CN114703117A - 一种重组枯草芽孢杆菌、其构建方法及一种重组胶原酶 - Google Patents

一种重组枯草芽孢杆菌、其构建方法及一种重组胶原酶 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组枯草芽孢杆菌、其构建方法及一种重组胶原酶，属于基因工程技术领域，筛选利用淀粉芽孢杆菌中的胶原酶基因，对产胶原酶编码基因进行基因克隆并转入宿主枯草芽孢杆菌细胞中，构建该酶的枯草芽孢杆菌异源表达系统，提供一种安全、绿色、无污染、可用于食品加工的重组胶原酶。本发明所采用的产酶方式温和、绿色、环保、高效；重组菌株的发酵条件稳定，发酵周期短，在工业化生产方面可以节约大量成本，为胶原酶的工业化生产打下了基础。

Description

一种重组枯草芽孢杆菌、其构建方法及一种重组胶原酶
技术领域
本发明涉及一种重组枯草芽孢杆菌、其构建方法及一种重组胶原酶，属于基因工程技术领域。
背景技术
胶原蛋白由氨基酸和自身独特的三螺旋结构构成，这种特殊结构决定了其具备蛋白质所无法替代的使用价值和功能。胶原蛋白在很多领域都有应用：在保健品中作为添加剂，既可以辅助补钙，又可促进人体对血液中钙的吸收和运输；在食品中作为添加剂，可以达到改善食品外观和口味的目的，进而提高了产品品质；胶原蛋白在医疗领域的应用也日益凸显，比如在关节炎、真皮损伤、骨质疏松等病症的临床治疗中都取得很好的疗效；在化妆品中作为添加剂，可以使美容产品具备滋养保湿、防皱紧肤等各种修复功能。胶原蛋白的用途很多，依据所需蛋白分子量大小的不同其用途也有所不同。
目前胶原蛋白以小分子的蛋白应用比较广泛，例如化妆品添加剂和食品添加剂等，但胶原蛋白的超螺旋结构极其特殊，普通蛋白酶很难对其产生降解作用，导致胶原多肽片段的获取非常困难，经研究发现，微生物来源的细菌胶原酶可以做到。胶原酶是一类蛋白水解酶，能够在一定pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白。微生物胶原酶来源主要是细菌，随着研究的深入，越来越多的产胶原酶菌株被分离筛选出来，不同来源的胶原酶结构与性质差异性大，目前能够工业化生产胶原酶的菌株很少。商品化的微生物胶原酶来源于溶组织梭状芽孢杆菌，菌株的致病性限制了胶原酶在工业上的应用，尤其是在食品行业中的应用。枯草芽孢杆菌是非致病菌，代谢过程中不产生内毒素，被公认为食品级安全性菌株，生长速率快，培养周期短，营养要求低，抗逆性强，培养成本低，具有高效的蛋白分泌能力等优点，被广泛应用在发酵、食品、农业等领域。因此，枯草芽孢杆菌是产胶原酶的优良菌株，如何利用枯草芽孢杆菌工业化生产胶原酶是本领域技术人员所要研究的课题。
发明内容
本发明针对如何利用枯草芽孢杆菌工业化生产胶原酶，提供一种重组枯草芽孢杆菌、其构建方法及一种重组胶原酶，筛选利用淀粉芽孢杆菌中的胶原酶基因，并应用现代基因工程手段，对产胶原酶编码基因进行基因克隆并转入宿主枯草芽孢杆菌细胞中，构建该酶的枯草芽孢杆菌异源表达系统，提供一种安全、绿色、无污染、可用于食品加工的重组胶原酶。
本发明的目的之一在于提供一种重组枯草芽孢杆菌（B. subtills WB600/pP43NMK-col）。
本发明中的菌株已提交菌种保藏。
【生物保藏说明】
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国武汉；
保藏日期：2022年4月29日；
保藏编号：CCTCC NO：M2022525；
分类命名：枯草芽孢杆菌 WB600/pP43NMK-col Bacillus subtilis WB600/pP43NMK-col。
本发明的目的之二在于提供上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）引物设计
根据GenBank数据库中淀粉芽孢杆菌基因组胶原酶基因序列，利用引物设计软件DNAMAN和Primer Premier 5设计出特异性引物，进行合成。
上下游引物添加保护碱基和酶切位点，同时在C末端引入6×His标签；
（2）重组质粒pP43NMK-col的构建
通过引物设计在胶原酶目的基因col的5’端添加了PstⅠ酶切位点，3’端添加HindⅢ酶切位点和组氨酸标签，带有双启动子PHpaⅡ和P43的pP43NMK穿梭质粒作为载体，进行重组质粒转化，合成的重组质粒目的基因pP43NMK-col转化到E.coli JM109中，双酶切验证重组质粒，pP43NMK大小为7365bp,col大小为966bp；
（3）E.coli JM109感受态细胞的制备及转化
1）取出-20℃保藏的E.coli JM109在LB培养基上划线，37℃过夜培养，
2）挑取单菌落接种于5 mL液体LB培养基中，37℃，200 rpm过夜培养，
3）以初始OD600=0.02的接种量接种到50 mL/250 mL摇瓶LB培养基中，37℃，200rpm培养2-3 h，测得OD600为0.4-0.6，取1 mL培养基于离心管中，冰浴放置10 min，
4）4℃，4000 rpm离心10 min，收集菌体，彻底去上清，
5）小心加入1 mL预冷的0.1M氯化钙溶液悬浮菌体，轻轻混匀，冰浴放置15 min，
6）4℃，4000 rpm离心15 min，收集菌体，彻底去上清，
7）加入0.5 mL氯化钙-甘油溶液悬浮菌体，轻轻混匀，-80℃保藏，
8）从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰中5 min，加入10 μL连接产物，轻微混匀，冰浴30 min，
9）42℃热激1.5 min后迅速冰浴5 min，
10）加入1 mL灭菌LB液体培养基，37℃，100 rpm培养1 h，
11）离心收集菌体，去除部分上清后混匀，100μL浓缩菌液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养8-10 h；
按照质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司）说明书将E.coli JM109中构建好的重组质粒pP43NMK-col提取出来，-20℃保藏。
（4）B. subtills WB600感受态制备及转化
1）接种枯草芽孢杆菌于5 mL LB培养基中，37℃，250 rpm培养过夜，
2）取100μL上述菌液于5 mL SPⅠ培养基中，37℃，250 rpm培养至对数生长末期约（4-5 h），
3）取上步骤菌液0.2 mL至2 mL SPⅡ培养基中，于37℃，100 rpm培养90 min，
4）加入20μL 10 mM EGTA，再于37℃，100 rpm培养10 min，
5）分装成每管0.5 mL，加入10 μL连接产物，37℃，100 rpm培养90 min，取菌液涂布到含有卡那霉素的LB平板上过夜培养；
（5）重组B. subtills WB600/pP43NMK-col的表达
将重组菌B. subtills WB600/pP43NMK-col在添加卡那霉素的50 mL/250 mL摇瓶LB培养基中活化培养，37℃，200 rpm培养12 h，作为活化的种子液，以1%的接种量转接到100 mL添加卡那霉素的液体TB培养基中发酵培养，37℃，200 rpm的条件下发酵24 h。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以作出如下的改进：
进一步，所述引物序列如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，单下划线部分为酶切位点，上游PstⅠ，下游HindⅢ，双下划线部分为保护碱基，小写字母为6×His标签。
进一步，所述步骤（2）中，在添加卡那霉素抗性的平板中筛选阳性子，挑取单菌落进行质粒提取，通过单酶切和PCR验证目的基因是否成功连接到载体上。
进一步，所述步骤（3）中，氯化钙-甘油溶液含有甘油含量为8%-12%。
进一步，所述步骤（4）中，挑取平板上的单菌落进行菌落PCR验证和电泳分析，选取有目的条带的菌落进行液体扩大培养，然后提取质粒和酶切验证。
本发明的目的之三在于提供一种重组胶原酶，利用上述构建方法制备的重组枯草芽孢杆菌（B. subtills WB600/pP43NMK-col）分离纯化制得。
其制备方法包括以下步骤：
A、硫酸铵沉淀：将发酵完成的菌液4℃，10000 rpm离心10 min收集菌体上清液，配制100%的饱和硫酸铵溶液，缓慢添加上清液，混合配制30%-70%的梯度浓度硫酸铵溶液，4℃缓慢搅拌盐析2 h，析出的蛋白质沉淀用非变性裂解液重悬，然后将重悬液置于非变性裂解液缓冲液中4℃充分透析，3-6 h更换透析缓冲液，透析液过0.45 μm滤膜准备上镍柱。
B、镍柱纯化
1）取混合均匀的50% BeyoGoldTM His-tag Purification Resin，4℃离心弃去储存液；
2）向凝胶中加入1个柱体积的非变性裂解液平衡凝胶，重复平衡1-2次，弃去液体；
3）加入裂解液，重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白，收集20μL穿流液作后续分析应用；
4）洗柱4-5次，每次加入1个柱体积的非变形洗涤液，每次收集20μL穿柱的洗涤液；
5）洗脱目的蛋白6-10次，每次用1个柱体积的非变性洗脱液，将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中，收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。
进一步，所述步骤B中，按照每0.5 mL凝胶中加入4 ml细菌裂解液上清的比例加入裂解液。
本发明的优点在于：以pP43NMK为出发质粒构建重组表达载体pP43NMK-col,通过化学转化的方法导入到枯草芽孢杆菌WB600中，获得重组枯草芽孢杆菌B. subtillsWB600/pP43NMK-col；对重组菌进行发酵实验验证了胶原酶基因的表达。
本发明所采用的产酶方式温和、绿色、环保、高效；重组菌株的发酵条件稳定，发酵液纯化，发酵时不需要IPTG诱导，发酵周期短，在工业化生产方面可以节约大量成本，为胶原酶的工业化生产打下了基础，提供一种安全、绿色、无污染、可用于食品加工的重组胶原酶。
附图说明
图1为重组质粒pP43NMK-col双酶切验证；
图2为镍柱纯化电泳图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明采用如下的技术方案：
（1）引物设计
根据GenBank数据库中淀粉芽孢杆菌基因组胶原酶基因序列，利用引物设计软件DNAMAN和Primer Premier 5设计出特异性引物，进行合成。
引物序列如下：
Figure 543453DEST_PATH_IMAGE001
其中，单下划线部分为酶切位点，上游PstⅠ，下游HindⅢ，双下划线部分为保护碱基，小写字母为6×His标签。
（2）重组质粒pP43NMK-col的构建
胶原酶目的基因通过化学方法合成，通过引物设计在目的基因col的5’端添加了PstⅠ酶切位点，3’端添加HindⅢ酶切位点和组氨酸标签。带有双启动子PHpaⅡ和P43的pP43NMK穿梭质粒作为载体，进行重组质粒转化，合成的重组质粒目的基因pP43NMK-col转化到E.coli JM109中，参见图1，在添加卡那霉素抗性的平板中筛选阳性子，挑取单菌落进行质粒提取，从图1可以看到，通过双酶切和PCR验证目的基因成功连接到载体上。pP43NMK大小为7365bp,col大小为966bp。
（3）E.coli JM109感受态细胞的制备及转化
1）取出-20℃保藏的E.coli JM109在LB培养基上划线，37℃过夜培养。
2）挑取单菌落接种于5 mL液体LB培养基中，37℃，200 rpm过夜培养。
3）以初始OD600=0.02的接种量接种到50 mL/250 mL摇瓶LB培养基中，37℃，200rpm培养2-3 h，测得OD600为0.4-0.6，取1 mL培养基于离心管中，冰浴放置10 min。
4）4℃，4000 rpm离心10 min，收集菌体，彻底去上清。
5）小心加入1 mL预冷的0.1M氯化钙溶液悬浮菌体，轻轻混匀，冰浴放置15 min。
6）4℃，4000 rpm离心15 min，收集菌体，彻底去上清。
7）加入0.5 mL氯化钙-甘油溶液（含有10%甘油）悬浮菌体，轻轻混匀，-80℃保藏。
8）从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰中5 min，加入10 μL连接产物，轻微混匀，冰浴30 min。
9）42℃热激1.5 min后迅速冰浴5 min。
10）加入1 mL灭菌LB液体培养基，37℃，100 rpm培养1 h。
11）离心收集菌体，去除部分上清后混匀，100μL浓缩菌液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养8-10 h。
按照质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司）说明书将E.coli JM109中构建好的重组质粒pP43NMK-col提取出来，-20℃保藏。
（4）B. subtills WB600感受态制备及转化
1）接种枯草芽孢杆菌于5 mL LB培养基中，37℃，250 rpm培养过夜。
2）取100μL（接种量2%）上述菌液于5 mL SPⅠ培养基中，37℃，250 rpm培养至对数生长末期约（4-5 h）。
3）取上步骤菌液0.2 mL至2 mL SPⅡ培养基中，于37℃，100 rpm培养90 min。
4）加入20μL 10 mM EGTA，再于37℃，100 rpm培养10 min。
5）分装成每管0.5 mL，加入10 μL连接产物，37℃，100 rpm培养90 min，取菌液涂布到含有卡那霉素的LB平板上过夜培养。
（5）重组枯草芽孢杆菌的验证
挑取平板上的单菌落进行菌落PCR验证和电泳分析，选取有目的条带的菌落进行液体扩大培养，然后提取质粒和酶切验证。
（6）重组B. subtills WB600/pP43NMK-col的表达
将重组菌B. subtills WB600/pP43NMK-col在添加卡那霉素的50 mL/250 mL摇瓶LB培养基中活化培养，37℃，200 rpm培养12 h，作为活化的种子液，以1%的接种量转接到100 mL液体TB培养基中（添加卡那霉素）发酵培养，37℃，200 rpm的条件下发酵24 h后验证胶原酶酶活，通过SDS－PAGE鉴定目的在蛋白成功在重组菌株枯草芽孢杆菌B. subtillsWB600/pP43NMK-col表达（参见图2）。
（7）重组胶原酶的分离纯化
1）硫酸铵沉淀：将发酵完成的菌液4℃，10000 rpm离心10 min收集菌体上清液，配制100%的饱和硫酸铵溶液，缓慢添加上清液，混合配制30%-70%的梯度浓度硫酸铵溶液，4℃缓慢搅拌盐析2 h，析出的蛋白质沉淀用非变性裂解液重悬，然后将重悬液置于非变性裂解液缓冲液中4℃充分透析，3-6 h更换透析缓冲液。透析液过0.45 μm滤膜准备上镍柱。
2）镍柱纯化
①取适量混合均匀的50% BeyoGoldTM His-tag Purification Resin（耐还原螯合剂），4℃离心（1000 g×10 s）弃去储存液。
②向凝胶中加入1个柱体积的非变性裂解液平衡凝胶，重复平衡1-2次，弃去液体。
③按照每0.5 mL凝胶中加入4 ml细菌裂解液上清的比例（1：8），加入裂解液，重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白，收集20μL穿流液作后续分析应用。
④洗柱5次，每次加入1体积的非变形洗涤液，每次收集20μL穿柱的洗涤液用于后续分析检测。
5）洗脱目的蛋白6-10次，每次用1个柱体积的非变性洗脱液。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中，收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。
参见图2，为镍柱纯化电泳图，其中，
M：标准蛋白；
1：WB600/p43-col洗脱2次；
2：WB600/p43-col洗脱3次；
3：WB600/p43-col洗脱4次；
由图可知，目的条带和预测大小35kDa一致，证明重组质粒目的蛋白表达并纯化成功。
（8）重组胶原酶酶活测定
茚三酮比色法： 1 mg 的胶原蛋白用0.5m L 磷酸缓冲液溶解（pH7.4），加入0.1 mL 酶液，37℃反应40 min。加0.5 m L 三氯乙酸（10%，m/v）终止反应，再加入0.9 m L 乙酸缓冲液（pH5.4）和1 m L 茚三酮显色液混匀。100℃下水浴加热10 min，冷却后用3 m L 的60%％乙醇稀释。在570nm 下比色测定。对照组：为消除干扰，首先取0.1m L 的酶液在100℃下水浴煮沸10min 将酶进行灭活，其余步骤同酶活力测定。以每 m L 酶液水解胶原蛋白每min 生成1μg 的甘氨酸的量为一个酶活力单位（U）。
重组胶原酶活原酶液30 U/ml,镍柱纯化后胶原酶活为651.26 U/ml。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 烟台大学
<120> 一种重组枯草芽孢杆菌、其构建方法及一种重组胶原酶
<130> 2022.05.13
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ctgcagatga tcatgaaaaa acctgaactt ttggtgactc cgacttctgt acaggatatt 60
cttccgctca ttcaagcggg cgcaacggcc ctgttagtcg gagaacagag atacggcctg 120
agactggccg gtgaattttc aagagaagat ataaaagaag ccgtaaagac agctcatcag 180
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ccggccgttt taatggcggc gcgtgaagcg gctcccgagc ttaaactgca ttggagcacg 360
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gcagtgctgg ctaaggaatt aaatatggac agcatcattg acataaaaga aaacgccgaa 480
gtggaaattg aaattcaaat ccacggcatg acgtgcatgt tccaatcgaa gcgttcttta 540
gtgggccatt acttcgaata ccaaggtaaa gtcatggaca tcgaacagaa gaaaaaagaa 600
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aacggcacgc acatcatgag cccgaacgat gtgtgcatga ttgatgaatt agaggacctg 720
atggacgccg gcatcgattc tttcaaaatc gacggagttt tgaagtctcc tgaatactta 780
actgaagtga cccgcatgta cagagaagca atcgatttgt gcttcgaaag ccgagagaca 840
tacgaagaga aaaaagagag ctggatagag cggattgaaa gcattcagcc tgtgaacaga 900
agcatcgaca caggattctt ctttaaagaa acggtctatc atcatcacca tcaccactaa 960
aagctt 966

Claims (9)

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，于2022年4月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2022525；分类命名为：枯草芽孢杆菌 WB600/pP43NMK-col Bacillus subtilis WB600/pP43NMK-col。
2.一种权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）引物设计
根据GenBank数据库中淀粉芽孢杆菌基因组胶原酶基因序列，利用引物设计软件DNAMAN和Primer Premier 5设计出特异性引物，进行合成，
上下游引物添加保护碱基和酶切位点，同时在C末端引入6×His标签；
（2）重组质粒pP43NMK-col的构建
通过引物设计，带有双启动子PHpaⅡ和P43的pP43NMK穿梭质粒作为载体，进行重组质粒转化，合成的重组质粒目的基因pP43NMK-col转化到E.coli JM109中，双酶切验证重组质粒，pP43NMK大小为7365bp,col大小为966bp；
（3）E.coli JM109感受态细胞的制备及转化
1）取出-20℃保藏的E.coli JM109在LB培养基上划线，37℃过夜培养，
2）挑取单菌落接种于5 mL液体LB培养基中，37℃，200 rpm过夜培养，
3）以初始OD600=0.02的接种量接种到50 mL/250 mL摇瓶LB培养基中，37℃，200 rpm培养2-3 h，测得OD600为0.4-0.6，取1 mL培养基于离心管中，冰浴放置10 min，
4）4℃，4000 rpm离心10 min，收集菌体，彻底去上清，
5）小心加入1 mL预冷的0.1M氯化钙溶液悬浮菌体，轻轻混匀，冰浴放置15 min，
6）4℃，4000 rpm离心15 min，收集菌体，彻底去上清，
7）加入0.5 mL氯化钙-甘油溶液悬浮菌体，轻轻混匀，-80℃保藏，
8）从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰中5 min，加入10 μL连接产物，轻微混匀，冰浴30 min，
9）42℃热激1.5 min后迅速冰浴5 min，
10）加入1 mL灭菌LB液体培养基，37℃，100 rpm培养1 h，
11）离心收集菌体，去除部分上清后混匀，100μL浓缩菌液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养8-10 h；
（4）B. subtills WB600感受态制备及转化
1）接种枯草芽孢杆菌于5 mL LB培养基中，37℃，250 rpm培养过夜，
2）取100μL上述菌液于5 mL SPⅠ培养基中，37℃，250 rpm培养至对数生长末期约（4-5h），
3）取上步骤菌液0.2 mL至2 mL SPⅡ培养基中，于37℃，100 rpm培养90 min，
4）加入20μL 10 mM EGTA，再于37℃，100 rpm培养10 min，
5）分装成每管0.5 mL，加入10 μL连接产物，37℃，100 rpm培养90 min，取菌液涂布到含有卡那霉素的LB平板上过夜培养；
（5）重组B. subtills WB600/pP43NMK-col的表达
将重组菌B. subtills WB600/pP43NMK-col在添加卡那霉素的50 mL/250 mL摇瓶LB培养基中活化培养，37℃，200 rpm培养12 h，作为活化的种子液，以1%的接种量转接到100 mL添加卡那霉素的液体TB培养基中发酵培养，37℃，200 rpm的条件下发酵24 h。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，
所述引物序列如下：
Figure 227742DEST_PATH_IMAGE001
其中，单下划线部分为酶切位点，上游PstⅠ，下游HindⅢ，双下划线部分为保护碱基，小写字母为6×His标签。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中，在添加卡那霉素抗性的平板中筛选阳性子，挑取单菌落进行质粒提取，通过双酶切和PCR验证目的基因是否成功连接到载体上。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，氯化钙-甘油溶液含有甘油含量为8%-12%。
6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（4）中，挑取平板上的单菌落进行菌落PCR验证和电泳分析，选取有目的条带的菌落进行液体扩大培养，然后提取质粒和酶切验证。
7.一种重组胶原酶，其特征在于，利用权利要求2的构建方法制备的重组枯草芽孢杆菌分离纯化制得。
8.根据权利要求7所述的重组胶原酶，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
A、硫酸铵沉淀：将发酵完成的菌液4℃，10000 rpm离心10 min收集菌体上清液，配制100%的饱和硫酸铵溶液，缓慢添加上清液，混合配制30%-70%的梯度浓度硫酸铵溶液，4℃缓慢搅拌盐析2 h，析出的蛋白质沉淀用非变性裂解液重悬，然后将重悬液置于非变性裂解液缓冲液中4℃充分透析，3-6 h更换透析缓冲液，透析液过0.45 μm滤膜准备上镍柱；
B、镍柱纯化
1）取混合均匀的50% BeyoGoldTM His-tag Purification Resin，4℃离心弃去储存液；
2）向凝胶中加入1个柱体积的非变性裂解液平衡凝胶，重复平衡1-2次，弃去液体；
3）加入裂解液，重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白，收集20μL穿流液作后续分析应用；
4）洗柱4-5次，每次加入1个柱体积的非变形洗涤液，每次收集20μL穿柱的洗涤液；
5）洗脱目的蛋白6-10次，每次用1个柱体积的非变性洗脱液，将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中，收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。
9.根据权利要求8所述的重组胶原酶，其特征在于，所述步骤B中，按照每0.5 mL凝胶中加入4 ml细菌裂解液上清的比例加入裂解液。
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