa 1020

atttgtgtcg tttgacaaga tggttcattt aggcaactgg tcagatcagc cccacttgta 1080

gcagtagcgg cggcgctcga agtgtgactc ttattagcag acaggaacga ggacattatt 1140

atcatctgct gcttggtgca cgataacttg gtgcgtttgt caagcaaggt aagtgaacga 1200

cccggtcata ccttcttaag ttcgcccttc ctccctttat ttcagattca atctgactta 1260

cctattctac ccaagcatcg atatgaaaaa gcctgaactc accgcgacgt ctgtcgagaa 1320

gtttctgatc gaaaagttcg acagcgtctc cgacctgatg cagctctcgg agggcgaaga 1380

atctcgtgct ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcctgcggg taaatagctg 1440

cgccgatggt ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg ccgcgctccc 1500

gattccggaa gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc ctgacctatt gcatctcccg 1560

ccgtgcacag ggtgtcacgt tgcaagacct gcctgaaacc gaactgcccg ctgttctgca 1620

gccggtcgcg gaggccatgg atgcgatcgc tgcggccgat cttagccaga cgagcgggtt 1680

cggcccattc ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca tggcgtgatt tcatatgcgc 1740

gattgctgat ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg gacgacaccg tcagtgcgtc 1800

cgtcgcgcag gctctcgatg agctgatgct ttgggccgag gactgccccg aagtccggca 1860

cctcgtgcac gcggatttcg gctccaacaa tgtcctgacg gacaatggcc gcataacagc 1920

ggtcattgac tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg ccaacatctt 1980

cttctggagg ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg agcggaggca 2040

tccggagctt gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg ctccgcattg gtcttgacca 2100

actctatcag agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc agggtcgatg 2160

cgacgcaatc gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg cccgcagaag 2220

cgcggccgtc tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa accgacgccc 2280

cagcactcgt ccgagggcaa aggaatagag tagatgccga ccgggatcca cttaacgtta 2340

ctgaaatcat caaacagctt gacgaatctg gatataagat cgttggtgtc gatgtcagct 2400

ccggagttga gacaaatggt gttcaggatc tcgataagat acgttcattt gtccaagcag 2460

caaagagtgc cttctagtga tttaatagct ccatgtcaac aagaataaaa cgcgtttcgg 2520

gtttacctct tccagataca gctcatctgc aatgcattaa tgcattggac ctcgcaaccc 2580

tagtacgccc ttcaggctcc ggcgaagcag aagaatagct tagcagagtc tattttcatt 2640

ttcgggagac gagatcaagc agatcaacgg tcgtcaagag acctacgaga ctgaggaatc 2700

cgctcttggc tccacgcgac tatatatttg tctctaattg tactttgaca tgctcctctt 2760

ctttactctg atagcttgac tatgaaaatt ccgtcaccag cccctgggtt cgcaaagata 2820

attgcactgt ttcttccttg aactctcaag cctacaggac acacattcat cgtaggtata 2880

aacctcgaaa atcattccta ctaagatggg tatacaatag taaccatggt tgcctagtga 2940

atgctccgta acacccaata cgccggccga aactttttta caactctcct atgagtcgtt 3000

tacccagaat gcacaggtac acttgtttag aggtaatcct tctttctaga ggatcctcta 3060

cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat 3120

cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt 3180

cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca 3240

tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct 3300

aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg agatctagag gatcccccga atccgaggtt 3360

cttcaacatg tcgccgcgcg aggcactgca ggcagatccg ggtcaacggt tagccctgat 3420

gactgcatat gaagccatgg aaatggccgg attggtcccg gattcgaccc agtcaacaca 3480

gagagaccgg gttggcatat tttacgggat gaccagcgac gactaccgtg aagtgaacag 3540

cggccaggat atcgacacct acttcatccc aggaggcaac cgagcgttca cgccaggtcg 3600

gatcaactat tacttcaaat tcagcggtcc cagtgttagt gtcgatactg catgttcgtc 3660

cagcctagca gcaattcaca tggcttgcaa ctcgttatgg aggaacgact gtgacactgc 3720

aatcgccggc ggaacaaata tcctgacgaa tcccgacaac catgcaggac tcgatcgcgg 3780

gcactttcta tcccggaaag ggaactgcaa tacattcgat gacggcgccg acggatactg 3840

cagagctgac gctgttggca ctcttgtgct gaaacgactc gaagatgcgc tggctgacaa 3900

ggatcctatc tatggtgtaa ttgtcggtgc ctacacaaat cattccgccg aggctgtatc 3960

gatgactcgt cctcatgttg gcgcccagac ttacatcttc gagaagatcc tgaatgaagc 4020

aaatgtggac ccacatgaca tcagctacat cgaaatgcac ggaacgggga cacaggctgg 4080

tgatgccgtg gagatgaatt cggtattggg tgtgtttgca ccagattacc gacgaaagcc 4140

agagcagtcc ttgtatctag gctctacgaa agccaatatc ggcca 4185

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 2

agtgccaagc ttgcatgcct gcaggaccat gctacagcta ctatggagac 50

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 3

tcgaggcctg atcatcgatg tcgggccgac cagtacagtt gatg 44

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 4

cgtcgagatc tagaggatcc cccgaatccg aggttcttca acatgtcgc 49

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 5

ctggtaagct ttgacctcct cgagtggccg atattggctt tcgtagagc 49

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 6

acatcaactg tactggtcgg cccgacatcg atgatcaggc ctcgac 46

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 7

ggcgacatgt tgaagaacct cggattcggg ggatcctcta gatctcg 47

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 8

accatgctac agctactatg gagac 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 9

tggccgatat tggctttcgt agagc 25

<210> 10

<211> 6290

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 10

agtaccccgc catgacacta ctgtacagta tcatcgcggt acttaccggt aactccggac 60

cggggtaccc acggtgccca cagtggatcc cttgactcga ctggagggca cggggttagg 120

cgggtcaggg ccctaactac atgcatacag gggccgcagc tggcaaaaac tcacaaacaa 180

agtggggcat ggattggcct ccttgttctt cactctttgg caaggctgaa gcttgtgaat 240

aatgatggac ggagtagtcg gaggctaatc aaaagtcgtt gaacttggga ccttaagtac 300

tccgtaccgt accccgcagc tcttcttgag attctatcat tctagaaggc ttccatagaa 360

cgcacgatca agtttgtttt ctcattgtcc tcttggcact agttactgga gcttggtaac 420

ttagtttcac tacataatta ctagttaact acttgcggaa gatcaaatcc aaagtgttga 480

acttttccgt cgcatcccgc caccaccttg acttgaatct ttacctttgc aatactgggg 540

gtgccgaagg agcatcatcg cggatatcac ccgatttcag cgaaatttga aggtttttga 600

gggtattttg gtaccttaag gaccatagag agactaccag aaaaccatag gtagtgaaaa 660

tatcaagatc tccttggcac tgagtgtctg tgcccttcga ttctgttgcc ctcctccgca 720

aagtccgagc cctaacttgt actccgcagt tggcacccag ggtcattgcc attcagagtg 780

tgtccacagc cgctgggaat gtggatgcaa tcgacctaga aattaagtgg ggtaagaatt 840

gggattgcat atagattaat acattatcaa ctccatgctg tactcgtcca ggtgctgaag 900

taatgcggag tattacgtcg gacaactcca ttccgtatca cgtactcggt aagtacggag 960

taactcggta cgagtaggaa tcctagggga aggttgaacg gcccccaaaa ctgtaatctg 1020

aatgacctta tacttggtac gttaagtcga tgtcgatcac ggacgtaatc aacattaggg 1080

tcatcggctg aacgaatgcc agtattaatc acaacgcggt atgcttcaat gaagttcgta 1140

gttcaagcga atagtactcc ggatgatcac aagaatttga catggatgaa caccattggg 1200

ctttgaatgg ggcacttgca atgtcaattg catcacaatc cttgttccca gctgagaagg 1260

tgtttctaca gacaatcctc agtatggaat acaggagtac atctcatggc tgaacgaggg 1320

accagattac acagaccagt atttcatgaa atgaaaagtg gaaatgacat tggatgaatc 1380

tgtggcctga tccattctct gtagattaaa tgcaacgcaa acgatgtaaa tcgcacaatg 1440

cgtgatgttg tttgccctgt gttcacagct tcgttgttga tggtgttggt ggagaacagt 1500

tatcaccaac gtcgggttca cttcggagta ccatccatgt acgagtacgc ataggtaata 1560

gttaccaccg tcctgcccgg tgactcaaaa ggctgaaaat acgtcacatg ttcttccttc 1620

aggacagaat tgctcgaaag acgagtgatt ccttcaactg gagacagatg gggcgcatct 1680

gactagtcat catcatagaa acccatacct accatctgag ttcgttttta atagctctca 1740

ttacatctgt cgaaactgtt ctttttaaag cattgatttc agccgaacgg cttgccacgt 1800

tctctactaa ggcctcaaag tatcctctgt ctcttggctg ccctcctcga catcgatgat 1860

caggcctcga cagaagatga tattgaagga gcactttttg ggcttggctg gagctagtgg 1920

aggtcaacaa tgaatgccta ttttggttta gtcgtccagg cggtgagcac aaaatttgtg 1980

tcgtttgaca agatggttca tttaggcaac tggtcagatc agccccactt gtagcagtag 2040

cggcggcgct cgaagtgtga ctcttattag cagacaggaa cgaggacatt attatcatct 2100

gctgcttggt gcacgataac ttggtgcgtt tgtcaagcaa ggtaagtgaa cgacccggtc 2160

ataccttctt aagttcgccc ttcctccctt tatttcagat tcaatctgac ttacctattc 2220

tacccaagca tcgatatgaa aaagcctgaa ctcaccgcga cgtctgtcga gaagtttctg 2280

atcgaaaagt tcgacagcgt ctccgacctg atgcagctct cggagggcga agaatctcgt 2340

gctttcagct tcgatgtagg agggcgtgga tatgtcctgc gggtaaatag ctgcgccgat 2400

ggtttctaca aagatcgtta tgtttatcgg cactttgcat cggccgcgct cccgattccg 2460

gaagtgcttg acattgggga attcagcgag agcctgacct attgcatctc ccgccgtgca 2520

cagggtgtca cgttgcaaga cctgcctgaa accgaactgc ccgctgttct gcagccggtc 2580

gcggaggcca tggatgcgat cgctgcggcc gatcttagcc agacgagcgg gttcggccca 2640

ttcggaccgc aaggaatcgg tcaatacact acatggcgtg atttcatatg cgcgattgct 2700

gatccccatg tgtatcactg gcaaactgtg atggacgaca ccgtcagtgc gtccgtcgcg 2760

caggctctcg atgagctgat gctttgggcc gaggactgcc ccgaagtccg gcacctcgtg 2820

cacgcggatt tcggctccaa caatgtcctg acggacaatg gccgcataac agcggtcatt 2880

gactggagcg aggcgatgtt cggggattcc caatacgagg tcgccaacat cttcttctgg 2940

aggccgtggt tggcttgtat ggagcagcag acgcgctact tcgagcggag gcatccggag 3000

cttgcaggat cgccgcggct ccgggcgtat atgctccgca ttggtcttga ccaactctat 3060

cagagcttgg ttgacggcaa tttcgatgat gcagcttggg cgcagggtcg atgcgacgca 3120

atcgtccgat ccggagccgg gactgtcggg cgtacacaaa tcgcccgcag aagcgcggcc 3180

gtctggaccg atggctgtgt agaagtactc gccgatagtg gaaaccgacg ccccagcact 3240

cgtccgaggg caaaggaata gagtagatgc cgaccgggat ccacttaacg ttactgaaat 3300

catcaaacag cttgacgaat ctggatataa gatcgttggt gtcgatgtca gctccggagt 3360

tgagacaaat ggtgttcagg atctcgataa gatacgttca tttgtccaag cagcaaagag 3420

tgccttctag tgatttaata gctccatgtc aacaagaata aaacgcgttt cgggtttacc 3480

tcttccagat acagctcatc tgcaatgcat taatgcattg gacctcgcaa ccctagtacg 3540

cccttcaggc tccggcgaag cagaagaata gcttagcaga gtctattttc attttcggga 3600

gacgagatca agcagatcaa cggtcgtcaa gagacctacg agactgagga atccgctctt 3660

ggctccacgc gactatatat ttgtctctaa ttgtactttg acatgctcct cttctttact 3720

ctgatagctt gactatgaaa attccgtcac cagcccctgg gttcgcaaag ataattgcac 3780

tgtttcttcc ttgaactctc aagcctacag gacacacatt catcgtaggt ataaacctcg 3840

aaaatcattc ctactaagat gggtatacaa tagtaaccat ggttgcctag tgaatgctcc 3900

gtaacaccca atacgccggc cgaaactttt ttacaactct cctatgagtc gtttacccag 3960

aatgcacagg tacacttgtt tagaggtaat ccttctttct agaggatcct ctacgccgga 4020

cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta tatcgccgac 4080

atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca tgagcgcttg tttcggcgtg 4140

ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ccatctcctt gcatgcacca 4200

ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac tgggctgctt cctaatgcag 4260

gagtcgcata agggagagcg tcgagatcta gaggatcccc cgaagcaagc gaacgtcttc 4320

cgatccgctc tatatcggat ccctgaaatc caacttcggg tctgtatgca acattatgac 4380

gatactggac atgaattaac tgtgcctagt cacacggaag cggcaagcgg cattctcggc 4440

gtaatcaagg cagtgatgat gattcaacgt ggatgtgttt tgcccaatgc caactttgaa 4500

aagctcaacg acaaaatcga aggaaaggaa aagttgaaag tgaggaccca tcatattttc 4560

tttgcactcc gacattgatc gaggacaatg actgacgtag tttaggtggc tccaacgact 4620

attccatggc catccaatgc acgaaagcgc gtctgtgtga cgaacttcgg tgagcaccca 4680

taccttgtta ttgactgtca ccggcttggc tcatcgctgg cttaggattt ggtggaagta 4740

acgccgtggt cattctcgac gaagcgccta agattcacag gccagcaatc catagcgcgg 4800

atttcgcgaa cggacatttg accgacggag aaaccacgaa cggagagttc actaacgggc 4860

atagggtcac aaatggtgtc gaaaaggcga acggagaatt gagatcggtt ggcttaaacg 4920

gtgacatctc caatcactcc aaggaaattg accgtgagaa gcgtgtatat gtgttctcag 4980

cccggtccga gagtagtctc accgcgtacc tgtcttcttt ccgagactat ctggagcgtg 5040

aatcggattc aaaagcattt atgcgcgatc tcagttttac cttgggacag cgccgcacac 5100

atcacgctca tcgagtggcc gtcatagcag actcattgga ggctctcaga acggaactga 5160

cgacggcaaa gtctaggaaa gcacgggatc aatctgccgc ctttgtcttc actggccaag 5220

gtgcccagta aggatatccc acaagcagtc aaatcgaaac gtgctaataa acccagacat 5280

gctcggatgg ccgcaagctt gacccgatat gagattttca atgcttccat taaacacgct 5340

gaagacactc ttcaaagatt ggggtctcaa ttcagcttga taggtacgga gattctacct 5400

ccacattctg aatctcggaa ttaacatctg gcagaggaac tacgccggcc agagtccgag 5460

tcgcgcatca acacggctga gatcagccaa ccggcctgta ccgcagttca gctggctttg 5520

gtttcattgc tgaagagctg gggtattcaa ccgaccacgg ttgcaggaca ctccagtggc 5580

gagattgcag cggctttcgc ggctggcttg ctttccttcg aagcggctgt tgctgtggct 5640

tattaccgtg gccaagctgc tattaagttg agccagagtg gtcaaatggg agcaatgctt 5700

gctctgggaa caagcgccga agaggccaca aagctgatcg aagagattga cagtggctac 5760

gcaacgatcg cggcaataaa cagtccccag agtgtaactg tttccggaga cgtttctgcc 5820

attgatagca ttcatcaatt ggccaacgcg cgtggtatct ttgctcgcag actacgagtc 5880

gacgttgcgt accattctcg gcacatggag caagttgcca catcgtacct ggaatccatc 5940

gaacctttct tcaatactat ggagaagctt cctgagacgt ctcgaccgat cttcgtgtct 6000

tctgtcactg gcgacgttct gaatgaagat gccgtcaatg cttcgtactg ggtcaagaat 6060

ttgcttcaac ctgttcgctt cacagatgca atccggggca tttttgcggc acggaaggat 6120

gccacgaatg ctggacatcg ctcgcctacc ctaatcgtcg aaatcgggcc gcattccgct 6180

ctccaggggc caatcaaaca aacagtggat tctctacgtc agcaacacac cgatcgacgt 6240

caggaccaat tcgcctatct cccgtcgctg gtacgcggaa cggacaatga 6290

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 11

agtgccaagc ttgcatgcct gcaggagtac cccgccatga cactactg 48

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 12

ttctgtcgag gcctgatcat cgatgtcgag gagggcagcc aagagac 47

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 13

cgtcgagatc tagaggatcc cccgaagcaa gcgaacgtct tccgatc 47

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 14

tctggtaagc tttgacctcc tcgagtcatt gtccgttccg cgtaccag 48

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 15

tctgtctctt ggctgccctc ctcgacatcg atgatcaggc ctcgacag 48

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 16

agcggatcgg aagacgttcg cttgcttcgg gggatcctct agatctcg 48

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 17

agtaccccgc catgacacta ctg 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 18

tcattgtccg ttccgcgtac cag 23

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 19

acccatacct accatctgag ttcg 24

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 20

attggatggc catggaatag tcg 23

Claims (7)

1.一种获得嗜热属(Thermomyces)真菌阳性转化子的方法，其包括如下步骤：

1)制备原生质体的浓度为1×10⁸个/mL的嗜热属真菌的原生质体溶液；

2)将所述原生质体溶液与同源重组片段混合，得到第一混合物，其中，每200μL的所述原生质体溶液使用所述同源重组片段的量为10μg至15μg；

3)将所述第一混合物进行第一次冰浴，然后加PTC转化液，培养30min至50min，然后再进行第二次冰浴，得到第二混合物；

4)将所述第二混合物涂布在原生质体再生固体培养基上培养，得到至少一个待鉴定的转化子；

5)将所述至少一个待鉴定的转化子在用于菌丝生长的培养基上进行传代培养，获得传代培养产物，并对所述传代培养产物进行DNA水平上的鉴定，以筛选出所述嗜热属真菌的阳性转化子；

所述原生质体溶液的制备方法包括以下步骤：

1-1)将所述嗜热属真菌接种于用于菌丝生长的固体培养基上，培养6至8天，获得5×10⁷个/mL至5×10⁸个/mL的孢子悬浮液；

1-2)以0.5‰至10‰的量将所述孢子悬浮液接种至YPS液体培养基中，在180rpm至200rpm下震荡培养18h至24h，获得菌丝培养物；

1-3)将所述菌丝培养物过滤后，收集菌丝体；

1-4)将所述菌丝体用P缓冲液洗涤至少一次；

1-5)将所述菌丝体置于酵母破壁酶渗透液中，得到酶解体系，所述酶解体系在28℃至30℃以及80rpm至100rpm的条件下酶解5h至5.5h，得到裂解产物；其中，酵母破壁酶渗透液中含有酵母破壁酶、N缓冲液和P缓冲液，且N缓冲液和P缓冲液的体积比为(2.5-3.5)：(16.5-17.5)；在所述酶解体系中的菌丝体的浓度为75mg/mL至125mg/mL，在所述酶解体系中的酵母破壁酶的浓度为15mg/mL至20mg/mL；

1-6)将所述裂解产物过滤，收集形成的原生质体并用酶终止液终止酶解反应，得到裂解物溶液；

1-7)将所述裂解物溶液在4℃至6℃以及4000rpm至6000rpm下离心8min至10min，弃去第一上清液，之后用STC溶液悬浮第一离心沉淀物，得到第一STC悬浮液；将所述第一STC悬浮液在4℃至6℃以及4000rpm至6000rpm下离心8min至10min，弃去第二上清液，再次用STC溶液悬浮第二离心沉淀物，得到第二STC悬浮液；将所述第二STC悬浮液在4℃至6℃以及4000rpm至6000rpm下离心8min至10min，弃去第三上清液之后，用STC溶液将第三离心沉淀物调至终浓度为1×10⁸个/mL的原生质体溶液；

其中，

所述P缓冲液的配方如下：MgSO₄·7H₂O 39.435g，柠檬酸钠11.764g，加入150mL蒸馏水溶解后，调pH值＝5.5，定容至200mL；

所述N缓冲液的配方如下：山梨醇9.105g，柠檬酸钠0.735g，加入30mL蒸馏水，溶解后，调至pH值＝5.8，定容至50mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，嗜热属真菌为嗜热杜邦菌(Thermomyces dupontii)和/或嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同源重组片段中含有报告基因表达盒，并且在此情况下，在步骤4)中，将所述第二混合物涂布在原生质体再生固体培养基上培养15至20h后，在所述原生质体再生固体培养基上覆盖一层含有所述报告基因选择压的所述原生质体再生固体培养基，继续培养，得到至少一个待鉴定的转化子；在步骤5)中，将所述至少一个待鉴定的转化子在含有所述报告基因选择压的用于菌丝生长的培养基上进行传代培养，获得传代培养产物，并对所述传代培养产物进行DNA水平上的鉴定，以筛选出所述嗜热属真菌的阳性转化子。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述同源重组片段中含有潮霉素抗性基因表达盒，并且在此情况下，在步骤4)中，将所述第二混合物涂布在原生质体再生固体培养基上培养15至20h后，在所述原生质体再生固体培养基上覆盖一层含有潮霉素的所述原生质体再生固体培养基，继续培养，得到至少一个待鉴定的转化子；在步骤5)中，将所述至少一个待鉴定的转化子在含有潮霉素的用于菌丝生长的培养基上进行传代培养，获得传代培养产物，并对所述传代培养产物进行DNA水平上的鉴定，以筛选出所述嗜热属真菌的阳性转化子。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于，在所述步骤4)中，所述固体培养基为TB3固体培养基；和/或在所述步骤5)中，进行传代培养的培养基为TYGA培养基。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于，在所述步骤3)、4)、5)、1-1)和1-2)中，培养温度各自独立地为42℃至48℃。

7.根据权利要求1至6中任意一项的方法，其特征在于，获得嗜热属真菌阳性转化子包括如下步骤：在无菌条件下，

1-1)将所述嗜热属真菌接种于PDA固体培养基上，在44℃至46℃下培养7天至8天，用含有0.05％的吐温20的水将培养物刮净，然后用四层至六层的擦镜纸过滤，富集并洗涤至少两次，获得1×10⁸个/mL的孢子悬浮液；

1-2)以1‰的量将所述孢子悬浮液接种至YPS液体培养基中，在44℃至46℃以及180rpm的条件下震荡培养20h至24h，获得菌丝培养物；

1-3)将所述菌丝培养物用四层六层擦镜纸过滤后，收集菌丝体；

1-4)将所述菌丝体用P缓冲液洗涤两次；

1-5)将所述菌丝体置于酵母破壁酶渗透液中，得到酶解体系，所述酶解体系在28℃至30℃以及80rpm至100rpm的条件下酶解5h至5.5h，得到裂解产物；其中，酵母破壁酶渗透液中含有酵母破壁酶、N缓冲液和P缓冲液，N缓冲液和P缓冲液的体积比为3：17；在所述酶解体系中的菌丝体的浓度为100mg/mL，在所述酶解体系中的酵母破壁酶的浓度为15mg/mL；

1-6)将所述裂解产物用六至八层擦镜纸过滤，收集形成的原生质体并用酶终止液终止酶解反应，得到裂解物溶液；

1-7)将所述裂解物溶液在4℃以及5000rpm下离心10min，弃去第一上清液，之后用STC溶液悬浮第一离心沉淀物，得到第一STC悬浮液；将所述第一STC悬浮液在4℃以及5000rpm下离心10min，弃去第二上清液，再次用STC溶液悬浮第二离心沉淀物，得到第二STC悬浮液；将所述第二STC悬浮液在4℃以及5000rpm下离心10min，弃去第三上清液之后，用STC溶液将第三离心沉淀物调至终浓度为1×10⁸个/mL的原生质体溶液；

2)将所述原生质体溶液与含有潮霉素表达盒的同源重组片段混合，得到第一混合物，其中，每200μL的所述原生质体溶液使用所述同源重组片段的量为10μg至15μg；

3)将所述第一混合物进行第一次冰浴，然后加PTC转化液，培养30min至50min，然后再进行第二次冰浴，得到第二混合物；

4)将所述第二混合物涂布在TB3固体培养基上于44℃至46℃下培养16h至18h后，再在涂布有所述第二混合物的TB3固体培养基上覆盖一层含有潮霉素B的TB3培养基，继续于44℃至46℃下培养5至7天，得到至少一个待鉴定的转化子；

5)将所述至少一个待鉴定的转化子在含有潮霉素B的TYGA固体培养基进行传代培养，获得传代培养产物，对所述传代培养产物进行基因组的提取，然后以所述基因组为模板进行PCR鉴定，以筛选出所述嗜热属真菌的阳性转化子。

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