CN110564630A - 赭曲霉毒素a基因敲除的赭曲霉突变菌株及其构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株及其构建和应用。所述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2019186。本发明通过同源重组的方式，将抗性标记基因插入聚酮合酶基因pks中，敲除pks基因得到赭曲霉突变菌株。该菌株失去合成聚酮合酶的能力，进而阻断了OTA的合成，为其在工业生产中的广泛应用奠定基础。

Description

赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株及其构建和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲 霉突变菌株及其构建方法。

背景技术

赭曲霉是隶属于曲霉属的一种丝状真菌，在全世界范围内广泛分布。由于其 生长能力强且具有多样化的碳水化合物水解作用和蛋白水解作用，常被应用于发 酵工程和生物医药工程等领域。在制药工业领域，赭曲霉主要用于转化环氧黄体 酮，进行甾体类药物的C11α-羟基化反应，如制备心血管药物C11α-羟基-坎利酮 及其它甾体类药物。此外，赭曲霉具有丰富的碳水化合物水解酶系，在食品、纺 织和纸浆等工业生产中起到非常重要的作用。然而，其次级代谢产物赭曲霉毒素 又是危害食物产品安全与人类健康的因素之一，严重制约了赭曲霉在制药和食品 等相关领域的应用。

赭曲霉毒素包括7种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A(OTA)毒性 最大，污染最严重。OTA性质稳定，耐酸，耐高温，不易降解，食品一旦污染 OTA，要完全去除非常困难。Marino等人研究表明，在玉米、小麦等谷物以及咖 啡、啤酒、牛奶、葡萄、橘子和果汁饮料等多种食品产品中都能检测到赭曲霉及 其分泌物OTA的污染。Petzinger等人报道，OTA具有强烈的肝脏和肾脏毒性以 及潜在的致癌和致突变能力，国际癌症研究机构(LARC)己将OTA认定为2B类 致癌物(即可能引起人类癌症的物质)。OTA的污染严重威胁了食品安全和人类 生存环境。因为赭曲霉强大的OTA分泌能力，所以一定程度上限制了其在工业生 产中的广泛应用。

目前报道了多种控制OTA的方法，其中生物防治安全环保，具有一定的实用 价值，但不能从根本上解决问题。随着新型分子生物学方法的应用，一些具有应 用价值的快速检测技术和降低毒素产生的方法得以开发，但OTA合成代谢通路及 基因调控网络机制仍有待研究。O’Callaghan等使用抑制差杂交PCR方法克隆了 一株赭曲霉中聚酮合酶(PKS)编码基因片段(GenBank登录号AAT92023.1)。通 过反转录PCR研究发现该pks基因表达仅发生在OTA合成早期，且敲除该pks基 因的突变菌株不能生成OTA，表明pks基因与OTA的合成有关。Bacha等利用基 因步查(gene Walking)方法克隆了一株赭曲霉pks基因片段(GenBank登录号 AAT92024.1)。基于反转录PCR和动态次级代谢合成研究进一步证实pks基因的 表达与OTA的合成相关。Han等研究表明OTA的生物合成由cluster37和cluster69 两个基因簇共同完成，其核心基因分别为pks和nrps。而这两个核心基因与上述 两个pks基因同源，说明OTA由两个PKS共同催化合成。

发明内容

本发明目的是提供赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株及其构建方法。 利用基因工程方法敲除赭曲霉中的pks基因，以获得失去产OTA能力的赭曲霉突 变菌株。从源头上解决OTA污染问题，为赭曲霉菌株的工业化应用提供安全菌株。

为了达到上述目的，本发明提供了一种赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突 变菌株，该突变菌株赭曲霉(Aspergillus ochratae)MF018现保藏于中国典型培 养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2019年3月21日，保藏编号为CCTCC NO： M2019186。

本发明还提供了上述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株的构建方 法，其特征在于，包括：

步骤1：克隆赭曲霉聚酮合酶编码基因pks；

步骤2：克隆选择性标记抗性基因；

步骤3：构建含有pks上下游关键DNA序列p-u1、p-d1和所述的选择性标 记抗性基因的融合基因，并将融合基因插入质粒构建重组质粒；

步骤4：重组质粒转化大肠杆菌DH5α，培养并筛选转化子进行重组质粒验 证；

步骤5：制备赭曲霉原生质体；

步骤6：重组质粒转化赭曲霉原生质体；

步骤7：培养和筛选转化后的赭曲霉获得赭曲霉阳性转化子；

步骤8：对阳性转化子进行基因水平的验证，获得赭曲霉毒素A基因敲除的 赭曲霉突变菌株。

优选地，所述的赭曲霉突变菌株不合成赭曲霉毒素A。

优选地，所述的质粒为pSilent-Dual1、pBC-Hygro、pAg1-H3和pMD18-T中的 至少一种。

优选地，所述的p-u1为上游交换臂，p-d1为下游交换臂。

优选地，所述的步骤4中筛选所用抗性标记为氨苄青霉素、氯霉素或卡那霉 素，浓度为10-60μg/mL。

优选地，所述的步骤7中筛选所用抗性标记为博来霉素或潮霉素，浓度为 20-150μg/mL。

本发明还提供了上述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株在发酵工 程或生物医药工程领域中的应用。

本发明还提供了上述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株在制备甾 体类药物中的应用。

本发明还提供了一种重组质粒，其特征在于，含有pks上下游关键DNA序 列p-u1、p-d1和所述的选择性标记抗性基因的融合基因。

本发明还提供了一种重组菌，其特征在于，含有上述的重组质粒。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过同源重组的方式，将抗性标记基因插入聚酮合酶基因pks中，敲 除pks基因得到赭曲霉突变菌株。该菌株失去合成聚酮合酶的能力，进而阻断了 OTA的合成，为其在工业生产中的广泛应用奠定基础。

保藏信息

赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株，该突变菌株赭曲霉MF018(Aspergillus ochratae MF018)现保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地 址在中国武汉武汉大学)，保藏日期为2019年3月21日，保藏编号为CCTCC NO： M2019186。

附图说明

图1：基因敲除重组质粒构建示意图。

图2：重组质粒PCR鉴定结果示意图。其中泳道1-2为p-u1、p-d1和抗性标 记基因构建获得的融合基因PCR产物(3610bp)；泳道3为DNA Marker。

图3：赭曲霉毒素A基因敲除突变株PCR鉴定结果示意图。其中泳道1为 DNAMarker；泳道2-3为原始菌pks基因PCR产物；泳道4-5：赭曲霉毒素A基 因敲除突变株融合基因PCR产物。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例进一步对发明进行说明，不能理解为是本发明的限 制，实施案例中使用的材料、试剂、仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径获 得。

1.菌株和质粒

赭曲霉菌株来自于本实验室收藏，该菌种已在CN108823266A《一种采用发 酵的方法制备几丁质的方法》中公开，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心(CGMCC)中，保藏日期为2018年4月25日，保藏号为CGMCC No.15668。

质粒pMD18-T simple Vector购于TakaRa公司，质粒pSilent-Dual1和pAg1-H3 购于淼灵质粒平台，质粒pBC-Hygro购于丰晖生物。

2.培养基

(1)LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。LB 固体培养基1L在与LB液体培养基一样的成分基础上，加15g琼脂粉。

(2)PDA固体培养基：PDA 46g/L，酵母提取物2g/L，琼脂粉10g/L。

(3)种子培养基：无水葡萄糖6g/L，可溶性淀粉4g/L，玉米浆20g/L，蛋 白胨10g/L，磷酸二氢铵1g/L，氯化镁2g/L。

(4)发酵培养基：无水葡萄糖25g/L，可溶性淀粉10g/L，玉米浆20g/L， 蛋白胨10g/L，磷酸二氢铵1g/L，氯化镁2g/L。

(5)RM培养基：水解酪蛋白1g/L，酵母粉1g/L，蔗糖274g/L。

3.实施例中所用的引物

表1实施例中所用的引物

实施例1

克隆赭曲霉聚酮合酶编码基因pks：

利用OMEGA-DNA提取试剂盒(D3390-00)提取的赭曲霉的基因组DNA 作为模板，以引物F-p-up1和R-p-down2进行PCR扩增聚酮合酶基因片段(1701bp)， PCR程序见表2。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，片段大小与预期一致。 采用胶回收试剂盒(生工货号：B518131-0050)切胶回收上述目的基因片段(SEQ ID NO：7)，按照操作说明进行TA克隆将所述的基因片段与质粒pMD18-T连接 起来，得到质粒pMD18-pks。菌落PCR验证结果与预期一致。测序结果经BLAST 分析显示为pks基因。

上述反应体系为：

上述PCR程序见表2。

表2 PCR程序

实施例2

潮霉素抗性基因的扩增及质粒pMD18-hyg的构建

以质粒pAg1-H3为模板，用引物F-h1和R-h2进行PCR反应，获得潮霉素抗 性基因hyg(1920bp)(SEQ ID NO：8)。将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳， 片段大小与预期一致。采用胶回收试剂盒(生工货号：B518131-0050)切胶回收 上述目的基因片段，按照操作说明进行TA克隆将所述的基因片段与质粒 pMD18-T连接起来，得到质粒pMD18-hyg。菌液PCR验证结果与预期一致，说明 质粒pMD18-hyg构建成功。

上述反应体系为：

上述PCR程序见表3。

表3 PCR程序

上述目的基因片段与pMD18-T-Vector连接体系见表4。

表4连接体系

实施例3

重组质粒pB-pks和pB-p1hp2的构建

(1)质粒pB-pks的构建

用限制性内切酶Spe I和Xho I分别对质粒pBC-hygro和pMD18-pks进行双酶 切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。采用胶回收试剂盒(生工货号： B518131-0050)切胶回收目的基因片段用T4 DNA ligase连接。酶连产物转化大肠 杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于含20μg/mL氯霉素的LB固体培养基，37℃培 养过夜。筛选得到的阳性转化子以引物F-p-up1和R-p-down2进行菌落PCR扩增， PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，片段大小与预期(1701bp)一致，认为质粒 pB-pks构建成功。

上述反应体系为：

上述PCR程序见表5。

表5 PCR程序

(2)质粒pB-p1hp2的构建

用限制性内切酶Sal I分别酶切质粒pB-pks和pMD18-hyg，酶切产物进行1％ 琼脂糖凝胶电泳。采用胶回收试剂盒(生工货号：B518131-0050)胶回收目的基 因片段用T4 DNAligase连接，即构建获得包括pks基因上下游同源臂，中间插入 hyg基因的融合基因片段(p1hp2)。酶连产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞， 并涂布于含20μg/mL氯霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜。筛选得到的阳性 转化子以引物F-p-up1和R-p-down2进行菌落PCR扩增目的基因片段p1hp2(SEQ ID NO：9)，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，片段大小与预期(3615bp)一 致，如图2所示。测序结果经BLAST2分析，表明重组质粒pB-p1hp2构建成功。

上述反应体系为：

上述PCR程序见表6。

表6 PCR程序

其中，重组质粒pB-p1hp2的详细构建过程如图1所示。

实施例4

赭曲霉的原生质体转化和重组菌的鉴定

(1)重组质粒pB-p1hp2转化赭曲霉

从大肠杆菌中提取重组质粒pB-p1hp2，通过CaCl₂/PEG介导法将该重组质粒 导入赭曲霉原生质体。原生质体经再生培养6-8h后涂布于含125μg/mL潮霉素 抗性的PDA平板上，28℃培养3-5天。重组质粒上的p1hp2融合片段通过同源重 组与赭曲霉染色体上的pks基因上同源片段发生双交换，使得聚酮合酶基因被敲 除且阳性菌株表现出潮霉素抗性。挑选经相同抗性平板复筛后所得的阳性转化子 进行基因水平的验证。

其中，原生质体制备操作如下：

挑取PDA平板上生长6-8天的原始赭曲霉菌株于装有10mL生理盐水的50mL 离心管中，涡旋混匀，再将孢子液接入100mL种子培养基中，200rpm，28℃摇 瓶培养过夜，约19h，此时获得较好的种子液。再将活化好的种子液接种于发酵 培养基中，200rpm，28℃摇瓶培养17-18h，使赭曲霉处于生长对数期。无菌条 件下收集菌丝体，称取3种细胞壁裂解酶：0.1％蜗牛酶、0.1％纤维素酶和0.01％ 溶菌酶溶解在10mL的1M山梨醇溶液中，用0.45μm的细菌滤器过滤酶液于30mL 的摇瓶中。将收集的菌丝体以1:10的比例加入混合酶液中轻轻摇匀，使得菌丝 体均匀分布在酶液中，置于摇床100rpm，28℃、摇瓶裂解3-4h，直至大多数孢 子裂解为原生质体。3层擦镜纸过滤酶解混合液，用1M山梨醇溶液冲洗滤渣2-3 次。收集滤液至1.5mL离心管中，4℃3000rpm离心10min。弃上清液留原生质 体沉淀，用500μL的山梨醇-Tris-CaCl₂溶液(STC：0.8M山梨醇，50mM Tris-HCl (pH 7.4)，50mM CaCl₂)重悬浮原生质体沉淀。4℃、3000rpm，离心10min弃 上清液，用400mL的STC溶液重悬浮原生质体沉淀。血球计数板，将原生质体 浓度调整在10⁷/mL，4℃、3000rpm，离心2min，弃上清液，用400μL的STC溶液重悬浮原生质体，逐滴加入100μL的山梨醇-Tris-CaCl₂-PEG4000溶液(SPTC： 0.8M山梨醇，50mM Tris-HCl(pH 7.4)，50mM CaCl₂，1M PEG400)，冰上放置待 用。

转化操作步骤如下：

将1mL的原生质体悬浮液、30μL的重组质粒和2.5μL的肝素钠(5mg/mL) 加入管中，轻轻混匀，冰上静置30min。逐滴加入1/3体积的SPTC溶液，轻轻 混匀，在室温下静置20min。将混合液转入10mL的再生培养基(RM)中，室 温静置2h后28℃、100rpm培养6-8h左右。取400μL菌液涂布于125μg/mL的 潮霉素抗性PDA平板上，以普通PDA平板做对照，静置培养约5-6天。

(2)重组菌株的鉴定

挑取经潮霉素抗性平板复筛所得的阳性转化子于种子培养基中，28℃培养 18h，转接种子液于发酵培养基中，28℃培养24h。利用OMEGA公司DNA提 取试剂盒(D3390-00)提取的阳性转化子基因组DNA为模板，以原始菌株pks 基因上、下游DNA序列设计引物F-Scp和R-Scp，通过PCR进行转化子验证。若 融合基因p1hp2在原始菌株pks基因位置发生双交换，则可扩增获得3813bp的 基因片段(命名为Sc-p1hp2)(SEQ ID NO：10)；以原始菌株的基因组DNA为对 照，用上述引物则扩增获得1893bp的基因片段(命名为Sc-pks)(SEQ ID NO：11)。 分别将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。PCR验证结果如图3所示，泳道2-3 为对照组，目的片段Sc-pks与预期大小一致；泳道4-5为实验组，目的片段 Sc-p1hp2大小与预期结果一致。测序结果显示，Sc-p1hp2与预期序列同源性高达 99.8％，说明成功得到pks基因敲除赭曲霉突变菌株，保藏编号为CCTCC NO： M2019186。

上述反应体系为：

上述PCR程序见表7。

表7 PCR程序

实施例5

重组菌产OTA检测结果

由茄子瓶内划取适量的MF018重组菌株孢子于种子培养基中，28℃培养18h， 转接种子液于发酵培养基中，28℃培养48h。灭活发酵混合液，利用砂式漏斗过 滤分离菌丝体与发酵液，将收集到的菌丝与发酵液分别体制备成灭活发酵液及菌 体灭活干粉，送至广东省微生物分析检测中心进行检测。该检测中心参照GB 5009.96-2016第一法内容进行OTA含量检测。检测结果如表8。

表8分析检测结果

根据检测结果可知，赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株不再具有产生 赭曲霉毒素A的能力。即利用基因工程方法敲除了赭曲霉中的pks基因，成功获 得失去产OTA能力的赭曲霉突变菌株。从源头上解决OTA污染问题，为赭曲霉 菌株的工业化应用提供安全菌株。

上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任 何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海应用技术大学

<120> 赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株及其构建和应用

<130> BCN1192083

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

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<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

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<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gtcgacctga tattgaagga gcac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gtcgacgcgg ccgctctaga acta 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gcagcagcgt gttctgctgg ag 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

cagcgtgatg ctagacgacg ag 22

<210> 7

<211> 1701

<212> DNA

<213> Aspergillus ochraceus

<400> 7

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gtatcttctg tggtgtgatg tgtgacgact atcagacgat ccagcagcgc gacgtctcag 120

agttaccgca ttacacggct acaggaacag cgcggtcgat catttcaaac cgcgtctcct 180

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ttgctctaca tttggcggcc aaagcattgc atgacggtga ctgccgcgtc gcagtcgcct 300

ccgggacaaa cctgatcttg gtcccaaaca tgtacatttc cgaatccaaa ttgagtatgc 360

tgtcgccgca cggccgcagt cgtatgtggg atgctggcgc agatggctac gcgcgtggcg 420

agggtgtcgc agccgtagcc ctcaagcgac tcagcgacgc tatcgccgac ggcgacgcta 480

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tgccctcttc cactgcccaa accgacctga tccggtcgac ctaccggaag gccggtctgg 600

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tgggcctaga tttgatgcaa cggagccctg acgcggagac atggctgaca accttgcaaa 1440

tggctttgga cgatctcccc gtcgagtacc ggcccgcgta ctcgatacta gacgagttat 1500

gcgccgagtc agagaactca cggctacacc tggcagagat ctcgcagcca ctgtgcacag 1560

cagtgcagat tgttctagtt aagttcctcc gctcacttgg catacacctg aatgctgttg 1620

tcggccactc ctcgggcgaa atcgcggctg cctacgctgc aggcatgatt tcagaaatag 1680

aggcaattcg cattgctcga g 1701

<210> 8

<211> 1920

<212> DNA

<213> Streptomyces hygroscopious

<400> 8

gtcgacctga tattgaagga gcactttttg ggcttggctg gagctagtgg aggtcaacaa 60

tgaatgccta ttttggttta gtcgtccagg cggtgagcac aaaatttgtg tcgtttgaca 120

agatggttca tttaggcaac tggtcagatc agccccactt gtagcagtag cggcggcgct 180

cgaagtgtga ctcttattag cagacaggaa cgaggacatt attatcatct gctgcttggt 240

gcacgataac ttggtgcgtt tgtcaagcaa ggtaagtgaa cgacccggtc ataccttctt 300

aagttcgccc ttcctccctt tatttcagat tcaatctgac ttacctattc tacccaagca 360

tcgatatgaa aaagcctgaa ctcaccgcga cgtctgtcga gaagtttctg atcgaaaagt 420

tcgacagcgt ctccgacctg atgcagctct cggagggcga agaatctcgt gctttcagct 480

tcgatgtagg agggcgtgga tatgtcctgc gggtaaatag ctgcgccgat ggtttctaca 540

aagatcgtta tgtttatcgg cactttgcat cggccgcgct cccgattccg gaagtgcttg 600

acattgggga attcagcgag agcctgacct attgcatctc ccgccgtgca cagggtgtca 660

cgttgcaaga cctgcctgaa accgaactgc ccgctgttct gcagccggtc gcggaggcca 720

tggatgcgat cgctgcggcc gatcttagcc agacgagcgg gttcggccca ttcggaccgc 780

aaggaatcgg tcaatacact acatggcgtg atttcatatg cgcgattgct gatccccatg 840

tgtatcactg gcaaactgtg atggacgaca ccgtcagtgc gtccgtcgcg caggctctcg 900

atgagctgat gctttgggcc gaggactgcc ccgaagtccg gcacctcgtg cacgcggatt 960

tcggctccaa caatgtcctg acggacaatg gccgcataac agcggtcatt gactggagcg 1020

aggcgatgtt cggggattcc caatacgagg tcgccaacat cttcttctgg aggccgtggt 1080

tggcttgtat ggagcagcag acgcgctact tcgagcggag gcatccggag cttgcaggat 1140

cgccgcggct ccgggcgtat atgctccgca ttggtcttga ccaactctat cagagcttgg 1200

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ccggagccgg gactgtcggg cgtacacaaa tcgcccgcag aagcgcggcc gtctggaccg 1320

atggctgtgt agaagtactc gccgatagtg gaaaccgacg ccccagcact cgtccgaggg 1380

caaaggaata gagtagatgc cgaccggatc gatccactta acgttactga aatcatcaaa 1440

cagcttgacg aatctggata taagatcgtt ggtgtcgatg tcagctccgg agttgagaca 1500

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<210> 9

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<213> Artificial sequence

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gtatcttctg tggtgtgatg tgtgacgact atcagacgat ccagcagcgc gacgtctcag 120

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ccgggacaaa cctgatcttg gtcccaaaca tgtacatttc cgaatccaaa ttgagtatgc 360

tgtcgccgca cggccgcagt cgtatgtggg atgctggcgc agatggctac gcgcgtggcg 420

agggtgtcgc agccgtagcc ctcaagcgac tcagcgacgc tatcgccgac ggcgacgcta 480

tcgaatgcat tattcctgct acgcatatca accaggatgg tcgcagcatg ggtatcacga 540

tgccctcttc cactgcccaa accgacctga tccggtcgac ctgatattga aggagcactt 600

tttgggcttg gctggagcta gtggaggtca acaatgaatg cctattttgg tttagtcgtc 660

caggcggtga gcacaaaatt tgtgtcgttt gacaagatgg ttcatttagg caactggtca 720

gatcagcccc acttgtagca gtagcggcgg cgctcgaagt gtgactctta ttagcagaca 780

ggaacgagga cattattatc atctgctgct tggtgcacga taacttggtg cgtttgtcaa 840

gcaaggtaag tgaacgaccc ggtcatacct tcttaagttc gcccttcctc cctttatttc 900

agattcaatc tgacttacct attctaccca agcatcgata tgaaaaagcc tgaactcacc 960

gcgacgtctg tcgagaagtt tctgatcgaa aagttcgaca gcgtctccga cctgatgcag 1020

ctctcggagg gcgaagaatc tcgtgctttc agcttcgatg taggagggcg tggatatgtc 1080

ctgcgggtaa atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc gttatgttta tcggcacttt 1140

gcatcggccg cgctcccgat tccggaagtg cttgacattg gggaattcag cgagagcctg 1200

acctattgca tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc aagacctgcc tgaaaccgaa 1260

ctgcccgctg ttctgcagcc ggtcgcggag gccatggatg cgatcgctgc ggccgatctt 1320

agccagacga gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa tcggtcaata cactacatgg 1380

cgtgatttca tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc actggcaaac tgtgatggac 1440

gacaccgtca gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc tgatgctttg ggccgaggac 1500

tgccccgaag tccggcacct cgtgcacgcg gatttcggct ccaacaatgt cctgacggac 1560

aatggccgca taacagcggt cattgactgg agcgaggcga tgttcgggga ttcccaatac 1620

gaggtcgcca acatcttctt ctggaggccg tggttggctt gtatggagca gcagacgcgc 1680

tacttcgagc ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc ggctccgggc gtatatgctc 1740

cgcattggtc ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg gcaatttcga tgatgcagct 1800

tgggcgcagg gtcgatgcga cgcaatcgtc cgatccggag ccgggactgt cgggcgtaca 1860

caaatcgccc gcagaagcgc ggccgtctgg accgatggct gtgtagaagt actcgccgat 1920

agtggaaacc gacgccccag cactcgtccg agggcaaagg aatagagtag atgccgaccg 1980

gatcgatcca cttaacgtta ctgaaatcat caaacagctt gacgaatctg gatataagat 2040

cgttggtgtc gatgtcagct ccggagttga gacaaatggt gttcaggatc tcgataagat 2100

acgttcattt gtccaagcag caaagagtgc cttctagtga tttaatagct ccatgtcaac 2160

aagaataaaa cgcgtttcgg gtttacctct tccagataca gctcatctgc aatgcattaa 2220

tgcattggac ctcgcaaccc tagtacgccc ttcaggctcc ggcgaagcag aagaatagct 2280

tagcagagtc tattttcatt ttcgggagac gagatcaagc agatcaacgg tcgtcaagag 2340

acctacgaga ctgaggaatc cgctcttggc tccacgcgac tatatatttg tctctaattg 2400

tactttgaca tgctcctctt ctttactctg atagcttgac tatgaaaatt ccgtcaccag 2460

cccctgggtt gcggccgctc tagaactagt cgacctaccg gaaggccggt ctggacccag 2520

ccaatccgcg tgaccgatgc cagtattttg aagcccacgg gacagggact ccagctggcg 2580

atccccaaga agcgtctgca atacacgcgg ctttctttcc taacccagtt gacgacaaga 2640

gcgatccgga taatcggttg tttgtgggct cggccaagac cgtcgtgggc cataccgaag 2700

gcgcggccgg ccttgcagcc ttaattaaag gtgtaatgag cctgcagcac ggggttgtgg 2760

cgccgaactt gcacttcgag cgactgaacc cggctattga accctatgcc aaccagctgc 2820

gtgtcccgac agactgtcag ccctggccac agctgcccga gggcacgccg cgacgagtct 2880

cggtcaattc attcgggttc ggcggtacca acgcccacgc gattctggag tcgtatagcc 2940

ctaccttgtc agacaacaat tcgcccgaat gggacggcat tatcccgttc gtctttactg 3000

ccccgtcgga taaggcgctc ggaaacgtct tgggcgcata cgtggattat ttggacggtc 3060

agcaaccaac ggccgacctg gccgatttgg catggacgtt gttccgccga cggtccacct 3120

tttctcaccg agttgcctta tgggcggcat ccgcgcagga tctgcaaaac cggctgcgcg 3180

aggaagtcgc gaggcgtggg tcgaaccagg cctccacagt gatttccaag cctcgaaacg 3240

atcgacccaa ggtactagga gtgtttaccg ggcagggcgc tcagtgggca cagatgggcc 3300

tagatttgat gcaacggagc cctgacgcgg agacatggct gacaaccttg caaatggctt 3360

tggacgatct ccccgtcgag taccggcccg cgtactcgat actagacgag ttatgcgccg 3420

agtcagagaa ctcacggcta cacctggcag agatctcgca gccactgtgc acagcagtgc 3480

agattgttct agttaagttc ctccgctcac ttggcataca cctgaatgct gttgtcggcc 3540

actcctcggg cgaaatcgcg gctgcctacg ctgcaggcat gatttcagaa atagaggcaa 3600

ttcgcattgc tcgag 3615

<210> 10

<211> 3813

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

gcagcagcgt gttctgctgg agacagtcta cactagtgag ccgtcgaggc cgccggtctg 60

cggctggaag acctcaaagg atcgcccaca ggtatcttct gtggtgtgat gtgtgacgac 120

tatcagacga tccagcagcg cgacgtctca gagttaccgc attacacggc tacaggaaca 180

gcgcggtcga tcatttcaaa ccgcgtctcc tactttttcg actggcacgg cccctctatg 240

accattgata ctgcctgctc atctagcctg gttgctctac atttggcggc caaagcattg 300

catgacggtg actgccgcgt cgcagtcgcc tccgggacaa acctgatctt ggtcccaaac 360

atgtacattt ccgaatccaa attgagtatg ctgtcgccgc acggccgcag tcgtatgtgg 420

gatgctggcg cagatggcta cgcgcgtggc gagggtgtcg cagccgtagc cctcaagcga 480

ctcagcgacg ctatcgccga cggcgacgct atcgaatgca ttattcctgc tacgcatatc 540

aaccaggatg gtcgcagcat gggtatcacg atgccctctt ccactgccca aaccgacctg 600

atccggtcga cctgatattg aaggagcact ttttgggctt ggctggagct agtggaggtc 660

aacaatgaat gcctattttg gtttagtcgt ccaggcggtg agcacaaaat ttgtgtcgtt 720

tgacaagatg gttcatttag gcaactggtc agatcagccc cacttgtagc agtagcggcg 780

gcgctcgaag tgtgactctt attagcagac aggaacgagg acattattat catctgctgc 840

ttggtgcacg ataacttggt gcgtttgtca agcaaggtaa gtgaacgacc cggtcatacc 900

ttcttaagtt cgcccttcct ccctttattt cagattcaat ctgacttacc tattctaccc 960

aagcatcgat atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga 1020

aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt 1080

cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt 1140

ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt 1200

gcttgacatt ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg 1260

tgtcacgttg caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga 1320

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ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc 1500

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gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc 1680

gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc 1740

aggatcgccg cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag 1800

cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt 1860

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gagggcaaag gaatagagta gatgccgacc ggatcgatcc acttaacgtt actgaaatca 2040

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agacaaatgg tgttcaggat ctcgataaga tacgttcatt tgtccaagca gcaaagagtg 2160

ccttctagtg atttaatagc tccatgtcaa caagaataaa acgcgtttcg ggtttacctc 2220

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cttcaggctc cggcgaagca gaagaatagc ttagcagagt ctattttcat tttcgggaga 2340

cgagatcaag cagatcaacg gtcgtcaaga gacctacgag actgaggaat ccgctcttgg 2400

ctccacgcga ctatatattt gtctctaatt gtactttgac atgctcctct tctttactct 2460

gatagcttga ctatgaaaat tccgtcacca gcccctgggt tgcggccgct ctagaactag 2520

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ggtgtaatga gcctgcagca cggggttgtg gcgccgaact tgcacttcga gcgactgaac 2820

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tccgcgcagg atctgcaaaa ccggctgcgc gaggaagtcg cgaggcgtgg gtcgaaccag 3240

gcctccacag tgatttccaa gcctcgaaac gatcgaccca aggtactagg agtgtttacc 3300

gggcagggcg ctcagtgggc acagatgggc ctagatttga tgcaacggag ccctgacgcg 3360

gagacatggc tgacaacctt gcaaatggct ttggacgatc tccccgtcga gtaccggccc 3420

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gagatctcgc agccactgtg cacagcagtg cagattgttc tagttaagtt cctccgctca 3540

cttggcatac acctgaatgc tgttgtcggc cactcctcgg gcgaaatcgc ggctgcctac 3600

gctgcaggca tgatttcaga aatagaggca attcgcattg ctcgagccca cctccgcggc 3660

cacgtcacct cactggcagg atgtaacggg cagcctggaa gcatgctggc cgttggcatg 3720

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<210> 11

<211> 1893

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

gcagcagcgt gttctgctgg agacagtcta cactagtgag ccgtcgaggc cgccggtctg 60

cggctggaag acctcaaagg atcgcccaca ggtatcttct gtggtgtgat gtgtgacgac 120

tatcagacga tccagcagcg cgacgtctca gagttaccgc attacacggc tacaggaaca 180

gcgcggtcga tcatttcaaa ccgcgtctcc tactttttcg actggcacgg cccctctatg 240

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catgacggtg actgccgcgt cgcagtcgcc tccgggacaa acctgatctt ggtcccaaac 360

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ctcagcgacg ctatcgccga cggcgacgct atcgaatgca ttattcctgc tacgcatatc 540

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gaagcccacg ggacagggac tccagctggc gatccccaag aagcgtctgc aatacacgcg 720

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tcggccaaga ccgtcgtggg ccataccgaa ggcgcggccg gccttgcagc cttaattaaa 840

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cagctgcccg agggcacgcc gcgacgagtc tcggtcaatt cattcgggtt cggcggtacc 1020

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tgggacggca ttatcccgtt cgtctttact gccccgtcgg ataaggcgct cggaaacgtc 1140

ttgggcgcat acgtggatta tttggacggt cagcaaccaa cggccgacct ggccgatttg 1200

gcatggacgt tgttccgccg acggtccacc ttttctcacc gagttgcctt atgggcggca 1260

tccgcgcagg atctgcaaaa ccggctgcgc gaggaagtcg cgaggcgtgg gtcgaaccag 1320

gcctccacag tgatttccaa gcctcgaaac gatcgaccca aggtactagg agtgtttacc 1380

gggcagggcg ctcagtgggc acagatgggc ctagatttga tgcaacggag ccctgacgcg 1440

gagacatggc tgacaacctt gcaaatggct ttggacgatc tccccgtcga gtaccggccc 1500

gcgtactcga tactagacga gttatgcgcc gagtcagaga actcacggct acacctggca 1560

gagatctcgc agccactgtg cacagcagtg cagattgttc tagttaagtt cctccgctca 1620

cttggcatac acctgaatgc tgttgtcggc cactcctcgg gcgaaatcgc ggctgcctac 1680

gctgcaggca tgatttcaga aatagaggca attcgcattg ctcgagccca cctccgcggc 1740

cacgtcacct cactggcagg atgtaacggg cagcctggaa gcatgctggc cgttggcatg 1800

tccccggacg aggccgatca ggtctgccag agcgcggtgt acacgggtcg catcaagcct 1860

gcggcggtga actcgtcgtc tagcatcacg ctg 1893

Claims (9)

1.一种赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株，保藏编号为CCTCC NO：M2019186。

2.权利要求1所述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株的构建方法，其特征在于，包括：

步骤1：克隆赭曲霉聚酮合酶编码基因pks；

步骤2：克隆选择性标记抗性基因；

步骤3：构建含有pks上下游关键DNA序列p-u1、p-d1和所述的选择性标记抗性基因的融合基因，并将融合基因插入质粒构建重组质粒；

步骤4：重组质粒转化大肠杆菌DH5α，培养并筛选转化子进行重组质粒验证；

步骤5：制备赭曲霉原生质体；

步骤6：重组质粒转化赭曲霉原生质体；

步骤7：培养和筛选转化后的赭曲霉获得赭曲霉阳性转化子；

步骤8：对阳性转化子进行基因水平的验证，获得赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株。

3.如权利要求2所述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株的构建方法，其特征在于，所述的质粒为pSilent-Dual1、pBC-Hygro、pAg1-H3和pMD18-T中的至少一种。

4.如权利要求2所述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株的构建方法，其特征在于，所述的步骤4中筛选所用抗性标记为氨苄青霉素、氯霉素或卡那霉素，浓度为10-60μg/mL。

5.如权利要求2所述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株的构建方法，其特征在于，所述的步骤7中筛选所用抗性标记为博来霉素或潮霉素，浓度为20-150μg/mL。

6.权利要求1所述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株在发酵工程或生物医药工程领域中的应用。

7.权利要求1所述的赭曲霉毒素A基因敲除的赭曲霉突变菌株在制备甾体类药物中的应用。

8.一种重组质粒，其特征在于，含有pks上下游关键DNA序列p-u1、p-d1和选择性标记抗性基因的融合基因。

9.一种重组菌，其特征在于，含有权利要求8所述的重组质粒。