CN113957028B - 一种胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，本发明以B.subtilis 168为出发菌株，使用CRISPR/Cpf1技术在基因组上整合了木糖诱导型启动子P_xylA控制的转录因子comK‑comS基因，使其转化效率大幅提高；回复突变了trpC基因和gudB基因，使其能够合成色氨酸并有效利用谷氨酸家族氨基酸；此外，将6个胞外蛋白酶基因进行了敲除，不仅降低了细胞的代谢压力，而且使重组蛋白能在胞外有效累计。利用最终的工程菌株G601在进行发酵时生产的胞外sfGFP的含量是B.subtilis 168的1.88倍，胞内胞外sfGFP总含量是B.subtilis 168的1.94倍。由本发明构建的工程菌转化简便、无营养缺陷、有更好的氨基酸利用能力、胞外蛋白酶活性低，能广泛应用于重组蛋白的分泌表达，具有广阔的应用前景。

Description

一种胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，属于遗传工程学技术领域。

背景技术

重组蛋白是指采用重组DNA技术，对编码目的蛋白的基因进行优化修饰，利用一定载体将目的基因导入适当的宿主细胞，表达目的蛋白，经过提取和纯化等技术制备获得的具有生物学活性的蛋白制品。重组蛋白被广泛应用于食品和医药领域，产生了巨大的经济价值与社会效益。为了实现重组蛋白的高效表达，对表达系统进行改造优化是当前研究的热点与重点。而使用异源蛋白生产的微生物表达系统来生产重组蛋白消耗资源少、效率高、环保可持续、营养全面并且能对蛋白进行良好的修饰改造。

选择合适底盘工程菌株对蛋白产品的下游加工至关重要。枯草芽孢杆菌具有清晰的遗传背景和成熟的基因操作技术，便于对底盘菌株进行改造；而且由于其具有生长速率快、分泌能力强、无明显密码子偏好性及不易受噬菌体感染等优良特性，也是工业发酵中常用的生产菌株；此外，由于不会产生内毒素等有害产物，B.subtilis还被美国食品药品安全监督管理局(FDA)认证为GRAS(Generally recognized as safe)菌株，是公认的食品安全级微生物。

B.subtilis 168是是重组蛋白表达中常用的底盘细胞，具有非常强的蛋白质分泌能力，但该菌株会产生多种胞外蛋白酶，如中性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、碱性蛋白酶和金属蛋白酶。这些胞外蛋白酶具有多种功能，包括降解生物有机物中的蛋白质以提供营养，以及对其他蛋白质进行蛋白质水解处理。胞外蛋白酶具有很高的降解异质性分泌蛋白的倾向，会导致目标蛋白产量的严重损失，不利于重组蛋白的分泌表达。先前构建的胞外蛋白酶失活菌株WB600，在基因组上整合了许多抗性基因不利于表达载体的转入，也增加了代谢压力，因此，本发明以B.subtilis 168为出发菌株，使用基于CRISPR/Cpf1的基因组无痕编辑系统重新构建了蛋白酶失活的底盘菌株，并将其用于分泌蛋白的生产。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明以B.subtilis 168为出发菌株，使用基于CRISPR/Cpf1的基因组无痕编辑系统对枯草芽孢杆菌进行基因的整合、回复突变和敲除，重新构建了蛋白酶失活的底盘菌株，并将其用于分泌蛋白的生产。

本发明的第一个目的是提供一种胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌，所述的枯草芽孢杆菌以B.subtilis 168为出发菌，在基因组上整合表达转录因子comK-comS基因，回复突变trpC基因和gudB基因，并敲除胞外蛋白酶丝氨酸蛋白酶基因aprE、中性蛋白酶基因nprE、杆菌肽酶基因bpr、金属蛋白酶基因mpr与中性蛋白酶基因nprB。

进一步地，所述的枯草芽孢杆菌是将待编辑的基因的表达框或敲除框，及基因组同源片段连接至pcrF19NM2载体上，通过基于CRISPR/Cpf1的基因组无痕编辑系统进行基因编辑。

具体的该系列的质粒的构建方法、引物设计、验证引物设计均由Wu等人在CAMERS-B:CRISPR/Cpf1 assisted multiple-genes editing and regulation system forBacillus subtilis.Biotechnology and Bioengineering 2020,117:1817–1825中的描述。

进一步地，所述的转录因子comK-comS基因通过木糖诱导型启动子P_xylA控制表达。

进一步地，所述的转录因子comK-comS基因由核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的comK基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的comS基因组成。

进一步地，所述的转录因子comK-comS基因的整合位点为胞外蛋白酶基因epr。

进一步地，回复突变trpC基因是将B.subtilis 168中色氨酸缺陷型的基因trpC2突变为核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的野生型的基因trpC0。

进一步地，回复突变gudB基因是将B.subtilis 168中无活性基因gudB突变为核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的有活性的基因gudB⁺。

本发明的第二个目的是提供所述的胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

S1、分别将待编辑的基因的表达框或敲除框，及基因组同源片段连接至pcrF19NM2载体上，分别构建comK-comS整合质粒pcrF19-epr-xcomKS，trpC回复突变质粒pcrF19-trpC0，gudB回复突变质粒pcrF19-gudB⁺，aprE敲除质粒pcrF19NM-1，nprE与bpr敲除质粒pcrF19NM-2，mpr与nprB敲除质粒pcrF19NM-3；

S2、依次将S1步骤中构建的质粒转化至B.subtilis 168中，得到所述的胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌。

在本发明中，还需要对所述的胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌B.subtilis G601进行表征：首先扩增回复突变后基因组上trpC基因片段来检查是否突变成功并使用合成培养基来验证trpC回复突变是否有效；然后扩增回复突变后基因组上gudB基因片段来检查是否突变成功；之后使用菌落PCR来验证蛋白酶基因敲除操作是否成功；最后脱脂牛奶培养基平板来验证B.subtilis G601及构建过程中的工程菌株的胞外蛋白酶活性。

本发明的第三个目的是提供所述的胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌在作为重组蛋白表达的底盘菌株中的应用。

进一步地，所述的应用是将重组蛋白构建至表达载体上，转化至所述的胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌中，筛选表达重组蛋白的重组菌。

在本发明中，以超级折叠绿色荧光蛋白sfGFP为例，对所述的胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌分泌蛋白能力进行了验证，具体是：

将Genbank登录号为BAP77013.1的超级折叠绿色荧光蛋白，按照B.subtilis的密码子偏好性进行优化，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的基因，并将该基因构建至sfGFP分泌表达载体pSTOP-P21sfGFP上，将该分泌表达载体pSTOP-P21sfGFP转化到B.subtilis中，得到高效分泌表达超级折叠绿色荧光蛋白sfGFP的重组菌，发酵后测定胞外的荧光强度对比工程菌株的胞外蛋白酶活力。

本发明中sfGFP分泌表达载体pSTOP-P21sfGFP通过将枯草芽孢杆菌组成型启动子P21和合成的超级折叠绿色荧光蛋白sfGFP表达框一起连接到pSTOP1622上之后得到，上述sfGFP表达框包含分泌到胞外所需的nprB信号肽基因。nprB信号肽的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，使用该信号肽会将sfGFP分泌到胞外，从而可以通过测定胞外的荧光强度对比工程菌株的胞外蛋白酶活力。

本发明的有益效果是：

本发明构建了一株胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌工程菌株B.subtilis G601。该菌株以B.subtilis 168为出发菌株，使用CRISPR/Cpf1技术在基因组上整合了木糖诱导型启动子P_xylA控制的转录因子comK-comS基因，使其转化效率大幅提高；回复突变了trpC基因和gudB基因，使其能够合成色氨酸并有效利用谷氨酸家族氨基酸；此外，将6个胞外蛋白酶基因进行了敲除，不仅降低了细胞的代谢压力，而且使重组蛋白能在胞外有效累计。利用最终的工程菌株G601在进行发酵时生产的胞外sfGFP的含量是B.subtilis 168的1.88倍，胞内胞外sfGFP总含量是B.subtilis 168的1.94倍。由本发明构建的工程菌转化简便、无营养缺陷、有更好的氨基酸利用能力、胞外蛋白酶活性低，能广泛应用于重组蛋白的分泌表达，具有广阔的应用前景。

附图说明：

图1为CRISPR/Cpf1系统质粒组构建；

图2为sfGFP表达质粒构建；

图3为trpC0基因组片段扩增测序；

图4为trpC0回复突变对菌株的影响；

图5为gudB⁺基因组片段扩增测序；

图6为基因工程菌株菌落PCR验证；

图7为基因工程菌株胞外蛋白酶活性；

图8为基因工程菌株对sfGFP表达的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

(1)菌株和载体

质粒的构建在E.coli DH5α中进行，质粒构建完成构转化到B.subtilis 168，B.subtilis WB600，B.subtilis G601中进行sfGFP的表达和发酵。B.subtilis 168是野生型菌株；B.subtilis WB 600失活了野生B.subtilis 168菌株的6个胞外蛋白酶基因，可以减弱胞外蛋白的降解；B.subtilis G601是本发明中应用CRISOP/Cpf1系统构建的工程菌株。

所使用的载体pSTOP1622为商业化质粒，pHT-XCR6和pcrF19NM2为实验室保藏质粒(可通过molecularcloud质粒共享平台获取，编号分别为MC_0068418与MC_0101256)。

(2)培养基

B.subtilis种子与E.coli均使用LB培养基(每升含10g胰蛋白胨、5g酵母粉和10gNaCl)进行培养。

工程菌株发酵使用TB培养基(每升含12g胰蛋白胨、24g酵母粉、10g NaCl、2.31gKH₂PO₄、12.54g K₂HPO₄和4mL甘油)进行。

合成培养基(54g/L K₂HPO₄·3H₂O，30g/L KH₂PO₄·3H₂O，5g/L柠檬酸三钠，1g/LMgSO₄，10g/L K₂SO₄，2g/L谷氨酰胺，5μM MnCl₂，50μM FerCl₃，1mg/L维生素B1，4g/L蔗糖)。

脱脂牛奶培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，脱脂奶粉30g，琼脂2％，pH 7.0～7.2)。

(3)色氨酸合成实验验证

使用LB培养基对工程菌株过夜培养12-14小时，使用接种环将工程菌株划线于缺少色氨酸的合成培养基，24h后观测生长状况。

(4)胞外蛋白酶活测定

使用LB培养基对工程菌株过夜培养12-14小时，取5μL菌液点在脱脂牛奶培养基上，每个菌株设置4个平行，在14h、24h、38h对蛋白水解圈进行对比。

(5)荧光测定

使用多功能微孔板检测仪Cytation 3(美国伯腾仪器有限公司)参照文献Yang S,Liu Q,Zhang Y,et al.Construction and characterization of broad-spectrumpromoters for synthetic biology[J].ACS Synthetic Biology,2018,7(1):287–291.的方法对GFP的相对荧光强度进行测定。

实施例1：CRISPR系列质粒的构建

如Wu等人在CAMERS-B:CRISPR/Cpf1 assisted multiple-genes editing andregulation system for Bacillus subtilis.Biotechnology and Bioengineering2020,117:1817–1825中的描述，CRISPR/Cpf1系统由两个质粒pHT-XCR6和pcrF19NM2组成(可通过molecularcloud质粒共享平台获取，编号分别为MC_0068418与MC_0101256)。质粒pHT-XCR6(大肠杆菌中为氨苄青霉素抗性，枯草芽孢杆菌中为氯霉素抗性)为Cpf1表达载体，其中Cpf1受木糖的诱导调控；除此之外该质粒还包含有NgAgo蛋白基因，用来提高基因编辑过程中同源重组的效率。质粒pcrF19NM2(在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中都是卡那霉素抗性)，且在枯草芽孢杆菌中为温敏型质粒，在37℃以上培养时无法复制，作为crRNA表达载体，用来表达crRNA；并且可将同源修复模板插入其中，其同源模板插入区中含有mCherry基因，用于插入筛选。

如图1所示，在进行基因操作一共需要构建6个pcrF19NM2系列的质粒，该系列质粒由质粒骨架、上游同源臂、下游同源臂、插入(替换)序列四部分组成，质粒构建方法、引物设计、验证引物设计均由Wu等人在CAMERS-B:CRISPR/Cpf1 assisted multiple-genesediting and regulation system for Bacillus subtilis.Biotechnology andBioengineering 2020,117:1817–1825中的描述。

(一)构建质粒所用的引物

1)comK-comS整合质粒pcrF19-epr-xcomKS整合位点为胞外蛋白酶epr，插入序列由xylR和P_xylA组成的木糖启动子表达框(核苷酸序列为SEQ ID NO.4)和comKS表达框(comK的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；comS的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)。构建质粒所采用的引物为：

2)trpC回复突变质粒pcrF19-trpC0可将导致B.subtilis 168色氨酸缺陷型的基因trpC2替换序列为野生型的trpC0(核苷酸序列如SEQ ID NO.7)，构建质粒所采用的引物为：

3)gudB回复突变质粒pcrF19-gudB⁺可将具有重复序列的无活性gudB替换为有活性的gudB⁺(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，构建质粒所采用的引物为：

4)aprE敲除质粒pcrF19NM-1可对该蛋白酶进行敲除，构建质粒所采用的引物为：

5)nprE与bpr敲除质粒pcrF19NM-2可将上述两个蛋白酶同时敲除，构建质粒所采用的引物为：

6)mpr与nprB敲除质粒pcrF19NM-3可将上述两个蛋白酶同时敲除，构建质粒所采用的引物为：

7)其他验证引物如下：

(二)质粒构建方法

1)crRNA连接

单个crRNA的连接：此时crRNA可以直接通过设计带有重叠区的一对引物，经过变性退火形成带有粘性末端的引物二聚体。使用碧云天的5X Annealing Buffer for DNAOligos，引物浓度为10uM，50uL体系中上下游引物(基因名-cr-F/R)各20uL，AnnealingBuffer 10uL。反应条件为：98℃2min，0.1℃/S降温至4℃后保温。将二聚体稀释10倍，取1uL与Eco31 I酶切后的载体pcrF19NM2-Li0连接即可。

双crRNA的连接：crRNA片段的构建过程和单片段的不同，因为crRNA之间的连接需要磷酸基团，若此时仍合成引物进行退火时，后续还要进行磷酸化，不然无法连接。多个crRNA的连接是通过下面的方法实现的，通过具有重叠区的引物(基因名-2cr-F/R)进行PCR，从而形成平末端的二聚体(PrimeSTAR延伸5秒，10个循环，结束后稀释10倍)，并通过引物设计在其5′端引入Eco31I酶切位点。之后将上述稀释后的PCR产物与pcrF19NM2质粒进行golden gate组装即可。

Golden gate配置体系：

反应条件如下：

当crRNA连接后，转入E.coli DH5α感受态中，使用验证引物mcherry-VR和基因名-cr-F或基因名-2cr-F进行菌落PCR验证。

2)同源臂的扩增与连接

使用基因名-U1000-F和基因名-U1000-R，以枯草芽孢杆菌基因组作为模板，分别扩增不同基因的上游同源臂；使用基因名-D1000-F和基因名-D1000-R，以枯草芽孢杆菌基因组作为模板，分别扩增不同基因的下游同源臂。使用PxylA-F和PxylA-R扩增PxylA表达框；使用ComKS-F和ComKS-R扩增整合comK-comS基因片段；PCR产物用DNA纯化试剂盒回收。

使用引物F19-LiF和F19-LiR对成功连接crRNA的6个质粒进行线性化。使用碧云天Seamless Cloning Kit(无缝克隆试剂盒)将6个质粒的载体、上下游同源臂、插入(替换)基因片段连接，转入E.coli DH5α感受态中。使用Pveg-F和Hominsert-R对转化子进行验证，测序。

实施例2：蛋白酶失活菌株B.subtilis G601的构建

将CRISPR/Cpf1系统的Cpf1蛋白表达质粒pHT-XCR6转入枯草芽孢杆菌感受态中，涂布于含有氯霉素抗性的LB平板待其长出单菌落。然后再将转化了pHT-XCR6的菌株制成感受态，转化实施例1中构建的pcrF19-epr-xcomKS，质粒加入到感受态中培养两个小时之后不直接涂布平板，而是将菌液离心(4000rmp，2min)后重悬于500μL含有氯霉素、卡那霉素和3％木糖的LB中过夜培养，第二天再离心浓缩到150μL涂布添加有氯霉素、卡那霉素和3％木糖的LB平板。长出单菌落后即可进行菌落PCR验证是否完成基因编辑。将验证成功的单菌落接到2mL含有0.006％SDS的LB过夜培养，划线于LB平板，点板验证pcrF19-epr-xcomKS质粒和pHT-XCR6质粒是否消除。2个质粒消除成功的菌株命名为B.subtilis 168KS；仅pcrF19-epr-xcomKS质粒消除成功的菌株命名为B.subtilis 168KS-XCR6用于下一步操作。依次按照上述步骤(转化-后培养-涂板-菌落PCR验证-消质粒)依次进行基因编辑操作：使用trpC回复突变质粒pcrF19-trpC0转化至B.subtilis 168KS-XCR6中，得到工程菌B.subtilisBSZR-XCR6，进一步消除质粒得到B.subtilis BSZR；使用gudB回复突变质粒pcrF19-gudB⁺转化至B.subtilis BSZR-XCR6中，得到工程菌株B.subtilis BSZRG-XCR6，进一步消除质粒得到B.subtilis BSZRG；使用aprE敲除质粒pcrF19NM-1转化至B.subtilis BSZRG-XCR6中，得到工程菌株B.subtilis G201-XCR6，进一步消除质粒得到B.subtilis G201；使用nprE与npr敲除质粒pcrF19NM-2转化至B.subtilis G201-XCR6中，得到工程菌株B.subtilisG401-XCR6，进一步消除质粒得到B.subtilis G401；使用mpr与nprB敲除质粒pcrF19NM-3转化至B.subtilis G401-XCR6中，得到工程菌株B.subtilis G601-XCR6，进一步消除质粒得到B.subtilis G601。

实施例3：蛋白酶失活菌株B.subtilis G601的验证

如图3所示，将B.subtilis G601上的trpC0进行扩增测序，其与设计突变的序列一致。如图4所示，突变前的野生型菌株B.subtilis 168(图4上)在合成培养基上不能生长，突变后的B.subtilis G601(图4下)则可以生长正常。如图5所示，将B.subtilis G601上的gudB⁺扩增测序，其与设计突变的序列一致。如图6所示，使用基因名-VF和基因名-VR对工程菌株进行菌落PCR，结果显示B.subtilis G601已经整合了木糖诱导型启动子P_xylA控制的转录因子comK-comS基因，回复突变了trpC0，并将6个胞外蛋白酶基因敲除。如图7所示，工程菌株在敲除胞外蛋白酶后其降解平板上脱脂牛奶中的蛋白能力明显下降，说明胞外蛋白酶基因的敲除成功，并且发挥了作用。

实施例4：重组表达质粒及工程菌株的构建

如图2所示，所构建的超级绿色荧光蛋白(sfGFP)表达框由nprB信号肽和sfGFP基因两部分构成。nprB信号肽的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，使用该信号肽可将sfGFP分泌到胞外，从而可以通过测定胞外的荧光强度对比工程菌株的胞外蛋白酶活力，进一步用以检测菌株的胞外蛋白生产能力；超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)的Genbank登录号为BAP77013.1，sfGFP基因已按照B.subtilis的密码子偏好性进行优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

B.subtilis中被σ^A因子所识别的启动子与E.coli的启动子存在很强的同源性，使用这类启动子构建的sfGFP表达载体在E.coli中也会表达，由于B.subtilis的信号肽并不会被E.coli所识别，这时由于该蛋白过多表达带来的生长压力会在构建过程使质粒产生随机突变。因此，在本发明使用了B.subtills中σ^H因子识别的启动子P_spoVG(核苷酸序列如所示SEQ ID NO.9所示)来表达sfGFP，该启动子在E.coli中不会表达，从而可以保证重组表达质粒的顺利构建。将P_spoVG与合成后的基因元件一起连接到载体pSTOP1622上之后，得到了载体pSTOP-P21sfGFP。将上述质粒转化到B.subtilis 168、WB600、G601菌株中之后，便得到了可以分泌表达sfGFP的工程菌株。

实施例5：sfGFP在工程菌中的表达

将实施例4中所得到的工程菌株接种到含四环素(25mg/L)的种子培养基中37℃，220rpm震荡培养过夜。然后，按4％的接种量(v/v)转接到含四环素(25mg/L)的发酵培养基中37℃，220rpm震荡培养14-80h。

实施例6：sfGFP胞内胞外量的测定

取不同发酵阶段的样品，8000xg离心2min，上清与菌体分离，菌体使用去离子水清洗一次，后用等量去离子水悬浮，得到菌体悬液。将上清和菌体悬液各200μL加入96孔板，使用酶标仪来检测荧光强度。如图8所示，在发酵60h时，3株分泌表达sfGFP的工程菌菌体浓度相当；而与野生菌株B.subtilis 168相比，B.subtilis G601的蛋白分泌量是其1.88倍，胞内胞外蛋白质总量是其1.95倍。上述结果说明，使用本发明中方法构建的胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌B.subtilis G601的重组蛋白合成与分泌能力均得到了显著提升。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 84

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgcgcaact tgaccaagac atctctatta ctggccggct tatgcacagc ggcccaaatg 60

gtttttgtaa cacatgcctc agct 84

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Met Arg Asn Leu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys Thr

1 5 10 15

Ala Ala Gln Met Val Phe Val Thr His Ala Ser Ala

20 25

<210> 3

<211> 717

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

atgagcaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtccgt ggagagggtg aaggtgatgc tacaaacgga 120

aaactcaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccgtg gccaacactt 180

gtcactactc tgacctatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca catgaaacgg 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300

aaagatgacg ggacctacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatcgtatcg agttaaaggg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ctcgagtaca actttaactc acacaatgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagcta acttcaaaat tcgccacaac gttgaagatg gttccgttca actagcagac 540

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ctgtcgacac aatctgtcct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt 660

cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaataa 717

<210> 4

<211> 1536

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

gaattagctt ggtaccagct attgtaacat aatcggtacg ggggtgaaaa agctaacgga 60

aaagggagcg aatggcaaga acgtcccggg gagctcctaa cttatagggg taacacttaa 120

aaaagaatca ataacgatag aaaccgctcc taaagcaggt gcattttttc ctaacgaaga 180

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aatattcttt tcttctttag agagcgaagc cagtaacgct ttttcagaag catataattc 480

ccaacagcct cgatttccac agctgcattt gggtccatta aaatctatcg tcatatgacc 540

catttcccca gaaaaaccct gaacaccttt atacaattcg ttgttaataa caagtccagt 600

tccaattccg atattaatac tgatgtaaac gatgttttca tagttttttg tcataccaaa 660

tactttttca ccgtatgctc ctgcattagc ttcattttca acaaaaaccg gaacattaaa 720

ctcactctca attaaaaact gcaaatcttt gatattccaa tttaagttag gcatgaaaat 780

aatttgctga tgacgatcta caaggcctgg aacacaaatt cctattccga ctagaccata 840

aggggactca ggcatatggg ttacaaaacc atgaataagt gcaaataaaa tctcttttac 900

ttcactagcg gaagaactag acaagtcaga agtcttctcg agaataatat ttccttctaa 960

gtcggttaga attccgttaa gatagtcgac tcctatatca ataccaatcg agtagcctgc 1020

attcttatta aaaacaagca ttacaggtct tctgccgcct ctagattgcc ctgccccaat 1080

ttcaaaaata aaatcttttt caagcagtgt atttacttga gaggagacag tagacttgtt 1140

taatcctgta atctcagaga gagttgccct ggagacaggg gagttcttca aaatttcatc 1200

taatattaat ttttgattca ttttttttac taaagcttga tctgcaattt gaataataac 1260

cactcctttg tttatccacc gaactaagtt ggtgtttttt gaagcttgaa ttagatattt 1320

aaaagtatca tatctaatat tataactaaa ttttctaaaa aaaacattga aataaacatt 1380

tattttgtat atgatgagat aaagttagtt tattggataa acaaactaac tcaattaaga 1440

tagttgatgg ataaacttgt tcacttaaat caaaggggga aatgacaaat ggtccaaact 1500

agtgatatct aaaaatcaaa gggggaaatg ggatcc 1536

<210> 5

<211> 579

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

atgagtcaga aaacagacgc acctttagaa tcgtatgaag tgaacggcgc aacaattgcc 60

gtgctgccag aagaaataga cggcaaaatc tgttccaaaa ttattgaaaa agattgcgtg 120

ttttatgtaa acatgaagcc gctgcaaatt gtcgacagaa gctgccgatt ttttggatca 180

agctatgcgg gaagaaaagc aggaacttat gaagtgacaa aaatttcaca caagccgccg 240

atcatggtgg acccttcgaa ccaaatcttt ttattcccta cactttcttc gacaagaccc 300

caatgcggct ggatttccca tgtgcatgta aaagaattca aagcgactga attcgacgat 360

acggaagtga cgttttccaa tgggaaaacg atggagctgc cgatctctta taattcgttc 420

gagaaccagg tataccgaac agcgtggctc agaaccaaat tccaagacag aatcgaccac 480

cgcgtgccga aaagacagga atttatgctg tacccgaaag aagagcggac gaagatgatt 540

tatgatttta ttttgcgtga gctcggggaa cggtattag 579

<210> 6

<211> 141

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

ttgaaccgat caggcaagca tcttatcagc agcattatcc tgtatccccg gcccagcgga 60

gaatgtatat cctcaatcag cttggacaag caaacacaag ctacaacgtc cccgctgtac 120

ttctgctgga gggagaagta g 141

<210> 7

<211> 750

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

atgcttgaaa aaatcatcaa acaaaagaaa gaagaagtga aaacactggt tctgccggta 60

gagcagcctt tcgagaaacg ttcatttaag gaggcgctgg caagcccgaa tcggtttatc 120

gggttgattg ccgaagtgaa gaaagcatcg ccgtcaaaag ggcttattaa agaggatttt 180

gtacctgtgc agattgcaaa agactatgag gctgcgaagg cagatgcgat ttccgtttta 240

acagacaccc cgttttttca aggggaaaac agctatttat cagacgtaaa gcgtgctgtt 300

tcgattcctg tacttagaaa agattttatt gattctcttc aagtagagga atcaagaaga 360

atcggagcgg atgccatatt gttaatcggc gaggtgcttg atcccttaca ccttcatgaa 420

ttatatcttg aagcaggtga aaaggggatg gacgtgttag tggaggttca tgatgcatca 480

acgctagaac aaatattgaa agtgttcaca cccgacattc tcggcgtaaa taatcgaaac 540

ctaaaaacgt ttgaaacatc tgtaaagcag acagaacaaa tcgcatctct cgttccgaaa 600

gaatccttgc ttgtcagcga aagcggaatc ggttctttag aacatttaac atttgtcaat 660

gaacatgggg cgcgagctgt acttatcggt gaatcattga tgagacaaac ttctcagcgt 720

aaagcaatcc atgctttgtt tagggagtga 750

<210> 8

<211> 1284

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

atggcagccg atcgaaacac cggtcataca gaagaggaca aacttgatgt attaaaatca 60

acccaaaccg taatacataa ggctctggaa aaattgggat atcccgaaga ggtatacgaa 120

ttgttaaaag agccgatgag attattaacg gtaaaaatac ctgttcgtat ggacgacggt 180

tcagtaaaga ttttcacagg atatcgtgcg cagcacaatg actctgtcgg tccaacgaaa 240

ggcgggatac gttttcaccc gaacgtaaca gaaaaagagg tgaaggcggt gaaggcgctt 300

tcaatttgga tgagtttaaa atgcggcata attgatcttc catatggcgg tggtaaaggc 360

ggaattgttt gtgatccaag ggatatgtcg tttagagagc tggagcgtct gagcagaggg 420

tatgtcagag cgatcagcca aattgtcggc ccgacaaaag acgtgccggc accggatgta 480

tttacaaact cacaaatcat ggcttggatg atggatgagt attcaagaat tgatgaattt 540

aattcgcctg gatttattac aggcaaaccg cttgtgcttg gcggatctca cgggagagaa 600

tctgcgacag caaaaggtgt taccatctgt attaaagaag cggctaagaa gagaggcatc 660

gatattaaag gtgcgcgtgt cgttgtccaa ggcttcggaa acgcgggaag ctatttggca 720

aaatttatgc atgatgcggg ggcaaaagtt gtcggcatct cagatgcgta tggcggactt 780

tatgatccgg aaggccttga tatcgattat ttactcgacc gacgcgacag cttcggtacc 840

gtaacaaagc ttttcaacga taccattacc aaccaagagc tgctggagct ggattgtgat 900

attctcgttc ctgctgcgat tgaaaatcaa attacagaag aaaatgccca taatatccgg 960

gctaaaattg tcgttgaagc agcgaacgga ccaacaacgc ttgaaggaac aaaaattctt 1020

tcagaccggg acattctgct tgtaccagac gtgctggcaa gtgccggtgg cgtaacagtt 1080

tcttattttg aatgggttca gaataaccaa ggcttctact ggagtgaaga agaggtagaa 1140

gaaaaattag aaaaaatgat ggtcaaatca tttaacaata tttacgaaat ggctaacaac 1200

cgaagaattg acatgaggct cgctgcatat atggtcggcg ttcgcaaaat ggctgaagct 1260

tcgcgtttta gaggctggat ataa 1284

<210> 9

<211> 300

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 9

tgcggaagta aacgaagtgt acggacaata ttttgacact cacaaaccgg cgagatcttg 60

tgttgaagtc gcgagactcc cgaaggatgc gttagtcgag atcgaagtta ttgcactggt 120

gaaataataa gaaaagtgat tctgggagag ccgggatcac ttttttattt accttatgcc 180

cgaaatgaaa gctttatgac ctaattgtgt aactatatcc tattttttca aaaaatattt 240

taaaaacgag caggatttca gaaaaaatcg tggaattgat acactaatgc ttttatatag 300

Claims (5)

1.一种胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌以B. subtilis 168为出发菌，在基因组上整合表达转录因子comK-comS基因，回复突变trpC基因和gudB基因，并敲除胞外蛋白酶丝氨酸蛋白酶基因aprE、中性蛋白酶基因nprE、杆菌肽酶基因bpr、金属蛋白酶基因mpr与中性蛋白酶基因nprB，

所述的转录因子comK-comS基因通过木糖诱导型启动子P _xylA 控制表达，

所述的转录因子comK-comS基因由核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的comK基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的comS基因组成，

所述的转录因子comK-comS基因的整合位点为胞外蛋白酶基因epr，

回复突变trpC基因是将B. subtilis 168中色氨酸缺陷型的基因trpC2突变为核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的野生型的基因trpC0，

回复突变gudB基因是将B. subtilis 168中无活性基因gudB突变为核苷酸序列如SEQID NO.8所示的有活性的基因gudB ⁺ 。

2.根据权利要求1所述的胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌是将待编辑的基因的表达框或敲除框，及基因组同源片段连接至pcrF19NM2载体上，通过基于CRISPR/Cpf1的基因组无痕编辑系统进行基因编辑。

3.一种权利要求1所述的胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、分别将待编辑的基因的表达框或敲除框，及基因组同源片段连接至pcrF19NM2载体上，分别构建comK-comS整合质粒pcrF19-epr-xcomKS，trpC回复突变质粒pcrF19-trpC0，gudB回复突变质粒pcrF19-gudB⁺，aprE敲除质粒pcrF19NM-1，nprE与bpr敲除质粒pcrF19NM-2，mpr与nprB敲除质粒pcrF19NM-3；

S2、依次将S1步骤中构建的质粒转化至B. subtilis 168中，得到所述的胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌。

4.一种权利要求1所述的胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌在作为重组蛋白表达的底盘菌株中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用是将重组蛋白构建至表达载体上，转化至所述的胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌中，筛选表达重组蛋白的重组菌。