JP5753419B2 - 遺伝子欠損株及びそれを用いたタンパク質の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、新規な遺伝子欠損株、及びそれを用いたタンパク質の製造方法に関する。

微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類、あるいはアミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐にわたっており、またそれらの用途も、食品、医薬品、洗剤、化粧品等の日用品、あるいは各種化成品原料等、幅広い分野にわたっている。

微生物を用いた有用物質の工業的生産における一つの重要課題として、当該有用物質の生産性向上が挙げられる。従来、当該課題を解決するため、突然変異等の遺伝学的手法による高生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いた、より効率的な高生産菌の育種が行われている。更に、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受け、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用する試みもなされている。

微生物は元来、自然界における環境変化に対応するための多種多様な遺伝子群を有しており、限定された生産培地が使用されるタンパク質等の工業的生産においては、必ずしも生産効率が高いとは言えない状況であった。

しかるところ、バチルス属細菌において、胞子形成初期に関わる遺伝子を欠失又は不活性化した菌株が構築され、タンパク質やポリペプチドの生産性向上効果が得られている。例えば、枯草菌のｓｉｇＥ、ｓｉｇＦ、ｓｐｏＩＩＥ、ｓｐｏＩＩＳＢ、ｓｉｇＧ、又は、ｓｐｏＩＶＣＢからｓｐｏＩＩＩＣまでの領域に含まれる遺伝子群を欠失した宿主菌株を用いることによって、セルラーゼなどの分泌生産性が向上することが開示されている（特許文献１）。

しかしながら、産業的なタンパク質やポリペプチド生産の場においては生産コストをできるだけ低減化する必要があり、このためには更に高い生産性が求められている。この点、上記の各遺伝子は胞子形成の第ＩＩ期以降に発現し機能する遺伝子であるため、当該遺伝子を欠失や不活性化した場合に於いても細胞は胞子形成の初期段階に入っており、ゆえにタンパク質やポリペプチド生産の観点から改善の余地がある。また、胞子形成期の初期段階を制御するｓｐｏ０Ａ遺伝子（ＢＧ１０７６５）を欠失又は不活性化することによって胞子形成が初期段階で停止することが知られているが、同時に激しい溶菌現象が生じるという問題が存在する。

近年、枯草菌ゲノムに存在する約４１００種類の遺伝子の破壊株が網羅的に研究され、２７１個の遺伝子が成育に必須であることが報告され（非特許文献１）、また本出願人は遺伝子組換えのための宿主微生物として、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ） Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８系統株の遺伝子破壊株を網羅的に解析し、枯草菌ゲノムの大量域を欠失させ、各種酵素の生産性に優れた宿主変異株の創出に成功している（特許文献２）。

また、ある種の微生物では、幾つかの細胞外プロテアーゼ遺伝子を欠失させた菌株が構築されており、例えば、ｎｐｒＥ遺伝子の欠失により溶菌の指標となる細胞内酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼの若干の溶出が見られ、更にａｐｒＥ遺伝子の欠失を組み合わせることにより、その溶出が顕著になることが示されている（特許文献３）。すなわち、複数の細胞外プロテアーゼの欠失を組み合わせることにより枯草菌の溶菌が生じるという問題が存在する。

この点、枯草菌の主要な細胞壁溶解酵素ＣｗｌＢ（Ｎ−アセチルムラモイル−アラニンアミダーゼ、以前はＬｙｔＣと呼ばれていた）をコードするｃｗｌＢ遺伝子（ＢＧ１０４０７、以前はｌｙｔＣ遺伝子）を不活性化することによる溶菌現象の抑制が報告されている（非特許文献３）。しかしながら、細胞壁溶解酵素群は細胞分裂や運動性など細胞の増殖にとり重要な役割を果たすといわれ、その欠失や不活性化によって細胞の生育に大きな変化が生じ、タンパク質又はポリペプチドの生産にも影響することが懸念される。例えば、予備検討データではあるが、細胞壁溶解酵素をコードするｃｗｌＢ（ｌｙｔＣ）遺伝子又はｃｗｌＧ（ｌｙｔＤ）遺伝子の不活性化によってタンパク質の分泌が抑制されたとの報告も存在する（非特許文献４）。

特開２００３−４７４９０号公報 特開２００７−１３００１３号公報 特開２００９−３８９８５号公報

Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，４６７８−４６８３，２００３ Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２９，１４１−１４５（１９９９） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３，７３０４−７３１２（１９９１） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４６，２４９−２６２（２０００）

本発明は、細胞外プロテアーゼ遺伝子の欠失株であっても目的タンパク質又はポリペプチドの培養液からの回収を容易にし、その生産性向上を可能とする枯草菌変異株の提供、並びに、当該枯草菌変異株を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの製造方法の提供に関する。

本発明者らは、枯草菌の各種遺伝子欠失株について検討したところ、細胞外プロテアーゼ遺伝子の欠失と溶菌関連遺伝子又は遺伝子群の欠失とを組み合わせた枯草菌変異株を構築することにより、細胞外プロテアーゼ遺伝子の欠失株と同等以上の目的タンパク質又はポリペプチドの分泌生産性が得られ、且つ当該枯草菌変異株の溶菌が起こらないため、、その結果、目的タンパク質又はポリペプチドの培養液からの回収が容易になることを見出した。

すなわち本発明は、以下の（１）〜（７）に係るものである。
（１） ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ及びａｐｒＸから選択される細胞外プロテアーゼ遺伝子が８個以上欠失又は不活性化し、かつ、ｃｗｌＢ、ｃｗｌＦ、ＰＢＳＸ、ｓｐｏＩＩＩＣ及びｓｉｇＤから選択される溶菌酵素関連遺伝子又は遺伝子群が１個以上欠失又は不活性化している枯草菌変異株。
（２） 前記細胞外プロテアーゼ遺伝子が９個欠失又は不活性化している、前記（１）記載の枯草菌変異株。
（３） 細胞外プロテアーゼ遺伝子ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ及びａｐｒＸと、溶菌酵素関連遺伝子又は遺伝子群ｃｗｌＢ、ｃｗｌＦ、ＰＢＳＸ、ｓｐｏＩＩＩＣ及びｓｉｇＤと、が全て欠失又は不活性化している枯草菌変異株。
（４） 更に、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を有する、前記（１）から（３）のいずれか１つに記載の枯草菌変異株。
（５） 前記異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、又は分泌用シグナル領域が結合している、前記（４）記載の枯草菌変異株。
（６） 前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域に由来するものである、前記（５）記載の枯草菌変異株。
（７） 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域が、配列番号８６で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号８８で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は、当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である、前記（５）記載の枯草菌変異株。
（８） 前記（１）から（７）のいずれか１つに記載の枯草菌変異株を用いる、異種タンパク質又はポリペプチドの製造方法。

本発明のプロテアーゼ／溶菌酵素欠失枯草菌変異株を用いることにより、（１）培養上清中の不要なタンパク質を低減させることが可能となり、（２）目的タンパク質の比率（比活性）を向上させることが可能となり、（３）細胞内から溶出するプロテアーゼの影響を抑制（目的タンパク質の更なる分解を抑制）することが可能となり、（４）枯草菌の形状がフィラメント状となる結果、膜透過性が向上し、目的タンパク質の生産後の処理工程において除菌が容易になる。

ＳＯＥ−ＰＣＲによる遺伝子欠失用ＤＮＡ断片の調製、及び当該ＤＮＡ断片を用いて標的遺伝子を欠失（薬剤耐性遺伝子と置換）する方法を模式的に示したものである。 遺伝子欠失用プラスミドを用いて標的遺伝子を欠失（薬剤耐性遺伝子と置換）する方法を模式的に示したものである。 ｂｇｌＣ過剰発現プラスミドの構築方法を模式的に示したものである。 枯草菌１６８株、Δ９ｐｒｔ株、Δ９ｌｙｔ株の培養液上清のタンパク質（セルラーゼＢｇｌＣ）分析を示したものである。 枯草菌１６８株、Δ９ｐｒｔ株、Δ９ｌｙｔ株の培養液上清のタンパク質（セルラーゼＮ２５２）分析を示したものである。

本発明の宿主微生物である枯草菌は、野生型のものでも変異を施したものでもよいが、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立され、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する枯草菌が好ましく、例えば枯草菌１６８株を元株として用い、更にその元株から所定の遺伝子を欠失させて作製した枯草菌変異株が挙げられる。

ここで、枯草菌１６８株とは、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８として公知の枯草菌株であり、通常、遺伝子組換えタンパク質生産の際の野生株として用いられている。また枯草菌１６８株の全塩基配列及び遺伝子は既に報告されており、またインターネット公開されている（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，１９９７及びＢＳＯＲＦ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ［ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／３８６８０３３５］）。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報に基づいて、各種遺伝子操作を行うことができる。

本発明において、細胞外プロテアーゼ遺伝子とは、細胞内で産生された後分泌された目的タンパク質又はペプチドの他、溶菌（細胞壁分解）酵素の分解を触媒する酵素タンパク質をコードする遺伝子を意味する。また、溶菌酵素関連遺伝子又は遺伝子群とは、細胞壁の分解を触媒する酵素タンパク質、並びにそれに関連して間接的に細胞壁の分解を促進する他のタンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子群を意味する。

本発明において欠失又は不活性化の対象となる、細胞外プロテアーゼ遺伝子及び溶菌酵素関連遺伝子の具体例を表１に示す。なお、表中の各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６（１９９７）で報告され、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）でインターネット公開（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／、２００３年６月１７日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づき記載されている。

参考文献１：Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９９０ ２２１（３）：４８６−９０
参考文献１１：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９６ １４２（Ｐｔ１２）：３４３７−４４
参考文献３：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０ １７２（２）：１０１９−２３
参考文献９：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０ １７２（２）：１０２４−９
参考文献１０：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９１ １７３（２０）：６３６４−７２
参考文献４：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９０ １７２（３）：１４７０−７
参考文献５：Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９０ ２６５（１２）：６８４５−５０
参考文献６：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９７９ １３９（２）：５８３−９０
参考文献８：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４ １６０（１）：１５−２１
参考文献２：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９１ １７３（２１）：６８８９−９５
参考文献７：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４ １５８（２）：４１１−８
参考文献１２：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０４，１３５−１４３（２００７）
参考文献１３：特開２００３−４７４９０号公報
参考文献１４：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３，７３０４−７３１２（１９９１）
参考文献１５：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０，２５４９−２５５５（１９９８）
参考文献１６：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４０，１８５５−１８６７（１９９４）
参考文献１７：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０，２１１０−２１１７（１９９８）
参考文献１８：Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４，５２５−５３５（１９９０）
参考文献１９：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｃｌｏｓｅｓｔ Ｒｅｌａｔｉｖｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＰＰ．２８９，（２００２）

すなわち、表１中のｅｐｒからａｐｒＸまでの９個の遺伝子が上記の細胞外プロテアーゼ遺伝子に該当し、ｌｙｔＣ（ｃｗｌＢ）からｓｉｇＤ遺伝子までの５種類の遺伝子又は遺伝子群が上記の溶菌関連遺伝子又は遺伝子群に該当する。

本発明では、細胞外に分泌される目的タンパク質又はポリペプチドの細胞外における分解を効果的に防止して目的タンパク質又はポリペプチドの生産性を向上させるため、上記の９個の細胞外プロテアーゼ遺伝子のうち、８個以上の遺伝子を欠失又は不活性化させることを特徴とし、９個欠失又は不活性化させるのがより好ましい。より具体的には、本願発明に係る枯草菌変異株は、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡの８個の遺伝子か、又は、ａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡの９個の遺伝子を欠失又は不活性化させるのが好ましい。なお、これらのプロテアーゼ遺伝子を欠失又は不活性化した枯草菌変異株は、特開２００６−１７４７０７号公報に記載の方法により作製することができる。

また、本発明では、細胞外プロテアーゼ欠失株と同等以上の目的タンパク質又はポリペプチドを生産し、且つ本発明に係る組換え枯草菌の溶菌を効果的に防止するため、上記の５個の溶菌関連遺伝子又は遺伝子群のうち、１個以上の遺伝子又は遺伝子群を欠失又は不活性化させることを特徴とし、２個以上欠失又は不活性化させるのがより好ましい。なお、本願における５個の溶菌関連遺伝子又は遺伝子群とは、ｃｗｌＢ、ｃｗｌＦ、ＰＢＳＸ、ｓｐｏＩＩＩＣ及びｓｉｇＤを意味するが、そのうちのＰＢＳＸとは、以下の３８種類の遺伝子群を含む領域のことを意味し、本願ではかかる領域を、欠失又は不活性化させる対象の１個とするものである。

本発明におけるＰＢＳＸの欠失又は不活性化は、これらの遺伝子群の一部又は全部の欠失又は不活性化により行うことができ、全部を欠失又は不活性化させることがより好ましい。

ここで、ｓｉｇＤ及びｓｐｏＩＩＩＣは転写因子の遺伝子である。すなわち本発明によれば、溶菌に直接関与しないが間接的に溶菌酵素に関連する遺伝子を欠失させた場合でも、溶菌を顕著に抑制することができる。

表１及び表２に記載の遺伝子は、例えば、当該遺伝子の塩基配列において１若しくは数個の塩基配列が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなる、当該遺伝子と同じ機能を有する遺伝子であってもよい。更に、表１及び表２に記載の遺伝子と同じ機能を有する、及び／又は、表１及び表２の各遺伝子と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する遺伝子も、表１及び表２に記載の遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失／不活性化しうる遺伝子に含まれる。

これらの遺伝子又は遺伝子群は、その内部に他のＤＮＡ断片を挿入するか、あるいは当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によっても不活性化できるが、好適には、標的遺伝子を物理的に削除する方がより望ましい。更に本発明の組換え枯草菌の構築において、上記以外の遺伝子の欠失又は不活性化と組み合わせてもよい。

遺伝子又は遺伝子群の欠失又は不活性化の手順としては、表１に示す標的遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。

標的遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親枯草菌細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域における相同組換えによって親枯草菌ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。あるいは、塩基置換や塩基挿入等による不活性化変異を導入した標的遺伝子、又は標的遺伝子の外側領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親枯草菌細胞内に取り込ませて親枯草菌ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側２ヶ所、又は標的遺伝子外側の２ヶ所の領域で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子が欠失又は不活性化した遺伝子断片と置換することが可能となる。

特に、相同組換えにより枯草菌の標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２３，２６８（１９９０）等）、かかる方法を２回又はそれ以上繰り返すことにより、本発明の組換え枯草菌を得ることができる。

また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化を行う方法としては、例えばランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親枯草菌にγ線等を照射する方法等が挙げられる。

以下、より具体的な例として、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１（１９８９））によって調製される欠失用ＤＮＡ断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明における遺伝子欠失方法は下記に限定されるものではない。

本方法で用いる欠失用ＤＮＡ断片は、標的遺伝子の上流に隣接する約０．２〜３ｋｂ断片（Ａ）と、同じく下流に隣接する約０．２〜３ｋｂ断片（Ｂ）の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片（Ｃ）を挿入した断片である。まず、１回目のＰＣＲによって、標的遺伝子の上流断片（Ａ）及び下流断片（Ｂ）、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片（Ｃ）の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片（Ａ）の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子断片（Ｃ）の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に下流断片（Ｂ）の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子断片（Ｃ）の下流側１０〜３０塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。

次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子が挿入し、（Ａ）（Ｃ）（Ｂ）の順に結合したＤＮＡ断片を得ることができる（図１）。

本発明では２つ又はそれ以上の遺伝子を欠失又は不活性化することが必要であるため、２種類又はそれ以上の薬剤耐性マーカー遺伝子を用いると簡便に目的の微生物菌株を分離することができる。薬剤耐性マーカー遺伝子の組合せについては特に限定されないが、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などが挙げられる。

ＰＣＲの方法についても特に限定されず、例えば実施例中に示したプライマーセットを用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のＰＣＲ用酵素キット等を用いて、成書（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ２５１（１９９３）、Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９）等）に示される通常の条件によりＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、各遺伝子の欠失用ＤＮＡ断片が得られる。

また、上記の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の３断片を、適当なプラスミドベクター上で、（Ａ）（Ｃ）（Ｂ）の順になる様にクローニングし、元のプラスミドベクター部分のみを１ヶ所で切断する制限酵素で処理することによっても、同様の欠失用ＤＮＡ断片を得ることができる（図２）。

かくして得られた欠失用ＤＮＡ断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある標的遺伝子の上流及び下流の相同領域において相同組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子で置換される。それにより得られた細胞を、クロラムフェニコールなどの薬剤を含む寒天培地上において生育させ、生じたコロニーを分離することにより、標的遺伝子が欠失した組換え枯草菌を得ることができる。また、標的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換されて欠失していることを、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによって確認することができる。

このようなステップを繰り返し、表１及び表２に示される枯草菌の遺伝子が欠失又は不活性化された枯草菌変異株に、目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。

本発明の微生物を用いて生産する目的タンパク質又はポリペプチドは特に限定されないが、例えば食品用、医薬品用、化粧品用、洗浄剤用、繊維処理用、医療検査薬用等として有用な酵素や生理活性因子等のタンパク質やポリペプチドが挙げられる。産業用に用いられる酵素としては、酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ）、転移酵素（トランスフェラーゼ）、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素（イソメラーゼ）、合成酵素（リガーゼ／シンセターゼ）等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８０，３０９（１９９１））中でファミリー５に属するセルラーゼ（エンドグルカナーゼ）が挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセルラーゼ（エンドグルカナーゼ）が挙げられる。

より具体的な例としては、配列番号８３で示されるアミノ酸配列からなる枯草菌由来エンドグルカナーゼＢｇｌＣ、又は当該アミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼ、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼ；

より具体的な例としては、配列番号８５で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌ＫＳＭ−Ｎ２５２（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４７４）株由来のアルカリエンドグルカナーゼ、又は当該アミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリエンドグルカナーゼ、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリエンドグルカナーゼ

配列番号８７で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ、又は当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上、もっとも好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ；

配列番号８９で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼ、又は当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上、もっとも好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが挙げられる。

その他の目的タンパク質又はポリペプチドの具体例としては、バチルス属細菌ＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４６、特開２０００-１８４８８２号）由来のアルカリアミラーゼ、又はそれと７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼ、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアミラーゼ；

バチルス属細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２、ＷＯ９９／１８２１８）由来のアルカリプロテアーゼ、又はそれと７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼ、又は当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが挙げられる。

宿主枯草菌に導入される上記目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、すなわちＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）、ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号８６で示される塩基配列の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号８８で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は上記いずれかの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントの条件でハイブリダイズし且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。またここで言うストリンジェントな条件とは、例えば［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）］に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。

なお、本発明におけるアミノ酸配列および塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメータであるＵｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

本発明の方法による目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、上記組換え微生物を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、当該目的のタンパク質又はポリペプチドを精製することにより行えばよい。培養に使用される培地の組成及び培養条件については、使用する微生物の種類や目的タンパク質又はポリペプチドの種類等にしたがって、当業者が適宜選択することができる。目的タンパク質又はポリペプチドの精製は、培養終了後の菌体を材料として行っても良いが、本発明の組換え微生物は多量の目的タンパク質又はポリペプチドを細胞外に分泌する能力を有するため、培養終了後の培養上清を材料として行うのが有利である。

具体的には、上記の適切なプロモーターが作動可能に連結した目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子を、枯草菌細胞内で自立複製可能なベクターに挿入して枯草菌細胞内に導入することにより、枯草菌形質転換体を得ることが可能であり、当該ベクターの例としてはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。

更に、上記で得られた枯草菌形質転換体を、適切な培地において培養し、目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子を発現させ、更に当該目的タンパク質又はポリペプチドを細胞外へ分泌させる。当該遺伝子を発現させる際、当該遺伝子に連結したプロモーターの性質に応じて、当該培地の組成を適宜調節するのが好ましい。特に発現誘導型プロモーターを用いる場合には、そのプロモーター活性を向上させる誘導物質を適切なタイミングで培地中に添加するのが好ましい。

上記の枯草菌変異株は、例えば同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種して培養して行うことができる。培養方法は、原則的には一般的な微生物の培養方法であってよく、通常、液体培養による振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。

培養終了後、培養液を遠心分離し、得られる上清又は菌体から、硫安沈殿やクロマトグラフィなどを適宜組み合わせ、常法に従い、目的タンパク質又はポリペプチドを抽出・精製することにより得ることができる。

以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）及び付属の試薬類を用いた、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）によるＤＮＡ増幅により行った。ＰＣＲ反応液は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センス及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ添加し、更に総反応液量を５０μＬとすることにより調製した。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整、目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応、とした。

また、以下の実施例において、遺伝子の上流及び下流とは、複製開始点からの位置を指すのではなく、上流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の開始コドンの５’側に続く領域を指し、一方下流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の終止コドンの３’側に続く領域を指すものとする。

枯草菌の形質転換は、コンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３，１９２５（１９６７））により行った。すなわち、枯草菌株をＳＰＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０２％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２５μＭ塩化マンガン、５０μｇ／ｍＬトリプトファン）中で、３７℃で、生育度（ＯＤ６００）の値が約１となるまで振盪培養し、振盪培養後、培養液の一部を９倍量のＳＰＩＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０１％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．４０μＭ塩化マンガン、５μｇ／ｍＬトリプトファン）に接種し、更に生育度（ＯＤ６００）の値が約０．４となるまで振盪培養することにより、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。

次いで調製したコンピテントセル懸濁液（ＳＰＩＩ培地における培養液）１００μＬに、各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）を５μＬ添加し、３７℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。３７℃での静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲを行い、目的とするゲノム構造の改変がなされたことを確認した。

目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の宿主微生物への導入は、コンピテントセル形質転換法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３，１９２５（１９６７））、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５，１３５（１９９０））、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８，１１１（１９７９））のいずれかによって行った。

組換え微生物によるタンパク質生産用の培養には、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）、２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）、２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物）、あるいはＣＳＬ発酵培地（２％酵母エキス、０．５％コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、０．０５％塩化マグネシウム七水和物、０．６％尿素、０．２％Ｌ−トリプトファン、１０％グルコース、０．１５％リン酸二水素ナトリウム、０．３５％リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．２）を用いた。

実施例１：ｅｐｒ遺伝子欠失用プラスミドの構築：
枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３−１、表３−２に示すｅｐｒｆｗ１とｅｐｒＵｐｒ、及びｅｐｒＤＮｆとｅｐｒｒｖ−ｒｅｐの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のｅｐｒ遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ａ）、及び下流に隣接する０．５ｋｂ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。また別途プラスミドｐＣ１９４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０（２），８１５（１９８２））由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子の上流にプラスミドｐＵＢ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ １５，９３（１９８６））由来のｒｅｐＵ遺伝子のプロモーター領域（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，４４１０（１９８９））を連結した１．２ｋｂ断片（Ｃ）を調製した。次に、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）３断片を混合して鋳型とし、表３−１、表３−２のプライマーｅｐｒｆｗ２とＣｍｒｖ２を用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図２）。このＤＮＡ断片の末端を平滑化及び５’−リン酸化し、プラスミドｐＵＣ１１８（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３，３（１９８７））のＳｍａＩ制限酵素部位に挿入してｅｐｒ遺伝子欠失用プラスミドｐＵＣ１１８−ＣｍｒΔｅｐｒを構築した。尚、上記１．２ｋｂ断片（Ｃ）は、ｒｅｐＵｆｗとｒｅｐＵｒ−Ｃｍのプライマーセット（表３−１、表３−２）及び鋳型としてプラスミドｐＵＢ１１０を用いて調製したｒｅｐＵ遺伝子プロモーター領域を含む０．４ｋｂ断片（Ｄ）と、ＣｍＵｆ−ｒｅｐとＣｍｒｖ１のプライマーセット（表３−１、表３−２）及び鋳型としてプラスミドｐＣ１９４を用いて調製したクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む０．８ｋｂ断片（Ｅ）とを混合して鋳型とし、表３−１、表３−２に示すプライマーｒｅｐＵｆｗとＣｍｒｖ１を用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行なうことによって調製した。

実施例２：欠失用プラスミドを用いたｅｐｒ遺伝子欠失株の構築：
実施例１にて構築したｅｐｒ遺伝子欠失用プラスミドｐＵＣ１１８−ＣｍｒΔｅｐｒをコンピテントセル形質転換法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３，１９２５（１９６７））によって枯草菌１６８株に導入し、ｅｐｒ遺伝子上流領域、あるいは下流領域の相当する領域間での１重交差の相同組換えによりゲノムＤＮＡと融合した形質転換株を、クロラムフェニコール耐性を指標に取得した。得られた形質転換株をＬＢ培地に接種し、３７℃にて２時間培養後、再度、コンピテンス誘導操作を行うことにより、ゲノム上で重複して存在するｅｐｒ遺伝子上流領域、あるいは下流領域の間におけるゲノム内相同組換えを誘導した。図２に示す様に、プラスミド導入の際と異なる領域で相同組換えが生じた場合、プラスミドに由来するクロラムフェニコール耐性遺伝子及びｐＵＣ１１８ベクター領域の脱落に伴ってｅｐｒ遺伝子が欠失する。次に、クロラムフェニコール感受性となった株の存在比率を高める為、以下の要領でアンピシリン濃縮操作を行なった。コンピテントセル誘導後の培養液を終濃度５ｐｐｍのクロラムフェニコール及び終濃度１００ｐｐｍのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地１ｍＬに、６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ６００）が０．００３となるように接種した。３７℃にて５時間培養後、１０，０００ｐｐｍのアンピシリンナトリウム水溶液を１０μＬ添加し、更に３時間培養した。培養終了後、２％塩化ナトリウム水溶液にて菌体を遠心洗浄した後、１ｍＬの２％塩化ナトリウム水溶液に懸濁し、懸濁液１００μＬをＬＢ寒天培地に塗沫した。３７℃にて約１５時間インキュベートし、生育した菌株のうち、プラスミド領域の脱落に伴ってクロラムフェニコール感受性となった株を選抜した。選抜した菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３−１、表３−２に示すプライマーｅｐｒｆｗ２とｅｐｒｒｖ−ｒｅｐを用いたＰＣＲを行なってｅｐｒ遺伝子欠失の確認を行ない、ｅｐｒ遺伝子欠失株を取得した。

実施例３：プロテアーゼ遺伝子８重欠失株及びプロテアーゼ９重欠失株の構築：
ｅｐｒ遺伝子欠失株に対し、次の欠失としてｗｐｒＡ遺伝子の欠失をｅｐｒ遺伝子欠失と同様に行なった。即ち、実施例１と同様にしてｗｐｒＡ遺伝子欠失用プラスミドｐＵＣ１１８−ＣｍｒΔｗｐｒＡを構築し、構築したプラスミドのゲノムＤＮＡへの導入とそれに続くゲノム内相同組換えによるｗｐｒＡ遺伝子の欠失によりｅｐｒ遺伝子とｗｐｒＡ遺伝子の２重欠失株を取得した。以降同様の操作を繰り返すことにより、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥの各遺伝子を順次欠失させ、８種類のプロテアーゼ遺伝子が欠失したプロテアーゼ８重欠失株を構築し、Δ８ｐｒｔ株と命名した。更に同様の操作を繰り返すことによりａｐｒＸ遺伝子を欠失させたプロテアーゼ９重欠失株を構築し、Δ９ｐｒｔ株と命名した。各欠失を行う際に用いたプライマーの配列を表３−１、表３−２に示し、また各プライマーと実施例１で示したｅｐｒ遺伝子欠失に用いたプライマーとの対応について表４に示す。

実施例４：プロテアーゼ９重欠失株からのｃｗｌＢ遺伝子、ＰＢＳＸ遺伝子群、ｃｗｌＦ遺伝子の欠失：
実施例３と同様にして、Δ９ｐｒｔ株より表３−１、表３−２及び表４に示すｃｗｌＢ遺伝子欠失用のプライマーセットを用いてｃｗｌＢ遺伝子の欠失を行い、９種類のプロテアーゼ遺伝子とｃｗｌＢ遺伝子が欠失したΔ９Ｂ株を構築した。続いてＰＢＳＸ遺伝子群の欠失を行うこととした。尚、本発明においてＰＢＳＸ遺伝子群とは、枯草菌ゲノム上に連続して存在するｘｌｙＢ遺伝子〜ｓｐｏＩＩＳＡ遺伝子の３８遺伝子群を指すものとする。Δ９Ｂ株より表３−１、表３−２及び表４に示すＰＢＳＸ遺伝子群欠失用のプライマーセットを用いてＰＢＳＸ遺伝子群の欠失を行い、Δ９ＢＰ株を構築した。またΔ９Ｂ株より表３−１、表３−２及び表４に示すｃｗｌＦ遺伝子欠失用のプライマーセットを用いてｃｗｌＦ遺伝子の欠失を行い、Δ９ＢＦ株を構築した。更にΔ９ＢＰ株より表３−１、表３−２及び表４に示すｃｗｌＦ遺伝子欠失用のプライマーセットを用いてｃｗｌＦ遺伝子の欠失を行い、Δ９ＢＰＦ株を構築した。

実施例５：Δ９ＢＰＦ株からのｓｐｏＩＩＩＣ遺伝子の欠失：
図１に基づいて、ゲノム中ｓｐｏＩＩＩＣ遺伝子の薬剤耐性遺伝子による欠失方法を説明する。尚、ｓｐｏＩＩＩＣ遺伝子は、ｓｐｏＩＶＣＢ遺伝子と共に枯草菌の胞子形成期に特異的に機能するシグマ因子ＳｉｇＫをコードする遺伝子である。

枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３−１、表３−２に示すｓｐｏＩＩＩＣ−ＦＷ及びｓｐｏＩＩＩＣ／Ｅｍ−Ｒのプライマーセットを用いて、ゲノム中のｓｐｏＩＩＩＣ遺伝子の上流に隣接する１．０ｋｂ断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、上記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｓｐｏＩＩＩＣ／Ｅｍ−Ｆ及びｓｐｏＩＩＩＣ−ＲＶのプライマーセットを用いて、ゲノム中のｓｐｏＩＩＩＣ遺伝子の下流に隣接する１．０ｋｂ断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。

更に、プラスミドｐＭＵＴＩＮ４（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４４，３０９７（１９９８））を鋳型として、表３−１、表３−２に示すｅｍｆ２及びｅｍｒ２のプライマーセットを用いて、１．３ｋｂのエリスロマイシン（Ｅｍ）耐性遺伝子領域（Ｃ）をＰＣＲにより調製した。

次に、図１に示すように、得られた１．０ｋｂ断片（Ａ）、１．０ｋｂ断片（Ｂ）及びＣｍ耐性遺伝子領域（Ｃ）の３断片を混合して鋳型として、表１に示したｓｐｏＩＩＩＣ−ＦＷ２及びｓｐｏＩＩＩＣ−ＲＶ２のプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲ法によって、３断片が１．０ｋｂ断片（Ａ）、Ｅｍ耐性遺伝子領域（Ｃ）、１．０ｋｂ断片（Ｂ）の順に含まれる３．３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ）を得た。

更に、コンピテントセル形質転換法によって、得られたＤＮＡ断片（Ｄ）を用いて、Δ９ＢＰＦ株の形質転換を行った。形質転換後、エリスロマイシン（１μｇ／ｍＬ）とリンコマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。

得られた形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによってｓｐｏＩＩＩＣ遺伝子が欠失し、Ｅｍ耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、Δ９ＢＰＦＣ株を構築した。

実施例６：Δ９ＢＰＦＣ株からのｓｉｇＤ遺伝子の欠失：
図１に基づいて、ゲノム中ｓｉｇＤ遺伝子の薬剤耐性遺伝子による欠失方法を説明する。尚、ｓｉｇＤ遺伝子は枯草菌の細胞壁溶解、鞭毛形成、あるいは走化性等に関与する遺伝子の発現を制御するシグマ因子ＳｉｇＤをコードする遺伝子である。

枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３−１、表３−２に示すｓｉｇＤ−ＦＷ及びｓｉｇＤ／Ｃｍ−Ｒのプライマーセットを用いて、ゲノム中のｓｉｇＤ遺伝子の上流に隣接する１．０ｋｂ断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、上記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｓｉｇＤ／Ｃｍ−Ｆ及びｓｉｇＤ−ＲＶのプライマーセットを用いて、ゲノム中のｓｉｇＤ遺伝子の下流に隣接する１．０ｋｂ断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。

更に、プラスミドＤＮＡ ｐＣ１９４を鋳型とし、表３−１、表３−２に示すｃａｔｆ及びｃａｔｒのプライマーセットを用いて、０．８５ｋｂのクロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性遺伝子領域（Ｃ）をＰＣＲにより調製した。

次に、図１に示すように、得られた１．０ｋｂ断片（Ａ）、１．０ｋｂ断片（Ｂ）及びＣｍ耐性遺伝子領域（Ｃ）の３断片を混合して鋳型として、表１に示したｓｉｇＤ−ＦＷ２及びｓｉｇＤ−ＲＶ２のプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲ法によって、３断片が１．０ｋｂ断片（Ａ）、Ｃｍ耐性遺伝子領域（Ｃ）、１．０ｋｂ断片（Ｂ）の順に含まれる２．８ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ）を得た。

更に、コンピテントセル形質転換法によって、得られたＤＮＡ断片（Ｄ）を用いて、１６８株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。

得られた形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによってｓｉｇＤ遺伝子が欠失し、Ｃｍ耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、Δ９ＢＰＦＣＤ株（Δ９ｌｙｔ株）を構築した。

実施例７：ｂｇｌＣ過剰発現プラスミドの構築：
プラスミドの構築は、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＴＭ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて行なった（図３）。プロトコールに従って設計したプライマー（表３−１、表３−２）を用いて、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号）のプロモーターとシグナル配列の断片を、ｐＨＹＳ２３７（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４（１１）：２２８１−９，２０００）を鋳型にして、並びに、配列番号８２で示される枯草菌セルラーゼ遺伝子ｂｇｌＣを、枯草菌ゲノムＤＮＡを鋳型にして、それぞれＰＳＦ＿ｉｎｆｕ（ＥｃＩ）とＰＳ２３７Ｒのプライマーセット、及びｂｇｌＣ−ｓｉｇ／ＰＳＦとｂｇｌＣ＿ｉｎｆｕ（ＳａＩ）のプライマーセットを用いて増幅した。得られた増幅産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ消化により線状化したｐＨＹ３００ＰＬＫ及びＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ酵素を適当量で混合して３０分間反応を行ない、Ｓ２３７セルラーゼのプロモーター配列及びシグナル配列にｂｇｌＣの構造遺伝子が連結したプラスミドを構築し、それをｐＨＰＳ−ｂｇｌＣと命名した。更に、当該プラスミドを大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセル（ＴａＫａＲａ）に導入し、形質転換した。

ＣＭＣ及びトリパンブルーを添加したＬＢ寒天培地を用い、テトラサイクリン耐性により大腸菌形質転換体を選抜した。また、当該形質転換体がハロー形成をすることが判明した。形質転換体より精製したプラスミドを用いて制限酵素処理あるいはＰＣＲを行い、形質転換が適切に行われていることを確認した。

実施例８：枯草菌宿主へのプラスミド導入及び得られた形質転換体の培養：
実施例７にて構築したプラスミドｐＨＰＳ−ｂｇｌＣを、プロトプラスト形質転換法によって実施例３及び実施例６にて構築した枯草菌変異株Δ９ｐｒｔ株及びΔ９ｌｙｔ株に導入した。同様に枯草菌野生株１６８株にも導入した。これにより得られた組換え菌株を、１０ｍＬのＬＢ培地で３０℃で一晩振盪培養し、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除くことにより培養液上清を得た。

実施例９：枯草菌形質転換体培養液上清のタンパク質分析：
実施例８にて得られた培養液上清５μＬ分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；濃縮ゲル４％、分離ゲル１２．５％）に供し、タンパク質バンドの分離を行った（１６８株組換え菌株の２サンプル、Δ９ｐｒｔ株組換え菌株の２サンプル、Δ９ｌｙｔ株組換え菌株の３サンプル）。その結果を図４に示す。１６８株組換え菌の培養上清には目的の枯草菌セルラーゼ遺伝子ｂｇｌＣがコードするセルラーゼＢｇｌＣの分子量に相当する位置にバンドは認められなかった。一方でΔ９ｐｒｔ株組換え菌株とΔ９ｌｙｔ株組換え菌株の培養上清にはＢｇｌＣの分子量に相当する位置にバンドが認められたことから、両株において欠失されているプロテアーゼ遺伝子がコードするプロテアーゼがＢｇｌＣの分解に関与しており、これらのプロテアーゼ遺伝子の欠失によりＢｇｌＣの分泌生産が可能になったと考えられた。またΔ９ｐｒｔ株組換え菌株の培養上清には目的とするＢｇｌＣ以外のタンパク質が著量認められるのに対し、Δ９ｌｙｔ株組換え菌株ではこれら夾雑タンパク質は大幅に減少していた。即ち、Δ９ｐｒｔ株では溶菌酵素関連遺伝子群の機能性産物の作用により細胞の溶解、及び細胞内タンパク質の漏出が起こっており、Δ９ｌｙｔ株ではこの様な溶菌現象に伴うタンパク質の漏出が抑制された結果、培養上清中の夾雑タンパク質が減少したものと考えられた。

実施例１０：培養上清のセルロース糖化活性：
セルロース（粉砕パルプ）を用い、セルロース糖化反応を行った。なお粉砕パルプは、粉末状パルプ（日本製紙ケミカル社製「Ｗ−４００Ｇ」、４００メッシュパス９０以上、セルロース含有量９９質量％、水分含量１質量％）を媒体撹拌式ミル（アトライタ、三井鉱山（株）製、「ＭＡ１Ｄ−Ｘ」、容器全容量：５．５Ｌ）に５００ｇ投入し、媒体として、直径１０ｍｍ、材質ジルコニア、ジルコニアボール：１１ｋｇをアトライタに充填（充填率５９％）して、回転数３０７ｒｐｍの条件で、２時間粉砕処理することにより粉砕パルプを調製した。

＜糖化反応＞：
１５０ｍｇの上記粉砕パルプを、３ｍＬの酵素反応液（最終濃度０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）、蓋つきスクリュー管（Ｎｏ．５、φ２７×５５ｍｍ；マルエム製））に懸濁し、Δ９ｐｒｔ株組換え菌株、あるいはΔ９ｌｙｔ株組換え菌株の培養上清を５００μＬ添加し、５０℃で振盪撹拌（１５０ｒｐｍ、タイテック製恒温振盪機「ＢＲ−１５ＣＦ」）しながら所定の時間反応させた。反応終了後、遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ、５分間）によって沈殿物と上清液を分離し、上清液中に遊離した還元糖をＤＮＳ法によって定量した。

＜糖化率測定（ＤＮＳ法）＞：
ＤＮＳ溶液２００μＬに上清液２μＬを添加し、１００℃で５分間熱処理した。冷却後、反応液１００μＬの吸光度（５３５ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で測定した。上清液に遊離した還元糖量をＤＮＳ法（「生物化学実験法」還元糖の定量法、学会出版センター）によってグルコース換算により定量した。糖化率（％）は、「遊離還元糖量×０．９÷反応前のホロセルロース量×１００」で算出した。各培養液上清の粉砕パルプに対する糖化活性を表５に示す。

またＰＲＯＴＥＩＮ ＡＳＳＡＹ ＲＡＰＩＤ ＫＩＴ（和光純薬工業製）を用い、キット添付の牛血アルブミンを標準として各培養上清のタンパク質濃度を測定した。糖化活性とタンパク質濃度より算出される比活性において、Δ９ｌｙｔ株組換え菌株の培養上清はΔ９ｐｒｔ株組換え菌株を５倍程度上回っており、実施例９の結果と共に、プロテアーゼ遺伝子欠失株からの溶菌酵素関連遺伝子群の欠失が高純度な目的タンパク質の生産に極めて有効であることが示された。

実施例１１：Ｎ２５２セルラーゼ分泌生産評価：
Ｎ２５２セルラーゼ分泌生産用プラスミドを以下の様に構築した。

バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ２５２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４７４）より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、表３−１、表３−２に示されるＮ２５２ｍａｔｕ／ＥＧＮＴＲ ＦＷと２５２ＲＢａのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、Ｎ２５２セルラーゼ（特開２００１−３４００７４号公報、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５７，１０−１１６，２００１）をコードする配列番号８４で示される塩基配列の１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｈ）を増幅した。またバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、表３−１、表３−２に示されるＳ２３７ｐｐｐ−Ｆ２（ＢａｍＨＩ）とＥＧＮＴＲ ＲＶのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報）の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む０．６ｋｂのＤＮＡ断片（Ｉ）を増幅した。次いで、得られた（Ｈ）（Ｉ）の２断片を混合して鋳型とし、表３−１、表３−２に示されるＳ２３７ｐｐｐ−Ｆ２（ＢａｍＨＩ）と２５２ＲＢａのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流にＮ２５２セルラーゼ遺伝子が連結した２．１ｋｂのＤＮＡ断片（Ｊ）を得た。得られた２．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｊ）をシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト）のＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ制限酵素切断点に挿入し、Ｎ２５２セルラーゼ分泌生産評価用プラスミドｐＨＹＮ２５２（Ｓ２３７ｐｓ）を構築した。

つづいてＮ２５２セルラーゼ分泌生産評価は以下の様に行った。分泌生産評価用プラスミドｐＨＹＮ２５２（Ｓ２３７ｐｓ）を、プロトプラスト形質転換法によってΔ９ｐｒｔ株及びΔ９ｌｙｔ株に導入した。同様に枯草菌野生株１６８株にも導入した。これにより得られた組換え菌株を、１０ｍＬのＬＢ培地で３０℃で一晩振盪培養し、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除くことにより培養液上清を得た。

得られた培養液上清５μＬ分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；濃縮ゲル４％、分離ゲル１２．５％）に供し、タンパク質バンドの分離を行った。その結果を図５に示す。１６８株組換え菌の培養上清には目的のＮ２５２セルラーゼの分子量に相当する位置にバンドは認められなかった。一方でΔ９ｐｒｔ株組換え菌株とΔ９ｌｙｔ株組換え菌株の培養上清にはＮ２５２セルラーゼの分子量に相当する位置にバンドが認められたことから、両株において欠失されているプロテアーゼ遺伝子がコードするプロテアーゼがＮ２５２セルラーゼの分解に関与しており、これらのプロテアーゼ遺伝子の欠失によりＮ２５２セルラーゼの分泌生産が可能になったと考えられた。またΔ９ｐｒｔ株組換え菌株の培養上清には目的とするＮ２５２セルラーゼ以外のタンパク質が著量認められるのに対し、Δ９ｌｙｔ株組換え菌株ではこれら夾雑タンパク質は大幅に減少していた。即ち、Δ９ｐｒｔ株では溶菌酵素関連遺伝子群の機能性産物の作用により細胞の溶解、及び細胞内タンパク質の漏出が起こっており、Δ９ｌｙｔ株ではこの様な溶菌現象に伴うタンパク質の漏出が抑制された結果、培養上清中の夾雑タンパク質が減少したものと考えられた。

＜アルカリセルラーゼ分泌生産評価＞
アルカリセルラーゼ分泌生産性評価は以下の様に行った。即ち、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報）断片（３．１ｋｂ）がシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を、プロトプラスト形質転換法により実施例３及び４にて構築した枯草菌変異株Δ９ｐｒｔ株、Δ９ＢＰ株及びΔ９ＢＦ株、更に野生株１６８株に導入した。これによって得られた各組換え菌株を１０ｍＬのＬＢ培地で一夜３７℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。セルラーゼ活性測定については、１／７．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、和光純薬）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｃｅｌｌｏｔｒｉｏｓｉｄｅ（生化学工業）を５０μＬ加えて混和し、３０℃にて反応を行った際に遊離するｐ−ニトロフェノール量を４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）変化により定量した。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとした。また遠心分離を行う前の培養液を１％塩化ナトリウム水溶液にて適宜希釈した後、分光光度計ＤＵ６５０（ベックマンコールター）を用いて測定した６００ｎｍの濁度（ＯＤ６００）を生育度とした。

評価の結果、Δ９ｐｒｔ株、Δ９ＢＰ株及びΔ９ＢＦ株はいずれも野生株より高いアルカリセルラーゼ生産性を示したが、Δ９ｐｒｔ株では著しい生育度の低下が認められた（表６）。一方でΔ９ＢＰ株及びΔ９ＢＦ株は高いアルカリセルラーゼ生産性を維持しつつ生育度の改善が認められており、ｃｗｌＢ遺伝子、ＰＢＳＸ遺伝子群、あるいはｃｗｌＦ遺伝子の欠失によりΔ９ｐｒｔ株で見られる溶菌現象が抑制されたものと考えられた。

Claims (6)

1. 細胞外プロテアーゼ遺伝子ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ及びａｐｒＸと、
   溶菌酵素関連遺伝子又は遺伝子群ｃｗｌＢ、ｃｗｌＦ、ＰＢＳＸ、ｓｐｏＩＩＩＣ及びｓｉｇＤと、が全て欠失している枯草菌変異株。
2. 更に、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を有する、請求項１記載の枯草菌変異株。
3. 前記異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、又は分泌用シグナル領域が結合している、請求項２記載の枯草菌変異株。
4. 前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域に由来するものである、請求項３記載の枯草菌変異株。
5. 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域が、配列番号８６で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号８８で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片である、請求項３記載の枯草菌変異株。
6. 請求項１から５のいずれか１項記載の枯草菌変異株を用いる、異種タンパク質又はポリペプチドの製造方法。